CN105002153B - 一种凝血酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了属于生物工程技术领域的一种凝血酶的制备方法。该方法利用壳聚糖‑精氨酸阴离子树脂加入抗凝血浆中吸附凝血酶原，将凝血酶原激活后，用肝素‑壳聚糖亲和磁性微球进行亲和层析分离。该方法采用壳聚糖‑精氨酸阴离子树脂吸附凝血酶原，吸附效果较好，采用肝素‑壳聚糖亲和磁性微球进行凝血酶特异性纯化，纯化速度快，酶活性高，纯化后的凝血酶比活性最高可为1928.7IU/mg，肝素‑壳聚糖亲和磁性微球经处理后可重复利用。本发明的方法工艺流程简单，在常温常压下进行即可，并且可以应用于大规模生产，生产周期短、操作简单、整个工艺生产仅需2天。

Description

一种凝血酶的制备方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种凝血酶的制备方法。
背景技术
凝血酶是具有高度专一性的丝氨酸蛋白水解酶，能直接促使血液中的纤维蛋白原转化为纤维蛋白，并促使血小板聚集，达到迅速止血的目的。凝血酶由血液中的凝血酶原(prothrombin)前体水解活化而来，凝血酶产品由提取的凝血酶原活化而来。20世纪中期开始人们将凝血酶应用于临床，由于其疗效显著，应用也越来越广泛。之后证明将动物凝血酶应用于人体未出现凝血酶抗原性，口服和局部外用时无过敏反应和其他不良反应等。从血浆中提取的凝血酶可应用于临床，作为局部止血的首选药物，具有止血快、无副作用的优点。同时，凝血酶也是纤维蛋白原定量检测试剂盒的主要成分，应用于出凝血疾病和血栓性疾病的临床检测。
目前，一般从牛、猪和人的血浆中制备凝血酶，对凝血酶的分离纯化主要包括有血浆的前处理、提取和激活凝血酶原、制备凝血酶粗酶和凝血酶的纯化等步骤。凝血酶原的提取方法主要有等电点法、柠檬酸钡沉淀法、氢氧化镁吸附法和离子交换吸附法。凝血酶进行纯化的方法目前主要有盐析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等。
等电点沉淀法根据蛋白质在溶液pH为其等电点的条件下溶解度最低的原理，用1％的醋酸将适当稀释后的血浆pH调至凝血酶原的等电点5.0-5.5之间，即可使凝血酶原析出。该方法虽然操作简便，成本较低，但得到的凝血酶含杂蛋白较多，比活性低。柠檬酸钡吸附法则根据柠檬酸钡能吸附依赖于维生素K的凝血因子这一特性，在柠檬酸钠抗凝获得的血浆中加入氯化钡产生柠檬酸钡，凝血酶原等因子随之沉淀分离出来，沉淀用EDTA解吸附，离心去沉淀，上清液经透析后获得凝血酶原溶液。该方法提取凝血酶需要经过透析或过柱除去钡盐，工业化生产不易操作，生产周期长。
中国专利文献(CN1031160486)公开了一种猪凝血酶的制备方法，该方法包括：首先分离猪血浆，将血浆进行化学法病毒灭活；按照猪血浆总重量的1.5％加入离子交换树脂进行凝血酶原的吸附，在室温下吸附40～60min后用滤布过滤收集离子交换树脂，洗涤离子交换树脂，弃去洗涤液。然后将经洗涤液洗涤的离子交换树脂，用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，将收集的洗脱液用截留分子量为10000道尔顿的超滤器进行透析，去除多余的盐类物质，得到凝血酶原溶液，将凝血酶原溶液用孔径为20nm的过滤器进行过滤，收集滤液进行凝血酶原活化制备凝血酶的冻干保存。其中所述的离子交换树脂为DEAE-Sephadex A-50型离子交换树脂。上述方法采用离子交换树脂吸附凝血酶原后用透析去盐，又经纳米过滤，活化后没有经过进一步纯化直接制备凝血酶。
