CN114276473A - 肝素钠精品及其提取方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肝素钠精品及其提取方法和应用。该提取方法包括以下步骤：(1)预处理，得沉淀A；(2)酸碱处理：对沉淀A水溶液调节pH值为1.5～2.0，过滤，得酸性滤液；对所述酸性滤液的调节pH值为11～12，在90～92℃下搅拌后过滤，得碱性滤液；将所述碱性滤液酒沉，得沉淀B；(3)氧化：对沉淀B水溶液进行2～4次氧化，得沉淀C；(4)冻干。本发明的提取方法可有效防止朊病毒进入肝素钠精品中，所述肝素钠精品中不含朊病毒，并且其他类型的蛋白杂质含量也很低，有很大的市场应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种肝素钠精品及其提取方法和应用。
背景技术
肝素钠是一种临床应用非常广泛的抗凝血药物，其基础原料从哺乳动物的内脏组织内提取。常用的来源为猪小肠粘膜、牛肺和牛小肠粘膜、羊小肠粘膜，其中猪小肠粘膜是最主要的提取来源。随着全球肝素钠供应紧张，以及猪病疫情频发，牛羊来源的肝素钠有了重回主流市场的潜力。
牛、羊在历史中曾出现过克雅氏病(俗称疯牛病，BSE)和羊瘙痒症(TSE)。BSE/TSE的致病源为朊病毒(朊蛋白)，是一个可以自我复制并使正常蛋白变异的蛋白类物质，由于其无典型病毒结构，不激发免疫反应，故人体无法抵御朊病毒(朊蛋白)的感染。人类感染朊病毒(朊蛋白)后，会导致中枢神经病变而致死。虽然朊病毒(朊蛋白)并不是一种常见的杂质，出现的几率可能只有几百万分之一，但是鉴于其高微危险性，有必要在提取牛羊来源的肝素钠时，去除可能的朊病毒(朊蛋白)，将感染朊病毒(朊蛋白)的可能性降到最低。然而，朊病毒(朊蛋白)结构特殊，可抵抗紫外线、高温、辐射等传统杀灭手段，因此，亟需一种有效去除牛羊来源的肝素钠中的朊病毒的方法。
发明内容
本发明为了解决现有技术中牛或羊肝素钠提取方法无法去除朊病毒的缺陷，从而提供了一种肝素钠精品及其提取方法和应用。本发明所述的提取方法可有效防止朊病毒进入肝素钠精品中，所述肝素钠精品中不含朊病毒，并且其他类型的蛋白杂质含量也很低。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种肝素钠精品提取方法，其包括以下步骤：
(1)预处理：对肝素钠粗品水溶液的调节pH值为7～9，然后与树脂混合，吸附后过滤，收集吸附树脂；用氯化钠水溶液洗脱所述吸附树脂，合并洗脱液；将所述洗脱液酒沉，得沉淀A；
(2)酸碱处理：对沉淀A水溶液调节pH值为1.5～2.0，过滤，得酸性滤液；对所述酸性滤液的调节pH值为11～12，在90～92℃下搅拌后过滤，得碱性滤液；将所述碱性滤液酒沉，得沉淀B；
(3)氧化：对沉淀B水溶液进行2～4次氧化，在第一次氧化结束后，将氧化溶液酒沉，得沉淀B1，对沉淀B1水溶液进行第二次氧化，依次类推；在最后一次氧化结束后，对氧化溶液中进行还原，得还原溶液，对还原溶液调节pH值为6～7，酒沉，得沉淀C；
(4)冻干：对沉淀C溶水溶液调节pH值为5.5～7，过滤，对所得滤液进行冻干。
步骤(1)中，所述肝素钠粗品可为市售可得的牛或羊肝素钠粗品。所述肝素钠粗品的效价一般为20～60IU/mg。按肝素钠粗品的效价计，所述肝素钠粗品水溶液的浓度较佳地为10000～15000IU/mL。
步骤(1)中，在调节pH值之前，较佳地，向肝素钠粗品水溶液中加入氯化钠。所述氯化钠的用量较佳地为1.5％～4％，所述百分比为所述氯化钠占所述肝素钠粗品水溶液的质量百分比。
