CN105821025A - 一种凝血酶的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及酶提取领域，公开了一种凝血酶的提取方法，包括：a、向血液中加入抗凝剂，离心分离后取上清液得到抗凝血浆；b、将抗凝血浆经过层析、洗脱后，制得凝血酶原溶液；c、向凝血酶溶液中添加活化剂进行活化，制得凝血酶粗液；d、将磁性吸附微球加入到凝血酶粗液中并进行搅拌，用磁石对磁性吸附微球进行吸附；取出磁性吸附微球后用含氯化钠的Tris‑HCl缓冲液洗涤，再用含氯化钠的Tris‑HCl缓冲液对磁性吸附微球进行洗脱，然后用磁石分离收集洗脱液；e、对洗脱液经过透析脱盐和浓缩后，最后经过冷冻干燥制得凝血酶。本发明方法提取时间短、效率高，提取的凝血酶纯度、比活高。且磁性吸附微球可重复利用，成本低。

Description

一种凝血酶的提取方法
技术领域
本发明涉及酶提取领域，尤其涉及一种凝血酶的提取方法。
背景技术
凝血酶是一种专一性很强的丝氨酸蛋白水解酶，能水解血纤维蛋白原的四个Arg-Gly肽键，产生不溶性的血纤维蛋白，使血液变成凝胶而发生凝固。因此凝血酶作为止血剂，广泛地应用于医药领域中。
目前凝血酶的制备工艺，一般包括以下过程：在动物血浆中加入抗凝剂制得抗凝血浆，然后通过吸附洗脱、沉淀等方法制得凝血酶原，将凝血酶原激活后，制得凝血酶粗液，将凝血酶粗液再进一步纯化，干燥后制得粉状凝血酶。
申请号为961036508的中国专利公开了一种牛凝血酶的提取分离方法：把过量的枸缘酸钠加入牛血液中，在常规离心分离出的牛抗凝血浆中加入氯化钡溶液，用帆布过滤出沉淀物，压干，硫酸铵溶液洗脱、盐析、激活，再经CN-SephadexC-50柱层析制得牛凝血酶。
申请号为2007101564302的中国专利公开了一种凝血酶原分离及其激活的方法，该方法利用透析或超滤控制凝血酶原粗提液的电导率的方法，使凝血酶原粗提液中的杂蛋白和凝血酶原在不同的电导率下发生沉淀，从而使凝血酶原和杂蛋白分离。另一方面，选用碳酸钙作为激活剂对凝血酶原进行激活。
通过上述方法虽然能够从动物血液中提取出凝血酶，但是提取效率较低，提取过程中凝血酶损失较多，且制得的产品纯度也不够高。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种凝血酶的提取方法。本发明方法提取时间短、效率高，提取的凝血酶纯度、比活高。且磁性吸附微球可重复利用，成本低。
本发明的具体技术方案为：一种凝血酶的提取方法，包括以下步骤：
a、向血液中加入抗凝剂，离心分离后取上清液，制得抗凝血浆。
b、将抗凝血浆经过阴离子层析柱层析，并用洗脱剂对层析柱进行洗脱后，制得凝血酶原溶液。
c、向凝血酶溶液中添加活化剂进行活化60-90min，制得凝血酶粗液。
d、将磁性吸附微球加入到凝血酶粗液中并进行搅拌，20-40min后用磁石隔着容器壁对磁性吸附微球进行吸附；取出磁性吸附微球后用含0.05-0.15mol/L氯化钠的pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液洗涤，再用含1.75-2.25mol/L氯化钠的pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液对磁性吸附微球进行洗脱，然后用磁石分离收集洗脱液。
e、对洗脱液经过透析脱盐和浓缩后，最后经过冷冻干燥制得凝血酶。
本发明采用磁性吸附微球对凝血酶进行亲和吸附纯化，与传统层析法纯化相比，其对凝血酶的吸附量大，吸附效率高，纯化度高，纯化后的凝血酶比活高，且可减少洗脱液用量，磁性吸附微球可回收利用，大大降低了成本。
