CN115109817B - 一种具有抗氧化及免疫活性的苦杏仁肽及其制备方法和用途 - Google Patents

一种具有抗氧化及免疫活性的苦杏仁肽及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种具有抗氧化及免疫活性的苦杏仁肽及其制备方法和用途，苦杏仁肽是苦杏仁蛋白酶解后采用凝胶过滤层析法分离，收集到的92‑100mi n洗脱组分Mx‑1、104‑132mi n洗脱组分Mx‑2、133‑144mi n洗脱组分Mx‑3、146‑172mi n洗脱组分Mx‑4、173‑192mi n洗脱组分Mx‑5或196‑264mi n洗脱组分Mx‑6即为具有抗氧化活性的苦杏仁肽；其制备方法包括：苦杏仁蛋白的提取；苦杏仁蛋白的酶解；将苦杏仁蛋白酶解液超滤分离并冷冻干燥，得到苦杏仁蛋白酶解物；苦杏仁蛋白酶解物采用凝胶过滤层析法分离。本发明提供的一种具有高抗氧化活性的苦杏仁肽，是一种天然抗氧化剂，不仅具有较强的ABTS自由基清除效果，而且具有安全、绿色等优点，可满足食品、药品和保健品等多种行业对抗氧化剂的高标准需求。

Description

一种具有抗氧化及免疫活性的苦杏仁肽及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及活性苦杏仁肽制备技术领域。具体地说是一种具有抗氧化及免疫活性的苦杏仁肽及其制备方法和用途。
背景技术
多肽是一类由2-16个通过肽键连接的氨基酸序列组成，也可以将由2-5个氨基酸组成的肽链称为短肽，6-16个氨基酸组成的肽链称为多肽。已有大量研究表明，各种生物体的各种细胞中许多重要的生物活性功能都与多肽有关，比如细胞分化、免疫调节以及激素调节等。另外，多肽还具有抗氧化、抗衰老、抗炎抗癌以及抑菌等多种生理功效，在食品、药品、保健品以及化妆品等多种领域都有广阔的应用前景。正是由于多肽这种既具有调节生理功能的作用又能为机体提供营养的特殊优点，目前国内外对多肽的开发和研究越来越广泛。
苦杏仁作为一种中药材，具有很高的药用价值。苦杏仁多肽是苦杏仁经干燥、粉碎、脱脂后，经蛋白酶水解得到的多肽试剂，由于杏仁多肽具有提高免疫功能、抗氧化、抗衰老、预防心脑血管疾病、抗炎抗癌以及有助于减轻体重和控制血糖等多种作用，在保健品开发和食品领域中具有广泛的应用。但目前，已有的苦杏仁多肽产品多为经蛋白酶水解后制备而成的成分较复杂的混合多肽，因而导致苦杏仁多肽的生物活性并不具有针对性，比如，目前并没有专门用于抗氧化功能的苦杏仁肽，且现有的苦杏仁肽的抗氧化活性并不高，从而限制了苦杏仁多肽的应用。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种具有抗氧化及免疫活性的苦杏仁肽及其制备方法和用途，以将苦杏仁中具有高抗氧化活性的多肽纯化、富集起来，弥补现有苦杏仁混合肽抗氧化活性不高的缺陷，扩大苦杏仁肽的应用范围。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种具有抗氧化及免疫活性的苦杏仁肽，苦杏仁蛋白酶解后采用凝胶过滤层析法分离，收集到的92-100min洗脱组分Mx-1、104-132min洗脱组分Mx-2、133-144min洗脱组分Mx-3、146-172min洗脱组分Mx-4、173-192 min洗脱组分Mx-5或196-264 min洗脱组分Mx-6即为具有抗氧化活性的苦杏仁肽。
上述一种具有抗氧化及免疫活性的苦杏仁肽，凝胶过滤层析法为：以GE AKTApure作为纯化系统，采用Sephadex G-15凝胶过滤层析柱进行分离，以超纯水为洗脱液，洗脱液的流速为0.5mL/min。
上述一种具有抗氧化及免疫活性的苦杏仁肽，采用FPLC法对146-172min洗脱组分Mx-4进一步分离，收集到的21-32min洗脱组分FPLC-2、33-46min洗脱组分FPLC-3或47-70min FPLC-4即为具有抗氧化活性的苦杏仁肽。
上述一种具有抗氧化及免疫活性的苦杏仁肽，采用FPLC法进一步分离苦杏仁肽，其检测方法和洗脱梯度如下；
