CN109880816A - 一种病毒灭活去除纯化尿激酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种病毒灭活去除纯化尿激酶的方法。具体的说,就是以健康成年男性新鲜尿液为原料,经过甲壳质吸附、氨水洗脱、硫酸铵盐析、吸附柱层析、亲和层析、低温乙醇沉淀及低PH法结合切向流超滤等现代蛋白质高端生化分离技术来制备高纯度的尿激酶,可以将总收率提高到70%以上,总效价不低于50000iu/mg,柱效提升约55%,病毒去除率不低于5log。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地说涉及一种低温乙醇沉淀、低PH法结合切向流超滤制备收率高、效价稳定、低病毒的尿激酶的制备方法及提高尿激酶复溶性的药物组合物。
背景技术
尿激酶(Urokinase)系从健康人尿中分离的,或从人肾组织培养中获得的一种酶蛋白。由分子量分别为33000 (LMW-tcu-PA)和54000(HMW-tcu-PA)两部分组成。本品直接作用于内源性纤维蛋白溶解系统,能催化裂解纤溶酶原成纤溶酶,后者不仅能降解纤维蛋白凝块,亦能降解血循环中的纤维蛋白原、凝血因子Ⅴ和凝血因子Ⅷ等,从而发挥溶栓作用。本品对新形成的血栓起效快、效果好。本品还能提高血管ADP酶活性,抑制ADP诱导的血小板聚集,预防血栓形成。
1909年欧洲首先报道人体尿液存在着胰蛋白酶抑制剂,随后人们发现,当人体受到感染、发热、肿瘤、妊娠、休克、手术、给予糖皮质激素等刺激时,人体尿液中UK活性升高。1985 年由日本首先开发上市,在日本已作为急性胰腺炎、急性循环衰竭的治疗药物被广泛应用于临床。
本发明人自2008年开始对UK的生产工艺进行试验研究,采用现代蛋白质高端生化分离技术进行生产,使UK的总收率提高到70%以上,总效价不低于50000iu/mg,柱效提高约55%。近期我们组织相关人员进行科研攻关,最终采用低温乙醇沉淀、低PH法结合切向流超滤来纯化尿激酶,病毒去除率不低于5log,生产工艺稳定,质量可控。
发明内容
本发明提供了一种病毒灭活去除纯化尿激酶的方法及,是为了攻克高岭土吸附、耐酸性混合模式吸附等传统方法提取尿激酶收率过低、效价不高不稳定、病毒指标不明的缺点,采用低温乙醇沉淀、低PH法结合切向流超滤来纯化尿激酶,从而提高了尿激酶的收率,保证了效价的稳定及用药安全性。
为解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案予以实现:
一种病毒灭活去除纯化尿激酶的方法及提高尿激酶复溶性的药物组合物,其特征在于:选用采用低温乙醇沉淀、低PH法结合切向流超滤来纯化尿激酶,可以使总收率提高到70%以上,总效价不低于50000iu/mg,柱效提高约55%,病毒去除率不低于5log。
该技术方案中,其技术特征还在于所述方法包括如下步骤:
1)尿激酶粗加工
称取1T pH小于6.5的澄清尿液,不断搅拌,缓慢加入16.5kg甲壳质吸附完全后用氨水洗脱,再经过3.5kg硫酸铵盐析,过夜沉淀、离心后置于用五氧化二磷作吸水剂的真空干燥器中真空干燥,干燥后即得尿激酶粗品。
2)吸附柱层析(以0.25L DEAE树脂柱为例)
2.1)将柱中的DEAE树脂用纯化水反冲下来,装入桶中,用纯化水浸没搅匀,静置,反复多次,纯化水浸没过夜;
2.2)将DEAE树脂滤干,用少量纯化水洗涤,再次滤干后装入桶中,用0.5 mol/L盐酸浸没,搅拌,过滤,用纯化水洗至中性,再用0.5 mol/L NaOH溶液浸泡,搅拌,过滤,再用纯化水洗至中性;
2.3)将上述经处理过的DEAE树脂加洗脱液A反复平衡到pH6.5后,再用洗脱液A浸泡待用;
2.4)将上述平衡好的树脂装入柱内,柱装好后,再用洗脱液A走柱;
