IT201800006062A1 - Processo di separazione e purificazione di ficobiliproteine - Google Patents
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Description
TITOLO
PROCESSO DI SEPARAZIONE E PURIFICAZIONE
DI FICOBILIPROTEINE
DESCRIZIONE
Campo dell’Invenzione
La presente invenzione riguarda in generale il campo della purificazione di principi attivi da prodotti naturali, e più precisamente si riferisce a un processo per ottenere ficobiliproteine con grado di purezza elevato a partire da biomasse di cianobatteri e/o alghe.
Stato dell’Arte
Le ficobiliproteine sono componenti dai colori brillanti, altamente fluorescenti, dei complessi antenna del sistema fotosintetico dei cianobatteri e di alcune alghe, quali le alghe appartenenti alle classi Rhodophyta, o alga rossa, e Cryptophyta, o criptomonadi. Le ficobiliproteine sono formate da un complesso tra proteine e gruppi tetrapirrolici lineari - che rappresentano i cromofori nel complesso – in cui i gruppi tetrapirrolici sono covalentemente legati alle unità proteiche. Le ficobiliproteine più comuni sono le ficocianine, le alloficocianine e le ficoeritrine, di colore blu le prime due e di colore fucsia brillante la terza. Queste proteine sono pigmenti naturali solubili in acqua che, oltre a svolgere un ruolo biologico importante per la raccolta della luce negli organismi in cui sono presenti, rappresentano anche prodotti con elevato valore aggiunto e svariate applicazioni commerciali. Per le loro proprietà di pigmenti con fluorescenza esse sono infatti utilizzate come coloranti naturali nel campo cosmetico o come sonde fluorescenti (e.g. nella citometria a flusso o per analisi immunologiche), e come additivo colorante in campo alimentare.
Tali proteine sono inoltre riconosciute da tempo come aventi un elevato potere nutrizionale e contenenti diverse molecole bioattive, da cui il loro utilizzo come alimento (le due ficobiliproteine ficocianina e alloficocianina estratte dall’alga spirulina sono approvate per il consumo alimentare dall’EFSA in Europa e dall’FDA negli Stati Uniti), e come fotosensibilizzante non tossico nella terapia fotodinamica (PDT) dei tumori, mentre numerosi sono gli studi sul potenziale uso di queste proteine come farmaco sulla base delle ormai comprovate proprietà antiossidanti, antinfiammatorie, neuroprotettive, antitumorali e immunomodulanti (si veda ad esempio [1] e [2]).
Con tali e tante applicazioni è evidente il valore commerciale che questi prodotti possono raggiungere, valore che può tuttavia variare considerevolmente a seconda del grado di purezza del coniugato proteico, che a sua volta varia a seconda del tipo di applicazione. Per l’impego alimentare, ad esempio, è richiesto un grado di purezza superiore a 0.7 o “grado alimentare”, per l’uso cosmetico il grado di purezza richiesto o “grado cosmetico” è superiore a 2.0, superiore a 3.9 il grado reattivo e superiore a 4.0 il grado analitico richiesto alle ficobiliproteine. In generale, come anche nella descrizione che segue, per “grado di purezza” di una ficobiliproteina si intende il rapporto tra il valore massimo di assorbanza della ficobiliproteina (attorno a 540-570 nm per la ficoeritrina, attorno a 615-620 nm per la ficocianina, attorno a 650 nm per la alloficocianina) e il valore di assorbanza a 280 nm, che è correlato alla quantità totale delle proteine nel prodotto (si vedano ad esempio i riferimenti [3], [4]).
Finora, sono stati proposti molti metodi per purificare le ficobiliproteine e la ficocianina in particolare. Di solito, con questi metodi, un grado di purezza elevato è raggiunto solo dopo svariati passaggi di purificazione, che ricorrono in genere a diversi passaggi cromatografici su colonna degli estratti delle biomasse che contengono il prodotto di interesse, con una conseguente riduzione nella resa e un considerevole aumento dei costi di produzione, che rendono di fatto impraticabile lo sfruttamento di questi metodi su scala industriale. Si veda ad esempio [5], [6].
Sono state allora proposte in alternativa alcune procedure di purificazione cromatografica semplificate, sulla carta più adatte per l’utilizzo su larga scala; tuttavia, solo pochi di questi protocolli riescono a evitare fasi di purificazione mediante cromatografia su colonna e tra questi, solo quelli che impiegano l’estrazione con sistema a due fasi acquose, combinata con l’ultrafiltrazione - metodologia anch’essa lunga e costosa - riescono a fornire un prodotto di grado analitico [7].
In effetti, è noto che la tradizionale cromatografia su colonna impaccata presenta una serie di svantaggi, quali la lentezza della separazione per diffusione tra i pori e il consumo di grandi volumi di solventi, che ne limitano l’applicazione su larga scala, specie nella purificazione di grandi molecole. D’altra parte, più recentemente, sono stati proposti altri tipi di separazione cromatografica per la purificazione di prodotti, come la cromatografia su membrana, che hanno acquisito una crescente importanza (si veda ad esempio [8]), in particolare per processare grandi volumi di soluzioni diluite, anche nella purificazione di grandi biomolecole, quali ad esempio acidi nucleici, proteine, anticorpi, o di virus. La cromatografia su membrana, infatti, presenta notevoli vantaggi rispetto a quella su colonna, da un tempo di trasporto dei soluti ridotto a un minor volume di solvente richiesto a parità di prodotto recuperato. L’efficienza di legame delle membrane verso i soluti è inoltre in genere indipendente dalla velocità del flusso di alimentazione alla membrana su un ampio intervallo, pertanto possono anche essere utilizzati flussi molto elevati, migliorando così i tempi di processo. Si tratta infine di dispositivi più semplici e meno costosi da produrre in serie. Dall’altra parte, però la cromatografia su membrana è caratterizzata da una bassa capacità di carico e da una non elevata risoluzione nei processi di separazione. In letteratura tali svantaggi, in particolare rispetto alla cromatografia su colonna, sono stati discussi ed evidenziati, ad esempio in [9].
In questo tipo di cromatografia, inoltre, la funzionalizzazione della membrana con appropriati leganti può consentire lo sfruttamento dei processi chimici più vari per realizzare la separazione, quali ad esempio affinità, scambio ionico, o interazioni idrofobiche. E’ stato però messo in evidenza che diversi materiali utilizzati per produrre le membrane da cromatografia hanno una certa capacità intrinseca di interagire selettivamente con le proteine, con conseguenze sulla possibilità di utilizzare questo tipo di separazione cromatografica per la purificazione di proteine.
