CN101948529A

CN101948529A - 一种高效纯化金属离子结合蛋白的疏水层析分离纯化方法

Info

Publication number: CN101948529A
Application number: CN 201010252608
Authority: CN
Inventors: 苏志国; 张焱; 罗坚; 马光辉
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Priority date: 2010-08-13
Filing date: 2010-08-13
Publication date: 2011-01-19
Anticipated expiration: 2030-08-13
Also published as: CN101948529B

Abstract

本发明一种高效纯化金属离子结合蛋白的疏水层析分离纯化方法，其步骤为：选取含有金属离子结合蛋白的待分离物料，添加沉淀剂进行沉淀粗分离获得蛋白混合物。在蛋白混合物中添加过量的螯合剂去除目标蛋白的辅基金属离子I，透析去除螯合剂后添加适量不易沉淀的金属离子II，以保持目标蛋白的三级结构。将处理所得蛋白混合物进行疏水层析分离操作，并在层析缓冲液中添加适量的金属离子II，由于金属离子辅基II可以有效地保持目标蛋白的天然结构，因此可以有效地提高目标蛋白与杂蛋白在疏水层析中的分辨率。进一步通过凝胶过滤层析可以得到高纯度、高回收率的金属离子结合蛋白的纯品，生产工艺稳定，适于规模化生产。

Description

一种高效纯化金属离子结合蛋白的疏水层析分离纯化方法

技术领域

本发明属于蛋白质的分离纯化方法，特别是涉及一种使用新型疏水层析纯化金属离子结合蛋白的分离纯化方法。

背景技术

许多蛋白质中含有金属离子辅基，这些金属离子对蛋白质的结构和性质具有重要的意义。金属离子结合蛋白质的纯化过程存在一些困难，在纯化过程中金属离子的丧失会导致蛋白质丧失天然结构，内部疏水性基团的过度暴露会影响该蛋白质在疏水层析过程中的分辨率。

在我们此前申请的专利(苏志国，张焱等，异源同种乳清蛋白的分离纯化方法，申请号200810118961.7)中，报道了可以使用疏水层析方法分离性质非常接近的牛源和人源α-乳清白蛋白，但是在疏水层析操作条件下，α-乳清白蛋白结合的钙离子容易发生沉淀丧失进而影响疏水层析的分辨率，因此疏水层析方法有待改进。

发明内容

本发明的目的是提供一种纯化金属离子结合蛋白的新型疏水层析纯化方法。

本发明采用的技术方案步骤如下：

1)选取至少含有一种金属离子结合蛋白的待分离原料，沉淀离心去除脂类和杂蛋白后收集上清液获得蛋白混合物；

2)在所得蛋白混合物中添加过量的螯合剂去除乳清蛋白中的辅基金属离子I；

3)所得蛋白混合物进行透析操作去除螯合剂；

4)在所得蛋白混合物中添加适量的辅基金属离子II；

5)在疏水层析缓冲液中添加适量的辅基金属离子II；

6)将乳清经过疏水作用层析和凝胶过滤层析联用的组合层析，分离得到金属离子结合蛋白。

本发明所述的待分离原料为转基因动物乳液、转基因工程菌的发酵液、转基因动物细胞的发酵液等，优选为转基因哺乳动物乳液，所述的金属离子结合蛋白优选为转基因人源α-乳清白蛋白、乳转铁蛋白等；以下仅以一种蛋白的分离来加以说明，但本发明的保护不局限与此；牛乳中总蛋白浓度为30-38g/L，异源同种乳清蛋白总浓度1.0-4.0g/L，优选蛋白总浓度为1.5-3.5g/L。

