CN106432549A - 一种从动物肺中提取肝素钠的方法及该肝素钠 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从动物肺中提取肝素钠的方法及该肝素钠，是以动物肺为原料，经过绞碎打浆、酶解脱脂、盐解提取、酶解除蛋白、树脂吸附与洗脱、调酸碱除蛋白、沉淀脱盐、复沉精制、脱水干燥制得肝素钠。本发明在动物肺肝素钠萃取、纯化过程中，采用盐解与酶解相结合，酸处理与碱处理相结合，树脂提纯与乙醇分级沉淀相结合工艺，最大限度地使肝素与蛋白质、软骨素等杂质解离，较为彻底地去除了与肝素紧密结合的蛋白质、硫酸软骨素、硫酸皮肤素等杂质，具有工艺简单、成本低廉、提取效果好、适合大规模工业化生产的特点。所制备的肝素钠纯度好，效价高，收率高，平均效价达到120U/mg以上，平均每公斤动物肺提取肝素钠效价达到22万单位以上。

Description

一种从动物肺中提取肝素钠的方法及该肝素钠

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种从动物肺中提取肝素钠的方法及该肝素钠。

背景技术

肝素钠（Heparin Sodium ）是肝素的钠盐形式产物。肝素广泛存在于动物体液以及肝、肺、小肠粘膜等组织中，在生物体内一般肝素与蛋白质结合形成蛋白质-多糖复合物而存在。肝素具有多种生化和生理功能，用途非常广泛，主要用于治疗血管栓塞、爆发性流脑、败血症、肾炎、急性心肌梗塞、动脉硬化等疾病，还具有澄清血浆脂质，降低胆固醇等作用。

目前，肝素钠粗品生产多以猪小肠粘膜为原料，采用酶解法或者盐解法提取，这种制备方法易受原材料单一、猪小肠原料紧张、成本高等不利因素制约，难以满足国内外市场的巨大需求。另一方面，我国是一个畜牧业生产大国，生猪、肉羊和肉牛生产总量位居世界前列，2015年生猪出栏数量超过7亿头，全年猪肺产量达到70万吨，肉羊出栏近3亿只，全年羊肺产量达到15万吨，肉牛出栏近5000万头，全年牛肺产量达到15万吨，因此有着丰富的动物肺脏资源。然而由于各种原因，除有少量的猪肺和羊肺直接食用以及部分猪牛肺经初级加工成饲料和肥料外，大部分被弃之浪费，造成了巨大的生物资源浪费，同时又带来严重的环境污染，甚至被一些不法商贩非法利用还带来食品安全问题。因此，对屠宰厂（场）副产物—动物肺脏进行深度开发和综合加工利用具有重要意义。

动物肺中碳水化合物含量（以干基计）在4%以上，肝素就存在于这些碳水化合物中，因此，动物肺脏是一类资源丰富的肝素制取原料。动物肺中虽然肝素含量高，但是由于大量杂蛋白、脂肪和类肝素存在，而且这些杂质与肝素结合非常牢固，不易分离纯化，因而很难获得纯度、活性俱佳的肺肝素成品。目前，国内也有极少数企业在开发、试产动物肺肝素钠，但因产品纯度低、效价低而无法销售。目前来看，利用动物肺提取肝素需要解决以下几个关键技术：（1）动物肺中粗蛋白含量（以干基计）达到70%以上，肝素和蛋白质结合在一起，以糖蛋白形式存在，肝素-蛋白质复合物是无活性的，因此必须有效地将肺组织中的肝素与蛋白质完全解离，并除去杂蛋白，以提高肝素活性和效价，获得较高收率；（2）动物肺中油脂含量（以干基计）在10%以上，过多的油脂不仅会影响提取过程中蛋白质的解离和肝素的释放，同时也影响树脂的吸附和再生，进而影响肝素的效价和收率，因此，有必要在肝素萃取之前最大程度地除去油脂，以提高肝素收率和效价；（3）动物肺中硫酸软骨素和硫酸皮肤素含量比较高，而且两者与肝素性质相似，不易分离，因此，如何有效去除肺肝素中的硫酸软骨素和硫酸皮肤素，是制备合格肝素成品的关键所在。近年来，国内已有少数科研工作者在研究提取动物肺肝素方面取得了一些进展，其中有些已申请了发明专利。例如，CN201110161138.6 公开了一种利用猪肺提取肝素钠粗品的制备工艺，该工艺采用常规的酶解方法，经破浆、酶解、过滤、离子交换吸附处理、洗涤与洗脱、沉淀、干燥等步骤制取肝素钠粗品，该方法制备的肝素钠粗品效价能达到90U/mg，但是在提取肝素钠过程中没有对肺原料进行脱脂处理，也没有对肝素钠粗品进行纯化与精制步骤，仅采用单纯性酶解方法不能使肝素从肺细胞中彻底释放出来，也不能彻底除去蛋白质、硫酸软骨素和硫酸皮肤素等杂质。因此，现有技术方案所制取的肺肝素钠效价低，杂质含量高，质量达不到市场收购的标准要求，难以产业化推广应用。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种从动物肺中提取肝素钠的方法，以解决现有利用动物肺提取肝素钠的制备方法中，均采用单纯性酶解或盐解方法不能实现肝素完全提取、产品收率低、杂质含量高、效价低、无法销售的问题，所述的从动物肺中提取肝素钠的方法，该工艺以丰富的动物肺为原料，应用酶解、盐解、树脂提纯、酸碱处理、复沉精制等现代生物与生化分离技术，具有工艺简单、成本低、收得率高、适合大规模工业化生产等优点。

