CN109354625A - 一种从螺旋藻中同时分离纯化出藻蓝蛋白和多糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种从螺旋藻中同时分离纯化藻蓝蛋白和多糖的方法，先将螺旋藻破壁并固液分离得到藻蓝蛋白与多糖的粗提液与藻渣；再将粗提液用超滤进行部分多糖与藻蓝蛋白的分离；将藻渣用热碱液溶解搅拌取上清得多糖粗提液；再将分离的藻蓝蛋白粗提液进行两步盐析，获得沉淀后用磷酸盐缓冲液溶解，通过Sephadex G‑25脱盐，最后进行聚丙烯酸酯柱层析以及羟基磷灰石柱层析，以获得了高纯度的藻蓝蛋白＞4.0和高得率的螺旋藻多糖＞4%。本发明以螺旋藻为原料，通过采用盐析联合柱层析分离纯化高纯度藻蓝蛋白和高得率螺旋藻多糖，充分利用了螺旋藻，提高了螺旋藻的附加值，并且省时省力，可以工业化大规模生产。

Description

一种从螺旋藻中同时分离纯化出藻蓝蛋白和多糖的方法
技术领域
本发明属于生化分离技术领域，具体涉及一种从螺旋藻中同时分离纯化出高纯度藻蓝蛋白与高得率多糖的方法。
背景技术
螺旋藻含有大量蛋白质及各种营养物质，其中活性多糖与藻蓝蛋白具有抗癌、提高免疫力、抗氧化等活性功能，因此越来越多的被开发为保健品、功能性食品。
藻蓝蛋白是一种普遍存在于蓝藻细胞中的补光色素蛋白，其基本组成单位是α亚基和β亚基，亚基分子量在17KDa和22KDa之间。藻蓝蛋白的纯度越高，售价越高，根据其纯度的不同可分为：食品级＞0.7，药品级＞3.0和试剂级＞4.0。藻蓝蛋白具有抗氧化性、抗癌性、免疫荧光性等功效，被广泛用作天然色素(食品、化妆品、染料等)、医药保健品和分子生物学研究中的荧光试剂。螺旋藻多糖是一类具有天然生物活性的多糖化合物，具有增强免疫力，抗氧化、抗肿瘤和降血糖等功能。螺旋藻中的藻蓝蛋白含量高达14％，螺旋藻多糖是螺旋藻藻体中碳水化合物的主要存在形式，含量高达干重的14％～16％。从螺旋藻中提取纯化藻蓝蛋白和多糖，可以对螺旋藻进行充分利用，使其更好地适应市场的需求，实现高附加值的资源利用。
目前藻蓝蛋白与多糖的提取方法主要有:反复冻融破壁发、溶胀破壁法、超声波法、高压均质法，化学试剂法、热水浸提法(多糖)、碱液浸提法(多糖)等等。现行很多的破壁提取方法强调连用，尽管一定程度上增加了螺旋藻破壁后蛋白质与多糖得率，但是增加了相应工艺步骤，操作复杂性增加，成本增大。另外，藻蓝蛋白和多糖的纯化的方法主要包括：盐析、超滤、透析、利凡诺沉淀、双水相萃取和层析法等等。其纯化方法重点在于单一提取纯化藻蓝蛋白或多糖，不能整体有效的同时分离和纯化出高纯度的藻蓝蛋白和高得率的多糖，未能实现高附加值的综合利用。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一，即解决现有技术中不能整体有效同时分离和纯化出高纯度藻蓝蛋白与高得率多糖的问题。为此，本发明的目的在于提出一种一种从螺旋藻中同时分离纯化出藻蓝蛋白和多糖的方法。
为达到上述目的，本发明实施例提出了一种从螺旋藻中同时分离纯化藻蓝蛋白和多糖的方法，其包括以下步骤：
S1，将螺旋藻进行破壁产生藻液，藻液进行固液分离，所得液体为藻蓝蛋白与第一部分多糖混合粗提液，所得固体作为提取纯化第二部分多糖使用；
S2，将步骤S1中获得的液体进行超滤，透过液为第一部分多糖溶液；浓缩液中加入适量硫酸铵混匀，静置后离心，获得上清液一；将步骤S1中获得的固体溶于水，调节pH至碱性，进行碱提破壁，再将其离心，获得上清液二，所得上清液二为第二部分多糖粗提液；
S3，向步骤S2中的上清液一中加适量硫酸铵混匀，静置后离心，获得沉淀；调节步骤S2中的上清液二的pH至酸性，静置后离心，获得上清液三；
S4，将步骤S3中的沉淀用磷酸盐缓冲溶液溶解，并用去离子水作为脱盐流动相进行脱盐，脱盐后的溶液为藻蓝蛋白初纯化溶液；