作为优选，步骤a中所述抗凝剂为4-5wt％的柠檬酸钠溶液，且抗凝剂的添加量为血液体积的4-6％。
作为优选，步骤b中所述洗脱剂为pH值为6-8的柠檬酸钠溶液。
作为优选，步骤c中所述活化剂为氯化钙溶液，所述活化剂添加后钙离子的浓度为0.2-0.25mol/L。
作为优选，在步骤c制得凝血酶粗液后，在进行步骤d之前，凝血酶粗液还经过泡沫纯化处理：将凝血酶粗液转移至泡沫分离柱中，对泡沫分离柱的底部进行鼓气，其中，泡沫分离柱的内径为8-10mm，凝血酶粗液的装载高度为40-60cm，鼓气速率为1.5-2.5L/min，凝血酶粗液温度为30-40℃；鼓气后在泡沫分离柱顶部收集泡沫液，并对泡沫液加热灭泡。
本发明在步骤c中制得凝血酶粗液后，对其进行泡沫纯化处理，泡沫纯化法方法简单，无污染、时间短，成本低。其依据表面吸附原理，对液体进行鼓泡后，泡沫分离柱顶部鼓出泡沫，以泡沫为载体，凝血酶聚集在气液界面(即泡沫表面)上，而其他物质非蛋白物质以及部分杂蛋白物质仍旧存留在液体中，分离收集泡沫液实现分离，灭泡后即得到纯化后的凝血酶。再经过后续的纯化后，制得的凝血酶纯度更高，比活更高。
作为优选，凝血酶粗液在转移至泡沫分离柱前，向凝血酶粗液中添加凝血酶粗液质量1-3％的β-环糊精并搅拌均匀。
虽然泡沫纯化法具有许多优点，但是对于凝血酶粗液而言，由于其自身的乳化、气泡性能较差，会造成泡沫纯化过程中的气泡效率低下，纯化时间长，纯化效果降低。如果添加普通的乳化剂又会带来更多杂质，从而影响纯化度。β-环糊精的内部具有疏水空腔，而其表面具有亲水端基，在泡沫纯化前与凝血酶粗液混合并与凝血酶复合后，能够增加液体的乳化活性，使得液体的起泡性能增加，从而增加回收率。并且在后续过程中，β-环糊精与凝血酶容易洗脱分离，对纯度的影响较小。
作为优选，步骤d中所述磁性吸附微球的粒径为20-60微米，包括四氧化三铁磁粉、包裹于磁粉外表面的复合材料以及与复合材料偶联的配基。
在上述磁性吸附微球，四氧化三铁作为磁核，复合材料作为吸附载体，而配基能够增加与凝血酶的亲和性，提高凝血酶的收率。
作为优选，所述磁性吸附微球的制备方法为：将β-环糊精、壳聚糖溶解于5-7wt％的乙酸溶液中，制得混合溶液，其中β-环糊精的浓度为1-2wt％，壳聚糖的浓度为2-4wt％；向混合溶液中添加β-环糊精和壳聚糖总质量0.6-1.0倍的四氧化三铁磁粉，在超声波分散条件下继续向混合溶液中逐渐滴加混合溶液体积0.5-1倍的乳化液；混合溶液充分乳化后，继续添加乳化后混合溶液体积1-3％的6-10wt％戊二醛溶液并搅拌均匀，然后用磁石隔着容器壁对磁粉进行吸附，去除上清液，取固体物质并洗净后制得磁性微球；将磁性微球浸没于水中溶胀5-10min后取出，按固液比0.75-0.1.25g/mL将磁性微球加入到活化液中，在40-50℃活化0.5-1.5h，取出磁性微球并洗净；将肝素与磁性微球按质量比0.4-0.5:1混合制得悬浮液，将悬浮液pH值调节至4-5，添加悬浮液体积2-3倍的3wt％的1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亚胺，在4℃下静置10-14h，取出磁性微球并洗净后、干燥后，制得磁性吸附微球。
