CN110128532A - 一种利用人血浆组份ii+iii生产制备ivig的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以人血浆组份II+III为起始原料，以低温乙醇沉淀结合离子交换柱层析生产制备静注人免疫球蛋白（IVIG）的方法。本发明中层析上样前料液不需要透析脱醇脱盐，也无需调节上样料液电导值，大大简化了工艺流程，使整个工艺具有流程简洁，生产周期短，纯度高的优点。通过本方法生产的IVIG产品所含的IgA和IgM较传统工艺大幅下降，PKA、ACA、抗A抗B血凝素及多聚体比均符合药典规定。

Description

一种利用人血浆组份II+III生产制备IVIG的方法
技术领域
本发明属生物制药领域。涉及一种从人血浆蛋白组分II+III中纯化免疫球蛋白的方法。
背景技术
静脉注射人免疫球蛋白（IVIG）是由健康人血浆经低温乙醇蛋白分离法提取制备的免疫球蛋白组分，经深加工和病毒灭活等步骤精制而成。IVIG具有免疫替代和免疫调节的双重治疗作用，临床使用广泛。IVIG最初多用于治疗多种原发性免疫球蛋白缺陷症和各种继发性免疫缺乏症如免疫介导的血小板减少、川崎病等。目前，已将IVIG的临床应用拓展到50多种疾病如再生障碍性贫血贫血、新生儿溶血病、输血后紫癜、特发性血小板减少性紫癜、癫痫、重症肌无力、多发性硬化症、多发性骨髓瘤、多发性肌炎、多发性神经病，脏器肿大，艾滋病等，在危重症的抢救中起着越来越重要的作用。
传统的生产工艺大都采用多步低温乙醇沉淀法，如专利CN104479011A,将I+II+III溶解后，先经两步低温乙醇（15%，V/V）沉淀，压滤除去大部分杂蛋白，然后将上清液（组分II）在中性条件下加乙醇(20%,V/V)沉淀出来，将沉淀复溶，经过超滤、透析、浓缩,再加乙醇(2%,V/V)沉淀一次，压滤收集上清液，再次超滤透析、浓缩加入保护剂后无菌分装。有少数采用低温乙醇沉淀结合柱层析法，如专利CN103554253A，以组分II+III为起始原料，溶解后加乙醇（18%，V/V）沉淀，压滤收集上清液，然后透析脱醇、脱盐，经过两步柱层析，收集流穿液，再次超滤、透析、浓缩，除菌过滤后孵化，后除病毒过滤再无菌分装得成品。
由于传统的低温乙醇结合柱层析法，料液在通过层析柱之前，需要透析脱醇脱盐，使得流程复杂，得率下降。
发明内容
本发明涉及一种改良的纯化方法，可以以人粗制血浆或粗制血浆蛋白组分为原料生产免疫球蛋白产品。
本方法具有下述主要技术特点：通过低温乙醇沉淀法去除聚集体和颗粒；料液不经过透析脱醇脱盐，在含有乙醇的条件下通过离子交换层析达到进一步纯化；包含低pH孵放和20纳米过滤两步除病毒步骤；所得免疫球蛋白产品纯度≥98%、IgG单体+二聚体≥96%、IgA含量≤3mg/L、IgM含量≤40mg/L、PKA<35IU/ml、ACA<50%、抗A、抗B血凝素<1:64。
与以前本领域的方法相比，由于料液可以在不去除乙醇的条件下直接进行层析纯化，大大简化了工艺流程，使整个工艺具有流程简洁，生产周期短，纯度高的优点。通过本方法生产的IVIG产品所含的IgA和IgM较传统工艺大幅下降，PKA、ACA、抗A、抗B血凝素及多聚体比均符合药典规定。
一种利用人血浆组份II+III生产制备IVIG的方法，包括如下步骤：
（1）组分沉淀的悬浮
将冰冻的组份II+III沉淀从冷库取出，切成碎块，然后按一定的质量投料比（组份：缓冲液），投入预先配制的悬浮缓冲液中，并按每kg组份加入0.17kg甘氨酸的比例加入甘氨酸，均匀搅拌4-18小时，使沉淀充分悬浮分散；
（2）乙醇沉淀
将步骤（1）得到的悬浮液pH调节到4.95-5.45，然后按11%-17%的体积比加入乙醇溶液，料液温度控制在-5~1℃，搅拌2-6小时，使杂质蛋白充分溶出，得到均匀的悬浮液；
（3）压滤
将步骤（2）得到的悬浮液pH调节到4.95-5.65，在-5~0℃下压滤；收集滤液，即为粗纯的IgG溶液；
（4）阴离子交换柱层析
