JPH04200388A - 流行性非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原ペプチドおよびこれをコードする核酸断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産Ｉ」ジグ上」した野 本発明は、Ａ型でもＢ型でもない流行性肝炎の原因ウィ
ルス（流行性非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス）のウィルス抗原
をコードする遺伝子断片、流行性非Ａ非Ｂ型肝炎ウィル
ス抗原ペプチド、およびこれら利用法に関する。

ウィルス性肝炎にはＡ型肝炎（伝染性肝炎）とＢ型肝炎
（血清肝炎）の２種類があることは古くから知られてい
た。これは主として感染経路の相違に基づいたもので、
Ａ型肝炎は経口感染で流行を起こし、Ｂ型肝炎は主とし
て血液を介して伝播されるものであることが確認されて
いた。これら二つの肝炎の起因ウィルスは既に分離同定
され、Ａ型肝炎ウィルスは、ピコルナウィルスに属する
、直径２７ｎｍのＲＮＡウィルスであり［Ｆｉｎｅｓｔ
ｏｎ、Ｓ。

Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　１８２　ｐ１
０２６　（１９７３）］、　一方Ｂ型肝炎ウィルスは、
ヘパドナウィルスに属する直径４２ｎｓのエンベロープ
を持つＤＮＡウィルスであルコとが突き止められた。［
Ｄａｎｅ、Ｏ，Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、Ｌａｎｃｅｔ、　
　Ｉ　ｐ６９５　（１９７０）］　　また、現在では、
これらの肝炎ウィルスの免疫血清学的診断方法が確立さ
れるに至っている。

これら２つの肝炎ウィルスの確定診断方法が確立される
に従い、このいずれにも属さない非Ａ非Ｂ型肝炎の存在
が明らかになってきた［　Ｐｒ１ｎｃｅ、　Ａ。

Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、、　Ｌａｎｃｅｔ、　Ｉ　ｐ２４１
　＜１９７４）］。

輸血後肝炎は、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ
）　　のスクリーニング法の導入により大幅に減少した
がゼロにはならず、しかも、発生した肝炎患者からは、
Ａ型、Ｂ型肝炎の感染の証拠は得られなかった。このこ
とから、この肝炎は一般に非Ａ非Ｂ型肝炎と呼ばれてい
る。

この肝炎は、我国では散発性肝炎の約５０％、輸血後肝
炎の９０％以上にのぼり、更に慢性肝炎、肝硬変、肝癌
の５０％以上が非Ａ非Ｂ型肝炎に起因すると推定されて
おり、大きな社会問題となっている。

最近になって、この主に血液を介して感染する非Ａ非Ｂ
型肝炎ウィルスに関して、ＨＣＶ　（Ｃ型肝炎ウィルス
）という呼称が定着しつつあり、ＨＣＶに関係した抗体
のスクリーニング方法も既に開発されているが、その詳
しいウィルス学的性状は未だ不明である［　Ｃｈｏｏら
、Ｓｃ　１ｅｎｃｅ、　２４４．３５９−３６２（１９
８９）、Ｋｕｏ　　ら、　５ｃｉｅｎｃｅ、２４４．３
６２−３６４（１９８９）］。

これとは別に、インド、ミャンマー、アフガニスタン、
または、化アフリカなどで経口感染で流行する、第二の
ウィルス性非Ａ非Ｂ型肝炎があることが明らかになった
［　Ｋｈｕｒｏｏ、　Ｌ　Ｓ、　　＾ｍ、　Ｊ、　Ｍｅ
ｄ、、　６８　ｐ８１８−８２４．　　（１９８０＞１
．　　これは、一般には水系、または流行性非Ａ非Ｂ型
肝炎と呼ばれている。我国では、この肝炎の流行は見ら
れていないが、渡航者の流行地からの肝炎の輸入は若干
見られるようである［福原ら、第２５回日本肝臓学会総
会講演要旨集１５１頁（１９８９）　］　。

本発明は、上記で言う後者の、主に水を介して感染する
流行性非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスに関するものであり、本
明細書中では、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶでないこのウィ
ルスを非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスと言う。

この非Ａ非Ｂ型肝炎についてはウィルス本体の分離同定
はされておらず、このため、この肝炎の診断方法、治療
法、予防法は確立されていない。

また、この肝炎の診断は除外診断によるしかなかった。

即ち、患者の血清について、診断方法が確立されている
Ａ型、Ｂ型肝炎の検査を行い、これらの肝炎であること
を否定し、更に、全身感染の一部の症状として肝炎症状
を示す、ヘルペス、サイトメガロ、エプスタインバーウ
ィルス感染の可能性を否定し、薬物性や、アルコール性
肝炎、自己免疫性肝炎を否定して非Ａ非Ｂ型肝炎として
診断されていた。

本発明の対象となる非Ａ非Ｂ型肝炎は、インド、ネパー
ル、ミャンマー及び化アフリカ等をその主な流行地とし
ている。感染経路としては、飲料水や野菜を通じたもの
が主な経路であり、感染後の症状としては、通常一過性
の感染、即ち急性肝炎を起こすだけで持続感染は一般に
ないことが知られている。しかしながら、妊婦がこのウ
ィルスに感染すると死亡率が２０％と非常に高いことが
知られており［Ｔａｎｄｏｎら、Ｉｎｄｉａｎ　Ｊ、Ｍ
ｅｄ、Ｒｅｓ、　７５゜７３９−７４４（１９８２）　
］、しばしば飲料水の汚染によって大流行を起こすこと
もある。最近の例としては、１９８６年から１９８８年
にかけて中国のウルムチ自治区の西南部において１２万
人の患者が発生するという大流行が報告されている［現
代科学、１９８７年７月号６２−６７、感染症学雑誌、
６４．１０５−１１１　（１９９０）　］　、　　従っ
て、このような流行地に渡航する人々にとって、有効な
ワクチンの開発並びに抗体、抗原又はウィルスそのもの
の保有状態を容易に検出できる診断試薬の開発が望まれ
ている。

