CN108865983A - 一种细胞外泌体的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞外泌体的提取方法，包括以下步骤：（1）上清液分离：将细胞培养后的培养基，离心去除杂质，分离出培养上清液；（2）一次提取：将步骤（1）所述培养上清液与外泌体提取液混合后进行孵育，孵育后得第一孵化液，对第一孵化液进行离心浓缩，得到含外泌体的浓缩液；（3）二次提取：将步骤（2）所述含外泌体的浓缩液加入无菌PBS溶解后加入外泌体提取液进行孵育，孵育后得第二孵化液，将第二孵化液进行离心收集底部沉淀，得细胞外泌体。本发明有效地提高细胞外泌体的纯度，降低其杂蛋白含量。

Description

一种细胞外泌体的提取方法
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种细胞外泌体的提取方法。
背景技术
细胞外泌体是由细胞内多泡体与细胞膜融合后释放到细胞外隙或生物学体液中的膜性囊泡，包含有蛋白质、mRNA 、miRNA和DNA片段等生物活性物质,参与人体许多重要的生理或病例过程，在细胞通讯、细胞迁移、促进组织修复或调节免疫反应等作用，具有广阔的应用前景，获得高纯度的细胞外泌体一直是展开应用研究的前提。
由于外泌体为纳米级囊泡结构，现有技术大部分采用外泌体提取试剂盒对其进行脱水处理后，高速离心得到。
上述方法提取出的细胞外泌体杂蛋白含量特别高，纯度很不纯，对细胞外泌体的后续应用及研究造成很大影响，所以有必要对现有的细胞外泌体提取方法进行改进，以解决细胞外泌体纯度低的问题。
发明内容
本发明针对以现有技术制备的细胞外泌体纯度不高的问题，提供了间充质干细胞外泌体的制备方法。
细胞外泌体的提取方法，其不同之处在于，所述细胞外泌体通过以下步骤制备：
步骤（1）上清液分离，将细胞培养后的培养基，离心去除杂质，分离出培养上清液；
步骤（2）一次提取，将步骤（1）所述培养上清液与外泌体提取液混合后进行孵育，孵育后得第一孵化液，对第一孵化液进行离心浓缩，得到含外泌体的浓缩液；
步骤（3）二次提取，将步骤（2）所述含外泌体的浓缩液加入无菌PBS溶解后加入外泌体提取液进行孵育，孵育后得第二孵化液，将第二孵化液进行离心收集底部沉淀，得细胞外泌体。
上述技术方案中，所述细胞为间充质干细胞。
上述技术方案中，所述细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或外周血间充质干细胞中的一种。
上述技术方案中，所述步骤（1）由以下步骤制备：
步骤1A:将间充质干细胞进行传代培养，从中筛选出细胞状态良好、增殖能力强的间充质干细胞；
步骤1B: 将不含外泌体血清的干细胞ɑ-MEM空白培养基加入步骤1A所述筛选的间充质干细胞中,24小时至48小时后收取细胞培养上清液即为条件培养基；
步骤1C：将步骤1B中所述条件培养基在4℃，2000g条件下离心30min，弃去沉淀杂质，收集上层液体，即培养上清液。
上述技术方案中，所述细胞外泌体制备步骤（2）通过以下步骤完成：
步骤2A：将步骤1C中所述培养上清液与Total exosome Isolation外泌体提取液以体积比为2:1进行混合后，在4℃条件下孵育8小时至12小时，孵育后得到第一孵育液；
步骤2B：将步骤2A所得孵育液在4℃，10000g条件下离心60min,所得肉眼不可见的底部沉淀，即为含外泌体的浓缩液。
上述技术方案中，所述细胞外泌体制备步骤（3）通过以下步骤完成：
步骤3A：将步骤2B中所述含外泌体的浓缩液用磷酸缓冲盐溶液（PBS）进行溶解，得到外泌体盐溶液；
步骤3B:在步骤3A所述外泌体盐溶液中加入Total exosome Isolation外泌体提取液，在1℃至4℃条件下孵育,所述外泌体盐溶液与Total exosome Isolation外泌体提取液的体积比为（1~3）:1，孵育后得到第二孵育液；
步骤3C：将步骤3B中所述第二孵育液在4℃，10000g条件下离心60min，所得下层肉眼不可见的沉淀即为细胞外泌体。
上述技术方案中，步骤3B中所述外泌体盐溶液加入所述外泌体盐溶液加入所述Total exosome Isolation外泌体提取液后在4℃条件下孵育1小时至12小时，所述外泌体盐溶液与Total exosome Isolation外泌体提取液的体积比为2:1。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于利用本发明所用提取方式可以适用于现有的细胞外泌体提取，所得到的细胞外泌体杂蛋白含量下降，纯度提高，有利于间充质干细胞外泌体的后续应用及实验。
附图说明
图1为细胞外泌体的电镜检测图；
图2为流式检测图；
图3为细胞外泌体的高分辨率显微成像；
图4为细胞外泌体SDS-PAGE凝胶电泳图；
图5为细胞外泌体BCA蛋白浓度定量测定曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