S5，将步骤S4的藻蓝蛋白初纯化溶液，过聚丙烯酸脂层析柱，用洗脱液进行梯度洗脱，分别收集洗脱液的组分，检测各组分中藻蓝蛋白的纯度和浓度，将富含藻蓝蛋白的组分用磷酸盐缓冲液作为流动相进行脱盐，以获得藻蓝蛋白纯化溶液；
S6，将步骤S3的上清液三，过聚丙烯酸脂层析柱，进行吸附杂蛋白，收集穿透峰，得第二部分多糖溶液；在将第二部分多糖溶液与步骤S2获得的第一部分多糖溶液合并，浓缩得多糖；
S7，将步骤S5中获得的藻蓝蛋白纯化溶液过羟基磷灰石层析柱，用洗脱液进行梯度洗脱，分别收集洗脱液组分，合并得高纯度藻蓝蛋白。
根据本发明实施例，本发明以螺旋藻干粉为原料，采用盐析联合柱层析分离纯化出高纯度藻蓝蛋白和高得率多糖，与传统层析法工艺相比，在兼顾多糖回收率的前提下，能同时提取纯化高纯度的藻蓝蛋白多糖，提高了螺旋藻的蛋白与多糖综合提取纯化的效率，实现高附加值的综合利用。
另外，根据本发明上述实施例提出的一种从螺旋藻中同时分离纯化藻蓝蛋白和多糖的方法，还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明实施例，所述步骤S1包括：将螺旋藻干粉按照料液比1：20加入0.02mol/L的pH7.0磷酸盐缓冲溶液，搅拌溶胀5h；再将搅拌溶胀后的溶液进行离心，分离得所述液体和所述固体。
根据本发明实施例，所述步骤S2包括：将步骤S1中获得的液体用5KDa进行超滤，透过液为第一部分多糖溶液，浓缩液中加入硫酸铵至饱和度为20％，混匀，静置后离心，弃沉淀，取上清液一；将步骤S1中获得的固体按照固液比1:20加入水，并用1M氢氧化钠调节pH12，搅拌提取2h之后离心，取上清液二。
根据本发明实施例，所述步骤S5采用0.02mol/L、pH＝7.0、3～5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡弱阴离子聚丙烯酸脂层析柱，平衡后，将藻蓝蛋白初纯化溶液上样，上样量为柱床体积的1/3～2/3；用含2M氯化钠的0.02M、pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液进行梯度洗脱，洗脱线速度为200～300cm/h。
根据本发明实施例，所述步骤S6采用0.02mol/L、pH＝4.0、3～5倍柱体积的醋酸-醋酸铵缓冲液平衡强阳离子聚丙烯酸脂层析柱，平衡后上样，上样量为柱床体积的1/3～2/3；上样后经过一个穿透峰开始收集一个穿透峰，洗脱线速度为200～300cm/h。
根据本发明实施例，所述步骤S7采用0.01mol/L、pH＝7.0、3～5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱，平衡后，将步骤S5中的藻蓝蛋白纯化溶液上样，上样量为柱床体积的1/3～2/3。
根据本发明实施例，所述步骤S4中磷酸盐缓冲液的浓度为0.02mol/L，pH为7.0，选用Sephadex G-25脱盐柱进行脱盐。
根据本发明实施例，所述步骤S3中向上清液一中加硫酸铵只饱和度为40％，用1MHCl将上清液二的pH值调至4。
根据本发明实施例，所述离心操作在4℃下进行。
附图说明：
图1为本发明的流程图；
图2为葡萄糖含量标准曲线图。
具体实施方式
为了更好的理解上述技术方案，下面将更详细地描述本发明的示例性实施例，应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明的一种从螺旋藻中同时分离纯化藻蓝蛋白与多糖的方法，采用溶胀破壁获得藻蓝蛋白与多糖粗提液与藻渣，分别以不同方式处理粗提液与藻渣，采用盐析联合柱层析的方法同时分离和纯化获得高纯度藻蓝蛋白和高得率多糖。
冻融法的原理是将螺旋藻浸泡于蒸馏水或低浓度盐溶液中，使螺旋藻溶胀破裂增加细胞膜的通透性而溶胀破壁，从而获得藻蓝蛋白与多糖破壁粗提液。
溶胀法易于保存螺旋藻，不受时空限制，不会导致蛋白质的变形，操作简单。