2.5)称取尿激酶粗品1kg,用洗脱液 A溶解,搅拌30分钟,离心20分钟,留取离心液,在60℃水浴搅拌加热10小时;
2.6)将上述离心液流经平衡好的DEAE树脂柱,流速控制在120~130mL/min左右;
2.7)用洗脱液B溶液洗脱,流速控制在120~130mL/min,得洗脱液;
2.8)将洗脱液经超滤膜,超滤至其体积的二十分之一,得超滤液约1.65L。
3)亲和层析(以0.25L柱体为例)
3.1)用洗脱液C平衡亲和层析柱,将超滤液流经平衡过的树脂柱,流速控制在120~130mL/min;
3.2)上样结束后,用洗脱液C洗脱,流速120~130mL/min左右,收集洗脱液;
3.3)柱中的亲和树脂经洗脱液C洗脱后,用洗脱液 D洗涤去除吸附在上面的杂质,流速控制在120~130mL/min,密封待用;
3.4)洗脱液经超滤膜超滤至一定体积,超滤液中加入一定量磷酸氢二钠溶液,继续超滤至同一体积,然后再加入等量磷酸氢二钠溶液,再经超滤膜超滤至相同体积。
4)沉淀
超滤液中按1:6的比例加入-20℃以下、95%以上的乙醇沉淀12小时,离心,固体再用无水乙醇脱水两次,离心,弃去上清液,留取沉淀物。
5)病毒灭活去除
将上述沉淀物用无水乙醇溶解,用稀盐酸调节pH3~6,在18~25℃条件下培育15~30天,切向流超滤,离心。
6)冻干
将沉淀物装入盘进冻干机,冻干即得尿激酶。
经核算,所得尿激酶总收率高达86%以上,按中国药典所示方法测定,总效价高达50000iu/mg以上,柱效提高约55%,病毒去除率不低于5log。。
与现有技术相比,本发明的优点和积极效果是:
选用病毒灭活去除法纯化尿激酶,可以更有效的去除尿激酶中的多种杂蛋白及病毒,并且使其理化性质和生物活性保持稳定,从而使产品的各项指标均符合中国药典标准。更重要的是,通过工艺的不断改进和完善,使得尿激酶总收率达到86%以上,总效价不低于50000iu/mg,柱效提高约55%,病毒去除率不低于5log,节约了成本,提高了用药安全性,创造了巨大的经济效益和社会效益。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,而不以任何方式限制。
实施例1
1)尿激酶粗加工
称取1T pH 6.0的澄清尿液,不断搅拌,缓慢加入16.5kg甲壳质吸附完全后用氨水洗脱,再经过3.5kg硫酸铵盐析,过夜沉淀、离心后置于用五氧化二磷作吸水剂的真空干燥器中真空干燥,干燥后即得尿激酶粗品。
2)吸附柱层析(以0.25L DEAE树脂柱为例)
2.1)将柱中的DEAE树脂用纯化水反冲下来,装入桶中,用纯化水浸没搅匀,静置1小时,倾去上清液及细小颗粒,反复三次,纯化水浸没过夜;
2.2)将DEAE树脂滤干,用少量纯化水洗涤,再次滤干后装入桶中,用0.5 mol/L盐酸浸没,搅拌1小时,过滤,用纯化水洗至中性,再用0.5 mol/L NaOH溶液浸泡,搅拌1小时,过滤,再用纯化水洗至中性;
2.3)将上述经处理过的DEAE树脂加洗脱液A反复平衡到pH6.5后,再用洗脱液A浸泡待用;
2.4)将上述平衡好的树脂装入柱内,柱装好后,再用洗脱液A走柱;
2.5)称取尿激酶粗品1kg,用洗脱液 A溶解,搅拌30分钟,离心20分钟,留取离心液,在60℃水浴搅拌加热10小时;
2.6)将上述离心液流经平衡好的DEAE树脂柱,流速控制在120mL/min左右;
2.7)用37L的洗脱液B溶液洗脱,流速控制在120mL/min,得洗脱液;
2.8)将洗脱液经超滤膜,超滤至其体积的二十分之一,得超滤液约1.85L。
3)亲和层析(以0.25L柱体为例)
3.1)用3.5L的洗脱液C平衡亲和层析柱,将超滤液流经平衡过的树脂柱,流速控制在120mL/min;
3.2)上样结束后,用12L的洗脱液C洗脱,流速120mL/min左右,收集洗脱液;