本发明所述的沉淀方法可采用酸性沉淀、凝乳酶沉淀或硫酸铵沉淀的方法。在采用酸性沉淀时，需在室温下将待分离原料调节pH到3.5-5.5，优选的pH值为4.0-5.0，静置15分钟，离心收集上清液。在采用凝乳酶法时，向待分离原料中加入浓度为5％的凝乳酶溶液，牛乳与凝乳酶溶液体积比例为20-500∶1，优选的比例为50-200∶1，室温下反应10分钟，离心收集上清液。在采用硫酸铵沉淀方法时，调节待分离原料的pH到5.0-10.0，优选的pH值为6.0-8.0，并通过加入硫酸铵粉末使得乳清中硫酸铵饱和度为20％-60％，以摩尔数计为0.86-2.95M，优选的硫酸铵饱和度为30％-60％，以摩尔数计为1.33-2.37M，振荡2小时，离心收集上清液或收集沉淀并使用20mM磷酸盐缓冲液复溶后备用。

本发明所述的螯合剂可以采用EDTA，8-羟基喹啉等。当处理转基因人源α-乳清白蛋白时，优选的螯合剂为EDTA；当处理转基因人源乳转铁蛋白时，优选的螯合剂为8-羟基喹啉。

本发明所述的乳清蛋白的辅基金属离子I为钙离子、三价铁离子等，辅基金属离子I容易在酸性沉淀步骤中因为低pH条件而同蛋白分离开，进而在后续疏水层析缓冲液中的阴离子如硫酸根反应沉淀。丧失辅基金属离子之后，金属离子结合蛋白质会发生结构变化，蛋白质内部疏水基团的大量暴露导致疏水性的升高，从而使其与其它高疏水性的杂蛋白之间的疏水性差异减少，影响疏水层析的分辨率。

本发明所述的透析操作中，本领域技术人员可根据异源同种乳清蛋白的类型和螯合剂的类型选择合适的截留分子量的透析膜或透析袋进行透析，透析液缓冲液优选为20-100mM，pH6.0-8.0的磷酸盐缓冲液。

本发明所述的辅基金属离子II，可以采用钾离子、钠离子、镁离子等，优选钾离子，添加量优选为1-50mM。辅基金属离子II可以同金属离子结合蛋白相结合，且不会同疏水层析缓冲液中的阴离子发生沉淀反应，有利于保持金属离子结合蛋白的空间结构，有效地提高其在疏水层析分离纯化中的分辨率。

本发明所述的疏水作用层析中，疏水作用层析介质采用琼脂糖材料为基质，所述的配基可为丁基、苯基、辛基，优选为丁基。

本发明所述的疏水作用层析中，可采用的疏水盐为硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等，优选采用硫酸铵。

本发明所述的疏水作用层析中，缓冲液体系可采用磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，优选为磷酸盐缓冲液；低盐缓冲液优选为20-100mM，pH6.0-8.0的磷酸盐缓冲液，缓冲液无疏水盐或疏水盐浓度在0.5M以下，添加辅基金属离子II浓度优选为1-50mM；高盐缓冲液优选为20-100mM，pH6.0-8.0的磷酸盐缓冲液，疏水盐浓度为0.5-2.0M，优选浓度为0.6-1.2M，添加辅基金属离子II浓度优选为1-50mM。

本发明所述的疏水作用层析中，将处理得到的蛋白混合物溶液调节pH到5.0-10.0，优选的pH值为6.0-8.0；并将乳清溶液调节疏水盐浓度为0.5-2.0M，优选浓度为0.6-1.5M，疏水盐浓度采用低盐缓冲液调节。

本发明所述的疏水层析中，本领域技术人员可根据金属离子结合蛋白的种类选择合适的疏水层析介质、层析柱和进样速度将经预处理后的蛋白混合物溶液进样到用高盐缓冲液平衡好的疏水层析柱中，层析过程使用280nm紫外吸收波长进行蛋白质的检测，进样的蛋白混合物溶液体积为0.5-5.0倍层析柱体积，优选为1.0-3.0倍层析柱体积。

本发明所述的疏水层析中，本领域技术人员可根据金属离子结合蛋白的性质选择合适的分离模式进行纯化。在吸附解吸分离模式中，蛋白混合物中金属离子结合蛋白在适宜的高盐浓度下同疏水介质的配基相结合保留在柱中，而低疏水性的杂质蛋白则无法保留，全部样品进样完毕后，用高盐缓冲液冲洗去疏水作用层析柱中未保留的蛋白，直到紫外吸收波长回到基线；再用低盐缓冲液洗脱，洗脱方式可为一步洗脱、阶段洗脱、线形洗脱，收集洗脱液以得到金属离子结合蛋白。在穿透分离模式中，蛋白混合物中的高疏水性杂质蛋白在适宜的高盐浓度下同疏水介质的配基相结合保留在柱中，而目标金属离子结合蛋白则无法保留，收集穿透组分可以得到金属离子结合蛋白。