盐析法是使用中性盐来中和溶液中蛋白质的电荷，破坏蛋白质表面的水化膜，使蛋白质相互聚集形成沉淀而析出。
UniM DEAE聚丙烯酸脂柱层析是一种阴离子交换分离技术，原理是利用蛋白质在不同pH缓冲液中蛋白质所带正负电荷的差异，从而与阴离子离子交换剂结合的能力也不同，所以被洗脱到溶液中的顺序也不同，从而被分离出来。
UniM SP聚丙烯酸脂柱层析是一种阳离子交换分离技术，原理与阴离子交换分离技术相反。与葡聚糖、聚丙烯酸脂和人工合成的聚合物类填料相比，具有机械强度高、溶出物少的优点。HA羟基磷灰石填料具有独特的分离机理，是目前唯一直接用于蛋白质和核酸纯化的无机层析填料，具有高度耐碱、生物安全性的优点，其表面具有丰富的PO43-和Ca2+，具有阳离子交换和金属螯合的混合作用机理。
本发明的一种从螺旋藻中同时分离纯化藻蓝蛋白与多糖的方法，包括如下步骤：
S1、将螺旋藻干粉按照料液比1：20加入0.02mol/L的pH＝7.0磷酸盐缓冲溶液，搅拌溶胀5h，使藻蓝蛋白以及部分多糖的破壁溶出；再将搅拌溶胀后的溶液进行离心，在4℃下进行10000r/min的高速离心，离心时间10min，分离得液体与固体。
S2、将将步骤S1中获得的液体用5KDa～20KDa进行超滤，透过液为第一部分多糖溶液，浓缩液中加入固体硫酸铵至饱和度为20％，混匀，静置2h后在4℃下进行10000r/min高速离心，弃沉淀，取上清液一；将步骤S1中获得的固体按照渣液比1:20加入水，并用1M氢氧化钠将其pH值调至12，搅拌提取2h之后在4℃下进行10000r/min高速离心，所得上清液二为第二部分多糖粗提液。
S3、向步骤S2的上清液一中加入硫酸铵至饱和度为40％，搅拌混匀后静置2h，在4℃下进行10000r/min的高速离心，离心时间10min，弃去上清液，获得藻蓝蛋白沉淀；再用1MHCl将上清液二的pH值调至3～5，静置10min，在4℃下进行10000r/min的高速离心，离心时间10min，弃去沉淀，获得上清液三。
S4、向步骤S3获得藻蓝蛋白沉淀中加入少量0.02M(指磷酸根浓度)，pH为7.0的磷酸缓冲溶液，以将藻蓝蛋白沉淀溶解，再将溶解后的溶液过SephadexTM G-25Fine脱盐柱进行脱盐；脱盐后的溶液为藻蓝蛋白初纯化溶液。
S5、UniM DEAE柱层析：柱子的规格优选为UniM DEAE-50XS PP 15×310mm实验室规模层析预装柱，使用0.02mol/L、pH＝7.0、3～5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡UniM DEAE层析柱，平衡后，将藻蓝蛋白初纯化溶液上样，上样量为柱床体积的1/3～2/3；进样完毕后分别用含1.5mol/L氯化钠的0.02mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲液洗脱样品，洗脱线速度为200～300cm/h；分别收集用洗脱液洗脱的组分，检测组分中藻蓝蛋白纯度和浓度，将主要富含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的组分用0.02mol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲液作为流动相进行脱盐柱脱盐以获得藻蓝蛋白纯化溶液。
S6、UniM SP柱层析：柱子的规格优选为UniM SP-50XS PP 15×310mm实验室规模层析预装柱，0.02mol/L、pH＝4.0、3～5倍柱体积的醋酸-醋酸钠缓冲液平衡UniM SP层析柱，平衡后，将上清液三上样，上样量为柱床体积的1/3～2/3；上样后经过一个穿透峰开始收集一个穿透峰，洗脱线速度为200～300cm/h；合并步骤S2中第一部分多糖溶液与收集液，浓缩获得高得率螺旋藻多糖。
