CN103251943B

CN103251943B - 一种制备b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的方法

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Publication number: CN103251943B
Application number: CN201310188248.0A
Authority: CN
Inventors: 李洪光; 伍长华; 关晓峰; 吴强; 吴畏
Original assignee: Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc
Current assignee: Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc
Priority date: 2013-05-20
Filing date: 2013-05-20
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2033-05-20
Also published as: CN103251943A

Abstract

本发明公开了一种制备b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的方法，它包括以下步骤：S1、多糖的凝胶过滤层析纯化，得大分子Hib荚膜多糖；S2、多糖-TT结合物的制备，它包括以下子步骤：S21、向大分子Hib荚膜多糖溶液中加入CNBr活化15～25分钟，再加入己二酰肼进行10～20分钟衍化反应，去掉残余CNBr，得到多糖-AH衍生物；S22、在多糖-AH衍生物溶液中加入TT溶液，混匀后置冰浴中，加入EDAC粉末；反应物经分离纯化、除菌过滤，得到成品。本发明的有益效果是：提高了合格结合物收率，降低了结合过程中的原料消耗，提高了生产工艺的稳定性和终产品质量的一致性。

Description

一种制备b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的方法

技术领域

本发明涉及疫苗制备方法技术领域，特别是一种制备b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的方法。

背景技术

流感嗜血杆菌（Haemophilus Influenza，Hi）迄今仍是导致人类侵袭性疾病的主要致病菌，其中绝大部分由b型流感嗜血杆菌（Haemophilus Influenza type b，Hib）引起。Hib脑膜炎居细菌性脑膜炎的首位，具有发病率高、病死率高和致残率高的特点；其另一个特点是发病年龄小，婴幼儿感染率高，发病年龄主要集中在5岁以下，尤其是2岁以下。全世界估计每年至少造成300万例严重疾病，其中约38.6万人死亡，已成为全球性的一大公共卫生问题。在发展中国家，Hib肺炎在儿童感染性疾病中占有重要地位，约占所有儿童肺炎的20%，是发展中国家儿童肺炎的重要死亡原因。在亚洲22个国家的48项研究中，有2/3表明Hib是儿童非结核性脑膜炎的首要致病原。

我国3～5岁儿童中Hib自然感染抗体水平低，为Hib感染高危人群。因此，我国有使用Hib疫苗的必要。接种疫苗是预防绝大多数Hib严重病例的唯一公共卫生措施。第一种Hib多糖疫苗于1985年4月在美国上市，这种疫苗适用于2～5岁的儿童。对于小于18月龄的儿童，这种采用PRP的疫苗的有效率实际为零，成为这种疫苗使用上的最大的障碍。流行病学调查表明6月龄前儿童就需要保护。

结合疫苗的研制成功解决了疫苗在婴幼儿中无效的问题。结合疫苗比以往的疫苗具有更强的免疫原性和更好的免疫效果。结合疫苗于1987年投放市场，针对18月龄以上儿童。在随后几年间，三种新的疫苗很快面市，采用了不同的蛋白作为结合蛋白。这些新疫苗在婴幼儿中非常有效。即使在小年龄婴儿中使用Hib疫苗，也是安全有效的。

在Hib结合疫苗制备的过程中，目前普遍运用的制备方法是：利用液体发酵的方法制备Hib菌液，杀菌后再经CDAP沉淀、乙醇沉淀、冷酚抽提、无水乙醇和丙酮洗涤等步骤获得精制Hib荚膜多糖，再用CNBr活化Hib荚膜多糖后连接己二酰肼，然后在碳二亚胺的催化作用下Hib荚膜多糖通过己二酰肼的桥连作用与载体蛋白结合，最后经凝胶过滤层析纯化收集高分子多糖蛋白结合物，即为多糖蛋白结合疫苗原液。