本领域技术人员可调节工艺参数以得到不同的金属离子结合蛋白的初步纯化产品或纯品；由于本发明的疏水层析过程中添加适量的辅基金属离子II，从而有效的保持金属离子结合蛋白的天然结构，通过本步骤可以有效地纯化金属离子结合蛋白。

本发明所述的凝胶过滤层析中，将金属离子结合蛋白的初步纯化产品再经凝胶过滤层析除去剩余杂质以得到纯品，凝胶过滤层析介质为琼脂糖介质，优选为Superdex 75。

本发明相对于现有技术，由于采用了在疏水层析过程中添加辅基金属离子II的方法，可有效地提高金属离子结合蛋白与杂蛋白之间的疏水性差异，可调节具体疏水层析的工艺条件，实现金属离子结合蛋白的高效纯化，得到不同的金属离子结合蛋白初步纯化产品或纯品；采用了凝胶过滤层析对初步纯化产品进行了进一步的精制纯化，得到了高纯度的金属离子结合蛋白的纯品；采用以疏水层析为核心的复合工艺方法，生产工艺稳定，适于进行金属离子结合蛋白的规模化生产，产品纯度高，工艺回收率高。

附图说明

图1为分离纯化工艺流程图

图2为疏水层析分离纯化人源α-乳清白蛋白和牛源α-乳清白蛋白。

图3为凝胶过滤I分离纯化人源α-乳清白蛋白。

图4为凝胶过滤II分离纯化牛源α-乳清白蛋白。

实施例1

取100mL转基因人源α-乳清白蛋白牛乳，牛乳总蛋白浓度为33g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为1.4g/L，牛源α-乳清白蛋白浓度为1.0g/L。乳液调节pH4.6，静置15分钟后使用Sigma 3k30离心机4摄氏度下，调离心力为10000g离心30分钟去除脂类和酪蛋白后收集上清液获得乳清80mL，总蛋白浓度为9.5g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为1.7g/L，牛源α-乳清白蛋白浓度为1.2g/L。向乳清中添加EDTA使得EDTA浓度为200mM，静置15分钟后使用截留分子量为3KD的透析膜透析24小时，透析缓冲液使用pH7.0的20mM磷酸盐缓冲液，透析完成后在乳清中添加硫酸钾粉末使得硫酸钾浓度为50mM。

使用1M的盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清pH到8.0，缓慢加入硫酸铵粉末到乳清硫酸铵浓度达到0.8M，使用1M盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清预处理样品pH到8.0，进样到用20mM，pH7.0含0.8M硫酸铵，50mM硫酸钾的磷酸盐缓冲液预平衡好的Butyl Sepharose 4FF疏水层析柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度10厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波长吸收检测，流速10ml/min，上样完毕后用20mM，pH8.0含0.8M硫酸铵，50M硫酸钾的磷酸盐缓冲液继续冲洗至280nm紫外吸收信号回到基线，收集上样的穿透峰150mL，总蛋白浓度为3.8g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为0.2g/L，牛源α-乳清白蛋白浓度为0.5g/L；再用20mM，pH8.0的磷酸盐缓冲液一步洗脱并收集洗脱峰112mL，总蛋白浓度为1.5g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为0.9g/L，牛源α-乳清白蛋白浓度为0.2g/L。

取疏水层析洗脱峰30mL进样到用20mM，pH7.0含0.1M硫酸钠的磷酸盐缓冲液预平衡好的Superdex 75凝胶过滤层析柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度60厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波长吸收检测，流速2mL/min，上样完毕后继续用20mM，pH7.0含0.1M硫酸钠的磷酸盐缓冲液冲洗，收集230mL处的蛋白峰共80mL，总蛋白浓度为0.35g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为0.32g/L，工艺回收率68％，纯度91％，牛源α-乳清白蛋白浓度为0.02g/L。