将步骤（3）得到的粗纯IgG溶液经深层滤器加0.45um滤芯过滤后，直接上阴离子交换柱，控制上样液的线流速不高于100cm/h，柱子预先用平衡缓冲液平衡；上柱过程中，收集流穿液，上柱结束后，用平衡缓冲液冲洗柱子，将冲洗液并入流穿液中；
（5）超滤浓缩及调节
将步骤（4）得到的流穿液用截留分子量10K-30K的超滤膜浓缩，然后用透析液恒体积透析6-10倍，然后浓缩至蛋白浓度6-7%(w/v)左右，转移出超滤膜包并用透析液后洗膜包，再用透析液调蛋白浓度至5.35-5.45%(w/v)；
（6）低PH孵化
往步骤（5）得到的蛋白溶液中加入5%的山梨醇(w/w)，并调节pH到4.10-4.20，用0.22微米的除菌滤芯过滤后置于室温孵化21天；
（7）纳米膜除病毒过滤
用20纳米的滤芯过滤步骤（6）孵化结束的蛋白溶液以去除病毒；
（8）除菌过滤并分装。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明作进一步的说明，实施例只是为了使本领域的技术人员更好地理解本发明，不可理解为对本发明权力保护范围的限定，相反，对于本领域的普通科研人员而言，凡利用本发明进行的任何非实质性的改动或调整，均应落入本发明的保护范围之内。
实施例一，
1，组分沉淀的悬浮：称取组分II+III沉淀1kg，投入19kg溶解缓冲液（10mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，PH4.15-4.25,0~4℃）中，加入0.17kg甘氨酸，均匀搅拌12小时，使沉淀充分悬浮；
2，乙醇沉淀：将以上悬浮液pH调节到5.05-5.15，按体积比17%加入95%的乙醇溶液混合，料液温度控制在1℃，搅拌5小时，使杂质蛋白从沉淀中充分沉淀，得到均匀悬浮液；
3，压滤：将以上悬浮液pH调节到5.35-5.45，在-3~1℃下压滤悬浮液，并用平衡缓冲液后洗沉淀；
4，阴离子交换柱层析：粗纯IgG溶液经深层滤器加0.45um滤芯过滤后，以60-65cm/h的上柱线速度上Fractogel® EMD DEAE和Fractogel® EMD TMAE串联柱，柱子预先用平衡缓冲液(10mmol/L的醋酸-醋酸钠溶液，PH5.35-5.45）平衡，收集流穿液；上柱结束后，用平衡缓冲液冲洗柱子，将冲洗液并入流穿液；
5，超滤浓缩及调节：用30k超滤膜(0.5M2）浓缩以上流穿液至约1.5kg，然后用15kg注射用水进行透析，后再次浓缩至蛋白浓度6-7%(w/v)，转移并后洗超滤膜；用透析液调蛋白浓度至5.35-5.45%(w/v)；
6，低PH孵化：往上述蛋白溶液加入5%山梨醇（w/w），待山梨醇溶解并搅拌均匀后将蛋白溶液pH调节到4.10-4.20，用0.22微米的除菌滤芯过滤以上溶液，收集滤液于无菌容器中，置于室温孵化21天；
7，纳米膜除病毒过滤：孵化结束后，用20nm滤芯除病毒过滤；
8，除菌过滤后分装。
实施例二，
1，组分沉淀的悬浮：称取组分II+III沉淀1kg，投入19kg溶解缓冲液（20mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，PH4.15-4.25,0~4℃）中，加入0.17kg甘氨酸，均匀搅拌6小时，使沉淀充分悬浮；
2，乙醇沉淀：将以上悬浮液pH调节到4.95-5.05，按体积比17%加入95%的乙醇溶液混合，料液温度控制在-3℃，搅拌2小时，使杂质蛋白从沉淀中充分沉淀，得到均匀悬浮液；
3，压滤：将以上悬浮液pH调节到4.9-5.05，在-5~-1℃下压滤悬浮液，并后洗沉淀；
4，阴离子交换柱层析：粗纯IgG溶液经深层滤器加0.45um滤芯过滤后，以70-75cm/h的上柱线速度上Fractogel® EMD DEAE和Fractogel® EMD TMAE串联柱，柱子预先用平衡缓冲液(10mmol/L的醋酸-醋酸钠溶液，PH5.15-5.25）平衡，收集流穿液；上柱结束后，用平衡缓冲液冲洗柱子，将冲洗液并入流穿液；