但因制备的精制Hib荚膜多糖中存在大量分子量低于700kd的小分子多糖，这部分多糖与载体蛋白结合后分子量小，经凝胶过滤层析后被分离出去了，导致结合过程中，高分子多糖蛋白结合物的收率很低，目前业内该制备方法的Hib荚膜多糖多糖收率仅4～6%。另外因制备过程中获得的精制Hib荚膜多糖的分子大小分布不均，每个批次的分子大小分布存在较大差异，导致每批多糖蛋白结合疫苗原液的理化指标各异，影响生产工艺的稳定性、成品疫苗的批间稳定性和成品疫苗质量的一致性。

凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析，是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种降低原料消耗、提高工艺稳定性、产品一致性的制备b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种制备b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的方法，它包括以下步骤：

S1、多糖的凝胶过滤层析纯化，将Hib荚膜多糖用注射用水稀释成浓度为3～6mg/ml的溶液，用孔径0.45μm的滤膜澄清过滤，滤液经Sepharose4FF凝胶层析柱层析纯化，收集KD≤0.3的层析洗脱液，收集的洗脱液再用300KD超滤膜超滤浓缩至多糖浓度≥4mg/ml，即得大分子Hib荚膜多糖；

S2、多糖-TT结合物的制备，它包括以下子步骤：

S21、将大分子Hib荚膜多糖溶液用注射用水稀释成2～4mg/ml的溶液，向该溶液中加入CNBr活化15～25分钟，加入的CNBr与多糖重量比为0.5～1:1；再加入己二酰肼进行10～20分钟衍化反应，加入的己二酰肼与多糖的重量比为3～5：1；反应物经300KD超滤膜反复用注射用水稀释、超滤浓缩，去掉残余CNBr，得到多糖-AH衍生物；

S22、在多糖-AH衍生物溶液中加入TT溶液，加入的TT溶液与多糖-AH衍生物溶液体积比为1:1，加入的TT溶液中TT浓度与步骤S21中将大分子Hib荚膜多糖溶液用注射用水稀释成的溶液中多糖浓度的浓度比为1.5～2.5:1；混匀后置冰浴中，加入EDAC粉末至溶液中EDAC终浓度为18～22mmol/L，在pH为4.7±0.2、温度为2～8℃的条件下反应1～2h；然后调节pH至7.0，在温度为2～8℃的条件下静置≥10小时；反应物经Sepharose4FF凝胶柱分离纯化，收集KD≤0.2的洗脱液段，除菌过滤，得到成品

本发明具有以下优点：

本发明提高了合格结合物收率，降低了结合过程中的原料消耗，提高了生产工艺的稳定性和终产品质量的一致性。

本发明提出了一种先进行多糖层析纯化，再利用纯化后的多糖制备结合疫苗的方法；通过凝胶过滤层析纯化Hib荚膜多糖，去掉小分子部分多糖，再进行结合反应，使结合反应更高效地进行，继而提高多糖与载体蛋白的结合率，增加了多糖的回收率，节省了生产原料，降低了生产成本。另外，纯化Hib荚膜多糖后，多糖分子大小分布的批次间差异减小，有利于提高结合工艺的稳定性，进而生产出优质、稳定的结合疫苗成品。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：

实施例1：

一种制备b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的方法，它包括以下步骤：

S1、多糖的凝胶过滤层析纯化，将Hib荚膜多糖用注射用水稀释成浓度为5mg/ml的溶液，用孔径0.45μm的滤膜澄清过滤，滤液经Sepharose4FF凝胶层析柱层析纯化，以10%柱体积上样于Sepharose4FF凝胶层析柱，以0.15M氯化钠为洗脱液洗脱，收集KD≤0.3的层析洗脱液，收集的洗脱液再用300KD超滤膜超滤浓缩至多糖浓度为6mg/ml，即得大分子Hib荚膜多糖；

按此方法共制备大分子Hib荚膜多糖，制备结果如下：

多糖用量mg	大分子多糖收获量mg	大分子多糖收率
			1000	417	41.7%

S2、多糖-TT（破伤风类毒素蛋白）结合物的制备，它包括以下子步骤：

S21、将大分子Hib荚膜多糖溶液用注射用水稀释成3mg/ml的溶液，向该溶液中加入CNBr活化20分钟，加入的CNBr与多糖重量比为1:1；再加入己二酰肼（ADH）进行15分钟衍化反应，加入的己二酰肼与多糖的重量比为4：1；反应物经300KD超滤膜反复用注射用水稀释、超滤浓缩，去掉残余CNBr，得到多糖-AH衍生物；

