CN105624134A - 限制性凝血酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种纯度高、比活高的限制性凝血酶的制备方法，利用阴离子交换层析介质从猪血浆中吸附凝血酶原，对阴离子层析柱进行洗脱，活化凝血酶原，得凝血酶粗溶液，经超滤浓缩，得凝血酶浓缩液，再用阳离子交换层析介质吸附凝血酶，对阳离子层析柱进行洗脱，得凝血酶溶液，经超滤脱盐浓缩，最后冻干得限制性凝血酶成品。本发明的有益效果在于：利用猪血制备限制性凝血酶，有利于充分利用猪血资源，减少环境污染；在常温常压下即可制备限制性凝血酶，减少设备投资；制备得到的限制性凝血酶纯度高，可达到电泳纯，可用于酶切GST融合蛋白；操作简单，仅需离心、上样层析、超滤和冻干等几个步骤，容易实现工业化生产。

Description

限制性凝血酶的制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体地说是一种限制性凝血酶的制备方法。
背景技术
凝血酶(Thrombin,EC3.4.21.5)是血浆凝血系统中的一种具有高度特异性的丝氨酸蛋白水解酶，可作为局部止血药，是凝血酶冻干粉的主要原料。凝血酶可以水解纤维蛋白原生成纤维蛋白单体，促使血小板分泌和聚集，因此，凝血酶在血液凝固和止血过程中发挥着重要的作用。在临床上，凝血酶广泛应用于局部止血，可用于手术中不易结扎的小血管止血，消化道出血以及外伤出血等。凝血酶能识别LeuValProArg↓GlySer氨基酸序列，因此凝血酶在基因工程中所得到的融合蛋白产品的后序加工处理过程中具有独特的作用，为达到子目的，必须使用限制性的凝血酶。现有技术制备方法一般包括三个基本步骤，即提取、纯化和冻干(或制剂)。公开号为CN1844380A的发明专利提出了一种制备高纯度凝血酶的方法，该方法利用层析介质吸附低纯度凝血酶溶液，对层析柱进行洗脱，收集凝血酶蛋白峰，再经凝胶层析，超滤脱盐浓缩，最后冻干得限制性凝血酶成品。该专利申请涉及到利用凝胶层析，不容易实现工业化生产，且仅用到比活一个参数，不足以说明凝血酶的纯度。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种纯度高、比活高的限制性凝血酶的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：限制性凝血酶的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、向新鲜猪血中加入抗凝剂，离心分离，取上清抗凝血浆；
步骤2、将上清抗凝血浆用阴离子交换柱层析，然后用洗脱剂Ⅰ对阴离子交换柱进行洗脱，所得洗脱液即为凝血酶原溶液；
步骤3、活化凝血酶原溶液中的凝血酶原，得凝血酶粗溶液；
步骤4、将凝血酶粗溶液进行超滤浓缩，得凝血酶浓缩液；
步骤5、将所得的凝血酶浓缩液用阳离子交换柱层析，然后用洗脱剂Ⅱ对阳离子交换柱进行洗脱，收集凝血酶蛋白峰，得初步纯化的凝血酶溶液；
步骤6、将步骤5所得凝血酶溶液用平衡液进行透析；
步骤7、将步骤6所得凝血酶溶液用阳离子交换柱层析，然后用洗脱剂Ⅲ对阳离子交换柱进行洗脱，所得洗脱液即为限制性凝血酶溶液；
步骤8、将限制性凝血酶溶液进行超滤脱盐浓缩，得限制性凝血酶浓缩液；
步骤9、将限制性凝血酶浓缩液冻干，即得白色粉末状限制性凝血酶成品。
本发明的有益效果在于：利用猪血制备限制性凝血酶，有利于充分利用猪血资源，减少环境污染；在常温常压下即可制备限制性凝血酶，减少设备投资；制备得到的限制性凝血酶纯度高，可达到电泳纯，可用于酶切GST融合蛋白；操作简单，仅需离心、上样层析、超滤和冻干等几个步骤，容易实现工业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例1限制性凝血酶制备方法的流程图。