本发明方法制得的磁性吸附微球，以四氧化三铁为磁核，以β-环糊精和壳聚糖的复合材料包裹磁核，在复合材料商偶联上对凝血酶具有亲和性的肝素，制得的磁性吸附微球，对凝血酶的特异性吸附效果好，吸附量大，吸附效果高；且纯化方法简单，可重复利用，降低成本。其中，以β-环糊精和壳聚糖的复合材料作为载体，不仅提高了磁性吸附微球的吸附容量，而且在前序的泡沫纯化步骤中，β-环糊精与凝血酶复合后，由于也含有β-环糊精，因此其对凝血酶的亲和性进一步增强，使得吸附效率、纯化效果更好。
作为优选，所述乳化液由等体积的吐温-60和无水乙醇组成；所述活化液由1mol/L的氢氧化钠溶液、二甲基亚砜和环氧氯丙烷按体积比6-8:1:0.6-0.8组成。
作为优选，步骤d中，所述磁性吸附微球的质量为凝血酶粗液的0.25-1％。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明方法提取时间短、效率高，提取的凝血酶纯度、比活高。且磁性吸附微球可重复利用，成本低。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
一种凝血酶的提取方法，包括以下步骤：
a、取猪新鲜血液，向血液中加入4.5wt％的柠檬酸钠溶液，柠檬酸钠溶液的体积为血液体积的5％，离心分离后取上清液，制得抗凝血浆。
b、将抗凝血浆经过阴离子层析柱层析，并用pH值为7左右的柠檬酸钠溶液对层析柱进行洗脱后，制得凝血酶原溶液。
c、向凝血酶溶液中添加氯化钙溶液，进行活化75min，添加后钙离子的浓度为0.225mol/L，活化后制得凝血酶粗液。
向凝血酶粗液中添加凝血酶粗液质量2％的β-环糊精并搅拌均匀。将凝血酶粗液转移至泡沫分离柱中，对泡沫分离柱的底部进行鼓气，其中，泡沫分离柱的内径为9mm，凝血酶粗液的装载高度为50cm，鼓气速率为2L/min，凝血酶粗液温度为35℃；鼓气后在泡沫分离柱顶部收集泡沫液，并对泡沫液加热至55℃灭泡，制得纯化后的凝血酶粗液。
d、磁性吸附微球的制备：将β-环糊精、壳聚糖溶解于6wt％的乙酸溶液中，制得混合溶液，其中β-环糊精的浓度为1.5wt％，壳聚糖的浓度为3wt％；向混合溶液中添加β-环糊精和壳聚糖总质量0.8倍的四氧化三铁磁粉，在超声波分散条件下继续向混合溶液中逐渐滴加混合溶液体积0.75倍的乳化液；所述乳化液由等体积的吐温-60和无水乙醇组成。混合溶液充分乳化后，继续添加乳化后混合溶液体积2％的8wt％戊二醛溶液并搅拌均匀，然后用磁石隔着容器壁对磁粉进行吸附，去除上清液，取固体物质并洗净后制得磁性微球；将磁性微球浸没于水中溶胀7.5min后取出，按固液比1g/mL将磁性微球加入到活化液中，所述活化液由1mol/L的氢氧化钠溶液、二甲基亚砜和环氧氯丙烷按体积比7:1:0.7组成。在45℃活化1h，取出磁性微球并洗净；将肝素与磁性微球按质量比0.45:1混合制得悬浮液，将悬浮液pH值调节至4.5左右，添加悬浮液体积2.5倍的3wt％的1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亚胺，在4℃下静置12h，取出磁性微球并洗净后、干燥后，制得粒径为20-60微米的磁性吸附微球。
将磁性吸附微球加入到纯化后的凝血酶粗液中并进行搅拌，所述磁性吸附微球的质量为凝血酶粗液的0.65％。搅拌30min后用磁石隔着容器壁对磁性吸附微球进行吸附；取出磁性吸附微球后用含0.1mol/L氯化钠的pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液洗涤，再用含2mol/L氯化钠的pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液对磁性吸附微球进行洗脱，然后用磁石分离收集洗脱液，并将此洗脱液标记为A1。