これまでの報告によれば、免疫電顕法によるウィルス様
粒子の検出が報告されており［５ｒｅｅｎｉｖａｓａｎ
　ら、　Ｊ、ＧｅｎＪｉｒｏｌ、、６５．１９９５−１
００７（１９８４）］、　さらにサルを用いた動物モデ
ルにおいて感染実験が成功したことが報告されている［
　１（ａｎｅら、　ＪＡ！４＾２５２．３１４０−３１
４５（１９８４）コ。

本発明者らにおいても、流行地における急性期患者の糞
便から調製したウィルス液をカニクイザルの静脈に接種
したところ感染が成立し、その継代感染にも成功した。

又、感染したサルの糞便及びサル肝臓細胞中にウィルス
様粒子を検出した［　Ｓｏｅら、Ｌｉｖｅｒ、９．１３
５−１４５（１９８９）　］、　　さらにサル胆汁中に
多量のウィルス様粒子が検出されることを確認し［現代
科学、１９８７年７月号、６２−６７　］、ウィルスｃ
ＤＮＡ断片のクローニングに成功し特許出願したし特願
平２〜６４６２９号、特願平２−１２８５６９号］。

最近になって米国のＧｅｎｅｌａｂｓ社が、非Ａ非Ｂ型
肝炎ウィルスのｃＤＮ＾をクローニングしたという報告
があったが［Ｒｅｙｅｓら、Ｓｃ　１ｅｎｃｅ、　２４
７．１３３５−１３３９（１９９０）　］、　ウィルス
そのものの性状、ウィルス構成蛋白の性状などは家だ一
切明らかにされていない。

光」ＷＱ」目的 このような状況のもとに、本発明者らは、非Ａ非Ｂ型肝
炎の原因ウィルスもしくはそのウィルス遺伝子のクロー
ニングを目的として研究を重ねた結果、非Ａ非Ｂ型肝炎
ウィルスの抗原ペプチド配列をコードしている新たな遺
伝子をクローニングすることに成功した。さらに、本発
明者らは、この遺伝子断片を遺伝子組換え技術を用いて
発現させ得られたペプチドが非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清と
蛋白レベルにおいても特異的に反応することを確認し、
本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎感染カニクイザル胆
汁標品を用いて、従来の免疫血清学的方法とは違った新
しい分子遺伝学的手法を取り入れたイムノスクリーニン
グ法により得られた非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスに特有なペ
プチド並びにこれをコードする遺伝子を提供するもので
ある。

本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子断片は、非Ａ非
Ｂ型肝炎ウィルス感染カニクイザルの胆汁から、抽出・
単離することが可能である。まず、胆汁を生理食塩水で
希釈し、低速遠心で組織片等を除く６次に２０％ショ糖
を含む生理食塩水の上に重層し超遠心を行う、このこと
により沈渣にウィルス粒子を回収することができる。こ
のウィルス粒子をグアニジンチオシアネート処理するこ
とによってＲＮＡを抽出し、これを鋳型としてｃＤＮＡ
を合成する。このｃＤＮＡをλｇｔｌｌベクターに挿入
しｃＤＮＡライブラリーを作成する。

λファージを大腸菌に感染させ、細菌培養プレートにま
き、４２℃で数時間培養する。その後ニトロセルロース
フィルター（ＮＣフィルター）をかぶせ数時間培養し、
ＮＣフィルターをはがしレプリカをとる。

このレプリカをブロッキング液で処理し、リン酸緩衝生
理食塩水（ＰＢＳ）などで洗浄した後イムノスクリーニ
ングを行う、すなわち、レプリカを非Ａ非Ｂ型肝炎回復
期のカニクイザル血清及び非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清と反
応させ、ＰＢＳなどで洗浄後、酵素標識抗ヒトＩｇＧ及
び酵素標識抗ヒトＩｇＭと反応させ、洗浄後、基質溶液
と反応させて発色させる０発色したプラークに対応する
ファージを選び二次スクリーニングを行い、再現性のあ
るλフアージクローンを得た。

このクローンについて非Ａ非Ｂ型肝炎特異性を調べた。

非Ａ非Ｂ型肝炎回復期、および正常期のカニクイザル血
清を用いてプラークイムノアッセイを行った結果、非Ａ
　ＩＰ−Ｂ型肝炎ウィルス感染に特異性の高いクローン
を得ることができた。このクローンのファージＤＮＡを
精製［実験医学　臨時増刊号、遺伝子工学総集編５（１
１）、Ｐ３１−３２　（１９８７）参照］し、制限酵素
ＢａｍＨＩで切断後ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
供し、１．２Ｋｂｐ、０．５１ｂｐ、ＩＸｂｐノ挿入断
片（＃３５、＃３８、＃４１）を確認した。

