CN109467622A

CN109467622A - 一种从猪小肠黏膜中提取肝素钠的方法

Info

Publication number: CN109467622A
Application number: CN201811554239.8A
Authority: CN
Inventors: 舒顺顺; 米倩; 刘芹; 张弦; 杨彩霞; 牛军; 骆啸
Original assignee: Zhengda Food Research And Development Co Ltd; Chia Tai Food (xiangyang) Co Ltd
Current assignee: Zhengda Food Research And Development Co Ltd; Chia Tai Food (xiangyang) Co Ltd
Priority date: 2018-12-19
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2019-03-15

Abstract

本发明提供了一种从猪小肠黏膜中提取肝素钠的方法，涉及肝素钠的制备技术领域。本发明所述方法，通过先盐解后酶解的方法分解猪肠粘膜，所得分解液依次经吸附、洗涤、洗脱、压滤过膜、酒精沉淀、透析和喷雾干燥后，得到肝素钠。利用本发明的方法，对所得的粗品肝素钠的抗凝血活性研究的结果表明，所得的粗品肝素钠效价为95.1～102IU/mg，每5L肠粘膜液可提取肝素钠0.66～0.70g。

Description

一种从猪小肠黏膜中提取肝素钠的方法

技术领域

本发明属于生化提取技术领域，具体涉及一种从猪小肠黏膜中提取肝素钠的方法。

背景技术

肝素钠是肝素的钠盐产物，是由生物材料中提取出来的天然粘多糖硫酸酯类物质，结构复杂，其基本骨架是由糖醛酸和葡萄糖胺以糖苷键连接起来的重复二糖单位组成的多糖链。肝素钠广泛分布于哺乳动物的肠粘膜、肺和肝脏中，其分子量一般在3000～30000D之间。肝素钠具有非常大的医学和生物学价值，其具有预防和治疗动、静脉血栓和肺栓塞，人工心肺、腹膜透析或血液透析时作为抗凝血药物，作为溶血栓疗法的维持治疗等作用，近年来研究证明肝素钠还有降血脂、抗癌等作用。目前，肝素钠的工厂规模化生产大多以猪小肠粘膜为原材料，采用最多的工艺为盐解-树脂吸附-洗脱-乙醇沉淀-干燥-粉碎。传统方法生产出的肝素钠具有产率低、效价低、产品颜色不正、溶解时间长等缺点。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种从猪小肠黏膜中提取肝素钠的方法，肝素钠得率高，提高肝素钠活性，改善肝素钠颜色。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种从猪小肠黏膜中提取肝素钠的方法，包括以下步骤：

1)将猪肠粘膜液与氯化钠水溶液按照1：(3～5)的体积比混合，调节pH值至8.5～10，搅拌升温至50℃～60℃进行盐解1～2h，得盐解液；

2)将蛋白酶与步骤1)所述盐解液混合，持续搅拌，保温2～4h后升温至80～90℃，过滤，得酶解液；所述蛋白酶与所述猪肠粘膜液的质量体积比为0.01～0.08g：100mL；

3)将所述酶解液与树脂混合，搅拌吸附6～8h后过滤，得粗品树脂；所述树脂的体积为所述酶解液体积的4～8％；

4)洗涤步骤3)所述粗品树脂，过滤得吸附肝素钠的树脂；

5)利用氯化钠溶液洗脱步骤4)所述吸附肝素钠的树脂，过滤得洗脱液；所述氯化钠溶液与所述吸附肝素钠的树脂的体积比为(0.8～1.2):(0.8～1.2)；

6)将步骤5)得到的所述洗脱液压滤过2～8μm的滤膜，得滤液；

7)将步骤6)得到的所述滤液与体积浓度为95％的乙醇混合，密封沉淀8～10h，得沉淀；所述滤液与所述体积浓度为95％的乙醇的混合溶液中，乙醇的终体积分数为35～45％；