取疏水层析穿透峰30mL进样到用20mM，pH7.0含0.1M硫酸钠的磷酸盐缓冲液预平衡好的Superdex 75凝胶过滤层析柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度60厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波长吸收检测，流速2mL/min，上样完毕后继续用20mM，pH7.0含0.1M硫酸钠的磷酸盐缓冲液冲洗，收集230mL处的蛋白峰共70mL，总蛋白浓度为0.22g/L，牛源α-乳清白蛋白浓度为0.2g/L，工艺回收率70％，纯度91％，人源α-乳清白蛋白浓度为0.01g/L。

实施例2

取100mL转基因人源α-乳清白蛋白牛乳，牛乳总蛋白浓度为33g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为1.4g/L，牛源α-乳清白蛋白浓度为1.0g/L。乳液调节pH4.7，静置15分钟后使用Sigma 3k30离心机4摄氏度下，调离心力为10000g离心15分钟去除脂类和酪蛋白后收集上清液获得乳清80mL，总蛋白浓度为9.5g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为1.7g/L，牛源α-乳清白蛋白浓度为1.2g/L。向乳清中添加EDTA使得EDTA浓度为100mM，静置15分钟后使用截留分子量为5KD的透析膜透析16小时，透析缓冲液使用pH7.0的20mM磷酸盐缓冲液，透析完成后在乳清中添加硝酸钾粉末使得硝酸钾浓度为30mM。

使用1M的盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清pH到7.0，缓慢加入硫酸铵粉末到乳清硫酸铵浓度达到0.9M，使用1M盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清预处理样品pH到7.0，进样到用20mM，pH7.0含0.9M硫酸铵，30mM硝酸钾的磷酸盐缓冲液预平衡好的Octyl Sepharose 4FF疏水层析柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度10厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波长吸收检测，流速10ml/min，上样完毕后用20mM，pH7.0含0.9M硫酸铵，30M硝酸钾的磷酸盐缓冲液继续冲洗至280nm紫外吸收信号回到基线，收集上样的穿透峰145mL，总蛋白浓度为3.9g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为0.1g/L，牛源α-乳清白蛋白浓度为0.5g/L；再用20mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液一步洗脱并收集洗脱峰120mL，总蛋白浓度为1.4g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为1.0g/L，牛源α-乳清白蛋白浓度为0.1g/L。

取疏水层析洗脱峰30mL进样到用20mM，pH7.0含0.1M硫酸钠的磷酸盐缓冲液预平衡好的Superdex 75凝胶过滤层析柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度60厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波长吸收检测，流速2mL/min，上样完毕后继续用20mM，pH7.0含0.1M硫酸钠的磷酸盐缓冲液冲洗，收集230mL处的蛋白峰共85mL，总蛋白浓度为0.37g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为0.35g/L，工艺回收率85％，纯度95％，牛源α-乳清白蛋白浓度为0.01g/L。

取疏水层析穿透峰30mL进样到用20mM，pH7.0含0.1M硫酸钠的磷酸盐缓冲液预平衡好的Superdex 75凝胶过滤层析柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度60厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波长吸收检测，流速2mL/min，上样完毕后继续用20mM，pH7.0含0.1M硫酸钠的磷酸盐缓冲液冲洗，收集230mL处的蛋白峰共75mL，总蛋白浓度为0.18g/L，牛源α-乳清白蛋白浓度为0.17g/L，工艺回收率62％，纯度94％，人源α-乳清白蛋白浓度为0.01g/L。

实施例3

取100mL转基因人源α-乳清白蛋白牛乳，牛乳总蛋白浓度为33g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为1.4g/L，牛源α-乳清白蛋白浓度为1.0g/L。乳液调节pH4.6，静置15分钟后使用Sigma 3k30离心机4摄氏度下，调离心力为10000g离心30分钟去除脂类和酪蛋白后收集上清液获得乳清80mL，总蛋白浓度为9.5g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为1.7g/L，牛源α-乳清白蛋白浓度为1.2g/L。向乳清中添加EDTA使得EDTA浓度为150mM，静置15分钟后使用截留分子量为1KD的透析膜透析18小时，透析缓冲液使用pH7.0的20mM磷酸盐缓冲液，透析完成后在乳清中添加氯化钾粉末使得氯化钾浓度为20mM。