カニクイザルの正常期及び非Ａ非Ｂ型肝炎急性期の肝臓
より染色体ＤＮＡを精製し、アガロースゲル電気泳動を
行った後、　　１２ｐ標識した＃４１を用いてサザンハ
イブリダイゼーションを行った。

＃４１はいずれのＤＮＡとも反応せず、したがって＃４
１は染色体由来ＤＮＡでないと判明した。

カニクイザルの正常期及び非Ａ非Ｂ型肝炎急性期の胆汁
よりＲＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動を行った
後、３２ＰＳＩ！Ｍした＃４１を用いてノザンハイブリ
ダイゼーションを行った。＃４１は正常期の胆汁ＲＮＡ
とは反応せず、急性期の胆汁ＲＮＡとのみ反応した。従
って＃４１は胆汁中ウィルス由来であることが強く示唆
された。

本発明の＃３５、＃３８、＃４１のＤＮＡ配列は、ジデ
オキシ法により決定された。その結果＃３５、＃３８、
＃４１は１つの連続した配列となり、また、先に発明者
らがクローニングしたＩ（Ｔ３−ＩＢ、　ＦＩＴ３−２
Ｅ、　ＨＴ３−３＾、　Ｉ（Ｔ３−５＾を含む配列とも
重複が認められ、これら全ての配列を含む連続した配列
をＨＴ−４とした。ＨＴ−４は１６４３ｂｐの非Ａ非Ｂ
型肝炎ウィルス遺伝子由来のｃＤＮ＾断片であり、その
塩基配列は第１図に示される通りであった。このＤＮＡ
配列をアミノ酸に読み直し、λｇｔｌｌの発現フレーム
に合致するフレームをオープンリーディングフレームと
した。この塩基配列とアミノ酸配列をデータベース（Ｇ
ｅｎｅｔｙｘ−ＣＤ　　ソフトウェア開発　１９９０　
）で検索したところ、現在まで知られているウィルス、
細菌、その他ホモロジーを示すものはなかった。

このアミノ酸配列から、ＨＯＰＰ　＆　ＷＯＯＤらの手
法に基づき、ＨＴ−４がコードするペプチドの親水性・
疎水性のパターンを解析した。その結果、第３図に示す
ような結果が得られ、このペプチド領域は、親水性に富
んだ領域であることが確認された。

このように、本発明で得られたｃＤＮＡ断片が、非Ａ非
Ｂ型肝炎ウィルス抗原のうち親水性の強いペプチド領域
をコードするものであったことは、免疫学的見地からも
非常に意義深いものと思われた。また、このような親水
性のペプチドは取扱が容易になることから、実用性の面
からも非常に有用である。

本発明では、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチドの好
ましい一例として、第２図に示すような５４７個のアミ
ノ酸からなるペプチドを開示するものである。第３図の
解析パターンにも示されたとうり、上記のアミノ酸配列
のペプチド領域は親水性の強いペプチドであることが確
認される。さらに非Ａ非Ｂ型肝炎との関連性を確認する
ために、この遺伝子断片を大腸菌の発現系に組み込み発
現させることによって得られた抗原を用い、多数の肝炎
患者、正常人の血清を対象としてウェスタンプロットア
ッセイを行った。その結果、正常人、Ｂ型肝炎、その他
の肝炎の群に比べ非Ａ非Ｂ型肝炎患者で高率に抗体陽性
者が検出され、イムノアッセイによる蛋白レベルでも、
本発明のペプチドの非Ａ非Ｂ型肝炎に対する特異性が証
明された。

本発明の遺伝子配列は、これを適当な発現系を用いて発
現させ、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの抗体検査に使用する
ことができるし、また、発現した蛋白を動物に免疫して
抗体を作らせ、これを用いて非Ａ非Ｂ型肝炎感染患者の
肝組織中、或は糞便中の非Ａｌｌ：Ｂ型肝炎ウィルスま
たは関連抗原を検出することも可能である。

さらに、本発明で得られた非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス関連
抗原は、感染予防のためのワクチンの作製に極めて有用
である。

また、遺伝子配列そのものは、非Ａ非Ｂ型肝炎のＤＮＡ
プローブ診断キットの開発に極めて有用である。

このような、本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプ
チドをコードする核酸断片、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗
原ペプチドおよびこれらを利用した非Ａ非Ｂ型肝炎ウィ
ルス関連抗原及び抗体の各種検出方法は、特に日本にお
ける非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの検出において極めて有用
であると考えられる。

以下、実施例に沿って本発明を更に詳細に説明する。

非Ａ非Ｂ型肝炎患者の急性期糞便より調製したウィルス
液を、カニクイザルの静脈に接種したところ感染が成立
した。さらに、感染したサルの糞便を用いての継代感染
も成立した［Ｌｉｖｅｒ　９．　ｐ１３５−１４５　（
１９８９＞］。

感染したサルの胆汁を電子顕微鏡で観察したところ、直
径的２７ｎ■のウィルス粒子が検出された（現代化学１
９８９年７月号、ｐ６２−６７　＞　、　　この胆汁的
３５０−からウィルス粒子を精製し、以下の実験に用い
た。

八　　８１　　′　　　　　　ス　　　　　　　　　　
　　ロー；」仁グ： （１）で得られたウィルス粒子を、４Ｍグアニジンチオ
シアネートで処理し、ウィルスゲノム由来の核酸を抽出
した。この抽出液を５．７Ｍ塩化セシウムに重層し、　
１３０００ｘｇで一夜遠心しＲＮＡ沈渣をえた。