e、对洗脱液经过常规方法的透析脱盐和浓缩后，最后经过冷冻干燥制得凝血酶。
实施例2
一种凝血酶的提取方法，包括以下步骤：
a、取猪新鲜血液，向血液中加入4wt％的柠檬酸钠溶液，柠檬酸钠溶液的体积为血液体积的4％，离心分离后取上清液，制得抗凝血浆。
b、将抗凝血浆经过阴离子层析柱层析，并用pH值为6左右的柠檬酸钠溶液对层析柱进行洗脱后，制得凝血酶原溶液。
c、向凝血酶溶液中添加氯化钙溶液，进行活化60min，添加后钙离子的浓度为0.2mol/L，活化后制得凝血酶粗液。
向凝血酶粗液中添加凝血酶粗液质量1％的β-环糊精并搅拌均匀。将凝血酶粗液转移至泡沫分离柱中，对泡沫分离柱的底部进行鼓气，其中，泡沫分离柱的内径为8mm，凝血酶粗液的装载高度为60cm，鼓气速率为1.5L/min，凝血酶粗液温度为40℃；鼓气后在泡沫分离柱顶部收集泡沫液，并对泡沫液加热至50℃灭泡，制得纯化后的凝血酶粗液。
d、磁性吸附微球的制备：将β-环糊精、壳聚糖溶解于5wt％的乙酸溶液中，制得混合溶液，其中β-环糊精的浓度为1wt％，壳聚糖的浓度为4wt％；向混合溶液中添加β-环糊精和壳聚糖总质量0.6倍的四氧化三铁磁粉，在超声波分散条件下继续向混合溶液中逐渐滴加混合溶液体积0.5倍的乳化液；所述乳化液由等体积的吐温-60和无水乙醇组成。混合溶液充分乳化后，继续添加乳化后混合溶液体积1％的10wt％戊二醛溶液并搅拌均匀，然后用磁石隔着容器壁对磁粉进行吸附，去除上清液，取固体物质并洗净后制得磁性微球；将磁性微球浸没于水中溶胀5min后取出，按固液比0.75g/mL将磁性微球加入到活化液中，所述活化液由1mol/L的氢氧化钠溶液、二甲基亚砜和环氧氯丙烷按体积比6:1:0.6组成。在40℃活化1.5h，取出磁性微球并洗净；将肝素与磁性微球按质量比0.4:1混合制得悬浮液，将悬浮液pH值调节至4左右，添加悬浮液体积2倍的3wt％的1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亚胺，在4℃下静置10h，取出磁性微球并洗净后、干燥后，制得粒径为20-60微米的磁性吸附微球。
将磁性吸附微球加入到纯化后的凝血酶粗液中并进行搅拌，所述磁性吸附微球的质量为凝血酶粗液的0.25％。搅拌20min后用磁石隔着容器壁对磁性吸附微球进行吸附；取出磁性吸附微球后用含0.05mol/L氯化钠的pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液洗涤，再用含1.75mol/L氯化钠的pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液对磁性吸附微球进行洗脱，然后用磁石分离收集洗脱液，并将此洗脱液标记为A2。
e、对洗脱液经过常规方法的透析脱盐和浓缩后，最后经过冷冻干燥制得凝血酶。
实施例3
一种凝血酶的提取方法，包括以下步骤：
a、取猪新鲜血液，向血液中加入5wt％的柠檬酸钠溶液，柠檬酸钠溶液的体积为血液体积的6％，离心分离后取上清液，制得抗凝血浆。
b、将抗凝血浆经过阴离子层析柱层析，并用pH值为8左右的柠檬酸钠溶液对层析柱进行洗脱后，制得凝血酶原溶液。
c、向凝血酶溶液中添加氯化钙溶液，进行活化90min，添加后钙离子的浓度为0.25mol/L，活化后制得凝血酶粗液。
向凝血酶粗液中添加凝血酶粗液质量3％的β-环糊精并搅拌均匀。将凝血酶粗液转移至泡沫分离柱中，对泡沫分离柱的底部进行鼓气，其中，泡沫分离柱的内径为10mm，凝血酶粗液的装载高度为40cm，鼓气速率为2.5L/min，凝血酶粗液温度为30℃；鼓气后在泡沫分离柱顶部收集泡沫液，并对泡沫液加热至60℃灭泡，制得纯化后的凝血酶粗液。