8)用透析袋对所述沉淀进行透析，对透析袋内的液体进行喷雾干燥，得粗品肝素钠，所述透析用透析液的体积为所述沉淀体积的5～10倍。

优选的，步骤1)所述氯化钠水溶液的质量浓度为4～6％。

优选的，步骤3)所述混合前，还包括将所述酶解液降温到45～50℃，调节pH至8.5～10。

优选的，步骤3)所述树脂为D254肝素钠专用树脂。

优选的，步骤4)所述洗涤包括第一洗涤和第二洗涤，所述第一洗涤为将所述粗品树脂与38～42℃的水按照1:2的体积比混合搅拌漂洗2～3次，每次10～15min，得第一洗涤树脂；将所述第一洗涤树脂与质量浓度为4～6％的氯化钠溶液按照1:1的体积比混合，搅拌洗涤20～30min。

优选的，步骤5)所述洗脱包括第一洗脱和第二洗脱，所述第一洗脱为将所述吸附肝素钠树脂与质量浓度为21～23％的氯化钠溶液按体积比1∶1混合，搅拌洗脱2～4h，过滤得第一洗脱液；所述第二洗脱为将第一洗脱过滤出的树脂与质量浓度为18～20％的氯化钠溶液按体积比1∶1的比例混合，搅拌洗脱1～2h，过滤得第二洗脱液；将所述第一洗脱液与第二洗脱液合并。

优选的，步骤5)氯化钠溶液与所述吸附肝素钠的树脂的体积比为(0.9～1.1):(0.9～1.1)。

优选的，步骤8)所述透析的时间为8～16h，所述透析时，2～3h换一次透析液。

优选的，所述透析袋的截留分子量为2000Da。

优选的，步骤8)所述喷雾干燥的程序设置：出口温度为50～60℃，干燥空气量为0.4～0.65m³/min，喷雾压力为0.1～0.5MPa，进样速率为4～6mL/min。

本发明提供了一种从猪小肠黏膜中提取肝素钠的方法，采用先盐解后酶解的工艺，结合了盐解和酶解的优点，能够充分提取肝素钠，提高肝素钠得率；采用透析工艺能有效去除小分子杂质和大部分有色物质，提高肝素钠活性，改善肝素钠颜色；采用滤膜过滤能去除颗粒性杂质，提高肝素钠纯度；采用喷雾干燥技术省去了常规方法中的烘干、粉碎操作，节约时间，得到的粗品肝素钠为淡白色粉末，易于溶解且易于包装，改善了产品的颜色和外观。在本发明实施例中，对所得的粗品肝素钠的抗凝血活性研究的结果表明，所得的粗品肝素钠效价为95.1～102IU/mg，每5L长粘膜液可提取肝素钠0.66～0.70g。

附图说明

图1为本发明肝素钠效价标准曲线。

具体实施方式

4)洗涤步骤3)所述粗品树脂，过滤得吸附肝素钠的树脂；

6)将步骤5)得到的所述洗脱液压滤过2～8μm的滤膜，得滤液；

本发明提供了一种从猪小肠黏膜中提取肝素钠的方法，将猪肠粘膜液与氯化钠水溶液按照1：(3～5)的体积比混合，调节pH至8.5～10，搅拌升温至50℃～60℃进行盐解1～2h，得盐解液。本发明对所述猪肠粘膜液的来源并没有特殊限定，优选利用刮刀刮制或刮肠机刮制新鲜猪小肠得所述猪肠粘膜液。本发明所述混合优选在反应锅中进行，当进行所述混合时，优选的将猪肠粘膜液加入反应锅中，加入3～5倍体积的氯化钠水溶液混合均匀。本发明所述氯化钠水溶液优选的首先向反应锅中添加3～5倍体积的水，再添加氯化钠，使溶液中氯化钠质量浓度为4～6％。本发明优选用氢氧化钠调节pH，本发明对所述氢氧化钠的浓度没有特殊限定，利用本领域的常规氢氧化钠溶液即可。本发明所述搅拌的速率优选为180～300rpm，更优选为200～250rpm，最优选为220rpm。本发明所述升温优选升温到52～58℃，更优选为54～56℃，最优选为55℃。本发明所述盐解的时间优选为1.2～1.8h，更优选为1.4～1.7h，最优选为1.6h。本发明在所述盐解期间，如果盐浓度或pH值下降，可加入适量的氯化钠和氢氧化钠调节。