A oggi pertanto, per quanto è a conoscenza della Richiedente, non sono note procedure efficienti di purificazione adatte all’impiego su larga scala, che permettano di abbattere i costi di produzione delle ficobiliproteine garantendo allo stesso tempo dei gradi di purezza accettabili. Ciò limita di fatto l’utilizzo massivo di queste cromoproteine nei diversi settori di applicazione commerciale, nonostante ne sia oramai riconosciuto l’alto valore nutraceutico e medico, o anche più semplicemente l’efficacia di colorante naturale.
Sommario dell'invenzione
Ora la Richiedente ha trovato che è possibile ottenere singole ficobiliproteine con elevato grado di purezza, in particolare ficocianina, alloficocianina o ficoeritrina, a partire da biomasse cianobatteriche e algali mediante trattamento cromatografico per interazione idrofobica su membrana.
Tale metodo, applicato direttamente a estratti acquosi grezzi contenenti miscele di ficobiliproteine, ha permesso di ottenere in modo semplice e a costi ridotti la separazione nei prodotti di interesse con un grado di purezza elevato, come richiesto per gli usi commerciali in campo farmaceutico, alimentare e cosmetico, oltre che per l’applicazione in analisi e ricerca.
Il ricorso alla cromatografia su colonna o ad altri procedimenti costosi e lunghi, come l’ultrafiltrazione, è inoltre evitato grazie al presente processo.
Rappresenta pertanto oggetto dell'invenzione un processo per la separazione e la purificazione di ficobiliproteine, come definito nella prima delle rivendicazioni annesse.
Altre importanti caratteristiche del processo secondo la presente invenzione sono riportate nella seguente descrizione dettagliata.
Breve descrizione delle figure
Figura 1 – Spettro di assorbimento della ficocianina purificata ottenuta come descritto nell’Esempio 1 che segue.
Figura 2 – Spettro di assorbimento della alloficocianina purificata ottenuta come descritto nell’Esempio 5 che segue.
Figura 3 – Spettro di assorbimento della B-ficoeritrina purificata ottenuta come descritto nell’Esempio 8 che segue.
Descrizione dettagliata dell'invenzione
In accordo con l’invenzione, il processo qui proposto è un processo semplificato per la separazione selettiva e la purificazione di ficobiliproteine, in particolare ficocianina, alloficocianina e ficoeritrina, da estratti grezzi di cianobatteri e/o alghe che contengono miscele di tali ficobiliproteine, senza l’impiego di tecniche cromatografiche su colonna o di ultrafiltrazione o di altre tecniche lunghe e costose. Gli inventori hanno infatti sorprendentemente trovato che è possibile effettuare una separazione e purificazione efficace delle ficobiliproteine presenti in un estratto acquoso salino mediante passaggio su una membrana da microfiltrazione, sfruttando il legame selettivo e reversibile delle diverse ficobiliproteine con la membrana, senza fare ricorso a processi di eluizione con solventi come nella cromatografia su colonna.
In un aspetto preferito di questa invenzione, gli estratti grezzi di partenza sono estratti di cianobatteri oppure sono estratti di alghe, ad esempio scelti tra estratti di Arthrospira platensis (Spirulina) ed estratti di Porphyridium cruentum. Preferibilmente, gli estratti di partenza sono estratti di Arthrospira platensis. Inoltre, nel presente processo, si possono utilizzare estratti da biomassa fresca oppure estratti da biomassa disidratata, ad esempio da biomassa liofilizzata in polvere. Secondo una forma di realizzazione preferita del processo di questa invenzione, gli estratti grezzi di partenza sono stati ottenuti per sospensione in soluzione acquosa di una biomassa di cianobatteri e/o alghe liofilizzata, successiva centrifugazione e raccolta del surnatante formatosi. La sospensione in soluzione acquosa della biomassa liofilizzata è preferibilmente mantenuta a riposo, ad esempio a 4°C per 24 ore, prima di essere sottoposta a centrifugazione. La sospensione di partenza può essere ad esempio una sospensione in acqua oppure in una soluzione acquosa di un sale o di un tampone.
In un particolare aspetto di questo processo, la sospensione da biomasse di cianobatteri o contenenti cianobatteri insieme ad alghe, può essere vantaggiosamente sottoposta ad un trattamento estrattivo prima della purificazione su membrana, allo scopo di disgregare le membrane esterne del batterio e liberare le proteine contenute al loro interno, per una più elevata resa dei prodotti desiderati. Qualsiasi tecnico con conoscenze ordinarie del settore potrà senza sforzo individuare un metodo di trattamento atto a tale scopo, quali ad esempio ultrasonicazione, liofilizzazione, cicli di congelamento/scongelamento o trattamenti enzimatici.
In una forma realizzativa particolare dell’invenzione, gli estratti grezzi da biomassa liofilizzata secca, ottenuti per sospensione della biomassa in soluzione salina e successiva centrifugazione, sono direttamente sottoposti alla separazione/purificazione su membrana. In un’altra forma realizzativa particolare dell’invenzione, gli estratti grezzi da biomassa fresca, umida, sono ottenuti grazie a più cicli di congelamento/scongelamento della sospensione in soluzione salina della biomassa e successiva centrifugazione della stessa, prima di essere sottoposti alla separazione/purificazione su membrana.
Il presente processo è risultato in ogni caso applicabile a qualsiasi cianobatterio e/o alga, su estratti grezzi ottenuti in qualsiasi modo.
Il presente processo di separazione e purificazione di ficobiliproteine da estratti grezzi di cianobatteri e/o alghe che le contengono, è basato sulla cromatografia su membrana dei suddetti estratti, e comprende almeno un ciclo di purificazione comprendente:
i)almeno un passaggio di una soluzione acquosa salina degli estratti grezzi su una membrana porosa idrofila, avente basso potere legante di proteine, in cui la soluzione acquosa salina degli estratti grezzi di ficobiliproteine è una soluzione acquosa di un sale S con concentrazione [S]1;
ii)desorbimento del retentato raccolto sulla membrana mediante lavaggio con un solvente scelto nel gruppo consistente di acqua, una soluzione acquosa di detto sale S a concentrazione [S]2 < [S]1, e una soluzione acquosa di un sale S’ che è un agente caotropico più forte del sale S.