图2为本发明实施例2限制性凝血酶冻干粉纯度检测SDS-PAGE色谱图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：利用带正电荷的阴离子交换柱结合带负电荷的凝血酶原，利用带负电荷的阳离子交换柱结合带正电荷的凝血酶，再将凝血酶原或凝血酶从交换柱上洗脱下来，常温常压下即可进行限制性凝血酶的制备，纯度高，投资少。
请参照图1，限制性凝血酶的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、向新鲜猪血中加入抗凝剂，离心分离，取上清抗凝血浆；
步骤2、将上清抗凝血浆用阴离子交换柱层析，然后用洗脱剂Ⅰ对阴离子交换柱进行洗脱，所得洗脱液即为凝血酶原溶液；
步骤3、在常温常压下活化凝血酶原溶液中的凝血酶原，得凝血酶粗溶液；
步骤4、将凝血酶粗溶液进行超滤浓缩，得凝血酶浓缩液；
步骤5、将所得的凝血酶浓缩液用阳离子交换柱层析，然后用洗脱剂Ⅱ对阳离子交换柱进行洗脱，收集凝血酶蛋白峰，得初步纯化的凝血酶溶液；
步骤6、将步骤5所得凝血酶溶液用平衡液进行透析；
步骤7、将步骤6所得凝血酶溶液用阳离子交换柱层析，然后用洗脱剂Ⅲ对阳离子交换柱进行洗脱，所得洗脱液即为限制性凝血酶溶液；
步骤8、将限制性凝血酶溶液进行超滤脱盐浓缩，得限制性凝血酶浓缩液；
步骤9、将限制性凝血酶浓缩液冻干，即得白色粉末状限制性凝血酶成品。
由于蛋白质具有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。凝血酶原的等电点为pH＝4.2，通过带正电荷的阴离子交换柱结合上清抗凝血浆中带负电荷的凝血酶原，通过洗脱剂Ⅰ将凝血酶原从阴离子交换柱上洗脱下来。凝血酶原经活化得到凝血酶，凝血酶的等电点为pH为7.02，再用阳离子交换柱结合凝血酶溶液中的凝血酶，通过洗脱剂Ⅱ洗脱后透析，透析后再次用阳离子交换柱吸附凝血酶，用洗脱剂Ⅲ将凝血酶从阳离子交换柱上洗脱下来，浓缩、冻干后即得白色粉末状限制性凝血酶成品。上述方法常温常压下即可进行限制性凝血酶的制备，设备投资少，由于是根据交换柱上与溶液中的离子结合力大小的差别进行分离纯化，制得的限制性凝血酶纯度高、比活高。
其中，所述抗凝剂为柠檬酸三钠质量分数为3.8％的柠檬酸三钠溶液，所述抗凝剂与血液的体积比为1∶7～1∶9。
其中，所述洗脱剂Ⅰ为pH为7.0、柠檬酸三钠浓度为0.02mol/L的柠檬酸三钠溶液。
其中，所述步骤3具体为：以氯化钙为活化剂，向凝血酶原溶液中加入氯化钙溶液，使凝血酶原溶液中所含Ca2+的终浓度为0.05～0.15mol/L，在常温常压下活化1～3小时得凝血酶粗溶液。
其中，所述洗脱剂Ⅱ包括第一基础液和第一梯度液，所述第一基础液为pH值5.0～6.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，所述第一基础液中柠檬酸-磷酸盐浓度为0.01～0.03mol/L；所述第一梯度液为pH值5.0～6.0的含有第一离子增强剂的缓冲液，所述第一梯度液中的缓冲剂柠檬酸-磷酸盐的浓度0.01～0.03mol/L，所述第一梯度液中第一离子增强剂浓度为0.2～1.0mol/L。
其中，所述洗脱剂Ⅲ包括第二基础液和第二梯度液，所述第二基础液为pH值为5.0～6.0的醋酸钠-醋酸缓冲液，所述第二基础液中醋酸钠-醋酸的浓度为0.01～0.03mol/L，所述第二梯度液为pH值5.0～6.0的含有离子增强剂的缓冲液，所述第二梯度液中的缓冲剂乙酸钠-乙酸的浓度为0.01～0.03mol/L，所述第二梯度液中第二离子增强剂的浓度为0.2～1.0mol/L。
其中，所述第一离子增强剂和第二离子增强剂为氯化钠、氯化钾或其他无机盐中的一种或几种。
其中，所述平衡液为含有氯化钠的缓冲液，所述平衡液的pH为5.0～6.0，所述平衡液中的缓冲剂乙酸-乙酸钠浓度为0.01～0.03mol/L。
其中，所述阴离子交换柱为DEAESepharoseFastFlow阴离子交换柱，所述阳离子交换柱为DEAESephroseCL-6B阳离子交换柱。
实施例1
