WO2020125447A1 - 无创超声处理细胞在制备外泌体中的应用、外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents

无创超声处理细胞在制备外泌体中的应用、外泌体及其制备方法和应用 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to the field of biotechnology, in particular, to the application of non-invasive ultrasonic treatment cells in the preparation of exosomes, exosomes, and preparation methods and applications thereof.
  • the second object of the present invention is to provide the application of non-invasive ultrasonic treatment of cells in the preparation of exosomes.
  • the method for preparing exosomes uses non-invasive ultrasonic treatment of the cells, by stimulating the cells to a certain extent, regulating the abundance of microRNA expression in the exosomes, and/or potentially increasing the expression of brain-derived neurotrophic factors , And/or promote the removal of harmful proteins from the brain, and/or reduce the oxidative damage of harmful substances to brain tissue.
  • This method is applicable to all cells, such as tumor cells, stem cells, nerve cells and osteoarthritis cells, etc. It has good universality and simple operation.
  • the output of exosomes is large, avoiding cumbersome molecular biological operations, in a short time Target exosomes can be obtained within, which greatly shortens the preparation time of exosomes.
  • this method can achieve the simultaneous increase in the abundance of multiple microRNA expressions. Compared with gene transfection methods, more exosomes with altered microRNA expression can be obtained instead of single microRNA-exchanged exosomes.
  • FIG. 8 is the test results of the Parkinson cell model uptake exosomes in Example 5 of the present invention.
  • each reaction or operation step may be performed sequentially or not.
  • the reaction methods herein are performed sequentially.
  • the precipitating agent includes polyethylene glycol 4000 or polyethylene glycol 6000, preferably polyethylene glycol 6000, further preferably 14%-18% (w/v) polyethylene glycol 6000, more More preferably, it is 16% (w/v) polyethylene glycol.
  • w/v is the mass number of polyethylene glycol contained in a unit volume.

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Abstract