Nell’ambito della presente invenzione, con l’espressione “un sale S’ che è un agente caotropico più forte del sale S” si intende un sale S’ avente una maggiore abilità rispetto al sale S di rompere i legami idrofobici e i legami idrogeno che le proteine formano sulla membrana.
Il sale S è preferibilmente scelto tra ammonio solfato e sodio solfato; risultati ottimali in termini di resa, separazione e grado di purezza sono ottenuti in questo processo con ammonio solfato. La soluzione acquosa di sale S’ è scelta di preferenza tra soluzione acquosa di sodio cloruro e tampone fosfato salino. Qualsiasi tecnico con conoscenze ordinarie del settore potrà senza sforzo selezionare eventuali altre soluzioni acquose di sali S’ di possibile utilizzo nel passaggio ii) del presente processo, tra le soluzioni di sali in grado di favorire il distacco delle proteine dalla membrana.
La membrana porosa idrofila di possibile utilizzo nel presente processo può essere ad esempio una membrana piana, a fibra cava, capillare o tubulare in materiale idrofilo, scelto ad esempio tra policarbonato e PVDF (polivinilidenfluoruro); preferibilmente il materiale della membrana è PVDF. Esistono diverse membrane commerciali per microfiltrazione di questo tipo, che possono essere utilizzate con successo nel presente processo.
Nell’ambito di questa invenzione per “membrana” nel passaggio i) di purificazione si intende una singola membrana oppure una pluralità di membrane, ad esempio più membrane impilate l’una sull’altra.
In un aspetto preferito del processo dell’invenzione, prima del passaggio di purificazione i) degli estratti sulla membrana, questa è preventivamente sottoposta a un trattamento di condizionamento con una soluzione acquosa salina del sale S alla stessa concentrazione [S]1 utilizzata nel passaggio successivo.
Secondo una forma di realizzazione preferita, che consente di ottenere gradi di purezza particolarmente elevati della ficobiliproteina separata, ad esempio una purezza di grado analitico ≥ 4.0, il processo dell’invenzione comprende inoltre, prima del passaggio di purificazione i) su membrana e a monte dell’eventuale condizionamento della membrana sopra descritto, una fase di pulizia su membrana degli estratti con una soluzione acquosa di sale S a concentrazione [S]0 < [S]1, concentrazione del sale S nella soluzione acquosa delle ficobiliproteine da purificare. Questa fase preliminare con una soluzione salina a concentrazione più bassa, permette di minimizzare l’interazione tra la membrana e le ficobiliproteine che passano dunque nel permeato, mentre sulla membrana restano impurezze di vario genere. Anche la membrana utilizzata in questa fase può essere dello stesso tipo di quella utilizzata nell’almeno un passaggio successivo di purificazione i).
In un aspetto preferito dell’invenzione, il processo è condotto sostituendo la membrana porosa idrofila dopo il passaggio di pulizia, quando presente, utilizzando in tutti gli altri passaggi del processo la medesima membrana porosa idrofila come sopra definita.
Allo scopo di recuperare più ficobiliproteine diverse a partire da una stessa biomassa che ne contiene diverse, il presente processo può comprendere più cicli di purificazione effettuati consecutivamente con concentrazioni uguali o crescenti di soluzione acquosa salina del sale S mediante passaggio su una membrana del permeato ottenuto dal passaggio precedente su membrana fino alla separazione della ficobiliproteina desiderata, ad esempio dopo n passaggi, al passaggio n+1 dovrà essere utilizzata per il sale S una concentrazione [S]n+1 ≥ [S]n.
In un aspetto preferito del processo dell’invenzione, prima di ciascun ciclo n di purificazione i) degli estratti sulla membrana, questa è preventivamente sottoposta a un trattamento di condizionamento con una soluzione acquosa salina del sale S alla stessa concentrazione [S]n utilizzata nel passaggio successivo.
Secondo una forma di realizzazione preferita del presente processo, ogni passaggio di purificazione può essere ripetuto più di una volta alla stessa concentrazione di sale S fino ad ottenere la ficobiliproteina del grado di purezza desiderato.
Nell’ambito della presente invenzione, per “grado di purezza elevato” si intende un grado di purezza ≥ 0.7, corrispondente al grado di purezza richiesto alle ficobiliproteine per l’uso alimentare, dove il grado di purezza è definito come sopra descritto. Con il presente processo è comunque possibile ottenere i prodotti di interesse, come dimostrato nella parte sperimentale che segue, anche con gradi di purezza ben maggiori, e in particolare ≥ 2.0, grado di purezza richiesto per l’uso cosmetico; ≥ 3.5, grado di purezza richiesto per l’applicazione delle ficobiliproteine nella ricerca scientifica, ad esempio come marcatori fluorescenti; e ≥ 4.0, grado di purezza richiesto per l’uso medico-farmaceutico delle ficobiliproteine, ad esempio come agenti antivirali, antiossidanti, antibatterici, antiinfiammatori o come traccianti.
Il principale vantaggio del processo dell'invenzione risiede nella possibilità di ottenere ficobiliproteine con elevato grado di purezza in modo semplice e rapido; su scala di laboratorio, gli inventori hanno portato avanti e concluso ogni ciclo di purificazione in soli 3-4 minuti.
Inoltre, il presente processo consente di ottenere gradi di purezza delle ficobiliproteine anche elevati, adatti alle varie applicazioni, dall’alimentare al cosmetico al farmaceutico, all’analitico.
Un ulteriore vantaggio del presente processo risiede nel fatto che tutti i reagenti e i dispositivi utilizzati, incluse le membrane da microfiltrazione utilizzabili, sono disponibili in commercio a basso costo, o comunque a un costo contenuto. Anche il costo unitario del prodotto finito sarà dunque proporzionalmente più basso.
Ancora un ulteriore vantaggio del presente processo è la sua flessibilità e riadattamento a seconda della ficobiliproteina che si vuole recuperare e del relativo grado di purezza desiderato. In base a questi desiderata si possono definire di volta in volta il numero di passaggi di purificazione su membrana, le relative concentrazioni di sale S da utilizzare e l’eventuale passaggio preventivo di pulizia, così da modulare il risultato del processo e ottenere il prodotto desiderato, della purezza desiderata, ottimizzando la resa.
I seguenti Esempi sono riportati a scopo illustrativo, e non limitativo della presente invenzione.