本发明的第二目的在于提供一种所述的从动物肺中提取肝素钠的方法所制备的肝素钠，该肝素钠具有纯度好、效价高、能达到市场收购标准要求等优点。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种从动物肺中提取肝素钠的方法，包括以下步骤：

（1）绞碎打浆：动物肺经预处理、绞碎、匀浆后加水，搅拌混匀，得到肺浆液；

（2）酶解脱脂：用NaOH调节步骤（1）中的肺浆液的pH值至8.5 -9.2，升温至40-45℃，加入脂肪酶，保温酶解，过滤，收集滤渣，加水搅拌得脱脂肺浆液；

（3）盐解提取：往步骤（2）中的脱脂肺浆液中加入氯化钠，调节pH值，升温至50-55℃并保温，再升温并进行过滤，得到盐解液；

（4）酶解除蛋白：将步骤（3）中的盐解液降温至55℃，调节pH值至8.0-9.0，加入蛋白酶，保温酶解，然后升温灭酶并进行过滤，得到酶解液；

（5）吸附：将步骤（4）中的酶解液降温至60℃，调整其盐度和pH值，加入D-254树脂，保温吸附处理10-12小时后，收集吸附后的树脂；

（6）洗脱：

（6-1）：用水反复冲洗步骤（5）中的吸附后的树脂至水变清为止，滤干树脂，再以完全浸没树脂为量，加入质量分数为5-7%的氯化钠溶液，温度保持在50-55℃，搅拌30-60min，滤干得洗涤后的树脂；

（6-2）：以完全浸没步骤（6-1）中的洗涤后的树脂为量，加入质量分数为20-25%的氯化钠溶液，温度保持在50-55℃，搅拌3-4小时后，分离树脂，收集洗脱液；

（6-3）：重复步骤（6-2）一次，将两次收集的洗脱液合并，并用100目滤袋过滤，收集洗脱液待用；

（7）调酸除蛋白：往步骤（6-3）中的洗脱液加入其重量0.1-0.3%的保护剂搅拌均匀后，用稀盐酸调节pH值至3.0-3.5，静置10分钟，用100目滤袋过滤，收集滤液待用；

（8）调碱除蛋白：用NaOH调节步骤（7）中的滤液的pH值至11.0，搅拌均匀后静置30分钟，用100目滤袋过滤，收集滤液待用；

（9）沉淀脱盐：用稀盐酸调节步骤（8）中的滤液的pH值至7.0-8.0，加入其体积1.8-2.2倍的质量分数为80-85%的预冷过的乙醇，搅拌均匀后密封沉淀18-24小时，倾出上层乙醇清液，收集沉淀物待用；

（10）复沉精制：

（10-1）：往步骤（9）中的沉淀物中加入其重量10倍的质量分数为3%的氯化钠溶液，搅拌溶解后,升温至80℃并保温，然后降温并进行过滤，收集滤液，加入乙醇，静置，收集沉淀物；

（10-2）：往步骤（10-1）中的沉淀物中加入其重量10倍的质量分数为3%的氯化钠溶液，充分搅拌溶解后,升温至80℃并保温，然后降温并进行过滤，收集滤液，加入乙醇，静置，收集沉淀物；

（11）脱水干燥：往步骤（10-2）中的沉淀物中加入其重量2倍的质量分数为95-100%的乙醇脱水2-3次，收集沉淀物，置于60-70℃下干燥10-15小时即得肝素钠。

在上述步骤（1）中，在所述动物肺经预处理、绞碎、匀浆后加水，搅拌混匀，得到肺浆液的过程中，具体包括以下步骤：取新鲜（或经冷冻保存后自然解冻）动物肺清洗去污，剥离气管，去除皮质脂肪，用斩拌机绞碎成肉糜状，再经细磨机研磨匀浆5-10min，得到肺浆料，然后添加肺浆料2-3倍重量的水，搅拌混匀，得到肺浆液。

在上述步骤（2）中，在所述升温至40-45℃，加入脂肪酶，保温酶解，过滤，收集滤渣，加水搅拌得脱脂肺浆液的过程中，具体包括以下步骤：升温至40-45℃，按每公斤肺添加1.2-2.5克的比例加入脂肪酶，保温酶解30-60分钟，酶解结束后用80目滤袋过滤，收集滤渣，往滤渣中加入3-5倍重量的水，搅拌均匀后得脱脂肺浆液；所述脂肪酶为碱性脂肪酶，酶活力为10000-30000U/g。

在上述步骤（3）中，在所述往脱脂肺浆液中加入氯化钠，调节pH值，升温至50-55℃并保温，再升温保温并进行过滤，得到盐解液的过程中，具体包括以下步骤：按每公斤肺添加300-400克的比例往脱脂肺浆液中加入氯化钠，调pH值至9.0，搅拌下升温至50-55℃，保温反应3-5小时，整个反应过程中保持pH值在8.5-9.0之间，反应结束后快速升温至100℃，保温10min，趁热用80目滤袋过滤，收集滤液得盐解液，滤渣经干燥可作饲料用。

在上述步骤（4）中，在所述加入蛋白酶，保温酶解，然后升温灭酶并进行过滤，得到酶解液的过程中，具体包括以下步骤：按每公斤肺添加3-5克的比例加入2709蛋白酶，保温50-55℃，酶解3-5小时后，升温至85℃，保温30min后，趁热用100目滤袋过滤，收集滤液得酶解液。