d、磁性吸附微球的制备：将β-环糊精、壳聚糖溶解于7wt％的乙酸溶液中，制得混合溶液，其中β-环糊精的浓度为2wt％，壳聚糖的浓度为4wt％；向混合溶液中添加β-环糊精和壳聚糖总质量1.0倍的四氧化三铁磁粉，在超声波分散条件下继续向混合溶液中逐渐滴加混合溶液体积1倍的乳化液；所述乳化液由等体积的吐温-60和无水乙醇组成。混合溶液充分乳化后，继续添加乳化后混合溶液体积3％的6wt％戊二醛溶液并搅拌均匀，然后用磁石隔着容器壁对磁粉进行吸附，去除上清液，取固体物质并洗净后制得磁性微球；将磁性微球浸没于水中溶胀10min后取出，按固液比0.1.25g/mL将磁性微球加入到活化液中，所述活化液由1mol/L的氢氧化钠溶液、二甲基亚砜和环氧氯丙烷按体积比8:1:0.8组成。在50℃活化0.5h，取出磁性微球并洗净；将肝素与磁性微球按质量比0.5:1混合制得悬浮液，将悬浮液pH值调节至5左右，添加悬浮液体积3倍的3wt％的1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亚胺，在4℃下静置14h，取出磁性微球并洗净后、干燥后，制得粒径为20-60微米的磁性吸附微球。
将磁性吸附微球加入到纯化后的凝血酶粗液中并进行搅拌，所述磁性吸附微球的质量为凝血酶粗液的1％。搅拌40min后用磁石隔着容器壁对磁性吸附微球进行吸附；取出磁性吸附微球后用含0.15mol/L氯化钠的pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液洗涤，再用含2.25mol/L氯化钠的pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液对磁性吸附微球进行洗脱，然后用磁石分离收集洗脱液，并将此洗脱液标记为A3。
e、对洗脱液经过常规方法的透析脱盐和浓缩后，最后经过冷冻干燥制得凝血酶。
实施例4
实施例4与实施例1的不同之处在于，实施例4的步骤c中，凝血酶粗液在泡沫纯化前不添加β-环糊精。其中，对实施例4中步骤e之前得到的洗脱液标记为A4。
实施例5
实施例5与实施例1的不同之处在于，实施例5的步骤c中，凝血酶粗液不经过泡沫纯化。其中，对实施例5中步骤e之前得到的洗脱液标记为A5。
按照《中国药典》2010版二部中有关凝血酶效价标准测检测方法对实施例1-5中的A1-5进行凝血酶效价检测；按照《中国药典》2010版二部附录VIIM的蛋白质含量测定法中福林酚法对实施例1-5中国的A1-5进行蛋白浓度测定。测试结果如下表所示。
效价(IU/mL) 蛋白浓度(mg/mL) 比活(IU/mg)
A1 2083.4 1.055 1974.8
A2 2011.1 1.012 1987.3
A3 1981.3 1.009 1963.6
A4 1926.5 1.003 1920.7
A5 1812.3 0.947 1913.7
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种凝血酶的提取方法，其特征在于包括以下步骤：
a、向血液中加入抗凝剂，离心分离后取上清液，制得抗凝血浆；
b、将抗凝血浆经过阴离子层析柱层析，并用洗脱剂对层析柱进行洗脱后，制得凝血酶原溶液；
c、向凝血酶溶液中添加活化剂进行活化60-90min，制得凝血酶粗液；