现有的制备方法，都是上述凝血酶原提取和凝血酶纯化方法的各种组合，但是不论从动物血还是人血制备的凝血酶产品，现有的制备方法都会存在以下问题：凝血酶产率较低，效价不稳定；产品杂质偏高；这些都会限制凝血酶产品的临床应用，并造成安全隐患，在制备过程中往往需要多次的纯化，以达到纯度较高的凝血酶。
发明内容
为此，本发明针对现有技术中制备出的凝血酶产率较低、产品杂质偏高、工艺步骤繁多等不足，提供一种工艺流程简单、生产周期短、成本低、纯度较高的新的制备凝血酶的方法。
为了解决上述技术问题，本申请的技术方案如下：
一种凝血酶的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)向血液中加入抗凝剂，离心分离，取上清抗凝血浆；
(2)向抗凝血浆中加入壳聚糖-精氨酸阴离子树脂，搅拌吸附30-60min，过滤收集壳聚糖-精氨酸阴离子树脂；用洗涤液洗涤壳聚糖-精氨酸阴离子树脂2-3次；
(3)将上述洗涤后的壳聚糖-精氨酸阴离子树脂洗脱液洗脱2-3次，收集洗脱液，得到凝血酶原溶液；
(4)对凝血酶原进行激活，得凝血酶粗溶液；
(5)将肝素-壳聚糖亲和磁性微球加入上述凝血酶粗溶液中，加入肝素-壳聚糖亲和磁性微球加入量为凝血酶粗溶液质量的0.5-2％，室温缓慢搅拌吸附30-60min，磁铁分离吸附液；用含0.1mol/L NaCl的0.05mol/L，pH 7.2的Tris-HCl缓冲液洗涤肝素-壳聚糖亲和磁性微球，洗去杂蛋白，然后用含2mol/L NaCl的0.05mol/L，pH 7.2的Tris-HCl缓冲液作为洗脱液洗涤肝素-壳聚糖亲和磁性微球，磁铁分离收集洗脱液；
(6)将收集的洗脱液，超滤脱盐浓缩，真空冷冻干燥得凝血酶。
上述凝血酶的制备方法中，所述抗凝剂为质量浓度为3.8-4.5％的柠檬酸钠溶液，加入量为血液体积的5-10％。
上述凝血酶的制备方法中，壳聚糖-精氨酸阴离子树脂加入量为抗凝血浆质量的0.5-3％。
上述凝血酶的制备方法中，壳聚糖-精氨酸阴离子树脂加入前用平衡液进行预平衡，方法为：将壳聚糖-精氨酸阴离子树脂加入水中浸泡30-90min，用0.08mol/L NaCl的0.05mol/L，pH 6.8-7.2的Tris-HCl缓冲液充分平衡洗涤。
上述凝血酶的制备方法中，步骤(2)中的洗涤液为0.1mol/L NaCl的0.05mol/L，pH6.8-7.2的Tris-HCl缓冲液。
上述凝血酶的制备方法中，步骤(3)中的洗脱液为1mol/L NaCl的0.05mol/L，pH6.8-7.2的Tris-HCl缓冲液。
上述凝血酶的制备方法中，凝血酶原进行激活的方法为；向凝血酶原溶液中加入CaCl2溶液，使其终浓度为Ca2+0.1mol/L，25℃下激活2小时。
将肝素-壳聚糖亲和磁性微球加入凝血酶粗溶液前进行预处理：将肝素-壳聚糖亲和磁性微球加入蒸馏水中溶胀1-3小时，用0.05mol/L，pH 7.2的Tris-HCl缓冲液充分平衡洗涤。
上述凝血酶的制备方法中，所述血液为猪血、牛血、羊血或人血。
本发明具有如下优点：