提供了一种外泌体的制备方法，是通过无创超声对细胞进行一定的刺激，调控细胞外泌体中的microRNA的表达丰度。该方法普适性好、操作简单且外泌体产量大，在短时间内即可得到目标外泌体。所得外泌体可用于提高脑源神经营养因子的表达，促进有害蛋白从脑内清除，或减轻有害物质对脑组织的氧化损伤。

Description

无创超声处理细胞在制备外泌体中的应用、外泌体及其制备方法和应用 技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种无创超声处理细胞在制备外泌体中的应用、外泌体及其制备方法和应用。
背景技术
外泌体是一种存在于细胞外的多囊泡体，可通过细胞内吞泡膜向内凹陷形成多泡内涵体，内涵体与细胞膜融合后释放其中的小囊泡。外泌体的直径为30-150nm，包含RNA、蛋白质、microRNA、DNA片段等多种成分，在血液、唾液、尿液、脑脊液和母乳等多种体液中均有分布。microRNA是一类内源性具有调控功能的非编码RNA，可以与靶mRNA的3’非翻译区结合，从而导致靶基因不同程度的差异性表达，因此，外泌体可以通过将microRNA传递到靶细胞胞质中，再特异性结合到对应mRNA的3'端非编码区，从而调控靶基因表达。细胞在不同病理、生理条件下选择性生成含有不同内容物的外泌体。而且不同细胞分泌的外泌体具有不同的组分，对靶细胞调节作用亦不相同。
目前对外泌体的研究中，microRNA的研究最为广泛，通常采用对细胞进行基因转染，通过电转，将基因转染至细胞系，再进行耗时费力的筛选，构建表达目标microRNA的细胞系，然后再通过对细胞系进行培养，收集细胞培养上清中的外泌体，从而得到表达目标microRNA的外泌体。这样的方法弊端是可能需要几个月的实验时间才能完成细胞系的构建，而且通常只能对单个microRNA进行高表达。此外，由于不同细胞的差异化，每种构建方式的普适性很差。
因此，开发一种可以同时高效提高多个目标物质丰度，普适性好并且操作简单成本低的外泌体制备方法具有重要的意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种外泌体的制备方法及外泌体，以缓解现有技术中外泌体的制备方法成本高、操作复杂并且难以实现多个目标物质表达调控的技术问题。
本发明的第二目的在于提供无创超声处理细胞在制备外泌体中的应用。
本发明的第三目的在于提供外泌体在制备药物中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种外泌体的制备方法，包括以下步骤：采用无创超声处理细胞，提取得到外泌体。
进一步地，包括以下步骤：将无创超声处理过的神经细胞培养36-60小时后提取外泌体，得到外泌体。
进一步地，所述无创超声处理包括：在探头频率0.5-1.5MHz和幅值10-200mV条件下无创超声细胞1-30min，幅值优选为50-10mV，进一步优选为90-110mV；超声时间优选为1-20min，进一步优选为1-10min，更进一步优选为3-7min。
进一步地，所述神经细胞包括SH-SY5Y细胞、IMR-32细胞、TGW细胞、LAN-1细胞、HA细胞或N2A细胞，优选为SH-SY5Y细胞。
进一步地，所述提取外泌体的方法包括：将去除神经细胞和凋亡小体的培养基进行浓缩得到浓缩液，获得浓缩液与沉淀剂作用的沉淀物，分离沉淀物得到外泌体。
进一步地，所述沉淀剂包括聚乙二醇4000或聚乙二醇6000，优选为聚乙二醇6000，进一步优选为14％-18％(w/v)聚乙二醇6000；
优选地，所述浓缩液和所述沉淀剂的体积比为1:0.5-1.5；
优选地，所述浓缩液和所述沉淀剂的作用条件为：2-8℃沉淀20-28小时；
优选地，所述分离沉淀物的步骤为：90000-110000×g离心1.5-2.5小时，沉淀为外泌体。
无创超声处理细胞在制备外泌体中的应用。
上述制备方法制备得到的外泌体。
进一步地，所述外泌体中miR-27a-3p、miR-27b-3p和miR-7-5p表达丰度提高。
上述制备方法或外泌体在如下A)-D)中任意一种的应用：
A)制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物；
B)制备预防和/或治疗帕金森病药物；
C)制备预防和/或治疗脊柱损伤药物；
D)制备预防和/或中风后脑损伤药物。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的外泌体制备方法，采用无创超声处理细胞，通过对细胞进行一定的刺激，调控细胞外泌体中的microRNA的表达丰度，和/或潜在的提高脑源神经营养因子的表达，和/或促进有害蛋白从脑内清除，和/或减轻有害物质对脑组织的氧化损伤。该方法对所有的细胞都适用，例如肿瘤细胞、干细胞、神经细胞和骨关节炎细胞等等，普适性好并且操作简单外泌体产量大，避免了繁琐的分子生物学操作，在短时间内即可得到目标外泌体，极大地缩短了外泌体的制备时间。此外，该方法可以实现多种microRNA表达丰度的同时提升，与基因转染方法相比较，可以得到更多microRNA表达改变的外泌体，而不是单个microRNA改变的外泌体。