检测方法：色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18；流动相A为含0.02vt%TFA的水溶液，流动相B为含0.02vt%TFA的乙腈溶液；流速为1.0 mL/min；进样量为5μL；柱温为40℃；
洗脱梯度为：0-5 min，5% B；5-25 min，5-30% B；25-35 min，30% B；35-55 min，30-95%B；55-65 min，95%B；65-66 min，95-5%B；66-72 min，5% B。
上述一种具有抗氧化及免疫活性的苦杏仁肽，苦杏仁蛋白的提取包括如下步骤：
步骤A-1：取脱脂苦杏仁粉于碱溶液中，经超声提取得到苦杏仁提取液；所述碱溶液为氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液pH为9.0；
步骤A-2：将所述苦杏仁提取液离心后取上清液，将所述上清液注入酸溶液中进行酸沉，静置后离心，得到沉淀物；所述酸溶液为盐酸溶液，所述盐酸溶液的pH为5.0；
步骤A-3：用超纯水洗涤所述沉淀物，并调节所述沉淀物洗涤液的pH至7.0，将洗涤后的所述沉淀物冷冻干燥，得到苦杏仁蛋白冻干粉。
上述一种具有抗氧化及免疫活性的苦杏仁肽，苦杏仁蛋白的酶解包括如下步骤：
步骤B-1：向苦杏仁蛋白冻干粉中加入磷酸盐缓冲液，震荡溶解，得到苦杏仁蛋白溶液；
步骤B-2：先将所述苦杏仁蛋白溶液置于恒温震荡水浴锅中水浴，然后加入木瓜蛋白酶进行酶解；
步骤B-3：将酶解后的混合溶液进行水浴，使木瓜蛋白酶钝化；用NaOH溶液或HCl溶液调节水浴后的混合溶液的pH至7.0；
步骤B-4：将步骤B-3中pH为7.0的混合溶液进行低温离心；离心结束后取上清液，即得到苦杏仁蛋白酶解液；采用分子量截留范围为3kDa超滤管对苦杏仁蛋白酶解液进行超滤分离；超滤后得到的所述苦杏仁蛋白酶解物分为分子量小于或等于3kDa的苦杏仁蛋白酶解物和分子量大于3kDa的苦杏仁蛋白酶解物；
凝胶过滤层析法分离的所述苦杏仁蛋白酶解物是所述分子量小于或等于3kDa的苦杏仁蛋白酶解物。
一种具有抗氧化及免疫活性的苦杏仁肽的制备方法，包括如下步骤：
步骤A：苦杏仁蛋白的提取；
步骤B：苦杏仁蛋白的酶解；
步骤C：将苦杏仁蛋白酶解液超滤分离并冷冻干燥，得到苦杏仁蛋白酶解物；
步骤D：苦杏仁蛋白酶解物采用凝胶过滤层析法分离，收集到的92-100min洗脱组分Mx-1、104-132min洗脱组分Mx-2、133-144min洗脱组分Mx-3、146-172min洗脱组分Mx-4、173-192 min洗脱组分Mx-5或196-264 min洗脱组分Mx-6即为具有抗氧化活性的苦杏仁肽。
上述一种具有抗氧化及免疫活性的苦杏仁肽的制备方法，在步骤A中，苦杏仁蛋白的提取包括如下步骤：
步骤A-1：取脱脂苦杏仁粉于碱溶液中，在超声功率250W、超声温度50℃的条件下超声提取75min，得到苦杏仁提取液；所述脱脂苦杏仁粉与所述碱溶液的W/V固液比为1:10；所述碱溶液为氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液pH为9.0；
步骤A-2：将所述苦杏仁提取液离心后取上清液，将所述上清液注入酸溶液中进行酸沉，静置后离心，得到沉淀物；所述酸溶液为盐酸溶液，所述盐酸溶液的pH为5.0；
步骤A-3：用超纯水洗涤所述沉淀物，并调节所述沉淀物洗涤液的pH至7.0，将洗涤后的所述沉淀物冷冻干燥，得到苦杏仁蛋白。
上述一种具有抗氧化及免疫活性的苦杏仁肽的制备方法，在步骤B中，苦杏仁蛋白的酶解包括如下步骤：
步骤B-1：称取10g苦杏仁蛋白冻干粉至500mL锥形瓶中，按照W/V固液比为30g/L的比例，加入pH为7.0、浓度为10mmol/L的磷酸盐缓冲液333mL，震荡溶解得到苦杏仁蛋白溶液；
步骤B-2：先将所述苦杏仁蛋白溶液置于50℃的恒温震荡水浴锅中水浴10min，然后按照每克蛋白质添加10000U木瓜蛋白酶的比例加入木瓜蛋白酶进行酶解，酶解时间为5h；