5，超滤浓缩及调节：用30k超滤膜(0.5M2）浓缩以上流穿液至约1.5kg，然后用15.0kg注射用水进行透析，后再次浓缩至蛋白浓度6-7%(w/v)，转移并后洗超滤膜；用透析液调蛋白浓度至5.35-5.45%(w/v)；
6，低PH孵化：往上述蛋白溶液加入5%山梨醇（w/w），待山梨醇溶解并搅拌均匀后将蛋白溶液pH调节到4.10-4.20，用0.22微米的除菌滤芯过滤以上溶液，收集滤液于无菌容器中，置于室温孵化21天；
7，纳米膜除病毒过滤：孵化结束后，用20nm滤芯除病毒过滤；
8，除菌过滤后分装。
实施例三，
1，组分沉淀的悬浮：称取组分II+III沉淀1kg，投入19kg溶解缓冲液（10mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，PH4.15-4.25,0~4℃）中，加入0.17kg甘氨酸，均匀搅拌12小时，使沉淀充分悬浮；
2，乙醇沉淀：将以上悬浮液pH调节到5.05-5.15，按体积比17%加入95%的乙醇溶液混合，料液温度控制在1℃，搅拌2小时，使杂质蛋白从沉淀中充分沉淀，得到均匀悬浮液；
3，压滤：将以上悬浮液pH调节到5.25-5.35，在-3~1℃下压滤悬浮液，并后洗沉淀；
4，阴离子交换柱层析：粗纯IgG溶液经深层滤器加0.45um滤芯过滤后，以70-75cm/h的上柱线速度上Fractogel® EMD DEAE和Fractogel® EMD TMAE串联柱，柱子预先用平衡缓冲液(10mmol/L的醋酸-醋酸钠溶液，PH5.25-5.35）平衡，收集流穿液；上柱结束后，用平衡缓冲液冲洗柱子，将冲洗液并入流穿液；
5，超滤浓缩及调节：用30k超滤膜(0.5M2）浓缩以上流穿液至约1.5kg，然后用9.0kg注射用水进行透析，后再次浓缩至蛋白浓度6-7%(w/v)，转移并后洗超滤膜；用透析液调蛋白浓度至5.35-5.45%(w/v)；
6，低PH孵化：往上述蛋白溶液加入5%山梨醇（w/w），待山梨醇溶解并搅拌均匀后将蛋白溶液pH调节到4.10-4.20，用0.22微米的除菌滤芯过滤以上溶液，收集滤液于无菌容器中，置于室温孵化21天；
7，纳米膜除病毒过滤：孵化结束后，用20nm滤芯除病毒过滤；
8，除菌过滤后分装。
实施例四，
1，组分沉淀的悬浮：称取组分II+III沉淀1kg，投入14kg溶解缓冲液（10mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，PH4.45-4.55,0~4℃）中，加入0.17kg甘氨酸，均匀搅拌4小时，使沉淀充分悬浮；
2，乙醇沉淀：将以上悬浮液pH调节到5.05-5.15，按体积比11%加入95%的乙醇溶液混合，料液温度控制在-5℃，搅拌3小时，使杂质蛋白从沉淀中充分沉淀，得到均匀悬浮液；
3，压滤：将以上悬浮液pH调节到5.35-5.45，在-3~1℃下压滤悬浮液，并后洗沉淀；
4，阴离子交换柱层析：粗纯IgG溶液经深层滤器加0.45um滤芯过滤后，以90-100cm/h的上柱线速度上Fractogel® EMD DEAE柱，柱子预先用平衡缓冲液(10mmol/L的醋酸-醋酸钠溶液，PH5.35-5.45）平衡，收集流穿液；上柱结束后，用平衡缓冲液冲洗柱子，将冲洗液并入流穿液；
5，超滤浓缩及调节：用10k超滤膜(0.5M2）浓缩以上流穿液至约1.5kg，然后用13.5kg注射用水进行透析，后再次浓缩至蛋白浓度6-7%(w/v)，转移并后洗超滤膜；用透析液调蛋白浓度至5.35-5.45%(w/v)；
6，低PH孵化：往上述蛋白溶液加入5%山梨醇（w/w），待山梨醇溶解并搅拌均匀后将蛋白溶液pH调节到4.10-4.20，用0.22微米的除菌滤芯过滤以上溶液，收集滤液于无菌容器中，置于室温孵化21天；
7，纳米膜除病毒过滤：孵化结束后，用20nm滤芯除病毒过滤；
8，除菌过滤后分装。
实施例五，