神经疾病都是具有多种复杂的成因，外泌体中一种物质的改变很难满足实际的需求，本发明提供的外泌体中包括多种microRNA表达丰度的改变，和/或潜在的提高脑源神经营养因子的表达，和/或促进有害蛋白从脑内清除，和/或减轻有害物质对脑组织的氧化损伤，可以作为载体实现多种疾病的同时诊断或制备治疗多种疾病的药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施方式中无创超声处理的方法示意图；
图2为本发明实施例2中外泌体提取流程图；
图3为本发明实施例3中外泌体马尔文粒径分析仪粒径检测结果图；
图4为本发明实施例3中外泌体透射电镜观察结果图；
图5为本发明实施例4中外泌体的miR-27a-3p含量检测结果图；
图6为本发明实施例4中外泌体的miR-27b-3p含量检测结果图；
图7为本发明实施例4中外泌体的miR-7-5p含量检测结果图；
图8为本发明实施例5中帕金森细胞模型摄取外泌体试验结果，
其中，1-帕金森细胞模型+外泌体；2-帕金森细胞模型；3-SH-SY5Y细胞+外泌体；4-SH-SY5Y细胞，可发现帕金森细胞模型大量摄取外泌体；
图9为本发明实施例5中帕金森细胞模型正常培养的细胞凋亡结果；
图10为本发明实施例5中帕金森细胞模型经外泌体治疗的细胞凋亡结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，除非有其他说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“6～22”表示本文中已经全部列出了“6～22”之间的全部实数，“6～22”只是这些数值组合的缩略表示。
本发明所公开的“范围”以下限和上限的形式，可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。
本发明中，除非另有说明，各个反应或操作步骤可以顺序进行，也可以不按照顺序进行。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
一种外泌体的制备方法，包括以下步骤：采用无创超声处理细胞，提取得到外泌体。
本发明提供的外泌体制备方法，采用无创超声处理细胞，通过对细胞进行一定的刺激，调控细胞外泌体中的microRNA的表达丰度，和/或潜在的提高脑源神经营养因子的表达，和/或促进有害蛋白从脑内清除，和/或减轻有害物质对脑组织的氧化损伤。该方法对所有的细胞都适用，例如肿瘤细胞、干细胞、神经细胞和骨关节炎细胞等等，普适性好并且操作简单外泌体产量大，避免了繁琐的分子生物学操作，在短时间内即可得到目标外泌体，极大地缩短了外泌体的制备时间。此外，该方法可以实现多种microRNA表达丰度的同时提升，与基因转染方法相比较，可以得到更多microRNA表达改变的外泌体，而不是单个microRNA改变的外泌体。
本发明中的无创超声指的是医学超声，通常是指频率为0.1-50MHz区间内的声波。超声作为一种机械波，是由物体(声源)振动产生，并通过压缩和膨胀媒质导致其传播。
基于超声的力学效应，超声神经调控是近年来出现的无创性脑刺激与调控新技术，通过不同的强度、频率、脉冲重复频率、脉冲宽度、持续时间使刺激部位的中枢神经产生刺激或抑制效应，对神经功能产生双向调节的可逆性变化。因此，采用无创超声处理细胞，刺激细胞使得细胞的外泌体成分发生变化，通过调节不同的超声条件和选择不同的细胞可以得到目标产物高丰度表达的外泌体，同时由于在特定的超声处理条件下，特定的细胞系可以产生特定的外泌体，该方法具有良好的重复性，并且不会损伤细胞，所以该方法可以大量快速的生产出目标外泌体。
在一些实施方式中，无创超声可以但不限于采用如图1所示的方式，采用无创超声处理含有细胞的培养基实现对培养基中的细胞的刺激，由于外泌体存在于培养基中，为了保证后续提取外泌体的纯度，在无创超声处理前将细胞悬浮于无血清培养基中，避免血清中的外泌体等杂质对产物纯度的污染。
在一个优选地实施方式中，包括以下步骤：将无创超声处理过的神经细胞培养36-60小时后提取外泌体，得到外泌体。对于神经细胞，通过试验发现，细胞在无创超声处理后继续培养36-60小时时间内细胞分泌的外泌体组分丰度变化较大，此时目标microRNA高丰度表达，含量较高。处理过的神经细胞培养时间典型但非限制性的为36小时、42小时、48小时、54小时或60小时。