S22、在多糖-AH衍生物溶液中加入TT（破伤风类毒素蛋白）溶液，加入的TT溶液与多糖-AH衍生物溶液体积比为1:1，加入的TT溶液中TT浓度与步骤S21中将大分子Hib荚膜多糖溶液用注射用水稀释成的溶液中多糖浓度的浓度比为2:1；混匀后置冰浴中，加入EDAC（碳二亚胺）粉末至溶液中EDAC终浓度为20mmol/L，在pH为4.7、温度为6℃的条件下反应1.5h；然后调节pH至7.0，在温度为6℃的条件下静置12小时；反应物经Sepharose4FF凝胶柱分离纯化，以10%柱体积上样于Sepharose4FF凝胶层析柱，以0.15M氯化钠为洗脱液洗脱，收集KD≤0.2的洗脱液段，用0.2μm除菌滤膜过滤，得到成品。

取样按药典方法检测多糖含量、蛋白含量、高分子结合物含量、相对分子质量，于2～8℃保存。按此方法制备结果如下：

实施例2：

S1、多糖的凝胶过滤层析纯化，将Hib荚膜多糖用注射用水稀释成浓度为3mg/ml的溶液，用孔径0.45μm的滤膜澄清过滤，滤液经Sepharose4FF凝胶层析柱层析纯化，以8%柱体积上样于Sepharose4FF凝胶层析柱，以0.15M氯化钠为洗脱液洗脱，收集KD≤0.3的层析洗脱液，收集的洗脱液再用300KD超滤膜超滤浓缩至多糖浓度为4mg/ml，即得大分子Hib荚膜多糖；

按此方法共制备大分子Hib荚膜多糖，制备结果如下：

多糖用量mg	大分子多糖收获量mg	大分子多糖收率
			1000	355	35.5%

S21、将大分子Hib荚膜多糖溶液用注射用水稀释成2mg/ml的溶液，向该溶液中加入CNBr活化15分钟，加入的CNBr与多糖重量比为0.8:1；再加入己二酰肼（ADH）进行10分钟衍化反应，加入的己二酰肼与多糖的重量比为3：1；反应物经300KD超滤膜反复用注射用水稀释、超滤浓缩，去掉残余CNBr，得到多糖-AH衍生物；

S22、在多糖-AH衍生物溶液中加入TT（破伤风类毒素蛋白）溶液，加入的TT溶液与多糖-AH衍生物溶液体积比为1:1，加入的TT溶液中TT浓度与步骤S21中将大分子Hib荚膜多糖溶液用注射用水稀释成的溶液中多糖浓度的浓度比为2.5:1；混匀后置冰浴中，加入EDAC（碳二亚胺）粉末至溶液中EDAC终浓度为18mmol/L，在pH为4.5、温度为2℃的条件下反应2h；然后调节pH至7.0，在温度为2℃的条件下静置15小时；反应物经Sepharose4FF凝胶柱分离纯化，以8%柱体积上样于Sepharose4FF凝胶层析柱，以0.15M氯化钠为洗脱液洗脱，收集KD≤0.2的洗脱液段，用0.2μm除菌滤膜过滤，得到成品。

实施例3：

S1、多糖的凝胶过滤层析纯化，将Hib荚膜多糖用注射用水稀释成浓度为6mg/ml的溶液，用孔径0.45μm的滤膜澄清过滤，滤液经Sepharose4FF凝胶层析柱层析纯化，以5%柱体积上样于Sepharose4FF凝胶层析柱，以0.15M氯化钠为洗脱液洗脱，收集KD≤0.3的层析洗脱液，收集的洗脱液再用300KD超滤膜超滤浓缩至多糖浓度5mg/ml，即得大分子Hib荚膜多糖；