S7、HA柱层析：柱子的规格优选为Vantage-L 1.6cm×50cm可伸缩实验室规模层析柱，称取30g羟基磷灰石(HA)，浸泡于50ml的0.1mol/L的NaOH溶液中，常温下摇匀静止1h。轻轻搅动层析填料使混合液均匀，用玻璃棒引流于层析柱中，敲击层析柱以确保装填均匀紧实；使用0.004mol/L、pH＝7.0、3-5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡HA层析柱，平衡后，将步骤S5中获得的藻蓝蛋白纯化溶液上样，上样量为柱床体积的1/3～2/3；进样完毕后用含有0.1mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度为0.2mol/L，pH＝7.0进行梯度洗脱，洗脱线速度为200～300cm/h；分别收集洗脱的组分，以获得试剂级的藻蓝蛋白。
藻蓝蛋白的吸光度用紫外-可见分光光度仪检测；藻蓝蛋白纯度计算依据公式P1＝A620/A280；别藻蓝蛋白纯度计算依据公式P2＝A650/A280；藻红蛋白纯度计算依据公式P3＝A565/A280；藻蓝蛋白浓度计算依据公式[PC]＝(A620-0.7×A650)/7.38；回收率计算依据公式Y＝(CtVt/C0V0)×100％，其中：A280、A620、A650分别为波长280、620、650nm处的吸光度；Ct为样品溶液中的藻蓝蛋白(别藻蓝蛋白)质量浓度；C0为粗提液中的藻蓝蛋白质(别藻蓝蛋白)质量浓度；Vt为样品溶液的体积；V0为粗提液的体积。
螺旋藻多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法。苯酚-硫酸法测定多糖含量的原理：在浓硫酸的作用下，多糖水解为单糖并脱水生成糠醛衍生物，后者能与苯酚生成橙黄色化合物，通过比色法可以测出糖浓度，此法简单、快速、灵敏、重复性好。
葡糖糖标准曲线制作：准确称取20mg干燥至恒重的葡萄糖置于100ml容量瓶中，定容后充分混勾，为葡萄糖标准液(0.2mg/ml)；分别吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml葡萄糖标准液至干燥试管中，分别加去离子水将总体积补至0.5ml，在分别加入6％的苯酚溶液1ml，浓硫酸4ml，充分摇匀后37℃水浴15min，室温放置30min冷却后于490nm处测光密度值。
样品中多糖含量的测定：吸取0.5mL适当浓度样品液于具塞试管，加入1mL 6％苯酚和4mL浓硫酸，充分摇匀后置于37℃水浴15min，室温放置30min冷却后于490nm处测光密度值：通过标准曲线方程计算多糖含量。
实施例一
一种从螺旋藻中同时分离纯化藻蓝蛋白与多糖的方法，包括如下步骤：
S1、将螺旋藻干粉按照料液比1：20加入0.02mol/L的pH＝7.0磷酸盐缓冲溶液，搅拌溶胀5h，使藻蓝蛋白以及部分多糖的破壁溶出；再将搅拌溶胀后的溶液进行离心，在4℃下进行10000r/min的高速离心，离心时间10min，分离得液体与固体。
S2、将将步骤S1中获得的液体用5KDa进行超滤，透过液为第一部分多糖溶液，浓缩液中加入固体硫酸铵至饱和度为20％，混匀，静置2h后在4℃下进行10000r/min高速离心，弃沉淀，取上清液一；将步骤S1中获得的固体按照渣液比1:20加入水，并用1M氢氧化钠将其pH值调至12，搅拌提取2h之后在4℃下进行10000r/min高速离心，所得上清液二为第二部分多糖粗提液。
S3、向步骤S2的上清液一中加入硫酸铵至饱和度为40％，搅拌混匀后静置2h，在4℃下进行10000r/min的高速离心，离心时间10min，弃去上清液，获得藻蓝蛋白沉淀；再用1MHCl将上清液二的pH值调至3，静置10min，在4℃下进行10000r/min的高速离心，离心时间10min，弃去沉淀，获得上清液三。
S4、向步骤S3获得藻蓝蛋白沉淀中加入少量0.02M(指磷酸根浓度)，pH为7.0的磷酸缓冲溶液，以将藻蓝蛋白沉淀溶解，再将溶解后的溶液过SephadexTM G-25Fine脱盐柱进行脱盐；脱盐后的溶液为藻蓝蛋白初纯化溶液。