请参照图1，取新鲜猪血9L，加入3.8％的柠檬酸三钠溶液抗凝剂1L，离心分离。取上清抗凝血浆5L。将抗凝血浆上样到事先平衡好的DEAESepharoseFastFlow阴离子交换柱，用调节pH为7，浓度为0.02mol/L的柠檬酸三钠洗脱剂进行洗脱，得凝血酶原洗脱液2200mL，对洗脱液进行超滤脱盐，得凝血酶原溶液。加入1mol/L的CaCl2溶液165mL，使得凝血酶原溶液中Ca2+的终浓度为0.07mol/L，常温常压下活化凝血酶原3h，得凝血酶溶液2365mL。采用超滤机对凝血酶溶液进行浓缩，浓缩约11倍左右，得凝血酶粗溶液200mL，标记为A1。
将200mL粗凝血酶溶液A1上样到已平衡好的DEAESephroseCL-6B离子交换柱，用pH为5.3、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲剂浓度为0.02mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲剂作为基础液；用pH为5.3、柠檬酸-磷酸氢二钠浓度为0.02mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲剂以及氯化钠浓度为1mol/L组成的混合液作为梯度剂；由上述基础液和梯度洗脱剂针对层析柱进行梯度洗脱，收集凝血酶活性峰A2，得初步纯化的凝血酶洗脱液155mL。
将收集的凝血酶洗脱液A2装于截留分子为3500Da的透析袋中，用含0.2mol/L氯化钠，浓度为0.02mol/L，pH值为5.3的乙酸钠-乙酸缓冲液进行透析。然后上样到已平衡好的DEAESephroseCL-6B离子交换柱，用含0.2mol/L氯化钠，浓度为0.02mol，pH值为5.3的乙酸钠-乙酸缓冲剂作为基础液；用调节pH为5.3，浓度为0.02mol/L的乙酸钠-乙酸缓冲剂以及氯化钠浓度为1mol/L组成的混合液作为梯度剂；由上述基础液和梯度洗脱剂针对层析柱进行梯度洗脱，收集凝血酶活性峰A3，得限制性凝血酶洗脱液345mL。
将限制性凝血酶溶液A3进行超滤脱盐浓缩，得到72ml限制性凝血酶浓缩液，标记为A4。冻干上述限制性凝血酶浓缩液，即得白色粉末状限制性凝血酶成品。
实施例2
凝血酶的检测
1、凝血酶效价以及蛋白浓度检测
按照《中华人民共和国药典》2015版二部第1561-1562页的有关凝血酶效价标准检测方法，作标准曲线，对上述实施案例1中凝血酶溶液A1、A2、A3、A4、进行效价测定。另外，对凝血酶溶液A1、A2、A3、A4进行了蛋白浓度的检测，测定方法采用《中国药典》2015版四部通则0731蛋白质含量测定法中的“第二法福林酚法(Lowry法)”，凝血酶效价及蛋白浓度检测结果见表1。
根据凝血酶效价检测结果以及相应的蛋白浓度检测结果，计算凝血酶比活和得率，其结果如表2所示。
表1
表2
2、凝血酶纯度检测
对实施例1制备的限制性凝血酶冻干制剂进行纯度检测，纯度测定方法为《中国药典》2015年版通则0541电泳法中的“第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法”，SDS-PAGE电泳图谱见图2，其中泳道1表示marker，泳道2为sigma凝血酶，泳道3为国内某厂家凝血酶，泳道4为本发明实施例1制备得到的凝血酶。
图2显示，本发明所制备的限制性凝血酶呈单一条带，经过本发明的精提纯化，限制性凝血酶成品可达到电泳纯。
综上所述，本发明提供的限制性凝血酶的制备方法的有益效果在于：利用猪血制备限制性凝血酶，有利于充分利用猪血资源，减少环境污染；在常温常压下即可制备限制性凝血酶，减少设备投资；制备得到的限制性凝血酶纯度高，可达到电泳纯，可用于酶切GST融合蛋白；操作简单，仅需离心、上样层析、超滤和冻干等几个步骤，容易实现工业化生产。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.限制性凝血酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1、向新鲜猪血中加入抗凝剂，离心分离，取上清抗凝血浆；