ｃＤＮＡ合成システムプラス（アマジャム社製）を用い
てｃＤＮ＾合成を行い、合成したｃＤＮＡをｃＤＮ＾ク
ローニングシステム＾ｇｔｌｌ（アマジャム社製）によ
りλｇｔｌｌベクターにクローニングした。　　ｉｎ　
ｖｉｔｒｏパッケージングの結果、３ｘｌＯ’プラーク
フオーミングユニツト（ＰＦＵ　）のライブラリーを得
た。

也１ （２）で構築したｃＤＮＡライブラリーから、−枚のＬ
Ｂプレート［１，５％＾ｇｗ、１％Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙ
ｐｔｏｎｅ、０．５％Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ　ｅｘｔ
ｒ＆ｃｔ　、１％Ｍａｉｌ　ｐＨ７，５，５０ＩＩＱ／
−アンピシリンの入った細菌培養用プレート（栄研社製
；８２膳鳳φ）］当り１０００　ＰＦＵのファージをと
り、別々に挿入断片のないファージと共に大腸菌Ｙ１０
９０に３７℃で１５分間感染させて、Ｔｏｐ　Ａｇａｒ
４ｄ（０，７％Ａｇａｒ＋１％Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔ
ｏｎｅ、０．５％Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａ
ｃｔ、１％ＮａＣ１，ｐＨ７，５，５０ａ／ｄアンピシ
リン）と共にまき、４２℃で３時間培養した。その後、
１０１Ｍ　ＩＰＴＧ　　（シグマ社製）を染みこませた
ニトロセルロースフィルター（ＮＣフィルター＋　ＳＡ
Ｓ社製）をかぶせ、さらに３７℃で培養を続けた。３時
間後ＮＣフィルターをプレートからはがし、スキムミル
ク液を用いてブロッキング操作を行った。

ス　　ｌ　−ニー ブロッキング操作を行ったレプリカフィルターをＰＢＳ
で洗浄後、大腸菌ライセードで吸収しＰＢＳで１０倍に
希釈したネパール患者血清及び非Ａ非Ｂ型肝炎回復期の
カニクイザル血清に浸し、３７℃で振盪しながら反応さ
せた。１時間ｆ＆ＰＢＳで洗浄し、１０００倍希釈した
ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧヤギ抗体及び５００
倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＭ（Ｆａｂ
’）液に浸し、３７℃で振盪しながら反応させた。１時
間後ＰＢＳで洗浄し、発色液［１０ｍＭ　ＰＢＳ　ｐＦ
１７．２．０．０２％Ｈ２Ｏ２，０，ｌ１ｎｉｃｋｅ１
．０．０２％ｄｉａｗ＋１ｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅｔｅ
ｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅコに浸し発色させた
。ＮＣフィルター上で発色したプラークに対応するファ
ージを選び、二次スクリーニングを行った。即ち、−次
スクリーニングで選択した各ファージを別々に挿入断片
のないファージと共に大腸菌Ｙ１０９０に感染させ、８
２■菖シヤーレ（栄研社製）のＬＢプレートにまき直し
、レプリカフィルターを作製した。これらを上述の方法
で抗体スクリーニングし、得られた陽性クローンに対し
更に三次スクリーニングを行い、非Ａ非Ｂ型肝炎回復期
のカニクイザル血清と再現性よく反応するファージを３
クローン（＃３５．　＃３８．　＃４１　）　　得た。

これらのクローンのファージＤＮＡを精製［実験医学　
臨時増刊号、遺伝子工学総集編５（１１）、Ｐ３１−３
２（１９８７）参照］し、制限酵素ＢｉｍＦ！＋で切断
後ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、１．２Ｋｂ
ｐ（＃３５）、０．５ｋｂｐ（＃３８）、　１ｋｂｐ　
（＃４１）の挿入断片を確認した。

いｔパ　　口・・　　　′ 下記のとうり、＃４１を用いたサザンプロット分析を行
った。カニクイザルの正常及び非Ａ非Ｂ型肝炎急性期の
肝臓より染色体ＤＮＡを精製し、各々１０周をＥｃｏＲ
Ｉで切断後、電気泳動で１％アガロースゲルに展開し、
ナイロンフィルターに転写した。

このフィルターにマルチプライム法で３２ｐ＠識した＃
４１をプローブとし、サザンハイプリダイゼーションを
行った（第４図）、＃４１プローブは正常及び非Ａ非Ｂ
型肝炎急性期のカニクイザルの染色体ＤＮＡとは反応せ
ず、先に発明者らがクローニングしたＨＴ３−１とハイ
ブリした。このことから、＃４１はカニクイザルの染色
体ＤＮＡ由来のクローンではなく、ウィルス核酸由来の
ものであると考えられる。

いた　　ン　ロ・・ 下記のとうり、＃４１を用いたノザンプロット分析を行
った。カニクイザルの正常及び非Ａ非Ｂ型肝炎急性期の
胆汁よりＲＮＡを抽出し、電気泳動で１％アガロースゲ
ルに展開し、ナイロンフィルターに転写した。このフィ
ルターにマルチプライム法で２２ｐ標識した＃４１をプ
ローブとし、ノザンハイブリダイゼーションを行った（
第５図）、　　＃４１プローブは正常カニクイザル胆汁
ＲＮ＾とは反応せず、非Ａ非Ｂ型肝炎急性期のカニクイ
ザルの胆汁ＲＮ＾とのみハイブリした。このことからも
、＃４１は胆汁中ウィルス核酸由来のものであると考え
られる。

