CN112961831A

CN112961831A - 一种肠源外泌体的制备方法

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Publication number: CN112961831A
Application number: CN202110217118.XA
Authority: CN
Inventors: 刘袆帆; 梁嘉熹; 马路凯; 钟玉鸣; 王琴
Original assignee: Zhongkai University of Agriculture and Engineering
Current assignee: Zhongkai University of Agriculture and Engineering
Priority date: 2021-02-26
Filing date: 2021-02-26
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2041-02-26
Also published as: CN112961831B

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肠源外泌体的制备方法。本发明提供的肠源外泌体的制备方法包括：培养Caco‑2细胞、脂多糖刺激、加药、超速离心、收集外泌体等步骤。本发明提供的肠源外泌体的制备方法具有材料来源易得，成本低廉，操作简单，提取工艺环节简便的优点，该制备方法还可以增加外泌体的浓度，提高产率。同时，采用本发明的肠源外泌体的制备方法制得的肠源外泌体对缓解肠道炎症具有很好的效果。

Description

一种肠源外泌体的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肠源外泌体的制备方法。

背景技术

外泌体(Exosomes,Ex)是由各种细胞分泌的微小囊泡，其可以由体内或体外培养的细胞分泌，同时也存在于精液、尿液、腹水、乳汁、血清等人体体液中。外泌体具有独立且完整的磷脂双分子层结构，其含有蛋白质、microRNA等物质而被认为是潜在的新兴的临床诊疗的生物标志物，可以揭示来源细胞的生理信息, 为临床诊断提供新方法。因此，越来越多的高浓度、高纯度的外泌体分离方法或提取方法的研究和报道出现。

专利文献CN108865983A公开了一种细胞外泌体的提取方法，其包括以下步骤：(1)上清液分离：将细胞培养后的培养基，离心去除杂质，分离出培养上清液；(2)一次提取：将步骤(1)所述培养上清液与外泌体提取液混合后进行孵育，孵育后得第一孵化液，对第一孵化液进行离心浓缩，得到含外泌体的浓缩液；(3)二次提取：将步骤(2)所述含外泌体的浓缩液加入无菌PBS溶解后加入外泌体提取液进行孵育，孵育后得第二孵化液，将第二孵化液进行离心收集底部沉淀，得细胞外泌体。该提取方法可以有效地提高细胞外泌体的纯度，降低其杂蛋白含量。

专利文献CN108918228A公开了一种血清或血浆中的外泌体制备试剂盒及外泌体制备方法，所述试剂盒包括外泌体提取试剂，所述外泌体提取试剂为亲水聚合物或亲水聚合物的溶液；所述亲水聚合物包括PEG、硫酸葡聚糖、PVP中的一种或几种的组合，利用该试剂盒得到的外泌体粒径分布更集中，使得外泌体的杂质更少，纯度更高。

专利文献CN109554341A公开了一种采用无创超声处理细胞，通过对细胞进行一定的刺激，调控细胞外泌体中的microRNA的表达丰度，和/或潜在的提高脑源神经营养因子的表达，和/或促进有害蛋白从脑内清除，和/或减轻有害物质对脑组织的氧化损伤。该方法可以在短时间内即可得到目标外泌体，而且可以实现多种microRNA表达丰度的同时提升，可以得到更多microRNA表达改变的外泌体。

专利文献CN110343664A公开了一种从人体体液或者细胞的培养液中提取外泌体及外泌体蛋白的方法。该方法包括：向含有外泌体的待提取液中加入提取材料提取得到外泌体；提取材料为金属氧化物或修饰有所述金属氧化物的功能材料；金属氧化物能与磷酸根离子发生双配位作用；所述待提取液为来源于人体的体液、所述体液的稀释液或细胞的培养产物。该提取方法可以实现对人体体液或细胞的培养液中外泌体的高效提取，提取时间短，获得的外泌体纯度高，可以通过洗脱液洗脱获得完整的外泌体。

专利文献CN112322584A公开了一种简便的外泌体提取方法，包括以下步骤：(1)收集外泌体细胞上清液；(2)通过离心去除上清液中的细胞碎片；(3)将去除细胞碎片的上清液转移到超滤管中，使用超滤管富集外泌体；(4)使用PBS对超滤管中富集的外泌体进行洗涤；(5)对洗涤后的外泌体进行盐析，得到相对纯化的外泌体；(6)测定纯化后外泌体的浓度。该方法利用滤过膜截流外泌体，再通过盐析析出大分子量蛋白，解决了外泌体提取困难的问题，提高了外泌体的提取质量和提取效率。