3.3)柱中的亲和树脂经洗脱液C洗脱后,用8.0L的洗脱液 D洗涤去除吸附在上面的杂质,流速控制在120mL/min,密封待用;
3.4)洗脱液经超滤膜超滤至190mL,超滤液中加入磷酸氢二钠溶液850mL,继续超滤至190mL,然后再加入850mL磷酸氢二钠溶液,再经超滤膜超滤至190mL。
4)沉淀
超滤液中按1:6的比例加入-22℃、96%乙醇沉淀12小时,离心,固体再用无水乙醇脱水两次,离心,弃去上清液,留取沉淀物。
5)病毒灭活去除
将上述沉淀物用无水乙醇溶解,用稀盐酸调节pH 4.0,在23℃条件下培育21天,切向流超滤,离心。
6)冻干
将沉淀物装入盘进冻干机,冻干即得尿激酶。
经核算,柱效提高54%,所得尿激酶总收率为73%,病毒去除率为5log。按中国药典所示方法测定,总效价高达52850iu/mg。
实施例2
1)尿激酶粗加工
称取1T pH 5.5的澄清尿液,不断搅拌,缓慢加入16.5kg甲壳质吸附完全后用氨水洗脱,再经过3.5kg硫酸铵盐析,过夜沉淀、离心后置于用五氧化二磷作吸水剂的真空干燥器中真空干燥,干燥后即得尿激酶粗品。
2)吸附柱层析(以0.25L DEAE树脂柱为例)
2.1)将柱中的DEAE树脂用纯化水反冲下来,装入桶中,用纯化水浸没搅匀,静置1小时,倾去上清液及细小颗粒,反复三次,纯化水浸没过夜。
2.2)将DEAE树脂滤干,用少量纯化水洗涤,再次滤干后装入桶中,用0.5 mol/L盐酸浸没,搅拌1小时,过滤,用纯化水洗至中性,再用0.5 mol/L NaOH溶液浸泡,搅拌1小时,过滤,再用纯化水洗至中性。
2.3)将上述经处理过的DEAE树脂加洗脱液A反复平衡到pH6.5后,再用洗脱液A浸泡待用。
2.4)将上述平衡好的树脂装入柱内,柱装好后,再用洗脱液A走柱
2.5)称取尿激酶粗品1kg,用洗脱液 A溶解,搅拌30分钟,离心20分钟,留取离心液,在60℃水浴搅拌加热10小时;
2.6)将上述离心液流经平衡好的DEAE树脂柱,流速控制在120mL/min左右;
2.7)用35L的洗脱液B溶液洗脱,流速控制在120mL/min,得洗脱液;
2.8)将洗脱液经超滤膜,超滤至其体积的二十分之一,得超滤液1.75L。
3)亲和层析(以0.25L柱体为例)
3.1)用3.0L的洗脱液C平衡亲和层析柱,将超滤液流经平衡过的树脂柱,流速控制在130mL/min;
3.2)上样结束后,用10L的洗脱液C洗脱,流速130mL/min左右,收集洗脱液;
3.3)柱中的亲和树脂经洗脱液C洗脱后,用7.5L的洗脱液 D洗涤去除吸附在上面的杂质,流速控制在130mL/min,密封待用;
3.4)洗脱液经超滤膜超滤至160mL,超滤液中加入磷酸氢二钠溶液820mL,继续超滤至160mL,然后再加入820mL磷酸氢二钠溶液,再经超滤膜超滤至160mL。
4)沉淀
超滤液中按1:6的比例加入-23℃、97%乙醇沉淀12小时,离心,固体再用无水乙醇脱水两次,离心,弃去上清液,留取沉淀物。
5)病毒灭活去除
将上述沉淀物用无水乙醇溶解,用稀盐酸调节pH 4.0,在23℃条件下培育20天,切向流超滤,离心。
6)冻干
将沉淀物装入盘进冻干机,冻干即得尿激酶。
经核算,柱效提高55%,所得尿激酶总收率为87%,病毒去除率为5log。按中国药典所示方法测定,总效价高达52100iu/mg。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非是对本发明作其它形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型,仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (8)