1，组分沉淀的悬浮：称取组分II+III沉淀1kg，投入17kg溶解缓冲液（10mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，PH3.95-4.05,0~4℃）中，加入0.17kg甘氨酸，均匀搅拌18小时，使沉淀充分悬浮；
2，乙醇沉淀：将以上悬浮液pH调节到5.05-5.15，按体积比14%加入95%的乙醇溶液混合，料液温度控制在1℃，搅拌6小时，使杂质蛋白从沉淀中充分沉淀，得到均匀悬浮液；
3，压滤：将以上悬浮液pH调节到5.35-5.45，在-3~1℃下压滤悬浮液，并后洗沉淀；
4，阴离子交换柱层析：粗纯IgG溶液经深层滤器加0.45um滤芯过滤后，以75-80cm/h的上柱线速度上Fractogel® EMD TMAE柱，柱子预先用平衡缓冲液(10mmol/L的醋酸-醋酸钠溶液，PH5.35-5.45）平衡，收集流穿液；上柱结束后，用平衡缓冲液冲洗柱子，将冲洗液并入流穿液；
5，超滤浓缩及调节：用30k超滤膜(0.5M2）浓缩以上流穿液至约1.5kg，然后用15.0kg注射用水进行透析，后再次浓缩至蛋白浓度6-7%(w/v)，转移并后洗超滤膜；用透析液调蛋白浓度至5.35-5.45%(w/v)；
6，低PH孵化：往上述蛋白溶液加入5%山梨醇（w/w），待山梨醇溶解并搅拌均匀后将蛋白溶液pH调节到4.10-4.20，用0.22微米的除菌滤芯过滤以上溶液，收集滤液于无菌容器中，置于室温孵化21天；
7，纳米膜除病毒过滤：孵化结束后，用20nm滤芯除病毒过滤；
8，除菌过滤后分装。
实施例六，
1，组分沉淀的悬浮：称取组分II+III沉淀1kg，投入19kg溶解缓冲液（10mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，PH4.15-4.25,0~4℃）中，加入0.17kg甘氨酸，均匀搅拌12小时，使沉淀充分悬浮；
2，乙醇沉淀：将以上悬浮液pH调节到5.05-5.15，按体积比11%加入95%的乙醇溶液混合，料液温度控制在1℃，搅拌2小时，使杂质蛋白从沉淀中充分沉淀，得到均匀悬浮液；
3，压滤：将以上悬浮液pH调节到5.15-5.25，在-3~1℃下压滤悬浮液，并后洗沉淀；
4，阴离子交换柱层析：粗纯IgG溶液经深层滤器加0.45um滤芯过滤后，以70-75cm/h的上柱线速度上Fractogel® EMD DMAE柱，柱子预先用平衡缓冲液(10mmol/L的醋酸-醋酸钠溶液，PH5.15-5.25）平衡，收集流穿液；上柱结束后，用平衡缓冲液冲洗柱子，将冲洗液并入流穿液；
5，超滤浓缩及调节：用30k超滤膜(0.5M2）浓缩以上流穿液至约1.5kg，然后用10.5kg注射用水进行透析，后再次浓缩至蛋白浓度6-7%(w/v)，转移并后洗超滤膜；用透析液调蛋白浓度至5.35-5.45%(w/v)；
6，低PH孵化：往上述蛋白溶液加入5%山梨醇（w/w），待山梨醇溶解并搅拌均匀后将蛋白溶液pH调节到4.10-4.20，用0.22微米的除菌滤芯过滤以上溶液，收集滤液于无菌容器中，置于室温孵化21天；
7，纳米膜除病毒过滤：孵化结束后，用20nm滤芯除病毒过滤；
8，除菌过滤后分装。
实施例七，
1，组分沉淀的悬浮：称取组分II+III沉淀1kg，投入6kg溶解缓冲液（10mmol/L的醋酸-磷酸二氢钠缓冲液，PH5.15-5.25,0~4℃）中，加入0.17kg甘氨酸，均匀搅拌12小时，使沉淀充分悬浮；
2，乙醇沉淀：将以上悬浮液pH调节到5.35-5.45，按体积比17%加入95%的乙醇溶液混合，料液温度控制在1℃，搅拌5小时，使杂质蛋白从沉淀中充分沉淀，得到均匀悬浮液；
3，压滤：将以上悬浮液pH调节到5.55-5.65，在-3~1℃下压滤悬浮液，并后洗沉淀；
4，阴离子交换柱层析：粗纯IgG溶液pH经深层滤器加0.45um滤芯过滤后，以70-75cm/h的上柱线速度上Fractogel® EMD DEAE和Fractogel® EMD TMAE串联柱，柱子预先用平衡缓冲液(10mmol/L的醋酸-磷酸氢二钠溶液，PH5.55-5.65）平衡，收集流穿液；上柱结束后，用平衡缓冲液冲洗柱子，将冲洗液并入流穿液；