在上述步骤（5）中所述将酶解液降温至60℃，调整其盐度和PH值，加入D-254树脂，保温吸附处理10-12小时后，收集吸附后的树脂的过程中，具体包括以下步骤：将酶解液降温至60℃，调整其盐度为2.0-2.8波美度，调节其PH值为8.0-8.5，然后按每公斤肺添加30-40克比例加入D-254树脂，搅拌状态下保持温度55-60℃吸附处理10-12小时后，过滤，收集吸附后的树脂。

在上述步骤（7）中，所述保护剂为亚硫酸氢钠。

在上述步骤（10-1）中，在所述升温至80℃并保温，然后降温并进行过滤，收集滤液，加入乙醇，静置，收集沉淀物的过程中，具体包括以下步骤：升温至80℃，保温10分钟后，冷却到常温，用100目滤袋过滤，收集滤液，再往滤液中加入其体积1-1.2倍的质量分数为95%的预冷过的乙醇，搅拌均匀后静置30分钟，倾出上层乙醇清液，收集沉淀物。

在上述步骤（10-2）中，在所述升温至80℃并保温，然后降温并进行过滤，收集滤液，加入乙醇，静置，收集沉淀物的过程中，具体包括以下步骤：升温至80℃，保温10分钟后，冷却到常温，用100目滤袋过滤，收集滤液，再往滤液中加入其体积0.5-0.8倍的质量分数为95%的预冷过的乙醇，搅拌均匀后静置30分钟，倾出上层乙醇清液，收集沉淀物。

如上所述的从动物肺中提取肝素钠的方法所制备的肝素钠。

肝素钠是一种生物医药中间体，是从动物肝、肺、小肠粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属粘多糖类物质，具有多种生理功能和非常广泛的用途。肝素钠是世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药物，主要应用于心脑血管疾病和血液透析治疗，其在血液透析治疗中是唯一有效的特效药物。临床应用及研究显示，肝素钠除具有抗凝血作用外，还具有其他多种生物活性和临床用途，包括降血脂作用、抗中膜平滑肌细胞（SMC）增生、促进纤维蛋白溶解等作用。此外，低分子肝素钠是由肝素钠原料药作为原料进一步加工成的一大类抗血栓的药物，具有更为广泛的临床医学用途，成为治疗急性静脉血栓和急性冠脉综合症（心绞痛、心肌梗塞）等疾病的首选药物。目前，肝素钠尚无法人工化学合成。

本发明方法所制备的肝素钠，纯度好，效价高，效价稳定在120U/mg以上，其中硫酸软骨素和硫酸皮肤素含量很低，完全达到了市场收购的标准要求。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果为：

（1）本发明方法在肝素钠萃取前，先对肺浆液进行酶解脱脂处理，除去肺浆液中的油脂，既有利于后续萃取过程中肝素与蛋白质的解离，又避免了过多的油脂对离子交换中树脂的干扰，大大提高了树脂的吸附能力和利用率。

（2）本发明方法在肝素钠萃取过程中，采用盐解与酶解相结合，酸处理与碱处理相结合工艺，最大限度地使肝素与蛋白质解离，较为彻底地去除了蛋白质杂质，解决了单纯性酶解或单纯性盐解不能使肝素从肺细胞中彻底释放出来的问题。

（3）本发明方法在肝素钠粗品纯化过程中，采用复沉与乙醇分级沉淀相结合方法，较为彻底地去除了硫酸软骨素和硫酸皮肤素等类肝素杂质，所得到的肝素钠成品纯度好，效价高，效价稳定在120U/mg以上，完全达到了市场收购的标准要求。

（4）本发明方法能有效提高肺肝素钠的收率，平均每公斤动物肺提取肝素钠效价达到22万单位以上，与现有技术相比，收率提高20%以上。

（5）本发明方法工艺简单，原料丰富，成本低廉，实现了动物肺脏的高值化开发利用，适合大规模工业化生产。

附图说明

附图1为本发明所制取的肝素钠核磁共振氢谱谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

（1）斩拌打浆：取新鲜猪肺100公斤，清洗去污，剥离气管，去除皮质脂肪，用斩拌机绞碎成肉糜状，再经细磨机研磨匀浆5min，得到肺浆料，然后往肺浆料中添加300公斤水，搅拌混匀，得到肺浆液；

（2）酶解脱脂：用NaOH调整步骤（1）中的肺浆液的PH值至8.6，升温至45℃，往肺浆液中加入脂肪酶150克，保温酶解45分钟，酶解结束后用80目滤袋过滤，收集滤渣，往滤渣中加入3倍重量的水，搅拌均匀后得脱脂肺浆液；

（3）盐解提取：往步骤（2）中的脱脂肺浆液中添加32公斤氯化钠，调pH值至9.0，搅拌下升温至52℃，保温反应5小时，反应过程中保持pH值在8.5-9.0之间，反应结束后快速升温至100℃，保温10min，趁热用80目滤袋过滤，收集滤液得盐解液，滤渣经干燥可作饲料用；

（4）酶解除蛋白：将步骤（3）中的盐解液降温至55℃，调节PH值至8.5，加入2709蛋白酶300克，保温53℃，酶解5小时后，升温至85℃，保温30min后，趁热用100目滤袋过滤，收集滤液得酶解液；

（5）吸附：将步骤（4）中的酶解液降温至60℃，调整其盐度为2.2波美度，调节其PH值为8.0，然后加入D-254树脂3.2公斤，搅拌状态下保持温度55-60℃吸附处理12小时后，过滤，收集吸附后的树脂；

（6）洗脱：

（6-1）：用水反复冲洗步骤（5）中的吸附后的树脂至水变清为止，滤干树脂，再以完全浸没树脂为量，加入质量分数为5%的氯化钠溶液，温度保持在50-55℃，搅拌60min，滤干得洗涤后的树脂；