使用1M的盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清pH到6.0，缓慢加入硫酸铵粉末到乳清硫酸铵浓度达到0.7M，使用1M盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清预处理样品pH到6.0，进样到用20mM，pH6.0含0.7M硫酸铵，20mM氯化钾的磷酸盐缓冲液预平衡好的Phenyl Sepharose 4FF疏水层析柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度10厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波长吸收检测，流速10ml/min，上样完毕后用20mM，pH6.0含0.7M硫酸铵，20M氯化钾的磷酸盐缓冲液继续冲洗至280nm紫外吸收信号回到基线，收集上样的穿透峰140mL，总蛋白浓度为3.8g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为0.2g/L，牛源α-乳清白蛋白浓度为0.4g/L；再用20mM，pH6.0的磷酸盐缓冲液一步洗脱并收集洗脱峰110mL，总蛋白浓度为1.6g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为0.9g/L，牛源α-乳清白蛋白浓度为0.3g/L。

取疏水层析洗脱峰30mL进样到用20mM，pH7.0含0.1M硫酸钠的磷酸盐缓冲液预平衡好的Superdex 75凝胶过滤层析柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度60厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波长吸收检测，流速2mL/min，上样完毕后继续用20mM，pH7.0含0.1M硫酸钠的磷酸盐缓冲液冲洗，收集230mL处的蛋白峰共80mL，总蛋白浓度为0.36g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为0.32g/L，工艺回收率67％，纯度89％，牛源α-乳清白蛋白浓度为0.03g/L。

取疏水层析穿透峰30mL进样到用20mM，pH7.0含0.1M硫酸钠的磷酸盐缓冲液预平衡好的Superdex 75凝胶过滤层析柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度60厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波长吸收检测，流速2mL/min，上样完毕后继续用20mM，pH7.0含0.1M硫酸钠的磷酸盐缓冲液冲洗，收集230mL处的蛋白峰共69mL，总蛋白浓度为0.21g/L，牛源α-乳清白蛋白浓度为0.17g/L，工艺回收率55％，纯度81％，人源α-乳清白蛋白浓度为0.01g/L。

实施例4

取100mL含有转基因人源α-乳清白蛋白的CHO细胞分泌液，总蛋白浓度为10g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为1.2g/L。使用1M的盐酸或氢氧化钠溶液调节分泌液pH到9.0，缓慢加入硫酸铵粉末到硫酸铵饱和度为50％，以摩尔记数为2.37M，在室温下振荡2小时后，将沉淀样品使用Sigma 3k30离心机4摄氏度下，调离心力为10000g离心30分钟并收集上清液81mL，上清液总蛋白浓度9.5g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为1.4g/L。向处理所得蛋白混合物中添加EDTA使得EDTA浓度为100mM，静置15分钟后使用截留分子量为2KD的透析膜透析24小时，透析缓冲液使用pH7.0的20mM磷酸盐缓冲液，透析完成后在蛋白溶液中添加硫酸钾粉末使得硫酸钾浓度为40mM。

使用1M的盐酸或氢氧化钠溶液调节蛋白溶液pH到6.0，缓慢加入硫酸铵粉末到蛋白溶液硫酸铵浓度达到1.0M，使用1M盐酸或氢氧化钠溶液调节蛋白溶液处理样品pH到6.0，进样到用20mM，pH6.0含1.0M硫酸铵，40mM硫酸钾的磷酸盐缓冲液预平衡好的Butyl Sepharose 4FF疏水层析柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度10厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波长吸收检测，流速10ml/min，上样完毕后用20mM，pH6.0含1.0M硫酸铵，40M硫酸钾的磷酸盐缓冲液继续冲洗至280nm紫外吸收信号回到基线，再用20mM，pH6.0的磷酸盐缓冲液一步洗脱并收集洗脱峰108mL，总蛋白浓度为1.7g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为0.8g/L。

