CN105031642A - 一种a群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗及其制备方法，结合疫苗包括A群流脑荚膜多糖与破伤风类毒素蛋白的偶联物，其制备方法包括；A群流脑荚膜多糖的稀释、活化、与癸二酸二酰肼偶联到A群流脑多糖-癸二酸二酰肼衍生物；再将A群流脑多糖-癸二酸二酰肼衍生物与破伤风类毒素溶液在碳二亚胺的催化反应得到A群流脑荚膜多糖与载体蛋白的偶联物。本发明将癸二酸二酰肼作为A群流脑结合疫苗制备的过程中的偶联剂，癸二酸二酰肼相比己二酰肼在碳链上多2个亚甲基，分子链更长，更能克服生物大分子相互间的空间位阻，提高结合收率。

Description

一种A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及一种A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗及其制备方法。
背景技术
脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis，Nm)是脑膜炎和爆发性败血症的首要致病菌，流行性脑脊髓膜炎(以下简称为流脑)的发病常呈散发性，各病例之间并无明显关联，通常以小规模方式爆发，在一些地区可转变为灾难性的、难以预料的地方性流行病。全球每年流脑发病人数约为50万，死亡5万。Nm为需氧菌，革兰染色阴性，有荚膜，一般成对出现(双球菌)。Nm根据荚膜多糖的化学组成可将其分成l3个血清群，根据外膜蛋白(Outermem—braneprotein，OMP)PorB和P0rA的抗原性差异，又可分成不同的血清型和血清亚型。A、B、C、Y和W135群脑膜炎球菌是主要的致病血清群，且血清群分布有显著的地理差异。在我国90%以上的流脑病例是由A群脑膜炎奈瑟氏菌引起的。
研究表明，A群脑膜炎球菌的荚膜多糖疫苗适用于2岁以上的儿童和成人。对于小于18月龄的儿童，这种采用PRP的疫苗的有效率极低。
A群流脑结合疫苗的研制成功解决了疫苗在婴幼儿中无效的问题。结合疫苗比以往的多糖疫苗具有更强的免疫原性和更好的免疫效果，在婴幼儿中非常有效，即使在小年龄婴儿中使用A群流脑结合疫苗，也是安全有效的。
在A群流脑结合疫苗制备的过程中，目前普遍运用的制备方法是：利用液体发酵的方法制备A群流脑菌液，杀菌后再经CDAP沉淀、乙醇沉淀、冷酚抽提、无水乙醇和丙酮洗涤等步骤获得精制A群流脑荚膜多糖，再用CNBr活化Hib荚膜多糖后连接己二酰肼，然后在碳二亚胺的催化作用下A群流脑荚膜多糖通过己二酰肼的桥连作用与破伤风类毒素蛋白结合，最后经凝胶过滤层析纯化收集高分子多糖蛋白结合物，即为多糖蛋白结合疫苗原液。
目前，A群流脑结合疫苗制备的过程中，A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗的结合多糖收率低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗，以克服现有A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗的结合多糖收率低的问题。
此外，本发明还提供一种A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗的制备方法。
本发明解决上述问题所采用的技术方案是：一种A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗，包括A群流脑荚膜多糖与载体蛋白的偶联物。
进一步地，所述载体蛋白为破伤风类毒素蛋白。
一种A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗的制备方法，包括以下步骤：
B1：将A群流脑荚膜多糖用注射用水稀释成8mg/ml的溶液,恒温至20℃，调节pH至10.50；
B2：加入与B1所述多糖等质量的溴化氰进行活化处理，维持pH10.5活化20分钟，调节pH至8.5；
B3：加入与B1所述多糖溶液等体积、等浓度的癸二酸二酰肼溶液进行偶联反应，维持pH8.5反应15分钟；
B4：将B3所得的反应物多次稀释-超滤浓缩，去掉残余溴化氰，得到A群流脑多糖-癸二酸二酰肼衍生物；
B5：在B4所得的A群流脑多糖-癸二酸二酰肼衍生物中加入与与B1所述多糖等质量的破伤风类毒素蛋白溶液，再用注射用水稀释，使多糖终浓度为3mg/ml；
B6：将B5所得溶液混匀后置冰浴中，加入碳二亚胺粉末至终浓度为30mmol／L，维持pH5.5，于2～8℃反应60分钟，调PH至7.0置2～8℃静置10小时；
B7：将B6所得的反应物经Sepharose4FF凝胶柱分离纯化，收集V0附近的洗脱液，将收集到的洗脱液除菌过滤，得到A群流脑荚膜多糖与载体蛋白的偶联物。
在荚膜多糖与破伤风类毒素蛋白结合过程中，桥连剂是非常重要的，通过桥连作用可以克服荚膜多糖与破伤风类毒素蛋白的空间位阻，使多糖更容易与破伤风类毒素蛋白通过共价键连接在一起。现有的结合疫苗使用的桥连剂是己二酰肼，己二酰肼分子两端各具有一个酰肼基，容易与活化后的多糖（或破伤风类毒素）生成酰胺键，共价连接在一起，目前，A群流脑结合疫苗制备的过程中，己二酰肼连接到荚膜多糖上的效率很低，需要过量添加，而制得的荚膜多糖-己二酰肼衍生物与破伤风类毒素蛋白结合的效率也不高，造成一定的资源浪费，导致A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗的结合多糖收率低，本发明将传统使用的偶联剂己二酰肼替换成癸二酸二酰肼，癸二酸二酰肼是一种结构与己二酰肼相似的小分子化合物，区别在于碳链上多2个亚甲基，分子链更长，用作结合疫苗连接剂，更能克服生物大分子相互间的空间位阻，提高结合收率。
综上，本发明的有益效果是：
本发明将癸二酸二酰肼作为A群流脑结合疫苗制备的过程中的偶联剂，癸二酸二酰肼相比己二酰肼在碳链上多2个亚甲基，分子链更长，更能克服生物大分子相互间的空间位阻，提高结合收率。
具体实施方式
下面结合实施例，对发明作进一步地的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例：
一种A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗，包括A群流脑荚膜多糖与破伤风类毒素蛋白的偶联物。
一种A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗的制备方法，包括以下步骤：
B1：将A群流脑荚膜多糖用注射用水稀释成8mg/ml的溶液,恒温至20℃，调节pH至10.50；
B2：加入与B1所述多糖等质量的溴化氰进行活化处理，维持pH10.5活化20分钟，调节pH至8.5；
B3：加入与B1所述多糖溶液等体积、等浓度的癸二酸二酰肼溶液进行偶联反应，维持pH8.5反应15分钟；
B4：将B3所得的反应物多次稀释-超滤浓缩，去掉残余溴化氰，得到A群流脑多糖-癸二酸二酰肼衍生物；
B5：在B4所得的A群流脑多糖-癸二酸二酰肼衍生物中加入与与B1所述多糖等质量的破伤风类毒素蛋白溶液，再用注射用水稀释，使多糖终浓度为3mg/ml；
B6：将B5所得溶液混匀后置冰浴中，加入碳二亚胺粉末至终浓度为30mmol／L，维持pH5.5，于8℃反应60分钟，调PH至7.0置8℃静置10小时；
B7：将B6所得的反应物经Sepharose4FF凝胶柱分离纯化，收集V0附近的洗脱液，将收集到的洗脱液除菌过滤，得到A群流脑荚膜多糖与载体蛋白的偶联物。
对得到的A群流脑荚膜多糖与载体蛋白的偶联物取样按药典方法检测多糖含量、蛋白含量、游离多糖、相对分子质量，于8℃保存，共制备3批，结果如表1所示：
表1
另按同样的方法使用己二酰肼作为偶联剂，进行结合反应，制备结合疫苗原液即A群流脑荚膜多糖与载体蛋白的偶联物，各项指标如表2所示：
表2
本发明制备A群流脑荚膜多糖结合物的多糖收率在30%以上，与传统结合方法15～20%的收率对比，多糖收率有很大的提高，节省了生产原料，使单剂成品疫苗的人力、原料、能源成本得到很大程度的降低。
如上所述，可较好的实现本发明。