ロー二ゝ （３）（Ｂ）で得られたクローンのファージＤＮＡを精
製し実験医学　臨時増刊号、遺伝子工学総集編５（１１
）、Ｐ３１−３２　（１９８７）参照ゴし、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩで切断後ｐＵＥＸ３ベクター（アマジャム社製
）のＢａ■Ｈ１部位に挿入し、サブクローニングを行い
、夫々のサブクローンを得た。

（６）で得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、　［ａ
　−”Ｓ］　ｄＣＴＰ　（１０００Ｃｉ／　ｍｍｏｌ　
）及びＳｅｑｕｅｎａｓｅｖ２．０キツト（ＵＳＢ社製
）を用い、ジデオキシ法により反応を行った。６％のポ
リアクリルアミド−８１４ウレアゲルを用いて、３時閉
２２００Ｖで電気泳動し１６時間感光した。

＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　之上記の結果、＃３５．　＃３８．　＃
４１は互いに重複しており１つの連続した配列が得られ
た。また、先に発明者らがクローニングした）［Ｔ３−
ＩＢ、　［（Ｔ３−２Ｅ、　ＩＴ３−３＾、ＦＩＴ３−
５＾を含む配列とも重複が認められ、これら全ての配列
を含む連続した配列を［（Ｔ−４とした。ＩＴ−４の配
列及び予測されるアミノ酸配列の解読の結果をそれぞれ
第１図、第２図に示した。

予測されるアミノ酸配列の親水性／疎水性プロフィール
を第３図に示す。

得られた塩基配列及びアミノ酸配列をデータベース（前
述）で検索した結果、ウィルス、細菌その他高いホモロ
ジーを示すものはなかった。

Ａ　　　　−セー　　− （６）で得られたプラスミド及び挿入断片のないｐＵＥ
Ｘ３を夫々別々に大腸菌８８１０１株に感染させ、組換
体を作製した。この大腸菌をＬＢ培地にて３０℃におい
て培養し、その対数増殖期に４２℃にて温度誘導を行い
発現を誘導し、２時間後に集菌した。

菌体は粗遠心にて沈渣とし、ｌｄ　ＰＭＳＦ、０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝生理食塩水＜ｐ！（
８，０）及びガラスピーズを添加し、１５分間激しく撹
拌し菌体を破砕した。これを３０００回転で１０分間遠
心し、沈渣を１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ　トリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁し大腸菌ライセード
とした。

Ｂ　　ニス　１　ロー　　・・セ （８）（Ａ）で得られた大腸菌ライセードの混合標品を
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、これ
をニトロセルロース膜に転写しく３）に準じてブロッキ
ング反応から発色反応を行った。但し、急性期患者血清
については、２次抗体として、抗ヒトＩｇＭヤギ抗体を
用いた。ウェスタンプロットアッセイの結果を表１、表
２、表３に示した。

表１　非Ａ非Ｂ型肝炎感染カニクイザル経時血清１、感
染後０日　　　　　−− １７日　　　　　　−− ２１日　　　　　　−− ２８日　　　　　　−− ４２日　　　　　　十　　　　　　　　　−２、感染後
０日　　　　−− ２１日　　　　　　−− ２８日　　　　　　−− ３５日　　　　　　十　　　　　　　　　−４２日　　
　　　　十十　　　　　　　　　−（以下余白） 表２　ミャン７−非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清との反応血清
　　　混合ライセード　　　ｐＵＥＸ３患者Ａ　急性期
　　　　−− 回復期１　　　±　　　　　　　− 回復期２　　　十　　　　　　　− 患者Ｂ　急性期　　　　−− 回復期１　　　十　　　　　　　− 回復期２　　　＋　　　　　　　− 患者Ｃ急性期　　　　十　　　　　　　−回復期１　　
　十　　　　　　　− 回復期２　　　＋　　　　　　　− 患者Ｄ　急性期　　　　−− 回復期１　　　＋　　　　　　　− 回復期２　　　＋　　　　　　　− （以下余白） 正常カニクイザル−１−− 一２　　−　　　　− 正常人−１−− ＝２　　　　　−　　　　− Ｂ型肝炎患者−１−− 一３　　　−　　　　− その他の肝炎患者−１−− 一２　　−　　　　− ＃３５．　＃３８．　＃４１由来蛋白は非Ａ非Ｂ型肝炎
感染カニクイザル経時血清及びミャンマー非Ａ非Ｂ型肝
炎患者血清と非常に良く反応し、挿入断片のないｐＵＢ
Ｘ３由来ライセードはこれら血清と全く反応しなかった
。また、正常カニクイザル血清、正常人血清、Ｂ型肝炎
患者血清及びその他の肝炎患者血清は＃３５．　＃３８
．　＃４１由来蛋白と全く反応しながった。