得盐解液后，本发明将蛋白酶与所述盐解液混合，持续搅拌，保温2～4h后升温至80～90℃，过滤，得酶解液；所述蛋白酶与所述猪肠粘膜液的质量体积比为0.01～0.08g：100mL。本发明对所述蛋白酶的来源并没有特殊限定，优选为碱性蛋白酶干粉，充分裂解肠粘膜，使肝素完全释放到提取液中。本发明所述蛋白酶的质量与猪肠粘膜液体积的比值优选为0.02～0.06g：100mL，更优选为0.03～0.05g:100mL，最优选为0.04g：100mL。本发明所述搅拌的速率优选为180～300rpm，更优选为200～250rpm，最优选为220rpm。本发明所述过滤优选为保持80～90℃过滤，所述过滤用滤筛优选为100～120目筛。

得酶解液后，本发明将所述酶解液与树脂混合，搅拌吸附6～8h后过滤，得粗品树脂；所述树脂的体积为所述酶解液体积的4～8％。本发明所述混合前，还包括将所述酶解液降温到45～50℃，调节pH至8.5～10。本发明所述搅拌的速率优选为180～300rpm，更优选为200～250rpm，最优选为220rpm。本发明所述搅拌吸附的时间优选为6～7h，更优选为6.5h。本发明所述过滤优选为吸附完毕后用100～120目滤布过滤出树脂。本发明所述树脂优选为D254肝素钠专用树脂，为强碱性阴离子交换树脂，其微孔数目多，收率高，降低反应时间。

得粗品树脂后，本发明洗涤所述粗品树脂，过滤得吸附肝素钠树脂。本发明所述洗涤优选包括第一洗涤和第二洗涤，所述第一洗涤优选为将所述粗品树脂与38～42℃的水按照1:2的体积比混合搅拌漂洗2～3次，每次10～15min，得第一洗涤树脂；将所述第一洗涤树脂与质量浓度为4～6％的氯化钠溶液按照1:1的体积比混合，搅拌洗涤20～30min。本发明所述第一洗涤可除去树脂表面杂质，所述第二洗涤去除与树脂结合不紧密的低分子肝素和蛋白质。本发明所述过滤用滤筛优选为100～120目筛。

得吸附肝素钠树脂后，本发明利用氯化钠溶液洗脱所述吸附肝素钠树脂，过滤得洗脱液；所述氯化钠溶液与所述吸附肝素钠树脂的体积比为(0.8～1.2):(0.8～1.2)。本发明所述所述氯化钠溶液与所述吸附肝素钠树脂的体积优选比为(0.9～1.1):(0.9～1.1)，更优选为1:1。本发明所述洗脱优选包括第一洗脱和第二洗脱，所述第一洗脱为将所述吸附肝素钠树脂与质量浓度为21～23％的氯化钠溶液按体积比1∶1混合，搅拌洗脱2～4h，过滤得第一洗脱液；所述第二洗脱为将第一洗脱过滤出的树脂与质量浓度为18～20％的氯化钠溶液按体积比1∶1的比例混合，搅拌洗脱1～2h，过滤得第二洗脱液；将所述第一洗脱液与第二洗脱液合并。本发明将合并后的洗脱液过滤，所述过滤用滤筛优选为100～120目筛。

得洗脱液后，本发明将所述洗脱液压滤过2～8μm的滤膜，得滤液。本发明对所述压滤用压滤机并没有特殊限定，优选日本Toyo Roshi Kaisha有限公司生产的TSU-90A压滤机，压力优选为0.05～0.5MPa，更优选为0.2～0.4MPa，最优选为0.3MPa。本发明所述滤膜的孔径优选为3～6μm，更优选为4～5μm，最优选为4.5μm。本发明利用所述滤膜进行过滤能去除颗粒性杂质，提高肝素钠纯度。

得滤液后，本发明将所述滤液与体积浓度为95％的乙醇混合，密封沉淀8～10h，得沉淀；所述滤液与所述体积浓度为95％的乙醇的混合溶液中，乙醇的终体积分数为35～45％。本发明在所述混合前，优选还包括将所述滤液的pH值调节为6.0～7.5，更优选为6.5。本发明所述体积浓度为95％的乙醇优选为预冷乙醇。本发明所述混合时优选为向所述滤液中缓慢加入预冷的95％乙醇，边加边搅拌，使酒精浓度为35～45％，之后加盖密封，沉淀8～10h。