取疏水层析洗脱峰30mL进样到用20mM，pH7.0含0.1M硫酸钠的磷酸盐缓冲液预平衡好的Superdex 75凝胶过滤层析柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度60厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波长吸收检测，流速2mL/min，上样完毕后继续用20mM，pH7.0含0.1M硫酸钠的磷酸盐缓冲液冲洗，收集230mL处的蛋白峰共82mL，总蛋白浓度为0.3g/L，人源α-乳清白蛋白浓度为0.28g/L，工艺回收率69％，纯度93％。

实施例5

取100mL转基因人源乳转铁蛋白牛乳，牛乳总蛋白浓度为33g/L，人源乳转铁蛋白浓度为1.7g/L，牛源乳转铁蛋白浓度为0.1g/L。向牛乳中加入浓度为5％的凝乳酶溶液，牛乳与凝乳酶溶液体积比例为50∶1，室温下反应10分钟，使用Sigma 3k30离心机4摄氏度下，调离心力为10000g离心10分钟去除脂类和酪蛋白后收集上清液获得乳清80mL，总蛋白浓度为9.5g/L，人源乳转铁蛋白浓度为2.0g/L，牛源乳转铁蛋白浓度为0.12g/L。向乳清中添加8-羟基喹啉使得8-羟基喹啉浓度为200mM，静置15分钟后使用截留分子量为5KD的透析膜透析20小时，透析缓冲液使用pH7.0的20mM磷酸盐缓冲液，透析完成后在乳清中添加硫酸钾粉末使得硫酸钾浓度为50mM。

使用1M的盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清pH到8.0，缓慢加入硫酸铵粉末到乳清硫酸铵浓度达到1.0M，使用1M盐酸或氢氧化钠溶液调节乳清预处理样品pH到8.0，进样到用20mM，pH8.0含1.0M硫酸铵，50mM硫酸钾的磷酸盐缓冲液预平衡好的Butyl Sepharose 4FF疏水层析柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度10厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波长吸收检测，流速10ml/min，上样完毕后用20mM，pH8.0含1.0M硫酸铵，50M硫酸钾的磷酸盐缓冲液继续冲洗至280nm紫外吸收信号回到基线，收集上样的穿透峰145mL，总蛋白浓度为3.8g/L，人源乳转铁蛋白浓度为0.2g/L，牛源乳转铁蛋白浓度为0.05g/L；再用20mM，pH8.0的磷酸盐缓冲液一步洗脱并收集洗脱峰120mL，总蛋白浓度为1.5g/L，人源乳转铁蛋白浓度为0.9g/L，牛源乳转铁蛋白浓度为0.01g/L。

取疏水层析洗脱峰30mL进样到用20mM，pH7.0含0.1M硫酸钠的磷酸盐缓冲液预平衡好的Superdex 75凝胶过滤层析柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度60厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波长吸收检测，流速2mL/min，上样完毕后继续用20mM，pH7.0含0.1M硫酸钠的磷酸盐缓冲液冲洗，收集170mL处的蛋白峰共81mL，总蛋白浓度为0.35g/L，人源乳转铁蛋白浓度为0.3g/L，工艺回收率57％，纯度86％，牛源乳转铁蛋白浓度为0.002g/L。

取疏水层析穿透峰30mL进样到用20mM，pH7.0含0.1M硫酸钠的磷酸盐缓冲液预平衡好的Superdex 75凝胶过滤层析柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度60厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波长吸收检测，流速2mL/min，上样完毕后继续用20mM，pH7.0含0.1M硫酸钠的磷酸盐缓冲液冲洗，收集170mL处的蛋白峰共72mL，总蛋白浓度为0.28g/L，牛源乳转铁蛋白浓度为0.02g/L，工艺回收率70％，纯度7％，人源乳转铁蛋白浓度为0.06g/L。