Esempio 1
Purificazione della ficocianina da estratti acquosi di biomasse di Arthrospira platensis (Spirulina)
Un estratto grezzo di ficobiliproteine è stato ottenuto sospendendo della biomassa di A. platensis liofilizzata in una soluzione acquosa di NaCl 100 mM (140 mg di Spirulina in 11 mL di soluzione). La sospensione è stata mantenuta a 4°C per 24 ore, poi centrifugata per 45 minuti (12000 rcf, T = 10°C). Il surnatante contenente la ficocianina (PC) e l’alloficocianina (APC) (di seguito “estratto grezzo”) è stato recuperato e conservato a 4°C.
Il processo di purificazione sull’estratto grezzo è stato eseguito utilizzando un dispositivo da vuoto in vetro per microfiltrazione e una membrana per microfiltrazione in PVDF, operando due passaggi successivi sulla membrana. Il secondo passaggio ha permesso di ottenere ficocianina con grado di purezza analitico.
Più in particolare, una beuta da vuoto in vetro per microfiltrazione è stata assemblata con una membrana in PVDF idrofilo (Durapore<®>, con dimensione media dei pori di 0.45 µm, diametro di 47 mm, spessore 125.0 µm, codice HVLP 04700). Utilizzando questo dispositivo sono stati condotti i seguenti due passaggi:
- passaggio di pulizia: la membrana è stata lavata con 100 mL di acqua deionizzata e poi condizionata con 5 mL di ammonio solfato 0.6 M. A una aliquota di 0.8 mL di estratto grezzo è stato aggiunto un volume di soluzione acquosa di NaCl 100 mM e di ammonio solfato 3 M tale da avere un volume finale di estratto in ammonio solfato 0.6 M di 5 mL, con un contenuto totale di ficobiliproteine (PC APC) di circa 1 mg. La soluzione è stata caricata sulla membrana e filtrata; il permeato è stato raccolto in una beuta codata pulita da 100 mL. 5 mL di ammonio solfato 0.6 M sono poi stati caricati sulla membrana, filtrati e raccolti nella beuta contenente il permeato, per massimizzare il recupero delle ficobiliproteine. Nessun composto blu è stato adsorbito sulla membrana alla concentrazione di ammonio solfato di 0.6 M. Il volume della soluzione è stato accuratamente misurato e, se necessario, è stato riportato a 10 mL utilizzando una soluzione di ammonio solfato di 0.6 M;
- passaggio di purificazione: al permeato in ammonio solfato 0.6 M (10 mL) ottenuto come descritto sopra nel passaggio i) di pulizia, è stata aggiunta una soluzione acquosa di ammonio solfato 3 M in modo da ottenere una soluzione di ficobiliproteine avente una concentrazione di ammonio solfato pari a 1.110 M. Questa soluzione è stata poi caricata su una membrana in PVDF nuova, adottando la procedura usuale: la membrana è stata lavata con 100 mL di acqua deionizzata e poi condizionata con 5 mL di una soluzione di ammonio solfato avente la stessa concentrazione di ammonio solfato della soluzione di ficobiliproteine, ossia 1.110 M. La soluzione di ficobiliproteine e ammonio solfato 1.110 M è stata quindi caricata sulla membrana e filtrata. Il retentato sulla membrana è stato lavato con 10 mL di soluzione di ammonio solfato 1.110 M, quindi desorbito con 10 mL di soluzione di NaCl 100 mM e recuperato in una beuta codata pulita da 100 mL. Lo spettro di assorbanza della PC purificata così ottenuta è mostrato in Figura 1.
La ficocianina ottenuta è risultata, in particolare, avere un grado di purezza pari a 4.20, mentre la resa della purificazione rispetto al contenuto di ficocianina nell’aliquota di estratto grezzo sottoposta a purificazione è risultata del 67%.
Esempio 2
Purificazione della ficocianina da estratti acquosi di biomasse di Arthrospira platensis (Spirulina)
L’estratto grezzo di ficobiliproteine è stato ottenuto da biomassa fresca di A. platensis. Un’aliquota di coltura della biomassa in acqua (40 mL) è stata centrifugata per 10 min (12,000 rcf, temperatura=10°C) e il surnatante eliminato. Il pellet di cianobatteri è stato sospeso e lavato con acqua pura 18 MΩ Milli-Q, quindi è stato centrifugato per 10 min (12,000 rcf, temperatura 10°C) e il surnatante eliminato. Il pellet è stato ripreso in 10 mL di una soluzione acquosa di NaCl 100 mM e sottoposto a tre cicli di congelamento-scongelamento (in ogni ciclo la sospensione è stata mantenuta a -20°C per 2.5 ore e poi scongelata in un bagno d’acqua a 20°C). Dopo aver aggiunto altri 10 mL di soluzione acquosa di NaCl 100 mM (20 mL in totale) la sospensione è stata sonicata quattro volte per 60 s (potenza 75%, impulso 60%, punta sonicante S2, Hielscher Ultrasonic Processor UP200S, 200 W, 24 kHz) in un bagno di acqua e ghiaccio, con un intervallo di 60 s tra un ciclo di sonicazione e il successivo. La sospensione è stata infine centrifugata per 45 minuti (12,000 rcf, temperatura = 10 °C) e il surnatante contenente la ficocianina (PC) e l’alloficocianina (APC) (estratto grezzo) è stato recuperato e conservato a 4°C.
Il processo di purificazione sull’estratto grezzo è stato eseguito utilizzando un dispositivo da vuoto in vetro per microfiltrazione e una membrana per microfiltrazione in PVDF, operando tre passaggi successivi sulla membrana. Il terzo passaggio ha permesso di ottenere ficocianina con grado di purezza analitico.