（6-2）：以完全浸没步骤（6-1）中的洗涤后的树脂为量，加入质量分数为22%的氯化钠溶液，温度保持在50-55℃，搅拌4小时后，分离树脂，收集洗脱液；

（6-3）：重复步骤（6-2）一次，将两次收集的洗脱液合并，并用100目滤袋过滤，收集洗脱液待用；

（7）调酸除蛋白：往步骤（6-3）中的洗脱液中加入20克亚硫酸氢钠，用稀盐酸调节PH值至3.0，静置10分钟，用100目滤袋过滤，收集滤液待用；

(8)调碱除蛋白：用NaOH调节步骤（7）中的滤液的PH值至11.0，搅拌均匀后静置30分钟，用100目滤袋过滤，收集滤液待用；

（9）沉淀脱盐：用稀盐酸调节步骤（8）中的滤液的PH值至7.2，加入其体积2倍的质量分数为85%的预冷过的乙醇，搅拌均匀后密封沉淀24小时，倾出上层乙醇清液，收集沉淀物待用；

（10）复沉精制：

（10-1）：往步骤（9）中的沉淀物中加入其重量10倍的质量分数为3%的氯化钠溶液，搅拌溶解后,升温至80℃，保温处理10分钟后，冷却到常温，用100目滤袋过滤，收集滤液，再往滤液中加入其体积1.0倍的质量分数为95%的预冷过的乙醇，搅拌均匀后静置30分钟，倾出上层乙醇清液，收集沉淀物待用；

（10-2）：往步骤（10-1）中的沉淀物中加入其重量10倍的质量分数为3%的氯化钠溶液，充分搅拌溶解后,升温至80℃，保温处理10分钟后，冷却到常温，用100目滤袋过滤，收集滤液，再往滤液中加入其体积0.8倍的质量分数为95%的预冷过的乙醇，搅拌均匀后静置30分钟，倾出上层乙醇清液，收集沉淀物待用；

（11）脱水干燥：往步骤（10-2）中的沉淀物中加入其重量2倍的质量分数为95%的乙醇脱水2次，收集沉淀物，置于65-70℃下干燥12小时，得肝素钠179克。

实施例2

（1）斩拌打浆：取冷冻猪肺100公斤，经自然解冻后清洗去污，剥离气管，去除皮质脂肪，用斩拌机绞碎成肉糜状，再经细磨机研磨匀浆8min，得到肺浆料，然后往肺浆料中添加200公斤水，搅拌混匀，得到肺浆液；

（2）酶解脱脂：用NaOH调整步骤（1）中的肺浆液的PH值至9.0，升温至45℃，往肺浆液中加入脂肪酶200克，保温酶解30分钟，酶解结束后用80目滤袋过滤，收集滤渣，往滤渣中加入5倍重量的水，搅拌均匀后得脱脂肺浆液；

（3）盐解提取：往步骤（2）中的脱脂肺浆液中添加40公斤氯化钠，调pH值至9.0，搅拌下升温至55℃，保温反应3小时，反应过程中保持pH值在8.5-9.0之间，反应结束后快速升温至100℃，保温10min，趁热用80目滤袋过滤，收集滤液得盐解液，滤渣经干燥可作饲料用；

（4）酶解除蛋白：将步骤（3）中的盐解液降温至55℃，调节PH值至8.2，加入2709蛋白酶500克，保温55℃，酶解4小时后，升温至85℃，保温30min后，趁热用100目滤袋过滤，收集滤液得酶解液；

（5）吸附：将步骤（4）中的酶解液降温至60℃，调整其盐度为2.5波美度，调节其PH值为8.5，然后加入D-254树脂3.8公斤，搅拌状态下保持温度55-60℃吸附处理10小时后，过滤，收集吸附后的树脂；

（6）洗脱：

（6-1）：用水反复冲洗步骤（5）中的吸附后的树脂至水变清为止，滤干树脂，再以完全浸没树脂为量，加入质量分数为7%的氯化钠溶液，温度保持在50-55℃，搅拌30min，滤干得洗涤后的树脂；

（6-2）：以完全浸没步骤（6-1）中的洗涤后的树脂为量，加入质量分数为25%的氯化钠溶液，温度保持在50-55℃，搅拌3小时后，分离树脂，收集洗脱液；

（6-3）：重复步骤（6-2）一次，将两次收集的洗脱液合并，并用100目滤袋过滤，收集洗脱液待用；

（7）调酸除蛋白：往步骤（6-3）中的洗脱液中加入30克亚硫酸氢钠，用稀盐酸调节PH值至3.5，静置10分钟，用100目滤袋过滤，收集滤液待用；

（8）调碱除蛋白：用NaOH调节步骤（7）中的滤液的PH值至11.0，搅拌均匀后静置30分钟，用100目滤袋过滤，收集滤液待用；

（9）沉淀脱盐：用稀盐酸调节步骤（8）中的滤液的PH值至7.8，加入其体积2.2倍的质量分数为85%的预冷过的乙醇，搅拌均匀后密封沉淀18小时，倾出上层乙醇清液，收集沉淀物待用；

（10）复沉精制：

（10-1）：往步骤（9）中的沉淀物中加入其重量10倍的质量分数为3%的氯化钠溶液，搅拌溶解后,升温至80℃，保温处理10分钟后，冷却到常温，用100目滤袋过滤，收集滤液，再往滤液中加入其体积1.2倍的质量分数为95%的预冷过的乙醇，搅拌均匀后静置30分钟，倾出上层乙醇清液，收集沉淀物待用；