在优选地实施方式中，无创超声处理包括：在探头频率0.5-1.5MHz和幅值10-200mV条件下无创超声细胞1-30min。探头频率典型但非限制性的为0.5MHz、0.7MHz、1MHz、1.3MHz或1.5MHz；探头幅值典型但非限制性的为10mV、20mV、30mV、40mV、50mV、60mV、70mV、80mV、90mV、100mV、110mV、120mV、130mV、140mV、150mV、160mV、170mV、180mV、190mV或200mV；超声时间典型但非限制性的为1min、2min、3min、 4min、5min、6min、7min、9min、10min、15min、20min、25min或30min。其中，神经细胞包括SH-SY5Y细胞、IMR-32细胞、TGW细胞、LAN-1细胞、HA细胞或N2A细胞，优选为SH-SY5Y细胞。HA细胞为星型胶质细胞，N2A细胞为小鼠脑神经瘤细胞；SH-SY5Y细胞、IMR-32细胞、TGW细胞和LAN-1细胞均为人神经母细胞瘤细胞，通过试验发现，对神经细胞进行上述条件的无创超声处理，培养36-60小时时间后提取培养基中的外泌体，miR-27a-3p、miR-27b-3p和miR-7-5p的表达丰度都得到不同程度的倍数增长，对于同时高表达miR-27a-3p、miR-27b-3p和miR-7-5p外泌体的获得具有重要意义，极大地缩短了生产时间，避免了基因工程操作，降低了成本。
在优选地实施方式中，提取外泌体的方法包括但不限于将去除神经细胞和凋亡小体的培养基进行浓缩得到浓缩液，获得浓缩液与沉淀剂作用的沉淀物，分离沉淀物得到外泌体。其他的密度梯度离心、差速离心、体积排阻、免疫分离以及聚合物沉淀等方法。
在优选地实施方式中，沉淀剂包括聚乙二醇4000或聚乙二醇6000，优选为聚乙二醇6000，进一步优选为14％-18％(w/v)聚乙二醇6000，更进一步优选为16％(w/v)聚乙二醇。其中，w/v为单位体积内含有的聚乙二醇质量数。
在优选地实施方式中，浓缩液和沉淀剂的体积比为1:0.5-1.5。
在优选地实施方式中，浓缩液和沉淀剂的作用条件为：2-8℃沉淀20-28小时。
在优选地实施方式中，分离沉淀物的步骤为：90000-110000×g离心1.5-2.5小时，沉淀为外泌体。
在优选地实施方式中，提取外泌体的方法具体为：
对细胞培养上清进行一系列离心处理，去除细胞碎片，凋亡小体等。再利用分子量为3KDa的超滤管进行浓缩，浓缩后的培养基按照1:1的比例与16％ (w/v)聚乙二醇进行混合，混合后的液体置于2-8℃沉淀，24小时后离心，获得的沉淀继续在100,000g离心2小时后，获得的最后沉淀即为外泌体。
无创超声处理细胞在制备外泌体中的应用。对细胞进行无创超声处理，可以刺激细胞的外泌体中组分含量发生大幅度的改变，通过筛选和检测可以得到目标外泌体。
本发明提供上述制备方法制备得到的外泌体。本发明提供的外泌体中多种microRNA表达丰度的同时增加，可以作为载体实现多种疾病的同时诊断或制备治疗多种疾病的药物。
在优选地实施方式中，通过研究发现，对神经细胞采用探头频率0.5-1.5MHz和幅值90-110mV条件处理3-7min，再培养36-60小时后提取外泌体，外泌体中miR-27a-3p、miR-27b-3p和miR-7-5p表达丰度提高。可以理解的是，表达丰度的提高相对于未进行无创超声处理的细胞而言。
miR-27a-3p在阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)病人脑脊液中表达减少，表明miR-27a-3p可以作为一个AD治疗的靶点。miR-23a可以减轻脑损伤后的神经元凋亡情况，miR-23a的表达对于保护神经元活性是有潜在的用途的。miR-7可以通过与α-synuclein结合，从而下调a-synuclein的mRNA和蛋白表达水平。而α-synuclein是一种有三种类型的含144个氨基酸的蛋白，是可能导致帕金森(PD)的潜在蛋白。同时，miR-7通过P53通路控制大脑皮层的发育。
上述制备方法或外泌体在如下A)-D)中任意一种的应用：
A)制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物；
B)制备预防和/或治疗帕金森病药物；
C)制备预防和/或治疗脊柱损伤药物；
D)制备预防和/或中风后脑损伤药物。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1无血清培养基培养细胞及超声无创刺激细胞
本实施例采用SH-SY5Y细胞，将SH-SY5Y细胞培养至70％-80％融合程度后，换成无血清高糖DMEM培养基。
超声装置对细胞培养皿进行刺激，总的超声刺激时间持续5分钟，具体超声刺激方法如图1所示。具体超声参数，探头频率：1MHz，幅值：100mV，超声时间:5分钟。
刺激结束后，在显微镜下观察细胞形态，结果表明超声处理后的细胞形态良好，与未刺激SH-SY5Y细胞没有差异。
将超声处理过的SH-SY5Y细胞继续置于37°培养箱继续培养，并且分别在培养24小时和48小时后，收集细胞培养上清，准备提取外泌体。
实施例2经超声刺激后的外泌体收集
外泌体的提取流程图如图2所示，具体为：
1)将实施例1中收集得到的细胞培养上清300×g离心5分钟，去除细胞；
2)将步骤1)中的溶液上清2000×g离心10分钟，去除凋亡小体；
3)将步骤2)中的溶液采用3kDa的超滤管进行浓缩，3000×g离心30分钟，收取截留液；
4)将步骤3)中的浓缩培养基与16％(w/v)聚乙二醇按照体积比1:1进行混合，将混合后的液体置于4℃条件下沉淀24小时，获取沉淀；
5)将步骤4)中的沉淀在100,000×g离心2小时，沉淀即为外泌体。
实施例3外泌体的验证