步骤(1)中，所述树脂可为本领域常规，较佳地为阴离子交换树脂，更佳地为强阴离子交换树脂，例如FPA98型阴离子交换树脂、WD-1701型阴离子交换树脂或D-254型阴离子交换树脂。所述树脂的用量可为本领域常规，较佳地为1kg肝素钠粗品用20～50kg树脂。
步骤(1)中，所述吸附的温度可为本领域常规，较佳地为55～65℃，例如60℃。所述吸附的时间可为3～6小时。
步骤(1)中，所述过滤可采用本领域常规的方法进行，例如采用100目尼龙袋过滤。
步骤(1)中，所述氯化钠水溶液的浓度较佳地为18～23％，所述百分比为氯化钠占氯化钠水溶液的质量百分比。所述氯化钠水溶液的用量较佳地为1kg所述吸附树脂用1.2L氯化钠水溶液。
步骤(1)中，所述洗脱的温度可为本领域常规，较佳地为55～65℃，例如为60℃。所述洗脱的时间可为本领域常规，较佳地为3～6小时。
较佳地，所述洗脱重复至少两次。
较佳地，在洗脱前对所述吸附树脂进行冲洗。所述冲洗的较佳的操作为：先用自来水冲洗，再用2倍于吸附树脂重量的氯化钠水溶液常温冲洗。其中，所述氯化钠水溶液的浓度较佳地为3％～5％，所述百分比为氯化钠占氯化钠水溶液的质量百分比。
步骤(2)中，按肝素钠粗品的效价计，所述沉淀A水溶液的浓度较佳地为10000～15000IU/mL。
步骤(2)中，所述过滤可采用本领域常规的方法进行，较佳地采用硅藻土过滤。
步骤(2)中，所述搅拌的时间较佳地为2～4小时。
步骤(3)中，按肝素钠粗品的效价计，所述沉淀B水溶液和所述沉淀B1水溶液的浓度较佳地为10000～15000IU/mL。同样地，若存在沉淀B2、沉淀B3，那么，按肝素钠粗品的效价计，沉淀B2水溶液、沉淀B3水溶液的浓度较佳地为10000～15000IU/mL。应理解，在第二次氧化结束后，将氧化溶液酒沉，得沉淀B2；在第三次氧化结束后，将氧化溶液酒沉，得沉淀B3。
步骤(3)中，所述氧化的操作可按照本领域常规方法进行，一般采用双氧水和/或过氧乙酸进行。
当采用双氧水进行氧化时，所述氧化的操作可包括：对沉淀B水溶液调节pH值为10.5～11.5，加入双氧水，搅拌后过滤，得氧化溶液。其中，所述双氧水的用量较佳地为0.5％～1％，所述百分比为质量体积比，即100mL溶液所用双氧水的质量，例如，所述双氧水的用量为0.5％，是指100mL溶液所用双氧水的质量为0.5g。所述搅拌的温度较佳地为50～60℃，所述搅拌的时间较佳地为3～6小时。所述过滤较佳地采用硅藻土进行。
当采用过氧乙酸进行氧化时，所述氧化的操作可包括：对沉淀B水溶液调节pH值为9～10，加入过氧乙酸，搅拌，得氧化溶液。其中，所述过氧乙酸的用量较佳地为0.8％～1％，所述百分比为质量体积比，即100mL溶液所用过氧乙酸的质量，例如，所述过氧乙酸的用量为0.8％，是指100mL溶液所用过氧乙酸的质量为0.8g。所述搅拌的温度较佳地为20～30℃，所述搅拌的时间较佳地为1～1.5小时。
步骤(3)中，较佳地，对沉淀B水溶液进行2次氧化，并且，先采用双氧水进行氧化氧化，再采用过氧乙酸进行氧化。
步骤(3)中，较佳地，采用双氧水对沉淀B水溶液进行2次氧化。
步骤(3)中，所述还原可采用本领域常规的还原剂，所述还原剂较佳地为亚硫酸盐和/或焦亚硫酸盐。所述亚硫酸盐较佳地为亚硫酸钠。所述焦亚硫酸盐较佳地为焦亚硫酸钠。所述还原剂的用量较佳地为0.15％～0.25％，所述百分比为质量体积比，即100mL氧化溶液所用还原剂的质量；例如，所述还原剂的用量为0.2％，是指100mL氧化溶液所用还原剂的质量为0.2g。
步骤(3)中，在对还原溶液调节pH值之后，较佳地，向还原溶液中加入氯化钠。所述氯化钠的用量较佳地为2％～4％，所述百分比为所述氯化钠占所述还原溶液的质量百分比。