（10-2）：往步骤（10-1）中的沉淀物中加入其重量10倍的质量分数为3%的氯化钠溶液，充分搅拌溶解后,升温至80℃，保温处理10分钟后，冷却到常温，用100目滤袋过滤，收集滤液，再往滤液中加入其体积0.5倍的质量分数为95%的预冷过的乙醇，搅拌均匀后静置30分钟，倾出上层乙醇清液，收集沉淀物待用；

（11）脱水干燥：往步骤（10-2）中的沉淀物中加入其重量2倍的质量分数为95%的乙醇脱水3次，收集沉淀物，置于65-70℃下干燥10小时，得肝素钠172克。

实施例3

（1）斩拌打浆：取新鲜羊肺100公斤，剥离气管，去除皮质脂肪，用斩拌机绞碎成肉糜状，再经细磨机研磨匀浆8min，得到肺浆料，然后往肺浆料中添加250公斤水，搅拌混匀，得到肺浆液；

（2）酶解脱脂：用NaOH调整步骤（1）中的肺浆液的PH值至8.8，升温至43℃，往肺浆液中加入脂肪酶200克，保温酶解45分钟，酶解结束后用80目滤袋过滤，收集滤渣，往滤渣中加入4倍重量的水，搅拌均匀后得脱脂肺浆液；

（3）盐解提取：往步骤（2）中的脱脂肺浆液中添加35公斤氯化钠，调pH值至9.0，搅拌下升温至52℃，保温反应4小时，反应过程中保持pH值在8.5-9.0之间，反应结束后快速升温至100℃，保温10min，趁热用80目滤袋过滤，收集滤液得盐解液，滤渣经干燥可作饲料用；

（4）酶解除蛋白：将步骤（3）中的盐解液降温至55℃，调节PH值至8.6，按加入2709蛋白酶400克，保温52℃，酶解4小时后，升温至85℃，保温30min后，趁热用100目滤袋过滤，收集滤液得酶解液；

（5）吸附：将步骤（4）中的酶解液降温至60℃，调整其盐度为2.8波美度，调节其PH值为8.3，然后加入D-254树脂3.5公斤，搅拌状态下保持温度55-60℃吸附处理11小时后，过滤，收集吸附后的树脂；

（6）洗脱：

（6-1）：用水反复冲洗步骤（5）中的吸附后的树脂至水变清为止，滤干树脂，再以完全浸没树脂为量，加入质量分数为6%的氯化钠溶液，温度保持在50-55℃，搅拌45min，滤干得洗涤后的树脂；

（6-2）：以完全浸没步骤（6-1）中的洗涤后的树脂为量，加入质量分数为23%的氯化钠溶液，温度保持在50-55℃，搅拌3.5小时后，分离树脂，收集洗脱液；

（6-3）：重复步骤（6-2）一次，将两次收集的洗脱液合并，并用100目滤袋过滤，收集洗脱液待用；

（7）调酸除蛋白：往步骤（6-3）中的洗脱液中加入25克亚硫酸氢钠，用稀盐酸调节PH值至3.0，静置10分钟，用100目滤袋过滤，收集滤液待用；

(8)调碱除蛋白：用NaOH调节步骤（7）中的滤液的PH值至11.0，搅拌均匀后静置30分钟，用100目滤袋过滤，收集滤液待用；

（9）沉淀脱盐：用稀盐酸调节步骤（8）中的滤液的PH值至7.5，加入其体积2倍的质量分数为85%的预冷过的乙醇，搅拌均匀后密封沉淀22小时，倾出上层乙醇清液，收集沉淀物待用；

（10）复沉精制：

（10-1）：往步骤（9）中的沉淀物中加入其重量10倍的质量分数为3%的氯化钠溶液，搅拌溶解后,升温至80℃，保温处理10分钟后，冷却到常温，用100目滤袋过滤，收集滤液，再往滤液中加入其体积1.0倍的质量分数为95%的预冷过的乙醇，搅拌均匀后静置30分钟，倾出上层乙醇清液，收集沉淀物待用；

（10-2）：往步骤（10-1）中的沉淀物中加入其重量10倍的质量分数为3%的氯化钠溶液，充分搅拌溶解后,升温至80℃，保温处理10分钟后，冷却到常温，用100目滤袋过滤，收集滤液，再往滤液中加入其体积0.6倍的质量分数为95%的预冷过的乙醇，搅拌均匀后静置30分钟，倾出上层乙醇清液，收集沉淀物待用；

（11）脱水干燥：往步骤（10-2）中的沉淀物中加入其重量2倍的质量分数为95%的乙醇脱水3次，收集沉淀物，置于65-70℃下干燥12小时，得肝素钠146克。

实施例4

（1）斩拌打浆：取新鲜牛肺100公斤，清洗去污，剥离气管，去除皮质脂肪，用斩拌机绞碎成肉糜状，再经细磨机研磨匀浆10min，得到肺浆料，然后往肺浆料中添加200公斤水，搅拌混匀，得到肺浆液；

（2）酶解脱脂：用NaOH调整步骤（1）中的肺浆液的PH值至8.8，升温至42℃，往肺浆液中加入脂肪酶200克，保温酶解40分钟，酶解结束后用80目滤袋过滤，收集滤渣，往滤渣中加入5倍重量的水，搅拌均匀后得脱脂肺浆液；

（3）盐解提取：往步骤（2）中的脱脂肺浆液中添加38公斤氯化钠，调pH值至9.0，搅拌下升温至53℃，保温反应4小时，反应过程中保持pH值在8.5-9.0之间，反应结束后快速升温至100℃，保温10min，趁热用80目滤袋过滤，收集滤液得盐解液，滤渣经干燥可作饲料用；