5，超滤浓缩及调节：用30k超滤膜(0.5M2）浓缩以上流穿液至约1.5kg，然后用6kg注射用水进行透析，后再次浓缩至蛋白浓度6-7%(w/v)，转移并后洗超滤膜；用透析液调蛋白浓度至5.35-5.45%(w/v)；
6，低PH孵化：往上述蛋白溶液加入5%山梨醇（w/w），待山梨醇溶解并搅拌均匀后将蛋白溶液pH调节到4.10-4.20，用0.22微米的除菌滤芯过滤以上溶液，收集滤液于无菌容器中，置于室温孵化21天；
7，纳米膜除病毒过滤：孵化结束后，用20nm滤芯除病毒过滤；
8，除菌过滤后分装。

Claims (7)

1.一种利用人血浆组份II+III生产制备IVIG的方法，其特征在于，所述生产制备方法包括以下工艺步骤：
（1）组分沉淀的悬浮
将冰冻的组份II+III沉淀从冷库取出，切成碎块，然后按一定的质量投料比（组份：缓冲液），投入预先配制的悬浮缓冲液中，并按每kg组份加入0.17kg甘氨酸的比例加入甘氨酸，均匀搅拌4-18小时，使沉淀充分悬浮分散；
（2）乙醇沉淀
将步骤（1）得到的悬浮液pH调节到4.95-5.45，然后按11%-17%的体积比加入乙醇溶液，料液温度控制在-5~1℃，搅拌2-6小时，使杂质蛋白充分溶出，得到均匀的悬浮液；
（3）离心或压滤
将步骤（2）得到的悬浮液pH调节到4.95-5.65，在-5~0℃下离心或压滤；收集上清液，即为粗纯的IgG溶液；
（4）阴离子交换柱层析
将步骤（3）得到的粗纯IgG溶液经深层滤器加0.45um滤芯过滤后，上阴离子交换柱，控制上样液的线流速不高于100cm/h，柱子预先用平衡缓冲液平衡；上柱过程中，收集流穿液，上柱结束后，用平衡缓冲液冲洗柱子，将冲洗液并入流穿液中；
（5）超滤浓缩及调节
将步骤（4）得到的流穿液用截留分子量30K的超滤膜浓缩，然后用透析液恒体积透析6-10倍，然后浓缩至蛋白浓度6-7%(w/v)左右，转移出超滤膜包并用透析液后洗膜包，再用透析液调蛋白浓度至5.35-5.45%(w/v)；
（6）低PH孵化
往步骤（5）得到的蛋白溶液中加入5%的山梨醇(w/w)，并调节pH到4.10-4.20，用0.22微米的除菌滤芯过滤后置于室温孵化21天；
（7）纳米膜除病毒过滤
用20纳米的滤芯过滤步骤（6）孵化结束的蛋白溶液以去除病毒；
（8）除菌过滤并分装。
2.根据权利1所述的一种利用人血浆组份II+III生产制备IVIG的方法，其特征在于，所述步骤（1）中悬浮缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液或醋酸-磷酸二氢钠缓冲液的一种或几种，浓度为10-20mmol/L，ph值为3.95-5.25。
3.根据权利1所述的一种利用人血浆组份II+III生产制备IVIG的方法，其特征在于，所述步骤（1）中搅拌时间为4-18小时；质量投料比为1：6-1：19。
4.根据权利1所述的一种利用人血浆组份II+III生产制备IVIG的方法，其特征在于，所述步骤（2）中悬浮液pH调节到4.95-5.45；向悬浮液中加入乙醇的体积比为11%-17%；悬浮液温度为-5~1℃；搅拌时间为2-6小时。
5.根据权利1所述的一种利用人血浆组份II+III生产制备IVIG的方法，其特征在于，所述步骤（3）中悬浮液pH调节到4.95-5.65。
6.根据权利1所述的一种利用人血浆组份II+III生产制备IVIG的方法，其特征在于，所述步骤（4）中阴离子交换层析介质为Fractogel® EMD TMAE、Fractogel® EMD DEAE、Fractogel® EMD DMAE中的一种或几种；上样液的线流速为60-100cm/h。
7.根据权利1所述的一种利用人血浆组份II+III生产制备IVIG的方法，其特征在于，所述步骤（5）中恒体积透析体积倍数为6-10倍。
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