细胞外泌体的提取方法，其包括以下步骤制备：
步骤（1）：上清液分离，将细胞培养后的培养基，离心去除杂质，分离出培养上清液；
步骤（2）：一次提取，将步骤（1）所述培养上清液与外泌体提取液混合后进行孵育，孵育后得第一孵化液，对第一孵化液进行离心浓缩，得到含外泌体的浓缩液；
步骤（3）：二次提取，将步骤（2）所述含外泌体的浓缩液加入无菌PBS溶解后加入外泌体提取液进行孵育，孵育后得第二孵化液，将第二孵化液进行离心收集底部沉淀，得细胞外泌体。
优选地，所述细胞为间充质干细胞。
优选地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或外周血间充质干细胞中的一种。
优选地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
优选地，所述步骤（1）由以下步骤制备：
步骤1A:将间充质干细胞进行传代培养，从中筛选出细胞状态良好、增殖能力强的间充质干细胞；
步骤1B: 将不含外泌体血清的Hylone公司的干细胞ɑ-MEM空白培养基加入步骤1A所述筛选的间充质干细胞中,24小时至48小时后收取细胞培养上清液即为条件培养基；
步骤1C：将步骤1B中所述条件培养基在4℃，2000g条件下离心30min，弃去沉淀杂质，收集上层液体，即培养上清液。
上述技术方案中，所述细胞外泌体制备步骤（2）通过以下步骤完成：
2A：将步骤1C中所述培养上清液与invitogen公司Total exosome Isolation外泌体提取液以体积比为2:1进行混合后，在4℃条件下孵育8小时至12小时，孵育后得到第一孵育液；
2B：将步骤2A所得孵育液在4℃，10000g条件下离心60min,所得肉眼不可见的底部沉淀，即为含外泌体的浓缩液。
优选地，所述细胞外泌体制备步骤（3）通过以下步骤完成：
3A：将步骤2B中所述含外泌体的浓缩液用磷酸缓冲盐溶液（PBS）进行溶解，得到外泌体盐溶液；
3B:在步骤3A所述外泌体盐溶液中加入invitogen公司Total exosome Isolation外泌体提取液，在1℃至4℃条件下孵育,所述外泌体盐溶液与Total exosome Isolation外泌体提取液的体积比为（1~3）:1，孵育后得到第二孵育液；
3C：将步骤3B中所述第二孵育液在4℃，10000g条件下离心60min，所得下层肉眼不可见的沉淀即为细胞外泌体。
优选地，步骤3B中所述外泌体盐溶液加入所述外泌体盐溶液加入所述Totalexosome Isolation外泌体提取液后在4℃条件下孵育1小时至12小时，所述外泌体盐溶液与Total exosome Isolation外泌体提取液的体积比为2:1。
细胞外泌体的鉴定：
（1）细胞外泌体的电镜检测：
图1为细胞外泌体的电镜检测图。
（2）细胞外泌体的流式检测：
将收集的外泌体用200ulpbs溶解后；
加入20ulCD83,5ulCD61,避光孵育半小时，上机检测；
图2为流式细胞仪检测间充质干细胞的特异性标志物CD63、CD81的检测图，结果外泌体特异性标志物CD63、CD81均阳性高表达。
（3）细胞外泌体的高分辨率共聚焦成像：
用PBS溶液将外泌体稀释20倍;
分别加1 ul（抗cd - 63和抗cd - 69)，稀释20倍取100 ul混合物在涂有Poly-L-Lysine的盖玻片，室温孵育1.5 小时，PBS洗3次；
添加二抗抗兔Alexa 647和抗鼠 Alexa 750，稀释1000；
室温孵育1.5小时，用0.1mol/L的 Dil脂膜染料染色5分钟；
用PBS洗3次；
图3为细胞外泌体的高分辨率显微成像，结果外泌体特异性标志物CD63、CD81均阳性高表达，证明了分离纯化的样品为外泌体。
（4）SDS-PAGE凝胶电泳
分别对步骤一次提取的细胞外泌体浓缩液与步骤二次提取的细胞外泌体进行SDS-PAGE凝胶电泳测试；
a:样品处理:
①根据样品浓度确定上样量；
②在蛋白样品中加入5×蛋白上样缓冲液使其终浓度为1×，沸水浴5min。
b:灌胶与上样:
① 将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
② 配制分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶；大约45min后可倒去胶上层水并用吸水纸将剩余水吸干。
③配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶；将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
④加入1×电泳缓冲液，将样品加入点样孔中，并加入20μl低分子量蛋白Marker作对照。
c:电泳：按浓缩胶80V、分离胶120V进行恒压电泳，至溴酚蓝刚出胶（约需2-3h）。
d:染色：将胶从玻璃板中取出，置于考马斯亮蓝染色液中染色，室温4-6h。
e:脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰。