步骤(4)中，按肝素钠粗品的效价计，所述沉淀C水溶液的浓度较佳地为10000～15000IU/mL。
步骤(4)中，所述过滤可采用本领域常规的方法进行，较佳地采用0.2μm的过滤器。
步骤(4)中，所述冻干可采用本领域常规的方法进行，较佳地操作包括：首先在-35～-40℃下冷冻，再在3～5℃升华，最后在60～70℃烘干。
本发明中，所述酒沉的一般操作包括：将待沉液与乙醇混合，静置后得沉淀。所述乙醇的用量较佳地为40％～60％，所述百分比为所述乙醇在所述乙醇和所述待沉液的混合液中的体积百分数。其中，所述待沉液是指进行酒沉的对象，例如在步骤(1)中是指所述洗脱液，在步骤(2)中是指所述碱性滤液，在步骤(3)中是指氧化溶液或还原溶液。
本发明中，所述调节pH值的方法可为本领域常规，较佳地采用氢氧化钠或盐酸进行。当采用氢氧化钠调节pH值时，一般采用氢氧化钠水溶液，所述氢氧化钠水溶液的浓度较佳地为20％～50％，所述百分比为氢氧化钠占氢氧化钠水溶液的质量百分比。当采用盐酸调节pH值时，所述盐酸可为本领域常规定义，即HCl水溶液。所述盐酸的浓度可为本领域常规，较佳地为5％～10％，所述百分比为质量体积比，例如，盐酸的浓度为5％，是指100mL盐酸中含有5g的HCl。
本发明中，所述肝素钠精品提取方法不可连续进行，不可进行母液回收重复利用。不同批次生产之间，必须进行严格清洗，并使用PH>11、温度>90℃氢氧化钠溶液循环清洗反应容器内壁超过4小时，经检测内壁无蛋白残留后，才可以进行下批次生产。
本发明还提供了一种肝素钠精品，其通过所述的肝素钠精品提取方法制得。
本发明还提供了所述肝素钠精品在制备抗凝血制品中的应用。
本发明中，所述抗凝血制品可为具有抗凝血功能的任何制品，例如抗凝血药物、具有抗凝血功能的化妆品、医疗器械的抗凝血涂层、留置针中的抗凝血溶液或血液制品中的抗凝血添加剂。
本发明优选提供了所述肝素钠精品在制备抗凝血药物中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明比传统工艺能够降低总蛋白的含量，从而大大降低朊病毒可能致病的几率，也可以降低肝素内的杂蛋白造成人体不良反应的几率。本发明所述的肝素钠精品提取方法可以通过多步骤氧化灭活，有效防止了可能的朊病毒(朊蛋白)进入肝素钠精品中；所得的牛羊肝素钠精品中不含朊病毒，并且其他类型的蛋白杂质含量也很低，有很大的市场应用价值。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
一种肝素钠精品提取方法，其包括以下步骤：
(1)预处理：取牛肝素钠粗品5000MU(约100kg，效价为50IU/mg)，按10000IU/mL溶解在500L纯水中，加入10kg的氯化钠，用5％盐酸或20％氢氧化钠水溶液调节pH到8；然后加2000kg的FPA98型阴离子交换树脂，在60℃下吸附3小时，过滤，收集吸附树脂；先用自来水冲洗，再用2倍于吸附树脂重量的4％氯化钠水溶液常温冲洗后，用20％氯化钠水溶液洗脱，洗脱两次，合并洗脱液；加入乙醇到50％进行酒沉，得沉淀A；
(2)酸碱处理：沉淀A用500L纯水溶解，用5％盐酸调节pH到1.8并保持0.5小时，用硅藻土过滤，得酸性滤液；用20％氢氧化钠水溶液调节pH到11.5，并在90℃下搅拌3小时，用硅藻土过滤，得碱性滤液；加入乙醇到50％进行酒沉，得沉淀B；
(3)氧化：沉淀B用500L纯水溶解，用20％氢氧化钠水溶液调节pH到11，加双氧水到1％，在55℃下搅拌5小时，用硅藻土过滤，得氧化溶液，加入乙醇到50％进行酒沉，得沉淀B1；