S5、UniM DEAE柱层析：柱子的规格优选为UniM DEAE-50XS PP 15×310mm实验室规模层析预装柱，使用0.02mol/L、pH＝7.0、3～5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡UniM DEAE层析柱，平衡后，将藻蓝蛋白初纯化溶液上样，上样量为柱床体积的1/3～2/3；进样完毕后分别用含1.5mol/L氯化钠的0.02mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲液洗脱样品，洗脱线速度为200～300cm/h；分别收集用洗脱液洗脱的组分，检测组分中藻蓝蛋白纯度和浓度，将主要富含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的组分用0.02mol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲液作为流动相进行脱盐柱脱盐以获得藻蓝蛋白纯化溶液。
S6、UniM SP柱层析：柱子的规格优选为UniM SP-50XS PP 15×310mm实验室规模层析预装柱，0.02mol/L、pH＝4.0、3～5倍柱体积的醋酸-醋酸钠缓冲液平衡UniM SP层析柱，平衡后，将上清液三上样，上样量为柱床体积的1/3～2/3；上样后经过一个穿透峰开始收集一个穿透峰，洗脱线速度为200～300cm/h；合并步骤S2中第一部分多糖溶液与收集液，浓缩获得高得率螺旋藻多糖。
S7、HA柱层析：柱子的规格优选为Vantage-L 1.6cm×50cm可伸缩实验室规模层析柱，称取30g羟基磷灰石(HA)，浸泡于50ml的0.1mol/L的NaOH溶液中，常温下摇匀静止1h。轻轻搅动层析填料使混合液均匀，用玻璃棒引流于层析柱中，敲击层析柱以确保装填均匀紧实；使用0.004mol/L、pH＝7.0、3-5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡HA层析柱，平衡后，将步骤S5中获得的藻蓝蛋白纯化溶液上样，上样量为柱床体积的1/3～2/3；进样完毕后用含有0.1mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度为0.2mol/L，pH＝7.0进行梯度洗脱，洗脱线速度为200～300cm/h；分别收集洗脱的组分，以获得试剂级的藻蓝蛋白。
表1实施例一实验数据
实施例二
一种从螺旋藻中同时分离纯化藻蓝蛋白与多糖的方法，包括如下步骤：
S1、将螺旋藻干粉按照料液比1：20加入0.02mol/L的pH＝7.0磷酸盐缓冲溶液，搅拌溶胀5h，使藻蓝蛋白以及部分多糖的破壁溶出；再将搅拌溶胀后的溶液进行离心，在4℃下进行10000r/min的高速离心，离心时间10min，分离得液体与固体。
S2、将将步骤S1中获得的液体用10KDa进行超滤，透过液为第一部分多糖溶液，浓缩液中加入固体硫酸铵至饱和度为20％，混匀，静置2h后在4℃下进行10000r/min高速离心，弃沉淀，取上清液一；将步骤S1中获得的固体按照渣液比1:20加入水，并用1M氢氧化钠将其pH值调至12，搅拌提取2h之后在4℃下进行10000r/min高速离心，所得上清液二为第二部分多糖粗提液。
S3、向步骤S2的上清液一中加入硫酸铵至饱和度为40％，搅拌混匀后静置2h，在4℃下进行10000r/min的高速离心，离心时间10min，弃去上清液，获得藻蓝蛋白沉淀；再用1MHCl将上清液二的pH值调至4，静置10min，在4℃下进行10000r/min的高速离心，离心时间10min，弃去沉淀，获得上清液三。