（4）酶解除蛋白：将步骤（3）中的盐解液降温至55℃，调节PH值至8.5，加入2709蛋白酶350克，保温50℃，酶解4小时后，升温至85℃，保温30min后，趁热用100目滤袋过滤，收集滤液得酶解液；

（5）吸附：将步骤（4）中的酶解液降温至60℃，调整其盐度为2.6波美度，调节其PH值为8.2，然后加入D-254树脂3.6公斤，搅拌状态下保持温度55-60℃吸附处理10小时后，过滤，收集吸附后的树脂；

（6）洗脱：

（6-1）：用水反复冲洗步骤（5）中的吸附后的树脂至水变清为止，滤干树脂，再以完全浸没树脂为量，加入质量分数为6%的氯化钠溶液，温度保持在50-55℃，搅拌40min，滤干得洗涤后的树脂；

（6-2）：以完全浸没步骤（6-1）中的洗涤后的树脂为量，加入质量分数为22%的氯化钠溶液，温度保持在50-55℃，搅拌4小时后，分离树脂，收集洗脱液；

（6-3）：重复步骤（6-2）一次，将两次收集的洗脱液合并，并用100目滤袋过滤，收集洗脱液待用；

（7）调酸除蛋白：往步骤（6-3）中的洗脱液中加入22克亚硫酸氢钠，用稀盐酸调节PH值至3.2，静置10分钟，用100目滤袋过滤，收集滤液待用；

(8)调碱除蛋白：用NaOH调节步骤（7）中的滤液的PH值至11.0，搅拌均匀后静置30分钟，用100目滤袋过滤，收集滤液待用；

（9）沉淀脱盐：用稀盐酸调节步骤（8）中的滤液的PH值至7.5，加入其体积2倍的质量分数为85%的预冷过的乙醇，搅拌均匀后密封沉淀20小时，倾出上层乙醇清液，收集沉淀物待用；

（10）复沉精制：

（10-1）：往步骤（9）中的沉淀物中加入其重量10倍的质量分数为3%的氯化钠溶液，搅拌溶解后,升温至80℃，保温处理10分钟后，冷却到常温，用100目滤袋过滤，收集滤液，再往滤液中加入其体积1.0倍的质量分数为95%的预冷过的乙醇，搅拌均匀后静置30分钟，倾出上层乙醇清液，收集沉淀物待用；

（10-2）：往步骤（10-1）中的沉淀物中加入其重量10倍的质量分数为3%的氯化钠溶液，充分搅拌溶解后,升温至80℃，保温处理10分钟后，冷却到常温，用100目滤袋过滤，收集滤液，再往滤液中加入其体积0.5倍的质量分数为95%的预冷过的乙醇，搅拌均匀后静置30分钟，倾出上层乙醇清液，收集沉淀物待用；

（11）脱水干燥：往步骤（10-2）中的沉淀物中加入其重量2倍的质量分数为95%的乙醇脱水2次，收集沉淀物，置于65-70℃下干燥12小时，得肝素钠215克。

实施例5

（1）斩拌打浆：取冷冻牛肺200公斤，经自然解冻后清洗去污，剥离气管，去除皮质脂肪，用斩拌机绞碎成肉糜状，再经细磨机研磨匀浆10min，得到肺浆料，然后往肺浆料中添加600公斤水，搅拌混匀，得到肺浆液；

（2）酶解脱脂：用NaOH调整步骤（1）中的肺浆液的PH值至9.0，升温至45℃，往肺浆液中加入脂肪酶300克，保温酶解60分钟，酶解结束后用80目滤袋过滤，收集滤渣，往滤渣中加入4倍重量的水，搅拌均匀后得脱脂肺浆液；

（3）盐解提取：往步骤（2）中的脱脂肺浆液中添加70公斤氯化钠，调pH值至9.0，搅拌下升温至52℃，保温反应5小时，反应过程中保持pH值在8.5-9.0之间，反应结束后快速升温至100℃，保温10min，趁热用80目滤袋过滤，收集滤液得盐解液，滤渣经干燥可作饲料用；

（4）酶解除蛋白：将步骤（3）中的盐解液降温至55℃，调节PH值至8.8，加入2709蛋白酶900克，保温52℃，酶解3.5小时后，升温至85℃，保温30min后，趁热用100目滤袋过滤，收集滤液得酶解液；

（5）吸附：将步骤（4）中的酶解液降温至60℃，调整其盐度为2.2波美度，调节其PH值为8.0，然后加入D-254树脂7公斤，搅拌状态下保持温度55-60℃吸附处理12小时后，过滤，收集吸附后树脂；

（6）洗脱：

（6-1）：用水反复冲洗步骤（5）中的吸附后的树脂至水变清为止，滤干树脂，再以完全浸没树脂为量，加入质量分数为7%的氯化钠溶液，温度保持在50-55℃，搅拌60min，滤干得洗涤后的树脂；

（6-2）：以完全浸没步骤（6-1）中的洗涤后的树脂为量，加入质量分数为25%的氯化钠溶液，温度保持在50-55℃，搅拌3小时后，分离树脂，收集洗脱液；

（6-3）：重复步骤（6-2）一次，将两次收集的洗脱液合并，并用100目滤袋过滤，收集洗脱液待用；

（7）调酸除蛋白：往步骤（6-3）中的洗脱液中加入60克亚硫酸氢钠，用稀盐酸调节PH值至3.0，静置10分钟，用100目滤袋过滤，收集滤液待用；

(8)调碱除蛋白：用NaOH调节步骤（7）中的滤液的PH值至11.0，搅拌均匀后静置30分钟，用100目滤袋过滤，收集滤液待用；

（9）沉淀脱盐：用稀盐酸调节步骤（8）中的滤液的PH值至7.2，加入其体积2.2倍的质量分数为85%的预冷过的乙醇，搅拌均匀后密封沉淀18小时，倾出上层乙醇清液，收集沉淀物待用；