1、本发明的凝血酶的制备方法，采用壳聚糖-精氨酸阴离子树脂吸附凝血酶原，壳聚糖-精氨酸阴离子树脂是交联壳聚糖微球再交联精氨酸，呈弱碱性，用于吸附酸性蛋白，从而分离凝血酶原。壳聚糖是自然界含量丰富、廉价易得的高分子材料，易生物降解、安全无毒、生物形容性好，容易进行化学修饰。壳聚糖多孔微球具有树脂的多孔，并且关联精氨酸后，给壳聚糖增加了阴离子活性和多分枝，增加了吸附性，可以较好的吸附凝血酶原。壳聚糖相较于常用的树脂成本较低，壳聚糖-精氨酸阴离子树脂洗涤之后经过一定的处理可以重新利用。
2、本发明的凝血酶的制备方法，采用肝素-壳聚糖亲和磁性微球进行凝血酶的纯化，肝素-壳聚糖亲和磁性微球对凝血酶具有特异性吸附，利用磁铁分离在用于提高凝血酶的活性和纯度，可以快速纯化凝血酶，并且纯化后的凝血酶比活性高，最高可为1928.7，肝素-壳聚糖亲和磁性微球经处理后可重复利用，大大降低了成本。
3、本发明的凝血酶的制备方法，本发明的方法工艺流程简单，在常温常压下进行即可，并且可以应用于大规模生产，生产周期短、操作简单、整个工艺生产仅需2天。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步对本发明进行说明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
本发明的壳聚糖-精氨酸阴离子树脂和肝素-壳聚糖亲和磁性微球可按现有的方法制备，其中：
本发明的壳聚糖-精氨酸阴离子树脂可按下述方法制备：
(1)制备交联壳聚糖-精氨酸阴离子树脂
将脱乙酰度90％以上的壳聚糖加入盐酸质量百分数为5％乙酸溶液中，制备出壳聚糖质量百分数为5％的壳聚糖溶液，后按壳聚糖酸性溶液：液体石蜡的体积比为1：5的比例，将壳聚糖酸性溶液缓慢加入液体石蜡中，搅拌20-30min，并加热升温至25℃制得到壳聚糖石蜡溶液后，再加入占壳聚糖石蜡溶液体积分数为0.15％戊二醛交联剂，再加入占壳聚糖石蜡溶液质量分数为0.05％碳酸钙致孔剂，进行制孔反应30min制得壳聚糖微球的悬浮液，最后用氢氧化钠溶液调节壳聚糖微球悬浮液的pH值为9-10，并加热至55-75℃，搅拌固化2-4h，再过滤，弃滤液，收集滤渣，对滤渣先用乙醇洗涤3-6次，后用质量分数为5％稀盐酸溶解滤渣中的碳酸钙，再用蒸馏水洗涤至中性；得多孔壳聚糖微球。
(2)壳聚糖-精氨酸阴离子树脂的制备
将第(1)步制备出的多孔壳聚糖微球，加入质量分数为2.0％精氨酸溶液中，振荡20-30min，制备出壳聚糖质量分数为1.5％的壳聚糖-精氨酸溶液，然后按壳聚糖-精氨酸溶液中精氨酸：二环己基碳二亚胺的摩尔比为1：0.5的比例，在壳聚糖-精氨酸溶液中，加入DCC接肽缩合剂，进行缩合反应20-40min，最后经过滤，再弃滤液，再收集滤渣，得到壳聚糖-精氨酸阴离子树脂。
本发明的肝素-壳聚糖亲和磁性微球可按下述方法制备：
(1)将浓度分别为0.3mol/L的Fe2+、Fe3+溶液按摩尔比1：2混合均匀的混合液，按混合液与PEG4000体积质量比为100(mL)：1再加入PEG4000，充分溶解后在磁力搅拌下快速滴加到2.5mol/L的NaOH中，维持溶液pH值为9-11，继续搅拌30分钟，接着超声10分钟，80℃水浴熟化30分钟后，再接着超声20分钟，此时溶液水解已趋于完全，变得均匀细腻，用磁铁吸住底部倾去上清液，重蒸水冲洗至中性，抽滤，真空冷冻干燥的Fe3O4纳米磁核。