S4、向步骤S3获得藻蓝蛋白沉淀中加入少量0.02M(指磷酸根浓度)，pH为7.0的磷酸缓冲溶液，以将藻蓝蛋白沉淀溶解，再将溶解后的溶液过SephadexTM G-25Fine脱盐柱进行脱盐；脱盐后的溶液为藻蓝蛋白初纯化溶液。
S5、UniM DEAE柱层析：柱子的规格优选为UniM DEAE-50XS PP 15×310mm实验室规模层析预装柱，使用0.02mol/L、pH＝7.0、3～5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡UniM DEAE层析柱，平衡后，将藻蓝蛋白初纯化溶液上样，上样量为柱床体积的1/3～2/3；进样完毕后分别用含1.5mol/L氯化钠的0.02mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲液洗脱样品，洗脱线速度为200～300cm/h；分别收集用洗脱液洗脱的组分，检测组分中藻蓝蛋白纯度和浓度，将主要富含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的组分用0.02mol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲液作为流动相进行脱盐柱脱盐以获得藻蓝蛋白纯化溶液。
S6、UniM SP柱层析：柱子的规格优选为UniM SP-50XS PP 15×310mm实验室规模层析预装柱，0.02mol/L、pH＝4.0、3～5倍柱体积的醋酸-醋酸钠缓冲液平衡UniM SP层析柱，平衡后，将上清液三上样，上样量为柱床体积的1/3～2/3；上样后经过一个穿透峰开始收集一个穿透峰，洗脱线速度为200～300cm/h；合并步骤S2中第一部分多糖溶液与收集液，浓缩获得高得率螺旋藻多糖。
S7、HA柱层析：柱子的规格优选为Vantage-L 1.6cm×50cm可伸缩实验室规模层析柱，称取30g羟基磷灰石(HA)，浸泡于50ml的0.1mol/L的NaOH溶液中，常温下摇匀静止1h。轻轻搅动层析填料使混合液均匀，用玻璃棒引流于层析柱中，敲击层析柱以确保装填均匀紧实；使用0.004mol/L、pH＝7.0、3-5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡HA层析柱，平衡后，将步骤S5中获得的藻蓝蛋白纯化溶液上样，上样量为柱床体积的1/3～2/3；进样完毕后用含有0.1mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度为0.2mol/L，pH＝7.0进行梯度洗脱，洗脱线速度为200～300cm/h；分别收集洗脱的组分，以获得试剂级的藻蓝蛋白。
表2实施例二实验数据
实施例三
一种从螺旋藻中同时分离纯化藻蓝蛋白与多糖的方法，包括如下步骤：
S1、将螺旋藻干粉按照料液比1：20加入0.02mol/L的pH＝7.0磷酸盐缓冲溶液，搅拌溶胀5h，使藻蓝蛋白以及部分多糖的破壁溶出；再将搅拌溶胀后的溶液进行离心，在4℃下进行10000r/min的高速离心，离心时间10min，分离得液体与固体。
S2、将将步骤S1中获得的液体用20KDa进行超滤，透过液为第一部分多糖溶液，浓缩液中加入固体硫酸铵至饱和度为20％，混匀，静置2h后在4℃下进行10000r/min高速离心，弃沉淀，取上清液一；将步骤S1中获得的固体按照渣液比1:20加入水，并用1M氢氧化钠将其pH值调至12，搅拌提取2h之后在4℃下进行10000r/min高速离心，所得上清液二为第二部分多糖粗提液。
S3、向步骤S2的上清液一中加入硫酸铵至饱和度为40％，搅拌混匀后静置2h，在4℃下进行10000r/min的高速离心，离心时间10min，弃去上清液，获得藻蓝蛋白沉淀；再用1MHCl将上清液二的pH值调至5，静置10min，在4℃下进行10000r/min的高速离心，离心时间10min，弃去沉淀，获得上清液三。