以上のように、本発明の＃３５．　＃３８．　＃４１ク
ローンが非Ａ非Ｂ型肝炎特異的であることが示された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明でクローニングした＃３５．　＃３８
゜＃４１及びｆ（Ｔ３−ＩＢ、　３Ａを連結した遺伝子
断片であるＨＴ−４の塩基配列を示す。 第２図は、ＨＴ−４がコードする全アミノ酸配列を示す
。 第３図は、アミノ酸配列を基にした。　　［（Ｔ−４が
コードするペプチドの親水性・疎水性プロフィールを示
す。 第４図は、本発明でクローニングした＃４１とカニクイ
ザル染色体ＤＮＡとのサザンハイプリダイゼーションの
模式図である。 第５図は、本発明でクローニングした＃４１とカニクイ
ザル胆汁ＲＮＡとのノザンハイブリダイゼーションの模
式図である。 特許出願人　財団法人　化学及血清療法研究所ＴＧＣＧ
ＣＣＧＧＣＡ　　ＧＴＡＴ＾＾ＴＣＴＡ　　ＴＣＡＡＣ
ＡＴＣＴＣＣＣＣＴＣＡＣＴＴＣＴＴＣＣＧＴＧＧＣＣ
ＡＣＣＧＧＣＡＣＴＡ　　ＡＣＣＴＧＧＴＴＣＴ　　Ｔ
ＴＡＴＧＣＣＧＣＣＣＣＴＣＴＴＡＧＴＣＣＧＣＴＣＴ
ＴＡＣＣＴＣＴＴＣＡＧＧＡＣＧＧＣＡＣＣＡＡＴ八Ｃ
ＣＣＡＴＡＴへＡＴ　　ＧＧＣＣＡＣＧＧ＾＾　ＧＣＴ
ＴＣＴＡＡＴＴ　　ＡＴＧＣＣＣＡＧ］’＾ＣＣＧＧＧ
ＴＴＧＴＣＣＧＴＧＣＣＡＣＡＡ　　ＴＣＣＧＴＴＡＣ
ＣＧ　　ＣＣＣＧＣＴＧＧＴＣＣＣＣＡＡＴＧＣＴＧ　
　ＴＣＧＧＣＧＧＴＴＡ　　ＴＧＣＣＡＴＣＴＣＣＡＴ
ＣＴＣＡＴＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＡＣＣＡＣＣＡＣＣ
ＡＣＣＣＣＧＡＣＧＴＣＣＧ　　ＴＴＧＡＴＡＴＧ＾＾
ＴＴＣＡＡＴＡＡＣＣＴＣＧＡＣＧＧＡＴＧ　　ＴＴＣ
ＧＴＡＴＴＴＴ　　ＡＧＴＣＣＡＧＣＣＣＧＧＣＡＴＡ
ＧＣＣＴ　　ＣＴＧＡＧＣＴＴＧＴ　　ＧＡＴＣＣＣＡ
ＡＧＴ　　ＧＡＧＣＧＣＣＴＡＣ＾ＣＴＡＴＣＧＴＡＡ
　　ＣＣ＾＾ＧＧＣＴＧＧ　　ＣＧＣＴＣＣＧＴＣＧ　
　ＡＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＴＧＧＣＴＧＡＧ　　ＧＡ
ＧＧＡＧＧＣＴＡ　　ＣＣＴＣＴＧＧＴＣＴ　ＴＧＴＴ
ＡＴＧＣＴＴＴＧＣＡＴＡＣＡＴＧ　　ＧＣＴＣＡＣＣ
ＣＧＴ　　ＡＡＡＴＴＣＣＴＡｔ　　ＡＣＴ＾＾ＣＡＣ
ＡＣＣＣＴＡＴＡＣＣＧＧ　　ＴＧＣＣＣＴＣＧＧＧ　
　ＣＴＧＣＴＧＧＡＣＴ　ＴＴＧＣＣＣＴＴＧ＾ＧＣＴ
ＴＧＡＧＴＴＴ　　ＣＧＣ＾＾ＣＣＴＴＡ　　ＣＣＣＣ
ＣＧＧＴＡＡ　　ＣＡＣＣＡＡＴＡＣＧＣＧＧＧＴＣＴ
ＣＣＣＧＴＴＡＴＴＣＣＡＧ　　ＣＡＣＴＧＣＴＣＧＣ
ＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＧＴＣＧＣＧＧＴＧＣＧＧＡＣＧ
ＧＧＡ（１’Ｔ　　ＣＣＣＧＡＧＣＴＣＡ　　ＣＣＡＣ
ＣＡＣＧＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＧＣＴＴＴＡＴＧ＾＾Ｇ
Ｇ　　ＡＣＣＴＣＴＡＴＴＴ　　ＴＡＣＴＡＧＴＡＣＴ
ＡＡＴＧＧＴＧＴＣＧ　　ＧＴＧＡＧＡＴＣＧＧ　　Ｃ
ＣＧＣＧＧＧＡＴＡ　　ＧＣＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＴＴ
ＴＡＡＣＣＴ　ＴＧＣＴＧＡＣＡＣＴ　　ＣＴＧＣＴＴ
ＧＧＣＧ　ＧＣＣＴＧＣＣＧＡＣ第１図その１ ＾ＧＡＡＴＴＧＡＴＴ　　ＴＣＧＴＣＧＧＣＴＧ　　Ｇ
ＴＧＧＣＣＡＧＣＴ　　ＧＴＴＣＴＡＣＴＣＣＣＧＴＣ
ＣＣＧＴＣＧ　　ＴＣＴＣＧＧＣＣＣＡ　　ＴＧＧＣＧ
ＡＧＣＣＧ　　ＡＣＴＧＴＴＡＡＧＴＴＧＴＡＴＡＣＡ
ＴＣＴＧＴＡＧＡＧＡＡＴ　ＧＣＴＣＡＧＣＡＧＧ　Ａ
ＴＡＡＧＧＧＴＡＴＴＧＣＡＡＴＣＣＣＧ　　ＣＡＴＧ
ＡＣＡＴＴＧ　　ＡＣＣＴＣＧＧＡＧＡ　　ＡＴＣＴＣ
ＧＴＧＴＧＧＴＴＡＴＴＣＡＧＧ　　ＡＴＴＡＴＧＡＣ
ＡＡ　　ＣＣＡＡＣＡＴＧＡＡ　　Ｃ＾＾ＧＡＴＣＧＧ
ＣＣＧＡＣＧＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＣＣＣＡ　　ＴＣ
ＧＣＧＣＣＣＴＴ　ＴＣＴＣＴＧＴＣＣＴＴＣＧＡＧＣ
ＴＡＡＴ　ＧＡＴＧＴＧＣＴＴＴ　　ＧＧＣＴＣＴＣＴ
ＣＴ　ＣＡＣＣＧＣＴＧＣＣＧＡＧＴＡＴＧＡＣＣＡＧ