(2)将脱乙酰度90％以上的壳聚糖溶解在5％的乙酸溶液中，得到浓度为5％的壳聚糖乙酸溶液。按壳聚糖与Fe3O4纳米磁核质量比1.5:1加入上述Fe3O4纳米磁核后超声分散10分钟，在缓慢搅拌下逐滴滴入到由液体石蜡、Span-80、Tween-60、正丁醇混合液中，超声并电动搅拌10分钟，形成微乳溶液。其中液体石蜡、Span-80、Tween-60、正丁醇的体积为80：2.5：1.5：2，液体石蜡的体积与壳聚糖体积比为5:1。停止超声后迅速滴加入体积为微乳溶液体积5％的10％戊二醛溶液，在2000rpm转速下继续搅拌2小时。反应结束后用磁铁将产物进行分离，再依次用石油醚、丙酮和重蒸水反复洗涤，洗去表面活性剂和有机溶剂，抽滤，真空冷冻干燥为得到壳聚糖磁性微球。
(3)将制备的壳聚糖磁性微球，用适量重蒸水充分溶胀，加入1mol/L氢氧化钠溶液，二甲基亚砜和环氧氯丙烷后，悬浮液在40℃振荡保温2小时进行活化。壳聚糖磁性微球和氢氧化钠溶液的质量体积比为1:12-18(g/mL)，二甲基亚砜和环氧氯丙烷和氢氧化钠溶液的体积比分别为1:6-8、1:10-14。用水充分洗涤活化后的微球，磁铁分离，加入壳聚糖磁性微球质量的60-80％的肝素，用0.1mol/L HCl调节pH至4.75，缓慢加入少量3％EDC，保持pH 4.75，4℃放置过夜，磁铁分离，用0.1mol/L NaOH溶液和去离子水交替充分洗涤，得到肝素-壳聚糖亲和磁性微球，真空冷冻干燥后备用。
实施例1
(1)采集猪血3500mL，向血液中加入350mL 3.8％的柠檬酸钠溶液，离心分离，取上清抗凝血浆，1300mL。
(2)将壳聚糖-精氨酸阴离子树脂加入水中浸泡30min，用0.08mol/L NaCl的0.05mol/L，pH 7.2的Tris-HCl缓冲液充分平衡洗涤，向抗凝血浆中加入抗凝血浆质量0.5％的平衡后的壳聚糖-精氨酸阴离子树脂，搅拌吸附60min，用滤布过滤收集壳聚糖-精氨酸阴离子树脂；用洗涤液洗涤壳聚糖-精氨酸阴离子树脂3次；洗涤液为0.1mol/L NaCl的0.05mol/L，pH7.2的Tris-HCl缓冲液。
(3)将上述洗涤后的壳聚糖-精氨酸阴离子树脂用洗脱液洗脱3次，收集洗脱液，得到凝血酶原溶液，450mL；洗脱液为1mol/L NaCl的0.05mol/L，pH 7.2的Tris-HCl缓冲液。
(4)向凝血酶原溶液中加入1mol/LCaCl2溶液50mL，使其终浓度为Ca2+0.1mol/L，25℃下激活2小时，得凝血酶粗溶液500mL，称为A1。
(5)提前将肝素-壳聚糖亲和磁性微球加入蒸馏水中溶胀3小时，用0.05mol/L，pH7.2的Tris-HCl缓冲液充分平衡洗涤后，加入上述凝血酶粗溶液中，加入肝素-壳聚糖亲和磁性微球加入量为凝血酶粗溶液质量的0.5％，室温缓慢搅拌吸附40min，磁铁分离吸附液；用含0.1mol/L NaCl的0.05mol/L，pH 7.2的Tris-HCl缓冲液洗涤肝素-壳聚糖亲和磁性微球，洗去杂蛋白，然后用含2mol/L NaCl的0.05mol/L，pH 7.2的Tris-HCl缓冲液作为洗脱液洗涤肝素-壳聚糖亲和磁性微球，磁铁分离收集洗脱液240mL，称为A2。
(6)将收集的洗脱液，超滤脱盐浓缩，得浓缩液为50mL，称为A3，真空冷冻干燥得凝血酶A。
实施例2
(1)采集牛血4500mL，向血液中加入225mL 4.5％的柠檬酸钠溶液，离心分离，取上清抗凝血浆，1700mL；