S4、向步骤S3获得藻蓝蛋白沉淀中加入少量0.02M(指磷酸根浓度)，pH为7.0的磷酸缓冲溶液，以将藻蓝蛋白沉淀溶解，再将溶解后的溶液过SephadexTM G-25Fine脱盐柱进行脱盐；脱盐后的溶液为藻蓝蛋白初纯化溶液。
S5、UniM DEAE柱层析：柱子的规格优选为UniM DEAE-50XS PP 15×310mm实验室规模层析预装柱，使用0.02mol/L、pH＝7.0、3～5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡UniM DEAE层析柱，平衡后，将藻蓝蛋白初纯化溶液上样，上样量为柱床体积的1/3～2/3；进样完毕后分别用含1.5mol/L氯化钠的0.02mol/L、pH＝7.0的磷酸盐缓冲液洗脱样品，洗脱线速度为200～300cm/h；分别收集用洗脱液洗脱的组分，检测组分中藻蓝蛋白纯度和浓度，将主要富含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的组分用0.02mol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲液作为流动相进行脱盐柱脱盐以获得藻蓝蛋白纯化溶液。
S6、UniM SP柱层析：柱子的规格优选为UniM SP-50XS PP 15×310mm实验室规模层析预装柱，0.02mol/L、pH＝4.0、3～5倍柱体积的醋酸-醋酸钠缓冲液平衡UniM SP层析柱，平衡后，将上清液三上样，上样量为柱床体积的1/3～2/3；上样后经过一个穿透峰开始收集一个穿透峰，洗脱线速度为200～300cm/h；合并步骤S2中第一部分多糖溶液与收集液，浓缩获得高得率螺旋藻多糖。
S7、HA柱层析：柱子的规格优选为Vantage-L 1.6cm×50cm可伸缩实验室规模层析柱，称取30g羟基磷灰石(HA)，浸泡于50ml的0.1mol/L的NaOH溶液中，常温下摇匀静止1h。轻轻搅动层析填料使混合液均匀，用玻璃棒引流于层析柱中，敲击层析柱以确保装填均匀紧实；使用0.004mol/L、pH＝7.0、3-5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡HA层析柱，平衡后，将步骤S5中获得的藻蓝蛋白纯化溶液上样，上样量为柱床体积的1/3～2/3；进样完毕后用含有0.1mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度为0.2mol/L，pH＝7.0进行梯度洗脱，洗脱线速度为200～300cm/h；分别收集洗脱的组分，以获得试剂级的藻蓝蛋白。
表3实施例三实验数据
依据上述三个实施例制得的藻蓝蛋白为深蓝色溶液，藻蓝蛋白的纯度(A620/A280)大于4.0，满足高纯度藻蓝蛋白纯度的要求，为试剂级藻蓝蛋白，蛋白质回收率≥6.0％。多糖得率≥4.0％，满足目的要求。
综上所述，本发明以螺旋藻为原料，采用盐析联合柱层析制备高纯度藻蓝蛋白和多糖，与传统层析法工艺相比，在兼顾蛋白质回收率的前提下，能同时提取纯化两种高纯度的藻蓝蛋白和高得率多糖，提高了螺旋藻综合提取纯化的效率。本发明有效克服了现有技术中的种种缺点，具高度产业利用价值。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.一种从螺旋藻中同时分离纯化藻蓝蛋白和多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，将螺旋藻进行破壁产生藻液，藻液进行固液分离，所得液体为藻蓝蛋白与第一部分多糖混合粗提液，所得固体作为提取纯化第二部分多糖使用；
S2，将步骤S1中获得的液体进行超滤，透过液为第一部分多糖溶液；浓缩液中加入适量硫酸铵混匀，静置后离心，获得上清液一；将步骤S1中获得的固体溶于水，调节pH至碱性，进行碱提破壁，再将其离心，获得上清液二，所得上清液二为第二部分多糖粗提液；