按此方法共制备大分子Hib荚膜多糖，制备结果如下：

多糖用量mg	大分子多糖收获量mg	大分子多糖收率
			1000	348	34.8%

S21、将大分子Hib荚膜多糖溶液用注射用水稀释成4mg/ml的溶液，向该溶液中加入CNBr活化25分钟，加入的CNBr与多糖重量比为0.5:1；再加入己二酰肼（ADH）进行20分钟衍化反应，加入的己二酰肼与多糖的重量比为5：1；反应物经300KD超滤膜反复用注射用水稀释、超滤浓缩，去掉残余CNBr，得到多糖-AH衍生物；

S22、在多糖-AH衍生物溶液中加入TT（破伤风类毒素蛋白）溶液，加入的TT溶液与多糖-AH衍生物溶液体积比为1:1，加入的TT溶液中TT浓度与步骤S21中将大分子Hib荚膜多糖溶液用注射用水稀释成的溶液中多糖浓度的浓度比为1.5:1；混匀后置冰浴中，加入EDAC（碳二亚胺）粉末至溶液中EDAC终浓度为22mmol/L，在pH为4.9、温度为8℃的条件下反应1h；然后调节pH至7.0，在温度为8℃的条件下静置10小时；反应物经Sepharose4FF凝胶柱分离纯化，以5%柱体积上样于Sepharose4FF凝胶层析柱，以洗脱液洗脱，收集KD≤0.2的洗脱液段，用0.2μm除菌滤膜过滤，得到成品。

综合上述实施例的制备结果如下：

另按同样的方法使用未经层析纯化的Hib荚膜多糖进行结合反应，制备结合疫苗原液，各项制备如下：

采用本发明制备的结合疫苗原液均符合药典要求，通过本方法得到的合格结合疫苗原液的多糖回收率在20%以上，与传统结合方法4～6%的收率对比，多糖收率有很大的提高，单只成品疫苗的原料消耗大大降低，批量生产的结合产物各项质量指标接近，工艺重复性好。

通过Sepharose4FF凝胶层析柱层析纯化Hib荚膜多糖，去掉小分子部分多糖后，能使结合反应收率大大提高，节省了生产原料。并且得到的多批结合物各项指标稳定，生产工艺稳定高，有利于大规模生产。

Claims

1.一种降低原料消耗、提高工艺稳定性、产品一致性的制备b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的方法，其特征在于：它包括以下步骤：

S1、多糖的凝胶过滤层析纯化，将Hib荚膜多糖用注射用水稀释成浓度为3～6 mg /ml的溶液，用孔径0.45μm的滤膜澄清过滤，滤液经Sepharose 4FF凝胶层析柱层析纯化，收集KD≤0.3的层析洗脱液，收集的洗脱液再用300KD超滤膜超滤浓缩至多糖浓度≥4mg/ml，即得大分子Hib荚膜多糖；

S2、多糖-TT结合物的制备，它包括以下子步骤：

S21、将大分子Hib荚膜多糖溶液用注射用水稀释成2～4mg/ml 的溶液，向该溶液中加入CNBr 活化15～25分钟，加入的CNBr与多糖重量比为0.5～1:1；再加入己二酰肼进行10～20分钟衍化反应，加入的己二酰肼与多糖的重量比为3～5：1；反应物经300KD超滤膜反复用注射用水稀释、超滤浓缩，去掉残余CNBr，得到多糖-AH衍生物；

S22、在多糖-AH衍生物溶液中加入TT溶液，加入的TT溶液与多糖-AH 衍生物溶液体积比为1:1，加入的TT溶液中TT浓度与步骤S21中将大分子Hib荚膜多糖溶液用注射用水稀释成的溶液中多糖浓度的浓度比为1.5～2.5:1；混匀后置冰浴中，加入EDAC粉末至溶液中EDAC终浓度为18～22 mmol /L，在pH为4. 7±0. 2、温度为2～8℃的条件下反应1～2h；然后调节pH至7.0，在温度为2～8℃的条件下静置≥10小时；反应物经Sepharose 4FF凝胶柱分离纯化，收集KD≤0.2的洗脱液段，除菌过滤，得到成品。