(2)将壳聚糖-精氨酸阴离子树脂加入水中浸泡30min，用0.08mol/L NaCl的0.05mol/L，pH 7.2的Tris-HCl缓冲液充分平衡洗涤，向抗凝血浆中加入抗凝血浆质量1％的平衡后的壳聚糖-精氨酸阴离子树脂，搅拌吸附30min，用滤布过滤收集壳聚糖-精氨酸阴离子树脂；用洗涤液洗涤壳聚糖-精氨酸阴离子树脂3次；洗涤液为0.1mol/L NaCl的0.05mol/L，pH7.2的Tris-HCl缓冲液。
(3)将上述洗涤后的壳聚糖-精氨酸阴离子树脂用洗脱液洗脱3次，收集洗脱液，得到凝血酶原溶液，570mL；洗脱液为1mol/L NaCl的0.05mol/L，pH 7.2的Tris-HCl缓冲液。
(4)向凝血酶原溶液中加入2mol/L CaCl2溶液30mL，使其终浓度为Ca2+0.1mol/L，25℃下激活2小时，得凝血酶粗溶液600mL，称为B1。
(5)提前将肝素-壳聚糖亲和磁性微球加入蒸馏水中溶胀1小时，用0.05mol/L，pH7.2的Tris-HCl缓冲液充分平衡洗涤后，加入上述凝血酶粗溶液中，加入肝素-壳聚糖亲和磁性微球加入量为凝血酶粗溶液质量的1％，室温缓慢搅拌吸附40min，磁铁分离吸附液；用含0.1mol/L NaCl的0.05mol/L，pH 7.2的Tris-HCl缓冲液洗涤肝素-壳聚糖亲和磁性微球，洗去杂蛋白，然后用含2mol/L NaCl的0.05mol/L，pH 7.2的Tris-HCl缓冲液作为洗脱液洗涤肝素-壳聚糖亲和磁性微球，磁铁分离收集洗脱液270mL，称为B2；
(6)将收集的洗脱液，超滤脱盐浓缩，得浓缩液为55mL，称为B3，真空冷冻干燥得凝血酶B。
实施例3
(1)采集羊血2500mL，向血液中加入250mL 3.8％的柠檬酸钠溶液，离心分离，取上清抗凝血浆，900mL；
(2)将壳聚糖-精氨酸阴离子树脂加入水中浸泡60min，用0.08mol/L NaCl的0.05mol/L，pH7.2的Tris-HCl缓冲液充分平衡洗涤，向抗凝血浆中加入抗凝血浆质量2％的平衡后的壳聚糖-精氨酸阴离子树脂，搅拌吸附60min，用滤布过滤收集壳聚糖-精氨酸阴离子树脂；用洗涤液洗涤壳聚糖-精氨酸阴离子树脂2次；洗涤液为0.1mol/L NaCl的0.05mol/L，pH7.2的Tris-HCl缓冲液。
(3)将上述洗涤后的壳聚糖-精氨酸阴离子树脂用洗脱液洗脱3次，收集洗脱液，得到凝血酶原溶液，420mL；洗脱液为1mol/L NaCl的0.05mol/L，pH 6.8的Tris-HCl缓冲液。
(4)向凝血酶原溶液中加入1.5mol/L CaCl2溶液30mL，使其终浓度为Ca2+0.1mol/L，25℃下激活2小时，得凝血酶粗溶液450mL，称为C1。
(5)将肝素-壳聚糖亲和磁性微球加入蒸馏水中溶胀1小时，用0.05mol/L，pH7.2的Tris-HCl缓冲液充分平衡洗涤后，加入上述凝血酶粗溶液中，加入肝素-壳聚糖亲和磁性微球加入量为凝血酶粗溶液质量的2％，室温缓慢搅拌吸附50min，磁铁分离吸附液；用含0.1mol/L NaCl的0.05mol/L，pH 6.8的Tris-HCl缓冲液洗涤肝素-壳聚糖亲和磁性微球，洗去杂蛋白，然后用含2mol/L NaCl的0.05mol/L，pH 6.8的Tris-HCl缓冲液作为洗脱液洗涤肝素-壳聚糖亲和磁性微球，磁铁分离收集洗脱液240mL，称为C2，；
(6)将收集的洗脱液，超滤脱盐浓缩，得浓缩液为45mL，称为C3，真空冷冻干燥得凝血酶C。
凝血酶的效价测定，测定方法按照《中国药典》2010年版二部1149页的有关凝血酶效价标准检测方法进行检测。
