CN1587401A - 一种制备凝血酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种从动物血液以及人血液中提取凝血酶的方法。该方法是利用层析介质从血浆中吸附凝血酶原,对层析柱进行洗脱,活化凝血酶原,得凝血酶溶液,经超滤浓缩,最后冻干得凝血酶成品。该方法在常温常压下进行,工艺环保,生产周期短,凝血酶提取效率高,一般每升血浆能提取5万IU以上的凝血酶产品;操作简单,本发明仅需离心、上样层析、超滤和冻干等几个步骤,容易实现工业化生产。

Description

一种制备凝血酶的方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域,尤其是以动物血液为原料制备凝血酶的方法。
技术背景
目前国内外主要从动物血浆及人血浆中制备凝血酶原,再经激活物激活而成为凝血酶。它可催化血纤维蛋白原中血纤维肽A和B的断裂,转变成不溶性血纤维蛋白凝块。凝血酶在临床上应用广泛,常以干粉或溶液局部涂于伤口及手术处,控制毛细血管血液渗出,多用于骨出血、扁桃腺摘除和拔牙时出血等。有时也可口服,用于胃和十二指肠出血。凝血酶局部止血效果好,且无副作用。目前凝血酶的应用范围正日渐扩大,由单纯的局部外敷发展到外科手术、耳鼻喉、口腔、妇产、泌尿及消化道等部位出血的止血,亦可作为多种外用止血药物的重要原料,其止血效果优于“对氨基苯甲酸”、“止血环酸”、“止血敏”等通过注射后须经血管收缩而起止血作用的药物。
凝血酶是一种蛋白质,其制备方法一般包括三个基本步骤,即提取、纯化和冻干(或制剂)。我国专利ZL92112188、ZL93110426和ZL96103650分别提出了从猪血或者牛血中提取凝血酶的方法,但这些方法都存在着工艺流程复杂、生产周期长和收率低等问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种工艺流程简单、生产周期短和收率高的制备凝血酶的方法。
本发明制备凝血酶的方法包括以下几个步骤:
(1)、向血液中加入抗凝剂,离心分离,取上清抗凝血浆;
(2)、将收集所得的上清抗凝血浆上阴离子层析柱层析,用洗脱剂对层析柱进行洗脱,洗脱液即为凝血酶原溶液;
(3)、如洗脱剂中使用了柠檬酸三钠,在进行活化之前对凝血酶原溶液进行超滤脱盐;
(4)、在常温常压下活化凝血酶原,得凝血酶溶液;
(5)、将凝血酶溶液进行超滤浓缩,得凝血酶浓缩液;
(6)、将凝血酶浓缩液冻干,即得白色的粉状凝血酶成品。
本发明制备凝血酶的方法中,所述的血液是猪血、牛血等动物血液或人血液。
所述抗凝剂可以是柠檬酸三钠溶液或者草酸钾溶液。使用柠檬酸三钠抗凝剂,浓度为0.109mol/L的柠檬酸三钠溶液与血液的体积比为1∶7-1∶9。使用草酸钾抗凝剂,浓度为0.125mol/L的草酸钾溶液与血液的体积比为1∶7-1∶9。
所述的洗脱剂可以是pH值为6-9的氨基酸或者柠檬酸三钠溶液。氨基酸或者柠檬酸三钠溶液的浓度是0.01-0.3mol/L。所述的洗脱剂也可以是调节pH值为6-9,以氨基酸为保护剂,以柠檬酸三钠溶液为缓冲液,以氯化钠或者其它无机盐为离子增强剂组成的混合溶液。
所述的活化凝血酶原,是使用CaCl2为活化剂,直接向凝血酶原溶液中加入CaCl2溶液,在常温常压下活化1-3小时得凝血酶溶液。加入CaCl2溶液后的凝血酶原溶液中所含Ca2+的终浓度为0.05-0.15mol/L。
本发明具有如下优点:
1、本发明提供的凝血酶提取纯化方法在常温常压下进行;
2、凝血酶提取效率高。一般每升血浆能提取5万IU以上的凝血酶产品;
3、操作简单,易实现自动化控制。工艺仅需5~6个步骤,包括:离心、上样层析、超滤脱盐、活化、超滤浓缩和冻干等几个步骤,这些过程均易实现自动化控制;
4、本发明环保。工艺彻底摒弃了以往的有机溶剂提纯方法,操作过程中对人员和周围环境不产生危害,工艺末段采取了适当的废物处理措施,废物排放符合国家的环保要求;
5、工艺周期短,整个工艺生产仅需3天(包括冻干)左右。
具体实施方式
实施例1  采集羊血液2800ml,加入0.109mol/L的柠檬酸三钠抗凝剂400ml,离心分离。取上清抗凝血浆1000ml。将上述血浆上已平衡好的阴离子层析柱,用调节pH为8,浓度为0.2mol/L的氨基酸洗脱剂对层析柱进行洗脱,得凝血酶原的洗脱液883.2ml,加入1mol/L的CaCl2溶液76.8ml,使得凝血酶原溶液中Ca2+的终浓度为0.08mol/L,常温常压下活化凝血酶原3小时,得凝血酶溶液960ml,标记为A1。采用超滤机对凝血酶溶液进行浓缩,浓缩约5倍左右,得凝血酶浓液190ml。冻干上述凝血酶浓液,即得白色的粉状凝血酶成品。
实施例2采集猪血液4300ml,加入0.109mol/L的柠檬酸三钠抗凝剂500ml,离心分离。取上清抗凝血浆1000ml。将上述血浆上已平衡好的阴离子层析柱,用调节pH为7,浓度为0.1mol/L的柠檬酸三钠洗脱剂对层析柱进行洗脱,得凝血酶原的洗脱液1590ml。对洗脱液进行超滤脱盐,得到凝血酶原溶液1832.1ml。加入1mol/L的CaCl2溶液137.9ml,使得凝血酶原溶液中Ca2+的终浓度为0.07mol/L,常温常压下活化凝血酶原3小时,得凝血酶溶液1970ml,标记为A2。采用超滤机对凝血酶溶液进行浓缩,浓缩约9倍左右,得凝血酶浓液200ml。冻干上述凝血酶浓液,即得白色的粉状凝血酶成品。
实施例3采集牛血液3200ml,加入0.125mol/L的草酸钾溶液抗凝剂400ml,离心分离。取上清抗凝血浆1500ml。将上述血浆上已平衡好的阴离子层析柱,采用以柠檬酸三钠为缓冲液,以氨基酸为保护剂,以氯化钠为离子增强剂等所组成的洗脱剂,调节pH为7,对层析柱进行洗脱,得凝血酶原的洗脱液1146ml。对洗脱液进行超滤脱盐,得到凝血酶原溶液1440ml。加入1mol/L的CaCl2溶液160ml,使得凝血酶原溶液中Ca2+的终浓度为0.1mol/L,常温常压下活化凝血酶原3小时,得凝血酶溶液1600ml,标记为A3。采用超滤机对凝血酶溶液进行浓缩,浓缩约8倍,得凝血酶浓液200ml。冻干上述凝血酶浓液,即得白色的粉状凝血酶成品。
实施例4  按照《中华人民共和国药典》2000版二部第1056~1057页的有关凝血酶效价标准检测方法,作标准曲线,对上述凝血酶产品A1、A2和A3进行效价检测,采用紫外260nm/280nm检测法进行蛋白浓度检测,检测结果如表1所示。根据凝血酶效价检测结果以及相应的蛋白浓度检测结果,计算凝血酶比活和得率(IU/L血浆),其结果如下表所示。
                        凝血酶质量检测及分析结果
类  别     凝血酶效价(IU/ml)     蛋白浓度(mg/ml)     凝血酶比活(IU/mg蛋白)     得  率(IU/L血浆)
凝血酶A1     52.5     0.15     350.0     50400
凝血酶A2     78.2     0.12     651.7     154000
凝血酶A3     73.8     0.10     732.8     118080