得沉淀后，本发明用透析袋对所述沉淀进行透析，对透析袋内的液体进行喷雾干燥，得粗品肝素钠，所述透析用透析液的体积为所述沉淀体积的5～10倍。本发明进行所述透析时，优选在沉淀中带有少量液体，使沉淀呈流体状。本发明所述透析的时间为8～16h，更优选为10～15h，最优选为12h。本发明在进行所述透析时，优选2～3h换一次透析液。本发明所述透析液优选为清水。本发明所述透析袋的截留分子量优选为2000Da。在本发明中，采用透析工艺能有效去除分子量低于2000Da的小分子杂质和大部分有色物质，提高肝素钠活性，改善肝素钠颜色。本发明所述喷雾干燥优选利用型号为Yamato-ADL311S的喷雾干燥器进行，设置程序为：出口温度为50～60℃，干燥空气量为0.4～0.65m³/min，喷雾压力为0.1～0.5MPa，进样速率为4～6mL/min。本发明所述喷雾干燥可节约时间，得到的粗品肝素钠为淡白色粉末，易于溶解且易于包装，改善了产品的颜色和外观。

下面结合实施例对本发明提供的一种从猪小肠黏膜中提取肝素钠的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1)盐解与酶解

取新鲜猪肠粘膜10升，加入反应锅中，加入40升水搅拌均匀，加入2.5kg的盐，用的氢氧化钠调pH至9.5，搅拌升温到55℃，持续搅拌保温1h进行盐解，期间如果盐浓度或pH值下降加入适量的盐和氢氧化钠溶液调节。加入碱性蛋白酶粉末0.2kg，搅拌溶解，保温3h后，升温至90℃，停止加热，所得分解液趁热用120目滤布过滤渣滓。

2)树脂交换吸附

将步骤1)滤液降温到50℃左右，用氢氧化钠调pH值9.5，加入3升的D254树脂。搅拌吸附6～8h，搅拌不宜过快或过慢须使树脂上下翻动，否则吸附效果差。吸附完毕，弃去上层吸附液，然后用120目的尼龙布过滤出树脂。

3)洗涤

过滤后的树脂用7升的38～42℃的温水漂洗3次，除去树脂表面杂质。再放入3.5升5％左右盐溶液，洗涤30min，除去低分子肝素和一些蛋白质，然后过滤出树脂。

4)洗脱

第一次洗脱，将过滤好的树脂中添加浓度为22％的盐溶液3升，搅拌洗脱3h，过滤出树脂收集滤液。

第二次洗脱，加入18％盐水30升，搅拌1h以上，滤液与第一次洗脱滤液合并。

5)压滤过膜

将步骤4)收集的滤液用压滤机过4.5μm的滤膜，去除杂质，收集滤液。

6)透析

将沉淀物放入2000Da透析袋中，用5倍滤液清水透析24h，2h换水一次，去除沉淀物中的氯化钠等小分子杂质。

8)喷雾干燥

将步骤7)得到的透析液进行喷雾干燥，得到粗品肝素钠1.39g。

实施例2

1)盐解与酶解

取新鲜猪肠粘膜100升，加入反应锅中，加入400升水搅拌均匀，加入25kg左右的盐使溶液盐浓度为5度，用的氢氧化钠调pH至9，搅拌升温到55℃，持续搅拌保温1h进行盐解，期间如果盐浓度或pH值下降加入适量的盐和氢氧化钠溶液调节。加入碱性蛋白酶粉末0.2kg，搅拌溶解，保温4h后，升温至90℃，停止加热，所得分解液趁热用120目滤布过滤渣滓。

2)树脂交换吸附

将步骤1)滤液降温到50℃左右，用氢氧化钠调pH至9，加入30升的D254树脂与滤液结合。搅拌吸附6h，搅拌不宜过快或过慢须使树脂上下翻动，否则吸附效果差。吸附完毕，弃去上层吸附液，然后用120目的滤布过滤出树脂。

3)洗涤

过滤后的树脂用60升的40℃的温水漂洗3次，除去树脂表面杂质。再放入30升5％左右盐溶液，洗涤30min，除去低分子肝素和一些蛋白质，然后用120目的滤布过滤出树脂。