然而，目前的外泌体制备方法一般是基于外泌体独特的密度、尺寸等物理学参数实现提取，缺乏特异性，无法满足特定样品特异性外泌体的提取和分析要求，从而妨碍了外泌体后续研究分析的进程。肠道是维持人体正常生理活动的重要器官之一，参与机体物质代谢、防御屏障、细胞体液免疫、分泌活性物质等重要功能，一旦出现炎症将严重影响人体健康，因此，研究和开发出新的有效的治疗肠道炎症的方法具有重大的意义。

发明内容

为解决现有技术中的不足，本发明提供一种肠源外泌体的制备方法，制备得到的外泌体对肠道炎症具有较好的缓解效果。

本发明提供了一种肠源外泌体的制备方法，包括以下步骤：

S1接种密度为1×10⁵个/孔的Caco-2细胞于DMEM培养基中培养20～22天；

S2将脂多糖溶于DMEM培养基中，接着加入步骤S1培养的Caco-2细胞中培养1～2h，得肠炎模型细胞；

S3将铁皮石斛葡甘聚糖溶于DMEM培养基中，接着加入步骤S2得到的肠炎模型细胞进行培养，收集细胞上清，离心除细胞沉淀，得上清液；

S4将步骤S3得到的上清液进行超速离心，取沉淀，即得。

进一步地，所述步骤S1、步骤S2和步骤S3中的DMEM培养基为高糖型 DMEM培养基，所述高糖型DMEM培养基还含有10％热灭活后的胎牛血清，100 U/mL链霉素和100U/mL青霉素。

进一步地，所述步骤S1中Caco-2细胞的培养步骤为：将接种后的Caco-2 细胞放入5％CO₂、温度为37℃、饱和湿度的条件下进行培养，待Caco-2细胞生长至80-90％后，接种至transwell板基底上端，每1～2天换液一次。

进一步地，所述步骤S2中DMEM培养基中脂多糖的浓度为1μg/mL。

进一步地，所述步骤S3中DMEM培养基中铁皮石斛葡甘聚糖的浓度为 0.5mg/mL。

进一步地，所述步骤S3中的离心条件为：在900～1100g条件下离心1～2min。

进一步地，所述步骤S4中的超速离心条件为：在11000～12000g的条件下超速离心12h。

此外，本发明还提供了所述的肠源外泌体的制备方法制得的外泌体在制备治疗肠道炎症药物中的用途。

所述脂多糖(LPS)为市售产品，品牌为SIGMA-ALDRICH，Sigma-Aldrich 脂多糖源于大肠杆菌055:B5。所述铁皮石斛葡甘聚糖(DOP)是委托Solarbio公司 (Beijing,China).制备得到，UV纯度≥85％。

铁皮石斛是兰科草本植物，作为药食同源植物已被我国认可。铁皮石斛多糖是从铁皮石斛茎中分离出的一种最主要的活性成分。研究证明铁皮石斛多糖 (DOP)具有广泛的药理活性，包括免疫调控、抗肿瘤、抗氧化、抗炎等。外泌体在肠上皮细胞(IECs)与巨噬细胞的调控起着重要作用。

本发明人首次提出将DOP结合外泌体用于肠道炎症的治疗的想法，在实践的过程中需解决：(1)肠道缺乏消化多糖的酶，不易被吸收利用的多糖难以直接调控机体内环境；(2)DOP在肠道内被微生物利用之前通过肠上皮细胞间接调控巨噬细胞减缓肠道炎症机制仍未被阐释；(3)DOP是否通过IECs间接参与减轻肠固有层炎症细胞的浸润，至今尚未明确，等等重大问题。经过大量的摸索试验，本发明首次提供了肠源外泌体的制备方法以解决上述问题。本发明阐明了采用本发明提供的肠源外泌体的制备方法制得的肠源外泌体对巨噬细胞的影响，并阐明了DOP缓解肠道炎症的新机制，为肠道炎症提供一种新的治疗方法。

而且，与现有技术相比，本发明提供的肠源外泌体的制备方法具有材料来源易得，成本低廉，操作简单，提取工艺环节简便的优点，该制备方法还可以增加外泌体的浓度，提高产率。同时，采用本发明的肠源外泌体的制备方法制得的肠源外泌体对缓解肠道炎症具有很好的效果。