f:凝胶摄像和保存：将脱色好的凝胶摄像，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。
图4为SDS-PAGE凝胶电泳测试图，结果表明，经过二次提取的细胞外泌体较与一次提取的细胞外泌体，其纯度明显提高。
（5）BCA蛋白浓度定量测定
分别对步骤一次提取的细胞外泌体浓缩液与步骤二次提取的间充质干细胞外泌体进行BCA蛋白浓度定量测定；
a:根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。
b:将蛋白标准品加纯化水稀释，终浓度分别为0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8,1.0, 1.2ug/ul；加20ul到96孔板的标准品孔中,用于制备标准曲线。
c:加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μl。
d:各孔加入200μl BCA工作液,37℃放置20-30分钟。
e:测定562nm波长的OD值。
f:根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
图5为 BCA蛋白浓度定量测定曲线，结果显示经过一次提取的细胞外泌体蛋白含量为10 ug/ml -20ug/ml；经过二次次提取的外泌体蛋白含量为2 ug/ml -4ug/ml；经过二次抽提细胞外泌体，其杂蛋白含量明显减少。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种细胞外泌体的提取方法，其特征在于，所述细胞外泌体通过以下步骤提取：
步骤（1）：上清液分离，将细胞培养后的培养基，离心去除杂质，分离出培养上清液；
步骤（2）：一次提取，将步骤（1）所述培养上清液与外泌体提取液混合后进行孵育，孵育后得第一孵化液，对第一孵化液进行离心浓缩，得到含外泌体的浓缩液；
步骤（3）：二次提取，将步骤（2）所述含外泌体的浓缩液加入无菌PBS溶解后加入外泌体提取液进行孵育，孵育后得第二孵化液，将第二孵化液进行离心收集底部沉淀，得细胞外泌体。
2.根据权利要求1所述一种细胞外泌体的提取方法，其特征在于，所述细胞为间充质干细胞。
3.根据权利要求2所述一种细胞外泌体的提取方法，其特征在于，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或外周血间充质干细胞中的一种。
4.根据权利要求1至3任一项所述细胞外泌体的提取方法，其特征在于，所述步骤（1）由以下步骤制备：
步骤1A:将间充质干细胞进行传代培养，从中筛选出细胞状态良好、增殖能力强的间充质干细胞；
步骤1B: 将不含外泌体血清的干细胞ɑ-MEM空白培养基加入步骤1A中所述筛选的间充质干细胞中,24小时至48小时后收取细胞培养上清液即为条件培养基；
步骤1C：将步骤1B中所述条件培养基在4℃，2000g条件下离心30min，弃去沉淀杂质，收集上层液体，即培养上清液。
5.根据权利要求4所述一种细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述细胞外泌体制备步骤（2）通过以下步骤完成：
步骤2A：将步骤1B中所述培养上清液与Total exosome Isolation外泌体提取液以体积比为2:1进行混合后，在4℃条件下孵育8小时至12小时，孵育后得到第一孵育液；
步骤2B：将步骤2A所得孵育液在4℃，10000g条件下离心60min,所得肉眼不可见的底部沉淀，即为含外泌体的浓缩液。
6.根据权利要求5所述一种细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述细胞外泌体制备步骤（3）通过以下步骤完成：
步骤3A：将步骤2B中所述含外泌体的浓缩液用磷酸缓冲盐溶液（PBS）进行溶解，得到外泌体盐溶液；
步骤3B:在步骤3A所述外泌体盐溶液中加入Total exosome Isolation外泌体提取液，在1℃至4℃条件下孵育,所述外泌体盐溶液与Total exosome Isolation外泌体提取液的体积比为（1~3）:1，孵育后得到第二孵育液；
步骤3C：将步骤3B中所述第二孵育液在4℃，10000g条件下离心60min，所得下层肉眼不可见的沉淀即为细胞外泌体。
7.根据权利要求6 所述一种细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤3B中所述外泌体盐溶液加入所述外泌体盐溶液加入所述Total exosome Isolation外泌体提取液后在4℃条件下孵育1小时至12小时，所述外泌体盐溶液与Total exosome Isolation外泌体提取液的体积比为2:1。
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