Claims (3)

1.一种A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗，其特征在于，包括A群流脑荚膜多糖与载体蛋白的偶联物。
2.根据权利要求1所述的一种A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗，其特征在于，所述载体蛋白为破伤风类毒素蛋白。
3.一种如权利要求2所述的A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
B1：将A群流脑荚膜多糖用注射用水稀释成8mg/ml的溶液,恒温至20℃，调节pH至10.50；
B2：加入与B1所述多糖等质量的溴化氰进行活化处理，维持pH10.5活化20分钟，调节pH至8.5；
B3：加入与B1所述多糖溶液等体积、等浓度的癸二酸二酰肼溶液进行偶联反应，维持pH8.5反应15分钟；
B4：将B3所得的反应物多次稀释-超滤浓缩，去掉残余溴化氰，得到A群流脑多糖-癸二酸二酰肼衍生物；
B5：在B4所得的A群流脑多糖-癸二酸二酰肼衍生物中加入与与B1所述多糖等质量的破伤风类毒素蛋白溶液，再用注射用水稀释，使多糖终浓度为3mg/ml；
B6：将B5所得溶液混匀后置冰浴中，加入碳二亚胺粉末至终浓度为30mmol／L，维持pH5.5，于2～8℃反应60分钟，调PH至7.0置2～8℃静置10小时；
B7：将B6所得的反应物经Sepharose4FF凝胶柱分离纯化，收集V0附近的洗脱液，将收集到的洗脱液除菌过滤，得到A群流脑荚膜多糖与载体蛋白的偶联物。
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