Claims (10)

1、一种制备凝血酶的方法,该方法包括以下几个步骤:
(1)、向血液中加入抗凝剂,离心分离,取上清抗凝血浆;
(2)、将收集所得的上清抗凝血浆上阴离子层析柱层析,用洗脱剂对层析柱进行洗脱,洗脱液即为凝血酶原溶液;
(3)、如洗脱剂中使用了柠檬酸三钠,在进行活化之前对凝血酶原溶液进行超滤脱盐;
(4)、在常温常压下活化凝血酶原,得凝血酶溶液;
(5)、将凝血酶溶液进行超滤浓缩,得凝血酶浓缩液;
(6)、将凝血酶浓缩液冻干,即得白色的粉状凝血酶成品。
2、根据权利要求1所述的制备凝血酶的方法,其特征在于:所述的血液是猪血、牛血等动物血液或人血液。
3、根据权利要求1所述的制备凝血酶的方法,其特征在于:所述抗凝剂是柠檬酸三钠或者草酸钾。
4、根据权利要求3所述制备凝血酶的方法,其特征在于:使用柠檬酸三钠抗凝剂,浓度为0.109mol/L的柠檬酸三钠溶液与血液的体积比为1∶7-1∶9。
5、根据权利要求3所述的制备凝血酶的方法,其特征在于:使用草酸钾抗凝剂,浓度为0.125mol/L的草酸钾溶液与血液的体积比为1∶7-1∶9。
6、根据权利要求1所述的制备凝血酶的方法,其特征在于:所述的洗脱剂是pH值为6-9的氨基酸或者柠檬酸三钠溶液。
7、根据权利要求6所述的制备凝血酶的方法,其特征在于:氨基酸或者柠檬酸三钠溶液的浓度是0.01-0.3mol/L。
8、根据权利要求1所述的制备凝血酶的方法,其特征在于:所述的洗脱剂是调节pH值为6-9,以氨基酸为保护剂,以柠檬酸三钠溶液为缓冲液,以氯化钠或者其它无机盐为离子增强剂组成的混合溶液。
9、根据权利要求1所述的制备凝血酶的方法,其特征在于:所述的活化凝血酶原,是使用CaCl2为活化剂,直接向凝血酶原溶液中加入CaCl2溶液,在常温常压下活化1-3小时得凝血酶溶液。
10、根据权利要求9所述的制备凝血酶的方法,其特征在于:加入CaCl2溶液后的凝血酶原溶液中所含Ca2+的终浓度为0.05-0.15mol/L。
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