步骤2、将上清抗凝血浆用阴离子交换柱层析，然后用洗脱剂Ⅰ对阴离子交换柱进行洗脱，所得洗脱液即为凝血酶原溶液；
步骤3、活化凝血酶原溶液中的凝血酶原，得凝血酶粗溶液；
步骤4、将凝血酶粗溶液进行超滤浓缩，得凝血酶浓缩液；
步骤5、将所得的凝血酶浓缩液用阳离子交换柱层析，然后用洗脱剂Ⅱ对阳离子交换柱进行洗脱，收集凝血酶蛋白峰，得初步纯化的凝血酶溶液；
步骤6、将步骤5所得凝血酶溶液用平衡液进行透析；
步骤7、将步骤6所得凝血酶溶液用阳离子交换柱层析，然后用洗脱剂Ⅲ对阳离子交换柱进行洗脱，所得洗脱液即为限制性凝血酶溶液；
步骤8、将限制性凝血酶溶液进行超滤脱盐浓缩，得限制性凝血酶浓缩液；
步骤9、将限制性凝血酶浓缩液冻干，即得白色粉末状限制性凝血酶成品。
2.根据权利要求1所述的限制性凝血酶的制备方法，其特征在于：所述抗凝剂为柠檬酸三钠质量分数为3.8％的柠檬酸三钠溶液，所述抗凝剂与血液的体积比为1∶7～1∶9。
3.根据权利要求1所述的限制性凝血酶的制备方法，其特征在于：所述步骤3具体为：以氯化钙为活化剂，向凝血酶原溶液中加入氯化钙溶液，使凝血酶原溶液中所含Ca2+的终浓度为0.05～0.15mol/L，在常温常压下活化1～3小时得凝血酶粗溶液。
4.根据权利要求1所述的限制性凝血酶的制备方法，其特征在于：所述洗脱剂Ⅰ为pH为7.0、柠檬酸三钠浓度为0.02mol/L的柠檬酸三钠溶液。
5.根据权利要求1所述的限制性凝血酶的制备方法，其特征在于：所述洗脱剂Ⅱ包括第一基础液和第一梯度液，所述第一基础液为pH值5.0～6.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，所述第一基础液中柠檬酸-磷酸盐浓度为0.01～0.03mol/L；所述第一梯度液为pH值5.0～6.0的含有第一离子增强剂的缓冲液，所述第一梯度液中的缓冲剂柠檬酸-磷酸盐的浓度0.01～0.03mol/L，所述第一梯度液中第一离子增强剂浓度为0.2～1.0mol/L。
6.根据权利要求1所述的限制性凝血酶的制备方法，其特征在于：所述洗脱剂Ⅲ包括第二基础液和第二梯度液，所述第二基础液为pH值为5.0～6.0的醋酸钠-醋酸缓冲液，所述第二基础液中醋酸钠-醋酸的浓度为0.01～0.03mol/L，所述第二梯度液为pH值5.0～6.0的含有离子增强剂的缓冲液，所述第二梯度液中的缓冲剂乙酸钠-乙酸的浓度为0.01～0.03mol/L，所述第二梯度液中第二离子增强剂的浓度为0.2～1.0mol/L。
7.根据权利要求1所述的限制性凝血酶的制备方法，其特征在于：所述平衡液为含有氯化钠的缓冲液，所述平衡液的pH为5.0～6.0，所述平衡液中的缓冲剂乙酸-乙酸钠浓度为0.01～0.03mol/L。
8.根据权利要求1所述的限制性凝血酶的制备方法，其特征在于：所述阴离子交换柱为DEAESepharoseFastFlow阴离子交换柱。
9.根据权利要求1所述的限制性凝血酶的制备方法，其特征在于：所述阳离子交换柱为DEAESephroseCL-6B阳离子交换柱。
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Denomination of invention: Preparation of restricted thrombin

Effective date of registration: 20200820

Granted publication date: 20190521

Pledgee: Jingdong sub branch of Fujian Sanming Rural Commercial Bank Co., Ltd

Pledgor: FUJIAN HUAGENE BIOSCIENCES Co.,Ltd.

Registration number: Y2020980005205