（10）复沉精制：

（10-1）：往步骤（9）中的沉淀物中加入其重量10倍的质量分数为3%的氯化钠溶液，搅拌溶解后,升温至80℃，保温处理10分钟后，冷却到常温，用100目滤袋过滤，收集滤液，再往滤液中加入其体积1.2倍的质量分数为95%的预冷过的乙醇，搅拌均匀后静置30分钟，倾出上层乙醇清液，收集沉淀物待用；

（10-2）：往步骤（10-1）中的沉淀物中加入其重量10倍的质量分数为3%的氯化钠溶液，充分搅拌溶解后,升温至80℃，保温处理10分钟后，冷却到常温，用100目滤袋过滤，收集滤液，再往滤液中加入其体积0.8倍的质量分数为95%的预冷过的乙醇，搅拌均匀后静置30分钟，倾出上层乙醇清液，收集沉淀物待用；

（11）脱水干燥：往步骤（10-2）中的沉淀物中加入其重量2倍的质量分数为95%的乙醇脱水3次，收集沉淀物，置于65-70℃下干燥10小时，得肝素钠438克。

肝素钠纯度检测：

对实施例1得到的肝素钠，取样采用BRUKER NMR仪器（型号：AV500），依据美国药典USP34-NF29方法进行核磁共振图谱分析，检测样品中硫酸皮肤素、肝素钠和硫酸软骨素三种物质的含量比。这三种物质出峰范围为2.02-2.07ppm，其中硫酸皮肤素的出峰位置为2.07ppm，肝素钠为2.04ppm，硫酸软骨素为2.02ppm。目前市场上对合格肝素钠粗品的收购标准为其硫酸皮肤素含量小于60%，硫酸软骨素含量小于30%，反映在核磁共振氢谱谱图上的信息要求则为在2.07ppm处的峰高不高于2.04ppm 处峰高的二分之一，在2.02ppm处的峰高不高于2.04ppm处峰高的四分之一。实施例1所得到的肝素钠样品检测结果如图1所示，从图1可见，在2.04ppm处的波峰高而窄，表示肝素钠含量高，在2.02ppm处和2.07ppm处峰分别有极小的峰波，表示样品中的硫酸软骨素和硫酸皮肤素含量很低，由此说明本发明方法所制备的肝素钠产品纯度高，完全达到市场收购的标准要求。

肝素钠活性检测：

对实施例1-5得到的肝素钠，取样采用绵羊血浆法进行活性（效价）检测，并与申请号为CN201110161138.6的专利进行对比。结果如表1所示。

从表1中可以看出，本发明方法所制备的肝素钠，活性高，单位效价达到每毫克120U以上，较对比例提高40%-80%，每公斤肺可提取肝素钠效价在22万U以上，肝素钠收率较对比例提高20%以上。

综上所述，本发明方法在肝素萃取前，对肺浆液进行酶解脱脂处理，避免了过多的油脂对离子交换中树脂的干扰，大大提高了树脂的吸附能力和利用率,在肝素萃取、纯化过程中，采用盐解与酶解相结合，酸处理与碱处理相结合，复沉与乙醇分级沉淀相结合，最大限度地使肝素与蛋白质解离，较为彻底地去除了蛋白质、硫酸软骨素、硫酸皮肤素等杂质，使肝素钠成品的纯度、活性和收率都有大幅度提高，获得了较理想的提取效果。所制备的肝素钠成品单位效价在120U/mg以上，肝素钠收率达到22万U/kg肺以上。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种从动物肺中提取肝素钠的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）绞碎打浆：动物肺经预处理、绞碎、匀浆后加水，搅拌混匀，得到肺浆液；

（2）酶解脱脂：用NaOH调节步骤（1）中的肺浆液的pH值至8.5 -9.2，升温至40-45℃，加入脂肪酶，保温酶解，过滤，收集滤渣，加水搅拌得脱脂肺浆液；

（3）盐解提取：往步骤（2）中的脱脂肺浆液中加入氯化钠，调节pH值，升温至50-55℃并保温，再升温并进行过滤，得到盐解液；

（4）酶解除蛋白：将步骤（3）中的盐解液降温至55℃，调节pH值至8.0-9.0，加入蛋白酶，保温酶解，然后升温灭酶并进行过滤，得到酶解液；

（5）吸附：将步骤（4）中的酶解液降温至60℃，调整其盐度和pH值，加入D-254树脂，保温吸附处理10-12小时后，收集吸附后的树脂；

（6）洗脱：

（6-1）：用水反复冲洗步骤（5）中的吸附后的树脂至水变清为止，滤干树脂，再以完全浸没树脂为量，加入质量分数为5-7%的氯化钠溶液，温度保持在50-55℃，搅拌30-60min，滤干得洗涤后的树脂；

（6-2）：以完全浸没步骤（6-1）中的洗涤后的树脂为量，加入质量分数为20-25%的氯化钠溶液，温度保持在50-55℃，搅拌3-4小时后，分离树脂，收集洗脱液；

（6-3）：重复步骤（6-2）一次，将两次收集的洗脱液合并，并用100目滤袋过滤，收集洗脱液待用；

（7）调酸除蛋白：往步骤（6-3）中的洗脱液加入其重量0.1-0.3%的保护剂搅拌均匀后，用稀盐酸调节pH值至3.0-3.5，静置10分钟，用100目滤袋过滤，收集滤液待用；