S3，向步骤S2中的上清液一中加适量硫酸铵混匀，静置后离心，获得沉淀；调节步骤S2中的上清液二的pH至酸性，静置后离心，获得上清液三；
S4，将步骤S3中的沉淀用磷酸盐缓冲溶液溶解，并用去离子水作为脱盐流动相进行脱盐，脱盐后的溶液为藻蓝蛋白初纯化溶液；
S5，将步骤S4的藻蓝蛋白初纯化溶液，过聚丙烯酸脂层析柱，用洗脱液进行梯度洗脱，分别收集洗脱液的组分，检测各组分中藻蓝蛋白的纯度和浓度，将富含藻蓝蛋白的组分用磷酸盐缓冲液作为流动相进行脱盐，以获得藻蓝蛋白纯化溶液；
S6，将步骤S3的上清液三，过聚丙烯酸脂层析柱，进行吸附杂蛋白，收集穿透峰，得第二部分多糖溶液；在将第二部分多糖溶液与步骤S2获得的第一部分多糖溶液合并，浓缩得多糖；
S7，将步骤S5中获得的藻蓝蛋白纯化溶液过羟基磷灰石层析柱，用洗脱液进行梯度洗脱，分别收集洗脱液组分，合并得高纯度藻蓝蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1包括：将螺旋藻干粉按照料液比1：20加入0.02mol/L的pH7.0磷酸盐缓冲溶液，搅拌溶胀5h；再将搅拌溶胀后的溶液进行离心，分离得所述液体和所述固体。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤S2包括：将步骤S1中获得的液体用5KDa进行超滤，透过液为第一部分多糖溶液，浓缩液中加入硫酸铵至饱和度为20%，混匀，静置后离心，弃沉淀，取上清液一；将步骤S1中获得的固体按照固液比1:20加入水，并用1M氢氧化钠调节pH12，搅拌提取2h之后离心，取上清液二。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S5采用0.02mol/L、pH＝7.0、3～5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡弱阴离子聚丙烯酸脂层析柱，平衡后，将藻蓝蛋白初纯化溶液上样，上样量为柱床体积的1/3～2/3；用含2M氯化钠的0.02M、pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液进行梯度洗脱，洗脱线速度为200~300cm/h。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S6采用0.02mol/L、pH＝4.0、3～5倍柱体积的醋酸-醋酸铵缓冲液平衡强阳离子聚丙烯酸脂层析柱，平衡后上样，上样量为柱床体积的1/3～2/3；上样后经过一个穿透峰开始收集一个穿透峰，洗脱线速度为200~300cm/h。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S7采用0 .01mol/L、pH＝7.0、3～5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱，平衡后，将步骤S5中的藻蓝蛋白纯化溶液上样，上样量为柱床体积的1/3～2/3。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S4中磷酸盐缓冲液的浓度为0.02mol/L，pH为7.0，选用Sephadex G-25脱盐柱进行脱盐。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中向上清液一中加硫酸铵只饱和度为40%，用1M HCl将上清液二的pH值调至4。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心操作在4℃下进行。
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