d、将磁性吸附微球加入到凝血酶粗液中并进行搅拌，20-40min后用磁石隔着容器壁对磁性吸附微球进行吸附；取出磁性吸附微球后用含0.05-0.15mol/L氯化钠的pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液洗涤，再用含1.75-2.25mol/L氯化钠的pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液对磁性吸附微球进行洗脱，然后用磁石分离收集洗脱液；
e、对洗脱液经过透析脱盐和浓缩后，最后经过冷冻干燥制得凝血酶。
2.如权利要求1所述的一种凝血酶的提取方法，其特征在于，步骤a中所述抗凝剂为4-5wt%的柠檬酸钠溶液，且抗凝剂的添加量为血液体积的4-6%。
3.如权利要求1所述的一种凝血酶的提取方法，其特征在于，步骤b中所述洗脱剂为pH值为6-8的柠檬酸钠溶液。
4.如权利要求1所述的一种凝血酶的提取方法，其特征在于，步骤c中所述活化剂为氯化钙溶液，所述活化剂添加后钙离子的浓度为0.2-0.25mol/L。
5.如权利要求1所述的一种凝血酶的提取方法，其特征在于，在步骤c制得凝血酶粗液后，在进行步骤d之前，凝血酶粗液还经过泡沫纯化处理：将凝血酶粗液转移至泡沫分离柱中，对泡沫分离柱的底部进行鼓气，其中，泡沫分离柱的内径为8-10mm，凝血酶粗液的装载高度为40-60cm，鼓气速率为1.5-2.5L/min，凝血酶粗液温度为30-40℃；鼓气后在泡沫分离柱顶部收集泡沫液，并对泡沫液加热灭泡。
6.如权利要求5所述的一种凝血酶的提取方法，其特征在于，凝血酶粗液在转移至泡沫分离柱前，向凝血酶粗液中添加凝血酶粗液质量1-3%的β-环糊精并搅拌均匀。
7.如权利要求1所述的一种凝血酶的提取方法，其特征在于，步骤d中所述磁性吸附微球的粒径为20-60微米，包括四氧化三铁磁粉、包裹于磁粉外表面的复合材料以及与复合材料偶联的配基。
8.如权利要求7所述的一种凝血酶的提取方法，其特征在于，所述磁性吸附微球的制备方法为：将β-环糊精、壳聚糖溶解于5-7wt%的乙酸溶液中，制得混合溶液，其中β-环糊精的浓度为1-2wt%，壳聚糖的浓度为2-4wt%；向混合溶液中添加β-环糊精和壳聚糖总质量0.6-1.0倍的四氧化三铁磁粉，在超声波分散条件下继续向混合溶液中逐渐滴加混合溶液体积0.5-1倍的乳化液；混合溶液充分乳化后，继续添加乳化后混合溶液体积1-3%的6-10wt%戊二醛溶液并搅拌均匀，然后用磁石隔着容器壁对磁粉进行吸附，去除上清液，取固体物质并洗净后制得磁性微球；将磁性微球浸没于水中溶胀5-10min后取出，按固液比0.75-0.1.25g/mL将磁性微球加入到活化液中，在40-50℃活化0.5-1.5h，取出磁性微球并洗净；将肝素与磁性微球按质量比0.4-0.5:1混合制得悬浮液，将悬浮液pH值调节至4-5，添加悬浮液体积2-3倍的3wt%的1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亚胺，在4℃下静置10-14h，取出磁性微球并洗净后、干燥后，制得磁性吸附微球。
9.如权利要求1或8所述的一种凝血酶的提取方法，其特征在于，所述乳化液由等体积的吐温-60和无水乙醇组成；所述活化液由1mol/L的氢氧化钠溶液、二甲基亚砜和环氧氯丙烷按体积比6-8:1:0.6-0.8组成。
10.如权利要求1或8所述的一种凝血酶的提取方法，其特征在于，步骤d中，所述磁性吸附微球的质量为凝血酶粗液的0.25-1%。
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