蛋白浓度的测定，测定方法采用《中国药典》2010年版二部附录VII M的蛋白质含量测定法中的“第二法福林酚法(Lowry法)”。
对上述凝血酶溶液Ai(A1、A2、A3)，Bi(B1、B2、B3)，Ci(C1、C2、C3)进行效价检测，检测结果见表1。根据凝血酶效价检测结果以及相应的蛋白浓度检测结果，计算凝血酶比活和得率(％)。
表1 凝血酶效价实验检测数据

Claims (5)

1.一种凝血酶的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)向血液中加入抗凝剂，离心分离，取上清抗凝血浆；
(2)向抗凝血浆中加入壳聚糖-精氨酸阴离子树脂，搅拌吸附30-60min，过滤收集壳聚糖-精氨酸阴离子树脂；用洗涤液洗涤壳聚糖-精氨酸阴离子树脂2-3次；壳聚糖-精氨酸阴离子树脂加入量为抗凝血浆质量的0.5-3％；壳聚糖-精氨酸阴离子树脂加入前用平衡液进行预平衡，方法为：将壳聚糖-精氨酸阴离子树脂加入水中浸泡30-90min，用含0.08mol/LNaCl的0.05mol/L，pH 6.8-7.2的Tris-HCl缓冲液充分平衡；洗涤液为含0.1mol/L NaCl的0.05mol/L，pH 6.8-7.2的Tris-HCl缓冲液；
(3)将上述洗涤后的壳聚糖-精氨酸阴离子树脂用洗脱液洗脱2-3次，收集洗脱液，得到凝血酶原溶液；洗脱液为含1mol/L NaCl的0.05mol/L，pH 6.8-7.2的Tris-HCl缓冲液；
(4)对凝血酶原进行激活，得凝血酶粗溶液；
(5)将肝素-壳聚糖亲和磁性微球加入上述凝血酶粗溶液中，加入肝素-壳聚糖亲和磁性微球加入量为凝血酶粗溶液质量的0.5-2％，室温缓慢搅拌吸附30-60min，磁铁分离吸附液；用含0.1mol/L NaCl的0.05mol/L，pH 7.2的Tris-HCl缓冲液洗涤肝素-壳聚糖亲和磁性微球，洗去杂蛋白，然后用含2mol/L NaCl的0.05mol/L，pH 7.2的Tris-HCl缓冲液作为洗脱液洗涤肝素-壳聚糖亲和磁性微球，磁铁分离收集洗脱液；
(6)将收集的洗脱液，超滤脱盐浓缩，真空冷冻干燥得凝血酶。
2.根据权利要求1所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，所述抗凝剂为质量浓度为3.8-4.5％的柠檬酸钠溶液，加入量为血液体积的5-10％。
3.根据权利要求1所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，凝血酶原进行激活的方法为；向凝血酶原溶液中加入CaCl2溶液，使其终浓度为Ca2+0.1mol/L，25℃下激活2小时。
4.根据权利要求1所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，将肝素-壳聚糖亲和磁性微球加入凝血酶粗溶液前进行预处理：将肝素-壳聚糖亲和磁性微球加入蒸馏水中溶胀1-3小时，用0.05mol/L，pH7.2的Tris-HCl缓冲液充分平衡洗涤。
5.根据权利要求1所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，所述血液为猪血、牛血、羊血或人血。
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