ＴＣＣＡＣＴＴＡ　　ＴＧＧＣＴＣＴＴＣＧ　　ＡＣＴ
ＧＧＣＣＣＡＧＴＴＴＡＴＧＴＴＴＣＴＧＡＣＴＣＴＧ
ＴＧ　　ＡＣＣＴＴＧＧＴＴ＾　＾ＴＧＴＴＧＣＧＡＣ
ＣＧＧＣＧＣＧＣＡＧ　　ＧＣＣＧＴＴＧＣＣＣＧＧＴ
ＣＧＣＴＣＧＡ　　ＴＴＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＣＡ
ＣＴＴＧ　　ＡＣＧＧＴＣＧＣＣＣＣＴＣＴＣＣＡＣＣ
Ａ　ＴＣＣＡＧＣＡＧＴ＾ＣＣＣＧＡＡＧＡＣＣＴＴＣ
ＴＴＴＧＴＣＣＴＧＣＧＣＴＣＧＣＧ　ＧＴ＾＾ＧＣＴ
ＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＧＡＧ　ＧＣＡＧＧＣＡＣＡＡ　
ＣＴＡＡＡＧＣＣＧＧ　ＧＴＡＣＣＣＴＴＡＴＡＡＴＴ
ＡＴＡＡＣＡ　　ＣＣＡＣＴＧＣＴＡＧ　ＣＧＡＣＣＡ
ＡＣＴＧ　ＣＴＴＧＴＣＧＡＧ＾ＡＴＧＣＣＧＣＣＧＧ
　ＧＣＡＣＣＧＧＧＴＣＧＣＴＡＴＴＴＣＣＡ　ＣＴＴ
ＡＣＡＣＣＡＣＴＡＧＣＣＴＧＧＧＴ　ＧＣＴＧＧＴＣ
ＣＣＧ　ＴＣＴＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＧＧＴＴＧＣＴＧ
ＴＴＴＴＡＧＣＣＣＣＣＣＡＣＴＣＴＧＣＧＣＴＡＧＣ
ＡＴＴＧ　ＣＴＴＧＡＧＧＡＴＡＣＣＴＴＧＧＡＣＴＡ
　ＣＣＣＴＧＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＴＡＣＴＴ　ＴＴＧ
ＡＴＧＡＴＴＴＣＴＧＣＣＣＡＧＡＧ　　ＴＧＣＣ’Ｇ
ＣＣＣＴＣＴＴＧＧＣＣＴＣＣＡ　　ＧＧＧＴＧＣＧＣ
Ｔ丁第１図その２ ＴＣＣＡＧＴＣＴＡＣＴＧＴＣＧＣＴＧＡＧ　　ＣＴＴ
ＣＡＧＣＧＣＣＴＴＡＡＧＡＸＸＸＡＧＧＴＧＧＧＴＡ
ＡＡ　　ＡＣＴＣＧＧＧＡＧＴ　ＴＡＴＡＧＴＴＴＡＴ
　ＣＴＧＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＣＴＴＣＴＴ　ＴＣＴ
ＧＴＴＧＣＴＴ　　ＡＴＴＴＣＴＴＡＴＴ　ＴＣＴＧＴ
ＴＣＣＧＣＣＴ （Ｘは任意の核酸） 第１図その３ ＲＲＱＹＮＬＳＴＳＰ　　ＬＴＳＳＶＡＴＧＴＮ　　Ｌ
ＶＬＹＡＡＰＬＳＰ　　ＬＬＰＬＱＤＧＴＮＴＨＩＭＡ
ＴＨＡＳＮＹ　　ＡＱＹＲＶＶＲＡＴＩ　　ＲＹＲＰＬ
ＶＰＮＡＶ　ＧＧＹＡＴＳ［５ＦＷＰＱＴＴＴＴＰＴＳ
Ｖ　　ＤＭＮＳＴＴＳＴＤＶ　　ＲｒＬＶＱＰＧＩＡＳ
　　ＥＬＶＩＰＳＥＲＬＨＹＲＮＱＧＷＲ３ＶＥ　　Ｔ
ＳＧＶＡＥＥＥＡＴ　　ＳＧＬＶＭＬＣＩＨＧ　　５Ｐ
ＶＮＳＹＴＮＴＰＹＴＧＡＬＧＬＬＤＦ　　ＡＬＥＬＥ
ＦＲＮＬＴ　　ＰＧＮＴＮＴＲＶＳＲＹＳＳＴＡＲＨＲ
ＬＲＲＧＡＤＧＴＡＥＬＴ　ＴＴＡＡＴＲＦＭＫＤ　　
ＬＹＦＴＳＴＮＧＶＧ　　ＥＩＧＲＧＩＡＬＴＬＦＮＬ
ＡＤＴＬＬＧＧ　　ＬＰ置ｌ５ＳＡＧ　　ＧＱＬＦＹＳ
ＲＰｖＶ　　５ＡＩ（ＧＥＰＴＶＫＬＹＴＳＶＥＮＡＱ
ＱＤ　　ＫＧＩＡＩＰＨＤＩＤ　　ＬＧＥＳＲＶＶＩＱ
Ｄ　　ＹＤＮＱＨＥＱＤＲＰＴＰＳＰＡＰＳＲＰＦ　　
５ＶＬＲＡＮＤＶＬＷ、ＬＳＬＴＡＡＥＹＤＱ　　５Ｔ
ＹＧＳＳＴＧＰＶＹＶＳＤＳＶＴＬＶＮ　　ＶＡＴＧＡ
ＱＡＶＡＲ５ＬＤＷＴＫＶＴＬＤ　ＧＲＰＳＰＰＳＳＳ
ＴＲＲＰ！３ＬＳＣＡＲＧ　　ＫＬＳＦＷＥＡＧＴＴ　
　ＫＡＧＹＰＹＮＹＮＴ　ＴＡＳＤＱＬＬＶＥＮＡＡＧ
ＨＲＶＡＩＳＴ　　ＹＴＴＳＬＧＡＧＰＶ　　５ＩＳＡ
ｖＡｖＬＡＰ　　Ｈ５ＡＬＡＬＬＥＤＴＬＤＹＰＡＣＡ
ＨＴＦ　　ＤＤＦＣＰＥＣＲＰＬ　ＧＬＱＧＡＬＳＳＬ
Ｌ　５ＬＳＦＳＡＬＩ’ｎＲＷＶＫＬＧＳＹＳＬＳ　　
ＡＣＡＰＬＬＳＶＡＹ　　ＦＬＦＬＦＲＡ（傘は任意の
アミノ酸） 第２図 ト　　　　　　　　　　　　　ω　　　　　　　　　　
　　　ｃ′′（Ｅや　　１ ±５５δ５；二ｙ＝跳ｉ≧よ芯＝兵兵兵よ旨跳ａ美仝；
跳：Ｃよ＝；５々＝Δ５己よ５＝：ミ謂δ５ａ二よｙδ
々二＝ρ々；δ己δ二ｙ５δβよδ謬蔓ε己δロ　　　
　　　　　　　　　　ロや　　　　　　　　　　　　　
ロ　　　　　　　　　　　　　ロ−ト氏○く←＜←（〉
ω（←のη←＜　＜　！　＜　−＜　＜じくく口←（口
レーン１：正常サル肝臓ＤＮＡｌ０周 ２：　感染　　　　　　　ノｌ　　　　　　　　　　　
ノＩ３：　　ＩＩＴ３−１７ラグメント 第４図 レーン１：正常サル胆汁ＲＮＡ ２：感染　　　ｌノ 第５図