Più in particolare, una beuta da vuoto in vetro per microfiltrazione è stata assemblata con una membrana in PVDF idrofilo (Durapore<®>, con dimensione media dei pori di 0.45 µm, dimetro di 47 mm, codice HVLP 04700). Utilizzando questo dispositivo sono stati condotti i seguenti due passaggi:
- passaggio di pulizia: la membrana è stata lavata con 100 mL di acqua deionizzata e poi condizionata con 5 mL di ammonio solfato 0.6 M. A una aliquota di 2.0 mL di estratto grezzo è stato aggiunto un volume di soluzione acquosa di NaCl 100 mM e di ammonio solfato 3 M tale da avere un volume finale di estratto in ammonio solfato 0.6 M di 3 mL, con un contenuto totale di ficobiliproteine (PC APC) di circa 1 mg. La soluzione è stata caricata sulla membrana e filtrata; il permeato è stato raccolto in una beuta codata pulita da 100 mL. 3 mL di ammonio solfato 0.6 M sono poi stati caricati sulla membrana, filtrati e raccolti nella beuta contenente il permeato, per massimizzare il recupero delle ficobiliproteine. Nessun composto blu è stato adsorbito sulla membrana alla concentrazione di ammonio solfato di 0.6 M. Il volume della soluzione è stato accuratamente misurato e, se necessario, è stato riportato a 6 mL utilizzando una soluzione di ammonio solfato di 0.6 M;
- passaggio di purificazione: al permeato in ammonio solfato 0.6 M (6 mL) ottenuto come descritto sopra nel passaggio i) di pulizia, è stata aggiunta una soluzione acquosa di ammonio solfato 3 M in modo da ottenere una soluzione di ficobiliproteine avente una concentrazione di ammonio solfato pari a 1.110 M. Questa soluzione è stata poi caricata su una membrana in PVDF nuova, adottando la procedura usuale: la membrana è stata lavata con 100 mL di acqua deionizzata e poi condizionata con 5 mL di una soluzione di ammonio solfato avente la stessa concentrazione di ammonio solfato della soluzione di ficobiliproteine, ossia 1.110 M. La soluzione di ficobiliproteine in ammonio solfato 1.110 M è stata quindi caricata sulla membrana e filtrata. Il retentato sulla membrana è stato lavato con 10 mL di soluzione di ammonio solfato 1.110 M, quindi desorbito con 5 mL di soluzione di NaCl 100 mM e recuperato in una beuta codata pulita da 100 mL. L’analisi spettrofotometrica del prodotto ha evidenziato un grado di purezza di ficocianina inferiore al grado analitico. E’ stato pertanto eseguito sulla soluzione di ficocianina recuperata un secondo passaggio di purificazione su membrana. In tale passaggio il volume di soluzione è stato accuratamente misurato ed è stata aggiunta una soluzione di ammonio solfato 3 M in modo da ottenere una soluzione di ficocianina avente una concentrazione di ammonio solfato 1.110 M, che è stata quindi caricata sulla membrana e filtrata. Il retentato sulla membrana è stato lavato con 10 mL di soluzione di ammonio solfato 1.110 M, quindi desorbito con 5 mL di soluzione acquosa di NaCl 100 mM e recuperato in una beuta codata pulita da 100 mL. L’analisi spettrofotometrica ha evidenziato per la ficocianina così ottenuta una purezza di grado analitico. Più in particolare, la ficocianina ottenuta è risultata avere un grado di purezza pari a 4.0, mentre la resa della purificazione rispetto al contenuto di ficocianina nell’aliquota di estratto grezzo sottoposta a purificazione è risultata del 60.0%.
Esempio 3
Purificazione della ficocianina da estratti acquosi di biomasse di Arthrospira platensis (Spirulina)
Un estratto grezzo di ficobiliproteine è stato ottenuto come descritto sopra nell’Esempio 1. Il processo di purificazione su tale estratto grezzo è stato eseguito utilizzando una siringa per microfiltrazione e una membrana da siringa in PVDF idrofilo (Durapore<®>, con dimensione media dei pori di 0.45 µm, dimetro di 33 mm, codice SLHV033RS). Utilizzando questo dispositivo sono stati condotti i seguenti due passaggi:
- passaggio di pulizia: la membrana è stata lavata con 5 mL di acqua deionizzata e poi condizionata con 3 mL di ammonio solfato 0.6 M, quindi è stata utilizzata per filtrare una aliquota di 2 mL di estratto grezzo in ammonio solfato 0.6 M con un contenuto totale di ficobiliproteine (PC APC) di circa 0.31 mg. La soluzione è stata filtrata sulla membrana il permeato è stato raccolto in una bottiglietta di vetro da 10 mL. La membrana è stata poi lavata con 1 mL di soluzione di ammonio solfato 0.6 M, raccogliendo la soluzione nella stessa bottiglietta contenente il permeato per massimizzare il recupero delle ficobiliproteine. Non si è osservato nessun composto blu adsorbito sulla membrana alla concentrazione di ammonio solfato di 0.6 M. Il volume della soluzione è stato quindi accuratamente misurato e, se necessario, è stato riportato a 3 mL utilizzando una soluzione di ammonio solfato di 0.6 M;
- passaggio di purificazione: al permeato in ammonio solfato 0.6 M (3 mL) ottenuto come descritto sopra nel passaggio i) di pulizia, è stato aggiunto un volume di soluzione acquosa di NaCl 100 mM e di ammonio solfato 3 M tale da avere un volume finale di estratto in ammonio solfato 1.110 M di 5 mL. Allo scopo di ottenere ficocianina di grado analitico, tale soluzione è stata caricata su un nuovo filtro a membrana per siringa in PVDF, seguendo poi l’usuale procedura: il filtro è stato lavato con 5 mL di acqua deionizzata e poi condizionato con 3 mL di una soluzione acquosa di ammonio solfato avente la stessa concentrazione di ammonio solfato della soluzione di ficobiliproteine, ossia 1.110 M. La soluzione di ficobiliproteine in ammonio solfato 1.110 M è stata filtrata e il retentato sulla membrana è stato lavato con 3 mL di soluzione di ammonio solfato 1.110 M. Il retentato è stato infine recuperato con 3 mL di soluzione acquosa di NaCl 100 mM.
La ficocianina ottenuta come descritto sopra è risultata, in particolare, avere un grado di purezza pari a 4.0, mentre la resa della purificazione rispetto al contenuto di ficocianina nell’aliquota di estratto grezzo sottoposta a purificazione è risultata del 63.0%.
Esempio 4
Purificazione della ficocianina da estratti acquosi di biomasse di Arthrospira platensis (Spirulina)
Un estratto grezzo di ficobiliproteine è stato ottenuto sospendendo della biomassa di A. platensis liofilizzata in una soluzione acquosa di ammonio solfato 0.6 M (100 mg di Spirulina in 15 mL di soluzione). La sospensione è stata mantenuta a 4°C per 24 ore, poi centrifugata per 45 minuti (12,000 rcf, temperatura = 10°C). Il surnatante contenente la ficocianina (PC) e l’alloficocianina (APC) (di seguito “estratto grezzo”) è stato recuperato e conservato a 4°C.
Il processo di purificazione sull’estratto grezzo è stato eseguito utilizzando un dispositivo da vuoto in vetro per microfiltrazione e una membrana per microfiltrazione in PVDF, operando due passaggi successivi sulla membrana. Il secondo passaggio ha permesso di ottenere ficocianina con grado di purezza analitico.