附图说明：

图1为铁皮石斛葡甘聚糖对Caco-2细胞的存活率图；

图2为本发明制得的肠源外泌体(DOP外泌体)的电镜图，粒径大小和外泌体标志蛋白表达量图；

图3为ELISA检测细胞因子IL-6和TNF-α在外泌体中与RAW264.7巨噬细胞共孵育24h后产生的细胞因子，n＝4；

图4为ELISA法检测结肠炎小鼠小肠组织中IL-6和TNF-α细胞因子的产生，

n＝4；

图5为HE染色小鼠结肠原放大50μm的组织学观察图；

图6为模具中DOP的浓度未确定，避免了DOP的干扰图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

一、铁皮石斛葡甘聚糖浓度的摸索试验

1、试验方法：

参考文献(Hu,X.,Yu,Q.,Hou,K.,Ding,X.,Xie,M.Regulatory effects ofGanoderma atrum polysaccharides on LPS-induced inflammatory macrophages modeland intestinal-like Caco-2/macrophages co-culture inflammation model.FoodChem. Toxicol.2020；140(1):111321.)，同时根据铁皮石斛葡甘聚糖对Caco-2细胞的存活率，确定铁皮石斛葡甘聚糖的添加浓度。

2、试验结果：

铁皮石斛葡甘聚糖对Caco-2细胞的存活率结果如图1所示。因此，最终确定铁皮石斛葡甘聚糖的添加浓度为0.5mg/mL。

实施例1、一种肠源外泌体的制备方法

S1接种密度为1×10⁵个/孔的Caco-2细胞于DMEM培养基中培养21天；所述DMEM培养基为高糖型DMEM培养基，所述高糖型DMEM培养基还含有 10％热灭活后的胎牛血清，100U/mL链霉素和100U/mL青霉素；所述Caco-2 细胞的培养步骤为：将接种后的Caco-2细胞放入5％CO₂、温度为37℃、饱和湿度的条件下进行培养，待Caco-2细胞生长至80-90％后，接种至transwell板基底上端，每1～2天换液一次；

S2将脂多糖溶于DMEM培养基中，调节脂多糖的浓度为1μg/mL，所述 DMEM培养基为高糖型DMEM培养基，所述高糖型DMEM培养基还含有10％热灭活后的胎牛血清，100U/mL链霉素和100U/mL青霉素；接着加入步骤S1 培养的Caco-2细胞中培养1h，得肠炎模型细胞；

S3将铁皮石斛葡甘聚糖溶于DMEM培养基中，调节铁皮石斛葡甘聚糖的浓度为0.5mg/mL，接着加入步骤S2得到的肠炎模型细胞进行培养，收集细胞上清，在1000g条件下离心1min除细胞沉淀，得上清液；

S4将步骤S3得到的上清液在12000g的条件下超速离心12h，取沉淀，即得。

试验例一、外泌体的鉴定试验

1、试验方法：

采用扫描电镜观察实施例1制得的肠源外泌体，采用NTA分析实施例1制得的肠源外泌体的粒径大小，采用western blot测定实施例1制得的肠源外泌体标志蛋白表达量，以无DOP刺激产生的外泌体作为空白组。

2、试验结果：

试验结果如图2所示，具体为：

(1)从图2-C中可以看出本发明实施例1制得的肠源外泌体样品中具备外泌体的标志蛋白CD9和HSP70，可以判断Caco-2肠细胞中能释放外泌体；

(2)从图2-A中可以看出，与无DOP刺激产生的外泌体相比，本发明实施例1制得的肠源外泌体(DOP外泌体)形态有差异；

(3)从图2-B中可以看出，与无DOP刺激产生的外泌体相比，本发明实施例1制得的肠源外泌体(DOP外泌体)粒径较大。

试验例二、外泌体的浓度测定试验

1、试验方法：

采用BCA蛋白浓度测定试剂盒对实施例1制得的肠源外泌体样品定量检测，以无DOP刺激产生的外泌体作为空白组。

2、试验结果：

在等体积下，空白组测定的外泌体浓度为1.833ug/ul，本发明实施例1制得的肠源外泌体(DOP组)浓度为2.308ug/ul，说明加入DOP可以增加Caco-2细胞分泌外泌体的能力，提高外泌体的浓度。

试验例三、功能鉴定试验

1、试验方法：

将RAW264.7巨噬细胞接种于含有1×10⁵cell/well的24孔板中24h。加入1 μg/mLLPS刺激RAW264.7巨噬细胞，再加入10μg/mL实施例1制得的肠源外泌体与RAW264.7巨噬细胞孵育24h，收集上清，采用ELISA法检测细胞因子IL-6 和TNF-α含量，n＝4，每个值代表平均值±SD。结果分析*p<0.05，**p<0.01， ***p<0.001,NS。不显著，双尾学生t检验，观察炎症情况。