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）流行性非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチドをコ
   ードする核酸断片。
2. （２）前記非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチドが、下
   記のアミノ酸配列の一部又は下記のアミノ酸配列を含む
   ペプチドである前記第（１）項記載の核酸断片。 【遺伝子配列があります】 （＊は任意のアミノ酸）
3. （３）下記の核酸配列の一部又は下記の核酸配列を含む
   前記第（２）項記載の核酸断片。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （Ｘは任意の核酸）
4. （４）下記のアミノ酸配列の一部又は下記のアミノ酸配
   列を含む流行性非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチド。 【遺伝子配列があります】 （＊は任意のアミノ酸）
5. （５）該ペプチドが、化学的に合成されたペプチドであ
   る前記第（４）項に記載の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原
   ペプチド。
6. （６）該ペプチドが、前記第（１）項の核酸断片を適当
   な発現ベクターに組み込み、これを宿主細胞内で発現さ
   せることにより得られるペプチドである前記第（４）項
   記載の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチド。
7. （７）前記第（４）項記載のペプチドを抗原として用い
   ることを特徴とする流行性非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス関連
   抗体の免疫学的検出方法。
8. （８）前記第（５）項記載のペプチドを抗原として用い
   ることを特徴とする流行性非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス関連
   抗体の免疫学的検出方法。
9. （９）下記の塩基配列に含まれる少なくとも１０塩基以
   上の核酸断片からなることを特徴とする流行性非Ａ非Ｂ
   型肝炎ウィルス遺伝子検出用核酸プローブ。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （Ｘは任意の核酸）
10. （１０）上記第（９）項の核酸プローブを用いて、対象
    となるサンプルのＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイゼ
    ーシヨンさせることを特徴とする流行性非Ａ非Ｂ型肝炎
    ウィルスの検出方法。
11. （１１）上記第（４）項記載のペプチドを抗原として調
    製される流行性非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス関連抗体。
12. （１２）上記第（１１）項記載の抗体を用いることを特
    徴とする流行性非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス及び関連抗原の
    免疫学的検出方法。