沉淀B1用500L纯水溶解，用20％氢氧化钠水溶液调节pH到8.5，加过氧乙酸到1％，在25℃下搅拌1小时，加入亚硫酸氢钠到0.2％，搅拌1小时，得还原溶液，用20％氢氧化钠水溶液或5％盐酸调节pH到6.5，然后加入2％的氯化钠；加入乙醇到40％进行酒沉，重复酒沉操作3次，得沉淀C；
(4)冻干：沉淀C用100L纯水溶解，用20％氢氧化钠水溶液或5％盐酸调节pH到6，用0.2um过滤器过滤后，滤液首先在-40℃下冷冻，再在5℃升华，最后在70℃烘干，得到肝素钠精品。所得肝素钠精品存放在双层PE袋或铝箔袋中。
效果实施例1
采用赛默飞希尔qPCR设备通过实时荧光定量PCR法测定实施例1中所制得的牛肝素钠精品中核酸含量。实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法，对肝素钠内残存的动物DNA进行倍增后测定，然后得出定量的结果。结果显示，实施例1所得的牛肝素钠精品的核酸残留量无法检出。
效果实施例2
按照《美国药典》测定实施例1中所制得的牛肝素钠粗品中蛋白含量为0.2％以下。而按照传统方法提取的肝素钠精品中蛋白含量约为2％。
效果实施例3
按照《中国药典》(2015年版)记载的肝素钠效价的测定方法测定实施例1所制得的牛肝素钠精品的活性，结果为120IU/mg。
Claims (10)
1.一种肝素钠精品提取方法，其包括以下步骤：
(1)预处理：对肝素钠粗品水溶液的调节pH值为7～9，然后与树脂混合，吸附后过滤，收集吸附树脂；用氯化钠水溶液洗脱所述吸附树脂，合并洗脱液；将所述洗脱液酒沉，得沉淀A；
(2)酸碱处理：对沉淀A水溶液调节pH值为1.5～2.0，过滤，得酸性滤液；对所述酸性滤液的调节pH值为11～12，在90～92℃下搅拌后过滤，得碱性滤液；将所述碱性滤液酒沉，得沉淀B；
(3)氧化：对沉淀B水溶液进行2～4次氧化，在第一次氧化结束后，将氧化溶液酒沉，得沉淀B1，对沉淀B1水溶液进行第二次氧化，依次类推；在最后一次氧化结束后，对氧化溶液中进行还原，得还原溶液，对还原溶液调节pH值为6～7，酒沉，得沉淀C；
(4)冻干：对沉淀C溶水溶液调节pH值为5.5～7，过滤，对所得滤液进行冻干。
2.根据权利要求1所述的肝素钠精品提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述肝素钠粗品的效价为20～60IU/mg；
和/或，按肝素钠粗品的效价计，所述肝素钠粗品水溶液的浓度为10000～15000IU/mL；
和/或，在调节pH值之前，向所述肝素钠粗品水溶液中加入氯化钠；所述氯化钠的用量较佳地为1.5％～4％，百分比为所述氯化钠占所述肝素钠粗品水溶液的质量百分比；
和/或，所述树脂为阴离子交换树脂，较佳地为强阴离子交换树脂，例如FPA98型阴离子交换树脂、WD-1701型阴离子交换树脂或D-254型阴离子交换树脂；所述树脂的用量较佳地为1kg肝素钠粗品用20～50kg树脂；
和/或，所述吸附的温度为55～65℃，例如60℃；所述吸附的时间较佳地为3～6小时；
和/或，所述过滤采用100目尼龙袋过滤。
3.根据权利要求1所述的肝素钠精品提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述氯化钠水溶液的浓度为18～23％，百分比为氯化钠占氯化钠水溶液的质量百分比；所述氯化钠水溶液的用量较佳地为1kg所述吸附树脂用1.2L氯化钠水溶液；
和/或，所述洗脱的温度为55～65℃，例如为60℃；所述洗脱的时间较佳地为3～6小时；所述洗脱较佳地重复至少两次；