Più in particolare, una beuta da vuoto in vetro per microfiltrazione è stata assemblata con una membrana in PVDF idrofilo (Durapore<®>, con dimensione media dei pori di 0.45 µm, dimetro di 47 mm, codice HVLP 04700). Utilizzando questo dispositivo sono stati condotti i seguenti due passaggi:
- passaggio di pulizia: la membrana è stata lavata con 100 mL di acqua deionizzata e poi condizionata con 5 mL di ammonio solfato 0.6 M. Una aliquota di 1.5 mL di estratto grezzo in soluzione di ammonio solfato 0.6 M, con un contenuto totale di ficobiliproteine (PC APC) di circa 1 mg, è stata caricata sulla membrana e filtrata; il permeato è stato raccolto in una beuta codata pulita da 100 mL. 5 mL di ammonio solfato 0.6 M sono poi stati caricati sulla membrana, filtrati e raccolti nella beuta contenente il permeato, per massimizzare il recupero delle ficobiliproteine. Nessun composto blu è stato adsorbito sulla membrana alla concentrazione di ammonio solfato di 0.6 M. Il volume della soluzione è stato accuratamente misurato e, se necessario, è stato riportato a 10 mL di volume finale, utilizzando una soluzione di ammonio solfato di 0.6 M;
- passaggio di purificazione: al permeato in ammonio solfato 0.6 M (10 mL) ottenuto come descritto sopra nel passaggio i) di pulizia, è stata aggiunta una soluzione acquosa di ammonio solfato 3 M in modo da ottenere una soluzione di ficobiliproteine avente una concentrazione di ammonio solfato pari a 1.110 M. Questa soluzione è stata poi caricata su una membrana in PVDF nuova, adottando la procedura usuale: la membrana è stata lavata con 100 mL di acqua deionizzata e poi condizionata con 5 mL di una soluzione di ammonio solfato avente la stessa concentrazione di ammonio solfato della soluzione di ficobiliproteine, ossia 1.110 M. La soluzione di ficobiliproteine e ammonio solfato 1.110 M è stata quindi caricata sulla membrana e filtrata. Il retentato sulla membrana è stato lavato con 10 mL di soluzione di ammonio solfato 1.110 M, quindi desorbito con 10 mL di soluzione di NaCl 100 mM e recuperato in una beuta codata pulita da 100 mL.
La ficocianina ottenuta è risultata, in particolare, avere un grado di purezza pari a 4.05, mentre la resa della purificazione rispetto al contenuto di ficocianina nell’aliquota di estratto grezzo sottoposta a purificazione è risultata del 60.0%.
Esempio 5
Purificazione della ficocianina e dell’alloficocianina da estratti acquosi di biomasse di Arthrospira platensis (Spirulina)
Un estratto grezzo di ficobiliproteine è stato ottenuto come descritto sopra nell’Esempio 1. Il processo di purificazione sull’estratto grezzo è stato quindi eseguito utilizzando un dispositivo da vuoto in vetro per microfiltrazione e una membrana per microfiltrazione in PVDF idrofilo (Durapore<®>, con dimensione media dei pori di 0.45 µm, dimetro di 47 mm, codice HVLP 04700), operando direttamente i cicli di purificazione sulla membrana, senza passaggio preliminare di pulizia, come segue:
- primo ciclo di purificazione: la membrana è stata lavata con 100 mL di acqua deionizzata e poi condizionata con 5 mL di soluzione acquosa di ammonio solfato 1.10 M. Una aliquota di 48 mL di estratto grezzo in soluzione acquosa di ammonio solfato 1.10 M, con contenuto totale di ficobiliproteine pari a circa 9.7 mg, è stata caricata sulla membrana e filtrata; il permeato è stato raccolto in una beuta codata pulita da 250 mL. Il retentato (PC) sulla membrana è stato lavato con 10 mL di ammonio solfato 1.10 M, quindi desorbito con 10 mL di NaCl 100 mM, recuperato in una beuta codata pulita da 100 mL e il suo grado di purezza determinato spettrofotometricamente. Il permeato è stato nuovamente caricato sulla membrana per recuperare la ficocianina ancora presente in soluzione. Per recuperare la ficocianina presente nel permeato sono stati eseguiti in tutto sei passaggi successivi di purificazione su membrana. Tra un ciclo e l’altro la membrana è stata pulita con 100 mL di acqua deionizzata e poi condizionata con 5 mL di soluzione di ammonio solfato 1.10 M.
- secondo ciclo di purificazione: per rimuovere dal permeato contenente alloficocianina (APC), ottenuto al termine dei sei passaggi di purificazione sopra descritti, la piccola quantità di PC ancora presente, è stata aggiunta una soluzione acquosa di ammonio solfato 3 M fino a una concentrazione finale di 1.30 M, e la soluzione è stata caricata sulla membrana precedentemente pulita con 100 mL di acqua deionizzata e condizionata con 5 mL di soluzione di ammonio solfato 1.30 M, quindi è stata filtrata. Il retentato presente sulla membrana è stato rimosso pulendo la membrana con 100 mL di acqua deionizzata. La membrana è stata condizionata con 5 mL di soluzione di ammonio solfato 1.3 M e il permeato caricato e filtrato nuovamente per eliminare l’eventuale PC ancora presente in soluzione.
- terzo ciclo di purificazione: al permeato ottenuto dal secondo ciclo di purificazione è stata aggiunta una soluzione acquosa di ammonio solfato 3 M fino a una concentrazione finale di 1.50 M e la soluzione è stata caricata sulla membrana precedentemente pulita con 100 mL di acqua deionizzata e condizionata con 5 mL di soluzione di ammonio solfato 1.50 M, quindi è stata filtrata. Il retentato (APC) sulla membrana è stato lavato con 10 mL di soluzione di ammonio solfato 1.50 M, quindi desorbito con 10 mL di soluzione acquosa di NaCl 100 mM e recuperato in una beuta codata pulita da 100 mL. Il grado di purezza di APC è stato determinato spettrofotometricamente, dallo spettro di assorbimento di Figura 2.
Nella seguente Tabella 1 sono illustrati il grado di purezza e la resa di prodotto rispetto al contenuto nell’aliquota di estratto grezzo sottoposta a purificazione di ficocianina e di alloficocianina nel corso del processo di purificazione.