实施例6

取100mL含有转基因人源乳转铁蛋白的E.Coli发酵液，总蛋白浓度为20g/L，人源乳转铁蛋白浓度为0.6g/L。使用1M的盐酸或氢氧化钠溶液调节蛋白溶液pH到7.0，缓慢加入硫酸铵粉末到蛋白溶液硫酸铵饱和度为40％，以摩尔记数为1.84M，在室温下振荡2小时后，将沉淀样品使用Sigma 3k30离心机4摄氏度下，调离心力为10000g离心30分钟收集沉淀，并使用85mLpH7.0的20mM磷酸盐缓冲液复溶，上清液总蛋白浓度10g/L，人源乳转铁蛋白浓度为0.5g/L。

向蛋白溶液中添加EDTA使得EDTA浓度为200mM，静置15分钟后使用截留分子量为2KD的透析膜透析12小时，透析缓冲液使用pH7.0的20mM磷酸盐缓冲液，透析完成后在蛋白溶液中添加硫酸钾粉末使得硫酸钾浓度为30mM。

使用1M的盐酸或氢氧化钠溶液调节蛋白溶液pH到7.0，缓慢加入硫酸铵粉末使得蛋白溶液硫酸铵浓度达到0.9M，使用1M盐酸或氢氧化钠溶液调节蛋白溶液预处理样品pH到7.0，进样到用20mM，pH7.0含0.9M硫酸铵，30mM硫酸钾的磷酸盐缓冲液预平衡好的Butyl Sepharose 4FF疏水层析柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度10厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波长吸收检测，流速10ml/min，上样完毕后用20mM，pH7.0含0.9M硫酸铵，30M硫酸钾的磷酸盐缓冲液继续冲洗至280nm紫外吸收信号回到基线，再用20mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液一步洗脱并收集洗脱峰118mL，总蛋白浓度为1.2g/L，人源乳转铁蛋白浓度为0.35g/L。

取疏水层析洗脱峰30mL进样到用20mM，pH7.0含0.1M硫酸钠的磷酸盐缓冲液预平衡好的Superdex 75凝胶过滤层析柱中，柱内径3.5厘米，柱床高度60厘米，层析设备GE AKTA Explorer 100，紫外280nm波长吸收检测，流速2mL/min，上样完毕后继续用20mM，pH7.0含0.1M硫酸钠的磷酸盐缓冲液冲洗，收集170mL处的蛋白峰共85mL，总蛋白浓度为0.14g/L，人源乳转铁蛋白浓度为0.12g/L，工艺回收率67％，纯度86％。

Claims

1.高效纯化金属离子结合蛋白的疏水层析分离纯化方法，其步骤包括：

1)选取至少含有金属离子结合蛋白的待分离原料，沉淀离心去除脂类等杂质后收集上清液获得蛋白混合物；

2)在所得蛋白混合物中添加过量的金属离子螯合剂去除目标蛋白中的辅基金属离子I；

3)所得蛋白混合物进行透析操作去除金属离子螯合剂；

4)在所得蛋白混合物中添加适量的辅基金属离子II；

5)在疏水层析缓冲液中添加适量的辅基金属离子II；

6)将蛋白混合物经过疏水作用层析和凝胶过滤层析联用的组合层析，分离得到金属离子结合蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其中的待分离原料为转基因动物乳液、转基因工程菌的发酵液、转基因动物细胞的发酵液。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述的蛋白质是有金属离子结合能力的蛋白，如重组人源α-乳清白蛋白，牛源α-乳清白蛋白，重组人乳转铁蛋白等。

4.如权利要求1所述的方法，螯合剂为EDTA，8-羟基喹啉等。

5.如权利要求1所述的方法，辅基金属离子I为钙离子。

6.如权利要求1所述的方法，在蛋白混合物及疏水层析缓冲液中添加的辅基金属离子II为钾离子。

7.如权利要求1所述的方法，疏水层析介质为常用的蛋白质层析介质，如琼脂糖基质的丁基疏水介质等。

8.如权利要求1所述的方法，疏水层析所用的盐为硫酸铵，其浓度为0.5-2M硫酸铵，优选为0.6-1.5M硫酸铵。

9.如权利要求1所述的方法，疏水层析所用的缓冲体系为磷酸盐缓冲液。

10.如权利要求1所述的方法，疏水层析单次处理量为2倍柱体积的蛋白混合物原料。