和/或，在洗脱前对所述吸附树脂进行冲洗；所述冲洗的较佳的操作为：先用自来水冲洗，再用2倍于吸附树脂重量的氯化钠水溶液常温冲洗，其中，所述氯化钠水溶液的浓度较佳地为3％～5％，百分比为氯化钠占氯化钠水溶液的质量百分比。
4.根据权利要求1所述的肝素钠精品提取方法，其特征在于，步骤(2)中，按肝素钠粗品的效价计，所述沉淀A水溶液的浓度为10000～15000IU/mL；
和/或，所述过滤采用硅藻土过滤；
和/或，所述搅拌的时间为2～4小时。
5.根据权利要求1所述的肝素钠精品提取方法，其特征在于，步骤(3)中，按肝素钠粗品的效价计，所述沉淀B水溶液和所述沉淀B1水溶液的浓度为10000～15000IU/mL；
和/或，所述氧化采用双氧水和/或过氧乙酸进行；
当采用双氧水进行氧化时，所述氧化的操作包括：对沉淀B水溶液调节pH值为10.5～11.5，加入双氧水，搅拌后过滤，得氧化溶液；其中，所述双氧水的用量较佳地为0.5％～1％，百分比为质量体积比，即100mL溶液所用双氧水的质量；所述搅拌的温度较佳地为50～60℃；所述搅拌的时间较佳地为3～6小时；所述过滤较佳地采用硅藻土进行；
当采用过氧乙酸进行氧化时，所述氧化的操作包括：对沉淀B水溶液调节pH值为9～10，加入过氧乙酸，搅拌，得氧化溶液；其中，所述过氧乙酸的用量较佳地为0.8％～1％，百分比为质量体积比，即100mL溶液所用过氧乙酸的质量；所述搅拌的温度较佳地为20～30℃；所述搅拌的时间较佳地为1～1.5小时；
较佳地，对沉淀B水溶液进行2次氧化，并且，先采用双氧水进行氧化氧化，再采用过氧乙酸进行氧化；
较佳地，采用双氧水对沉淀B水溶液进行2次氧化。
6.根据权利要求1所述的肝素钠精品提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述还原的还原剂为亚硫酸盐和/或焦亚硫酸盐；所述亚硫酸盐较佳地为亚硫酸钠；所述焦亚硫酸盐较佳地为焦亚硫酸钠；所述还原剂的用量较佳地为0.15％～0.25％，百分比为质量体积比，即100mL氧化溶液所用还原剂的质量；
和/或，在对还原溶液调节pH值之后，向还原溶液中加入氯化钠；所述氯化钠的用量较佳地为2％～4％，百分比为所述氯化钠占所述还原溶液的质量百分比。
7.根据权利要求1所述的肝素钠精品提取方法，其特征在于，步骤(4)中，按肝素钠粗品的效价计，所述沉淀C水溶液的浓度为10000～15000IU/mL；
和/或，所述过滤采用0.2μm的过滤器；
和/或，所述冻干包括：首先在-35～-40℃下冷冻，再在3～5℃升华，最后在60～70℃烘干。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的肝素钠精品提取方法，其特征在于，所述酒沉的操作包括：将待沉液与乙醇混合，静置后得沉淀；其中，所述乙醇的用量较佳地为40％～60％，百分比为所述乙醇在所述乙醇和所述待沉液的混合液中的体积百分数；
和/或，所述调节pH值采用氢氧化钠或盐酸进行；当采用氢氧化钠调节pH值时，较佳地采用氢氧化钠水溶液，所述氢氧化钠水溶液的浓度较佳地为20％～50％，百分比为氢氧化钠占氢氧化钠水溶液的质量百分比；当采用盐酸调节pH值时，所述盐酸的浓度较佳地为5％～10％，百分比为质量体积比。
9.一种肝素钠精品，其根据权利要求1～8中任一项所述的肝素钠精品提取方法制得。
10.根据权利要求9所述的肝素钠精品在制备抗凝血制品中的应用；
其中，所述抗凝血制品较佳地抗凝血药物、具有抗凝血功能的化妆品、医疗器械的抗凝血涂层、留置针中的抗凝血溶液或血液制品中的抗凝血添加剂。
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