Tabella 1
Esempio 6
Purificazione della ficocianina da estratti acquosi di biomasse di Arthrospira platensis (Spirulina) – Ottenimento di ficocianina con grado di purezza alimentare/cosmetico
Un estratto grezzo di ficobiliproteine è stato ottenuto come descritto sopra nell’Esempio 1. Il processo di purificazione è stato poi eseguito utilizzando un dispositivo da vuoto in vetro per microfiltrazione assemblato con una membrana in PVDF idrofilo (Durapore<®>, dimensione media dei pori 0.45 µm, diametro 47 mm, codice HVLP 04700). Il passaggio di pulizia della membrana non è stato eseguito, mentre è stato condotto un solo passaggio di purificazione, come segue:
-passaggio di purificazione: la membrana è stata lavata con 100 mL di acqua deionizzata e poi condizionata con 5 mL di soluzione acquosa di ammonio solfato 1.65 M. Una aliquota di 10 mL di estratto grezzo in soluzione acquosa di ammonio solfato 1.65 M, con contenuto totale di ficobiliproteine pari a circa 1.7 mg, è stata caricata sulla membrana e filtrata. Il retentato sulla membrana è stato lavato con 10 mL di soluzione di ammonio solfato 1.65 M, quindi desorbito con 10 mL di soluzione acquosa di NaCl 100 mM, recuperato in una beuta codata pulita da 100 mL e il suo grado di purezza determinato spettrofotometricamente.
La ficocianina purificata così ottenuta ha rivelato un grado di purezza pari a 2.5, e una resa rispetto al contenuto di ficocianina nell’aliquota di estratto grezzo sottoposto a purificazione del 90.0%.
Esempio 7
Purificazione della ficocianina da estratti acquosi di biomasse di Arthrospira platensis (Spirulina) su membrana in policarbonato
Un estratto grezzo di ficobiliproteine è stato ottenuto come descritto sopra nell’Esempio 1. Il processo di purificazione è stato poi eseguito utilizzando un dispositivo da vuoto in vetro per microfiltrazione assemblato con una membrana idrofila in policarbonato (Whatman Nuclepore, dimensione media dei pori 1.0 µm, diametro 47 mm, spessore 10 µm, codice 111110) applicando poi il processo con un passaggio di pulizia e uno di purificazione descritto nell’Esempio 1. In particolare si è proceduto come segue:
-passaggio di pulizia: la membrana è stata lavata con 100 mL di acqua deionizzata e poi condizionata con 5 mL di soluzione acquosa di ammonio solfato 0.6 M. Ad una aliquota di 0.75 mL di estratto grezzo con un contenuto totale di ficobiliproteine (PC APC) pari a circa 1 mg, è stato aggiunto un volume di soluzione acquosa di NaCl 100 mM e di ammonio solfato 3 M tale da avere un volume finale di estratto in ammonio solfato 0.6 M di 6 mL. La soluzione è stata caricata sulla membrana e filtrata; il permeato è stato raccolto in una beuta codata pulita da 100 mL. Nessun composto blu è stato adsorbito sulla membrana alla concentrazione di ammonio solfato 0.6 M. Il volume della soluzione è stato accuratamente misurato e, se necessario, è stato riportato a 6 mL utilizzando una soluzione acquosa di ammonio solfato 0.6 M;
-passaggio di purificazione: al permeato in 6 mL di soluzione acquosa di ammonio solfato 0.6 M, ottenuto nel passaggio di pulizia sopra descritto, è stata aggiunta una soluzione acquosa di ammonio solfato 3 M in modo da ottenere una soluzione di ficobiliproteine avente una concentrazione di ammonio solfato 1.110 M. La soluzione è stata caricata su una membrana in policarbonato nuova, adottando la procedura usuale: la membrana è stata lavata con 100 mL di acqua deionizzata e poi condizionata con 5 mL di una soluzione di ammonio solfato avente la stessa concentrazione in ammonio solfato della soluzione di ficobiliproteine (1.110 M). La soluzione di ficobiliproteine in ammonio solfato 1.110 M è stata caricata sulla membrana e filtrata. Il retentato sulla membrana è stato lavato con 10 mL di soluzione acquosa di ammonio solfato 1.110 M, quindi desorbito con 10 mL di soluzione acquosa di NaCl 100 mM, recuperato in una beuta codata pulita da 100 mL e il suo grado di purezza è stato determinato spettrofotometricamente.
E’ stata ottenuta ficocianina con grado di purezza pari a 2.44, e con una resa rispetto al contenuto di ficocianina nell’aliquota di estratto grezzo sottoposta a purificazione del 11.7%.
Esempio 8
Purificazione della B-ficoeritrina (B-PE) da estratti acquosi di biomasse di Porphyridium cruentum su membrana in PVDF
Un estratto grezzo di ficobiliproteine è stato ottenuto sospendendo della biomassa di P. cruentum liofilizzata in una soluzione acquosa di NaCl 100 mM (120 mg di polvere in 15 mL di soluzione). La sospensione è stata mantenuta a 4°C per 24 ore, poi centrifugata per 45 minuti (12,000 rcf, temperatura = 10°C). Il surnatante contenente B-PE (nel seguito “estratto grezzo”) è stato recuperato e conservato a 4°C.
Il processo di purificazione di B-PE è stato effettuato utilizzando una siringa e filtri a membrana da siringa in PVDF idrofilo di porosità 0.45 μm (Durapore<®>, dimensione media dei pori 0.45 μm, Ø 33 mm, codice SLHV033RS) o 0.22 μm (Durapore<®>, dimensione media dei pori 0.22 μm, Ø 33 mm, codice SLGV033RS) e applicando il processo di purificazione descritto qui di seguito. Nessun passaggio di pulizia della membrana è stata effettuato, mentre il passaggio di purificazione sulla membrana è stato eseguito come segue: una soluzione acquosa di NaCl 100 mM e di ammonio solfato 3 M sono stati aggiunti a una aliquota di 0.3 mL di estratto grezzo con un contenuto di B-PE pari a circa 0.1 mg, in modo da avere un volume finale di soluzione 1.15 M di ammonio solfato pari a 3 mL. Il filtro è stato lavato con 5 mL di acqua deionizzata e poi condizionato con 3 mL di ammonio solfato 1.15 M. La soluzione di estratto in ammonio solfato 1.15 M è stata caricata su un filtro in PVDF di porosità 0.22 μm, e in parallelo su un filtro sempre in PVDF con pori di dimensioni medie 0.45 μm, condizionati con ammonio solfato 1.15 M. Dopo filtrazione, il retentato sulla membrana è stato lavato con 3 mL di soluzione acquosa di ammonio solfato 1.15 M, recuperato con 3 mL di NaCl 100 mM e il suo grado di purezza determinato spettrofotometricamente.