2、试验结果：

试验结果如图3所示，LPS诱导下RAW264.7巨噬细胞共孵育后，采用实施例1制得的肠源外泌体(DOP外泌体，记为DIEs)处理的RAW264.7的IL-6和 TNF-α含量下降，炎症指标比经无DOP刺激产生的外泌体(记为IEs)处理的RAW264.7的IL-6和TNF-α含量低，可判断本发明制得肠源外泌体具有缓解炎症作用。

我们推测其原理为：为了模拟肠道固有层巨噬细胞的炎症反应，本发明使用 LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞，采用实施例1制得的肠源外泌体(DOP外泌体，记为DIEs)处理，其表达较低水平的炎症因子(IL-6和TNF-α)，这些细胞因子在调节炎症微环境中起重要作用，已知炎症细胞因子的减少可减轻炎症水平。因此，在细胞水平上，本发明制得肠源外泌体具有消炎作用。

试验例四、功能鉴定试验

1、试验方法：

1.1、结肠炎小鼠模型建立：

(1)小鼠品系balb/c，SPF级，雌性，6～8周龄，156只，动物来源于三峡大学。小鼠于无特定病原体(specific pathogen free,SPF)条件下饲养。饲养环境为温度22～26℃，相对湿度50％～60％，人工光照明暗各12h。

(2)建模过程：

第1-14天给予含5％DSS的饮用水，第15天后给予正常饮用水。

1.2、小鼠建模成功后：

随机分为4组，空白对照组(标记为“Blank”)、葡聚糖硫酸钠盐(DSS)模型组(标记为“DSS”)、无DOP处理的外泌体(IEs)+DSS组(标记为“IEs”)、本发明实施例1制得的肠源外泌体(DIEs)+DSS组(标记为“DIEs”)。结肠炎模型组前14天给予含5％DSS的水。正常组同样给予等量生理盐水。IEs和 DIEs治疗结肠炎的小鼠每天腹腔注射IEs和DIEs(10μg试验样品，200μl PBS/ 只)，连续20天，同时给予模型组相同的含DSS的饮用。实验期间，每天两次检查小鼠的健康状况。

将DSS模型组、IEs+DSS组和DIEs+DSS组，3组小鼠于第18天全部处死。结肠组织被取出并清洗。采用ELISA法检测结肠炎小鼠小肠组织中IL-6和 TNF-α细胞因子的产生，n＝4。每个值代表平均值±SD。结果分析*p<0.05，**p <0.01，***p<0.001,NS。不显著，双尾学生t检验。

2、试验结果：

图4为ELISA法检测结肠炎小鼠小肠组织中IL-6和TNF-α细胞因子的产生，n＝4。在DSS诱导的小鼠结肠，用ELISA法分析细胞因子分泌。与DSS组相比，DIEs显著降低结肠炎小鼠肠道组织中IL-6和TNF-α的表达。综上所述， DIEs可以降低促炎细胞因子的表达，从而减轻炎症反应。

2.2、图5为HE染色小鼠结肠原放大50μm的组织学观察图，与无DOP处理的外泌体(IEs)治疗组不同，DIEs结肠切片组织学显示固有层和上皮内腔的细胞浸润水肿和溃疡水平减弱。

2.3、为了支持模具是否含有DOP，模具中DOP的浓度未确定，避免了DOP 的干扰，结果如图6所示。这些结果表明，DIEs可以调节体内炎症因子的产生。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种肠源外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S4将步骤S3得到的上清液进行超速离心，取沉淀，即得。

2.如权利要求1所述的肠源外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤S1、步骤S2和步骤S3中的DMEM培养基为高糖型DMEM培养基，所述高糖型DMEM培养基还含有10％热灭活后的胎牛血清，100U/mL链霉素和100U/mL青霉素。

3.如权利要求1所述的肠源外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中Caco-2细胞的培养步骤为：将接种后的Caco-2细胞放入5％CO₂、温度为37℃、饱和湿度的条件下进行培养，待Caco-2细胞生长至80-90％后，接种至transwell板基底上端，每1～2天换液一次。

4.如权利要求1所述的肠源外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中DMEM培养基中脂多糖的浓度为1μg/mL。

5.如权利要求1所述的肠源外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中DMEM培养基中铁皮石斛葡甘聚糖的浓度为0.5mg/mL。

6.如权利要求1所述的肠源外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中的离心条件为：在900～1100g条件下离心1～2min。

7.如权利要求1所述的肠源外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中的超速离心条件为：在11000～12000g的条件下超速离心12h。

8.如权利要求1～7任一所述的肠源外泌体的制备方法制得的外泌体在制备治疗肠道炎症药物中的用途。