（8）调碱除蛋白：用NaOH调节步骤（7）中的滤液的pH值至11.0，搅拌均匀后静置30分钟，用100目滤袋过滤，收集滤液待用；

（9）沉淀脱盐：用稀盐酸调节步骤（8）中的滤液的pH值至7.0-8.0，加入其体积1.8-2.2倍的质量分数为80-85%的预冷过的乙醇，搅拌均匀后密封沉淀18-24小时，倾出上层乙醇清液，收集沉淀物待用；

（10）复沉精制：

（10-1）：往步骤（9）中的沉淀物中加入其重量10倍的质量分数为3%的氯化钠溶液，搅拌溶解后,升温至80℃并保温，然后降温并进行过滤，收集滤液，加入乙醇，静置，收集沉淀物；

（10-2）：往步骤（10-1）中的沉淀物中加入其重量10倍的质量分数为3%的氯化钠溶液，充分搅拌溶解后,升温至80℃并保温，然后降温并进行过滤，收集滤液，加入乙醇，静置，收集沉淀物；

（11）脱水干燥：往步骤（10-2）中的沉淀物中加入其重量2倍的质量分数为95-100%的乙醇脱水2-3次，收集沉淀物，置于60-70℃下干燥10-15小时即得肝素钠。

2.根据权利要求1所述的从动物肺中提取肝素钠的方法，其特征在于，在上述步骤（1）中，在所述动物肺经预处理、绞碎、匀浆后加水，搅拌混匀，得到肺浆液的过程中，具体包括以下步骤：取新鲜（或经冷冻保存后自然解冻）动物肺清洗去污，剥离气管，去除皮质脂肪，用斩拌机绞碎成肉糜状，再经细磨机研磨匀浆5-10min，得到肺浆料，然后添加肺浆料2-3倍重量的水，搅拌混匀，得到肺浆液。

3.根据权利要求1所述的从动物肺中提取肝素钠的方法，其特征在于，在上述步骤（2）中，在所述升温至40-45℃，加入脂肪酶，保温酶解，过滤，收集滤渣，加水搅拌得脱脂肺浆液的过程中，具体包括以下步骤：升温至40-45℃，按每公斤肺添加1.2-2.5克的比例加入脂肪酶，保温酶解30-60分钟，酶解结束后用80目滤袋过滤，收集滤渣，往滤渣中加入3-5倍重量的水，搅拌均匀后得脱脂肺浆液；所述脂肪酶为碱性脂肪酶，酶活力为10000-30000U/g。

4.根据权利要求1所述的从动物肺中提取肝素钠的方法，其特征在于，在上述步骤（3）中，在所述往脱脂肺浆液中加入氯化钠，调节pH值，升温至50-55℃并保温，再升温保温并进行过滤，得到盐解液的过程中，具体包括以下步骤：按每公斤肺添加300-400克的比例往脱脂肺浆液中加入氯化钠，调pH值至9.0，搅拌下升温至50-55℃，保温反应3-5小时，整个反应过程中保持pH值在8.5-9.0之间，反应结束后快速升温至100℃，保温10min，趁热用80目滤袋过滤，收集滤液得盐解液，滤渣经干燥可作饲料用。

5.根据权利要求1所述的从动物肺中提取肝素钠的方法，其特征在于，在上述步骤（4）中，在所述加入蛋白酶，保温酶解，然后升温灭酶并进行过滤，得到酶解液的过程中，具体包括以下步骤：按每公斤肺添加3-5克的比例加入2709蛋白酶，保温50-55℃，酶解3-5小时后，升温至85℃，保温30min后，趁热用100目滤袋过滤，收集滤液得酶解液。

6.根据权利要求1所述的从动物肺中提取肝素钠的方法，其特征在于，在上述步骤（5）中所述将酶解液降温至60℃，调整其盐度和PH值，加入D-254树脂，保温吸附处理10-12小时后，收集吸附后的树脂的过程中，具体包括以下步骤：将酶解液降温至60℃，调整其盐度为2.0-2.8波美度，调节其PH值为8.0-8.5，然后按每公斤肺添加30-40克比例加入D-254树脂，搅拌状态下保持温度55-60℃吸附处理10-12小时后，过滤，收集吸附后的树脂。

7.根据权利要求1所述的从动物肺中提取肝素钠的方法，其特征在于，在上述步骤（7）中，所述保护剂为亚硫酸氢钠。

8.根据权利要求1所述的从动物肺中提取肝素钠的方法，其特征在于，在上述步骤（10-1）中，在所述升温至80℃并保温，然后降温并进行过滤，收集滤液，加入乙醇，静置，收集沉淀物的过程中，具体包括以下步骤：升温至80℃，保温10分钟后，冷却到常温，用100目滤袋过滤，收集滤液，再往滤液中加入其体积1-1.2倍的质量分数为95%的预冷过的乙醇，搅拌均匀后静置30分钟，倾出上层乙醇清液，收集沉淀物。

9.根据权利要求1所述的从动物肺中提取肝素钠的方法，其特征在于，在上述步骤（10-2）中，在所述升温至80℃并保温，然后降温并进行过滤，收集滤液，加入乙醇，静置，收集沉淀物的过程中，具体包括以下步骤：升温至80℃，保温10分钟后，冷却到常温，用100目滤袋过滤，收集滤液，再往滤液中加入其体积0.5-0.8倍的质量分数为95%的预冷过的乙醇，搅拌均匀后静置30分钟，倾出上层乙醇清液，收集沉淀物。

10.一种根据权利要求1-9任一项所述的从动物肺中提取肝素钠的方法所制备的肝素钠。