1.一种病毒灭活纯化尿激酶的方法,其特征在于,该方法包括:将尿激酶粗品通过层析、低温乙醇沉淀、低PH法结合切向流超滤、冻干步骤进行纯化,所得纯化后的尿激酶的总收率提高到70%以上,总效价不低于50000iu/mg,柱效提升约55%,病毒去除率不低于5log。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述尿激酶粗品是通过以男性尿液为原料,将原料依次经过甲壳质吸附、氨水洗脱、硫酸铵盐析制备得到的。
3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于所述工序包括如下步骤:
(1)用洗脱液A溶解尿激酶粗品,搅拌、离心,留取离心液,所述洗脱液A为0.02-0.4mol/L的醋酸盐缓冲液;
(2)用洗脱液B平衡经特异性处理再生的吸附柱,将上述离心液上柱,洗脱液B为0.02-0.4mol/L醋酸钠和0.1-5mol/L NaCl的缓冲液;
(3)用洗脱液B洗脱吸附柱,收集洗脱液;
(4)用洗脱液C平衡亲和层析柱,将超滤液上柱,洗脱液C为0.01-0.5mol/L甘氨酸和0.1-5mol/L NaCl的缓冲液;
(5)上样结束后,用洗脱液C洗脱,收集洗脱液;
(6)柱中的亲和树脂经洗脱液C洗脱后,用洗脱液 D洗涤去除吸附在上面的杂质,密封待用,洗脱液D为0.02-0.3mol/L盐酸和0.1-5mol/L NaCl的缓冲液;
(7)将洗脱液经超滤膜,加入磷酸盐缓冲液反复超滤,得超滤液。
4.(8)超滤液中加入低温乙醇沉淀,离心,固体再用无水乙醇脱水,离心,弃去上清液,留取沉淀物;
(9)沉淀物经低PH法处理后,切向流超滤;
(10)冻干,即得尿激酶。
5.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.02-0.5mol/L。
6.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述吸附柱为阴离子交换柱,包括强阴离子交换柱Q-Sephadex A-25,Q-Sephadex A-50,Q-Sephadex C-25,Q-Sephadex C-50;弱阴离子交换柱DEAE-Cellulose DE-22,DEAE-Cellulose DE-23,DEAE-Cellulose DE-51,DEAE-Cellulose DE-52,DEAE-Cellulose DE-53。
7.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的树脂再生法即一定次序的水洗、酸洗、碱洗处理,提高树脂柱的效率。
8.如权利要求3所述的方法,其特征在于:所述亲和层析柱包括:CM-Sephadex A-25,CM-Sephadex A-50,CM-Sephadex C-25,CM-Sephadex C-50,SP-Sepharose 2B,SP-Sepharose 4B,SP-Sepharose 6B,SP-Sepharose CL-2B,SP-Sepharose CL-4B,SP-Sepharose CL-6B;
如权利要求1或2所述的方法,其特征在于:超滤液中加入低温乙醇沉淀,低PH法法结合切向流超滤处理进行病毒灭活去除,具体的说,选用-18℃以下、96%以上的乙醇,超滤膜选用截留孔径18nm的双层聚醚砜膜,低PH法处理条件选用pH3~6,20~23℃培育19~30天。
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CN115386564A (zh) * | 2022-09-20 | 2022-11-25 | 河南省尤里卡生物科技有限公司 | 一种尿激酶的纯化方法 |
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