将实施例2中收集到的外泌体利用马尔文粒径分析仪进行测定，结果如图3所示，得到外泌体的粒径基本在100nm左右。
将实施例2中收集到的外泌体利用透射电镜观察，结果如图4所示，可观察得到茶杯状的经典外泌体形态。
实施例4 microRNA检测
将实施例2中超声刺激细胞后培养24小时和48小时所得的外泌体进行总RNA进行提取，进行荧光定量qRT-PCR。设计引物，对其中miRNA进行定量分析，内参选择U6，引物的具体序列如下表1所示：
表1
Figure PCTCN2019123568-appb-000001
结果如图5-图7所示。可以发现超声刺激48小时后，SH-SY5Y细胞三种microRNA的表达大幅提高，具体包括miR-27a-3p，miR-27b-3p和miR-7-5p，在超声刺激48小时后的外泌体中，含量分别升高9.79倍，10.19倍和3.6倍。
将上述实验重复三次，结果表明本发明提供的技术方案确实可以将SH-SY5Y细胞分泌的外泌体中的miR-27a-3p，miR-27b-3p和miR-7-5p得到高丰度表达，实验具有良好的重现性。
实施例5外泌体的摄取和抑制细胞凋亡
1mM MPP处理SH-SY5Y细胞，建立帕金森细胞模型。采用实施例2中的超声刺激后培养48小时细胞分泌的外泌体与帕金森细胞共培养，其中外泌体用外泌体特异性荧光染料pkh26标记，利用流式细胞仪检查荧光强度。结果如图8所示，其中，1：帕金森细胞模型+外泌体；2：帕金森细胞模型；3：SH-SY5Y细胞+外泌体；4：SH-SY5Y细胞，可发现帕金森细胞模型大量摄取外泌体。
孵育帕金森细胞模型72小时后加入实施例2中的超声刺激后培养48小时细胞分泌的外泌体和无血清DMEM培养基培养72小时，同时以只加入无血清DMEM培养基作为对照组，采用AnnexinⅤ/PI双染色法，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果如图9和图10所示，对照组中凋亡细胞比例为Q3+Q2＝31.94％，外泌体治疗组中凋亡细胞比例为Q3+Q2＝15.78％，说明超声处理过的细胞提取的外泌体可以逆转SH-SY5Y细胞的凋亡。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (12)

  1. 一种外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：采用无创超声处理细胞，提取得到外泌体。
  2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将无创超声处理过的神经细胞培养36-60小时后提取外泌体，得到外泌体。
  3. 根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述无创超声处理包括：在探头频率0.5-1.5MHz和幅值10-200mV条件下无创超声细胞1-30min。
  4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述探头幅值为50-10mV，超声时间为1-20min。
  5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述探头幅值为90-110mV，超声时间为3-7min。
  6. 根据权利要求要2所述的制备方法，其特征在于，所述神经细胞包括SH-SY5Y细胞、IMR-32细胞、TGW细胞、LAN-1细胞、HA细胞或N2A细胞，优选为SH-SY5Y细胞。
  7. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述提取外泌体的方法包括：将去除神经细胞和凋亡小体的培养基进行浓缩得到浓缩液，获得浓缩液与沉淀剂作用的沉淀物，分离沉淀物得到外泌体。
  8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述沉淀剂包括聚乙二醇4000或聚乙二醇6000；
    所述浓缩液和所述沉淀剂的体积比为1:0.5-1.5；
    所述浓缩液和所述沉淀剂的作用条件为：2-8℃沉淀20-28小时；
    所述分离沉淀物的步骤为：90000-110000×g离心1.5-2.5小时，沉淀为外泌体。
  9. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述沉淀剂为14％-18％(w/v)的聚乙二醇6000。
  10. 一种如权利要求1-9任一项所述的制备方法制备得到的外泌体。
  11. 无创超声处理细胞在制备如权利要求10所述的外泌体中的应用。
  12. 权利要求1-9任一项所述的制备方法或权利要求10所述的外泌体在如下A)-D)中任意一种的应用：
    A)制备预防和/或治疗阿尔茨海默病药物；
    B)制备预防和/或治疗帕金森病药物；
    C)制备预防和/或治疗脊柱损伤药物；
    D)制备预防和/或中风后脑损伤药物。
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