4)洗脱

第一次洗脱，将过滤好的树脂中添加浓度为22％的盐溶液30升，搅拌洗脱3h，过滤出树脂收集滤液。

第二次洗脱，加入18％盐水30升，搅拌1h，滤液与第一次洗脱滤液合并。

5)压滤过膜

6)透析

将沉淀物放入截留量为2000Da透析袋中，透析16h，2h换水一次，去除沉淀物中的氯化钠等小分子杂质。

7)喷雾干燥

将步骤6)得到的透析液进行喷雾干燥，得到粗品肝素钠13.87g。

对实施例1～2得到的粗品肝素钠进行实验：

肝素抗IIa因子测定试剂盒(发色底物法)

通过抗FIIa发色底物来检测纯化液中普通肝素(UFH)的抗FIIa活性。当抗凝血酶与UFH结合后，能迅速作用并有效抑制促凝剂：IXa、Xa和凝血酶等的丝氨酸酯酶活性。抗FIIa实验是检测大分子量肝素抗凝血酶活性的合适方法。肝素抗FIIa采用二级发色底物法：含有外源性抗凝血酶的待测肝素抑制定量的凝血酶(IIa)；过量的凝血酶水解它的特异性发色底物；底物释放出游离的pNA，游离pNA的量反映了剩余凝血酶的活力，在405nm波长处检测，肝素浓度与显色程度呈负相关。其具体实验步骤如表1所示：

表1肝素钠活性检测步骤

注：R缓冲液配制方法为：Tris 0.05mol/L，NaCl 0.175mol/L，EDTA0.0075mol/L，pH值8.40，含0.2％的牛血清白蛋白(BSA)和作为防腐剂的叠氮化钠。

图1所示为肝素钠效价标准曲线，将制取的肝素钠样品稀释到适当浓度，通过标准曲线计算粗品肝素钠效价，实施例1为99.25IU/mg，实施例2为101.37IU/mg。

本发明提供了一种从猪小肠黏膜中提取肝素钠的方法，对所得的粗品肝素钠的抗凝血活性研究的结果表明，所得的粗品肝素钠效价为95.1～102IU/mg，每5L肠粘膜液可提取肝素钠0.66～0.70g。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种从猪小肠黏膜中提取肝素钠的方法，包括以下步骤：

4)洗涤步骤3)所述粗品树脂，过滤得吸附肝素钠的树脂；

6)将步骤5)得到的所述洗脱液压滤过2～8μm的滤膜，得滤液；

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)所述氯化钠水溶液的质量浓度为4～6％。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3)所述混合前，还包括将所述酶解液降温到45～50℃，调节pH至8.5～10。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3)所述树脂为D254肝素钠专用树脂。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤4)所述洗涤包括第一洗涤和第二洗涤，所述第一洗涤为将所述粗品树脂与38～42℃的水按照1:2的体积比混合搅拌漂洗2～3次，每次10～15min，得第一洗涤树脂；将所述第一洗涤树脂与质量浓度为4～6％的氯化钠溶液按照1:1的体积比混合，搅拌洗涤20～30min。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤5)所述洗脱包括第一洗脱和第二洗脱，所述第一洗脱为将所述吸附肝素钠树脂与质量浓度为21～23％的氯化钠溶液按体积比1∶1混合，搅拌洗脱2～4h，过滤得第一洗脱液；所述第二洗脱为将第一洗脱过滤出的树脂与质量浓度为18～20％的氯化钠溶液按体积比1∶1的比例混合，搅拌洗脱1～2h，过滤得第二洗脱液；将所述第一洗脱液与第二洗脱液合并。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤5)氯化钠溶液与所述吸附肝素钠的树脂的体积比为(0.9～1.1):(0.9～1.1)。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤8)所述透析的时间为8～16h，所述透析时，2～3h换一次透析液。

9.根据权利要求1或8所述方法，其特征在于，所述透析袋的截留分子量为2000Da。

10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤8)所述喷雾干燥的程序设置：出口温度为50～60℃，干燥空气量为0.4～0.65m³/min，喷雾压力为0.1～0.5MPa，进样速率为4～6mL/min。