In ambedue i casi è stata ottenuta B-ficoeritrina (B-PE) avente un grado di purezza di circa 3.95 e una resa pari a circa il 50 %.
Esempio 9
Purificazione della B-ficoeritrina (B-PE) da estratti acquosi di biomasse di Porphyridium cruentum su membrana in PVDF
Un estratto grezzo di ficobiliproteine è stato ottenuto sospendendo 170 mg di biomassa di P. cruentum liofilizzata in polvere in 21 mL di tampone fosfato salino (PBS, sodio fosfato 10 mM, NaCl 100mM) a pH 7. La sospensione è stata mantenuta a 4°C per 24 ore, poi centrifugata per 45 minuti (12,000 rcf, temperatura = 10°C). Il surnatante contenente B-PE (nel seguito “estratto grezzo”) è stato recuperato e conservato a 4°C.
Il processo di purificazione di B-PE è stato effettuato utilizzando un dispositivo da vuoto in vetro per microfiltrazione assemblato con una membrana in PVDF idrofilo (Durapore<®>, dimensione media dei pori 0.45 µm, diametro 47 mm, codice HVLP 04700) e procedendo ai passaggi di pulizia e purificazione come segue:
-passaggio di pulizia: la membrana è stata lavata con 100 mL di acqua deionizzata e poi condizionata con 5 mL di soluzione acquosa di ammonio solfato 0.83 M. PBS a pH 7 e soluzione acquosa di ammonio solfato 3 M sono stati aggiunti a una aliquota di 2 mL di estratto grezzo con contenuto di B-PE pari a circa 0.7 mg, in modo da avere un volume finale di 9 mL di estratto in soluzione di ammonio solfato 0.83 M. La soluzione è stata caricata sulla membrana e filtrata; il permeato è stato raccolto in una beuta codata pulita da 100 mL. Il volume della soluzione è stato accuratamente misurato e, se necessario, è stato riportato a 9 mL utilizzando una soluzione acquosa di ammonio solfato 0.83 M.
-passaggio di purificazione: al permeato in soluzione acquosa di ammonio solfato 0.83 M ottenuto da precedente passaggio di pulizia è stata aggiunta una soluzione acquosa di ammonio solfato 3 M in modo da ottenere una soluzione di ficobiliproteine avente una concentrazione di ammonio solfato 1.224 M. Questa soluzione è stata caricata su una membrana in PVDF nuova, adottando la procedura usuale: la membrana è stata lavata con acqua deionizzata (100 mL) e poi condizionata con 5 mL di una soluzione acquosa di ammonio solfato avente la stessa concentrazione di ammonio solfato della soluzione di ficobiliproteine (1.224 M). La soluzione di ficobiliproteine in ammonio solfato 1.224 M è stata caricata sulla membrana e filtrata. Il retentato sulla membrana è stato lavato con 10 mL di soluzione acquosa di ammonio solfato 1.224 M, quindi desorbito con 10 mL di PBS a pH 7, recuperato in una beuta codata pulita da 100 mL e il suo grado di purezza determinato spettrofotometricamente.
E’ stata ottenuta B-ficoeritrina (B-PE) con grado di purezza pari a 4.0, e con una resa rispetto al contenuto di B-PE nell’aliquota di estratto grezzo sottoposta a purificazione del 38.0 %.
La presente invenzione è stata fin qui descritta con riferimento a sue forme di realizzazione preferite. E' da intendersi che possono esistere altre forme di realizzazione che afferiscono al medesimo nucleo inventivo, tutte rientranti nell'ambito di protezione delle rivendicazioni qui di seguito riportate.
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
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Claims (9)
- RIVENDICAZIONI 1. Un processo di separazione e purificazione di ficobiliproteine da estratti grezzi di cianobatteri e/o alghe che le contengono, comprendente almeno un ciclo di purificazione comprendente: i) almeno un passaggio di una soluzione acquosa salina di detti estratti grezzi su una membrana porosa idrofila, avente basso potere legante di proteine, in cui detta soluzione acquosa salina di estratti grezzi di ficobiliproteine è una soluzione acquosa di un sale S con concentrazione [S]1; ii) desorbimento del retentato raccolto su detta membrana mediante lavaggio con un solvente scelto nel gruppo consistente di acqua, una soluzione acquosa di detto sale S a concentrazione [S]2 < [S]1, e una soluzione acquosa di un sale S’ che è un agente caotropico più forte di detto sale S.
- 2. Il processo secondo la rivendicazione 1, comprendente inoltre, a monte di detto ciclo di purificazione, una fase di pulizia su detta membrana porosa idrofila di detti estratti grezzi in una soluzione acquosa di detto sale S a concentrazione [S]0 inferiore a detta concentrazione [S]1 di detto sale S nella fase i).
- 3. Il processo secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui detta membrana porosa idrofila è una membrana idrofila in PVDF (polivinilidenfluoruro) o in policarbonato.
- 4. Il processo secondo la rivendicazione 3, in cui detta membrana porosa idrofila è una membrana idrofila in PVDF.
- 5. Il processo secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, comprendente più cicli di purificazione effettuati consecutivamente con concentrazioni uguali o crescenti di soluzione acquosa salina di detto sale S mediante passaggio su detta membrana porosa idrofila del permeato ottenuto dal ciclo precedente fino alla separazione della ficobiliproteina desiderata nel grado di purezza desiderato.
- 6. Il processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta membrana porosa idrofila, prima di ciascun detto ciclo di purificazione e/o di detta fase di pulizia, è preventivamente trattata con una soluzione acquosa salina di detto sale S a concentrazione [S]n, dove [S]n è la concentrazione del sale S nell’ennesimo ciclo di purificazione.
- 7. Il processo secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui detti estratti grezzi sono estratti di cianobatteri o di alghe scelti tra estratti di Arthrospira platensis (Spirulina) ed estratti di Porphyridium cruentum.
- 8. Il processo secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui detto sale S è ammonio solfato.
- 9. Il processo secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui detta soluzione acquosa di sale S’ è scelta tra soluzioni acquose di sodio cloruro e tampone fosfato salino.
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