步骤B-3：将酶解后的混合溶液置于95-100℃的水中水浴10min，使木瓜蛋白酶钝化；用1mol/L的NaOH溶液调节水浴后混合溶液的pH至7.0；
步骤B-4：将步骤B-3中pH为7.0的混合溶液进行低温离心，离心温度为4℃、离心速率为13800rpm、离心时间为15min；离心结束后取上清液，即得到苦杏仁蛋白酶解液。
上述一种具有抗氧化及免疫活性的苦杏仁肽的制备方法，还包括步骤E：采用FPLC法对146-172min洗脱组分Mx-4进一步分离，收集到的21-32min洗脱组分FPLC-2、33-46min洗脱组分FPLC-3或47-70min FPLC-4即为具有抗氧化活性的苦杏仁肽；采用FPLC法进一步分离苦杏仁肽的检测方法和洗脱梯度如下：检测方法：色谱柱为Agilent Poroshell 120EC-C18；流动相A为含0.02vt%TFA的水溶液，流动相B为含0.02vt%TFA的乙腈溶液；流速为1.0 mL/min；进样量为5μL；柱温为40℃；洗脱梯度为：0-5 min，5% B；5-25 min，5-30% B；25-35 min，30% B；35-55 min，30-95%B；55-65 min，95%B；65-66 min，95-5%B；66-72 min，5% B；
在步骤C中，采用分子量截留范围为3kDa超滤管对苦杏仁蛋白酶解液进行超滤分离；超滤后得到的所述苦杏仁蛋白酶解物分为分子量小于或等于3kDa的苦杏仁蛋白酶解物和分子量大于3kDa的苦杏仁蛋白酶解物；
在步骤D中，凝胶过滤层析法分离的所述苦杏仁蛋白酶解物是所述分子量小于或等于3kDa的苦杏仁蛋白酶解物；
所述凝胶过滤层析法：以GE AKTA pure作为纯化系统，采用Sephadex G-15凝胶过滤层析柱进行分离，以超纯水为洗脱液，洗脱液的流速为0.5mL/min；在280nm下测量，测定各吸收峰对应的洗脱液组分的抗氧化活性。
苦杏仁肽的用途，苦杏仁蛋白酶解后采用凝胶过滤层析法分离，收集到的92-100min洗脱组分Mx-1、104-132min洗脱组分Mx-2、133-144min洗脱组分Mx-3、146-172min洗脱组分Mx-4、173-192 min洗脱组分Mx-5或196-264 min洗脱组分Mx-6用于抗氧化。
苦杏仁肽的用途，苦杏仁蛋白酶解后采用凝胶过滤层析法分离，收集到的146-172min洗脱组分Mx-4用于刺激免疫细胞增殖。
苦杏仁肽的用途，苦杏仁蛋白酶解后采用凝胶过滤层析法分离，收集到的146-172min洗脱组分Mx-4用于制备治疗免疫疾病的药物或用于制备提高免疫力或刺激免疫细胞增殖的药物。
本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：
（1）本发明提供了一种具有高抗氧化活性的苦杏仁肽，是一种天然抗氧化剂，不仅具有较强的ABTS自由基清除效果，而且具有安全、绿色等优点，可满足食品、药品和化妆品等多种行业对抗氧化剂的高标准需求。
（2）本发明提供了一种具有抗氧化活性的苦杏仁肽的制备方法，通过多次试验，筛选出木瓜蛋白酶作为苦杏仁蛋白的水解蛋白酶，并以ABTS自由基清除率作为衡量苦杏仁肽的抗氧化活性的指标，通过调控苦杏仁蛋白的酶解条件，以及苦杏仁肽的分离纯化方法，制备出了具有高抗氧化活性的苦杏仁肽。
附图说明
图1 本发明实施例中蛋白质标准曲线；
图2 本发明实施例中苦杏仁蛋白的SDS-PAGE图；
图3 本发明实施例中各蛋白酶水解物的DPPH抗氧化活性测定结果图；
图4 本发明实施例中各蛋白酶水解物的ABTS自由基清除率测定结果图；
图5 本发明实施例中各蛋白酶水解物的铁离子还原能力测定结果图；
图6 本发明实施例中各蛋白酶水解物ABTS自由基清除率检测IC50测定结果图；
图7 本发明木瓜蛋白酶酶解物3kDa以上和3kDa以下组分的ABTS自由基清除率测定结果图；
图8 本发明苦杏仁肽3kDa以下组分过G-15层析柱图谱；
图9 本发明苦杏仁肽3kDa以下组分过G-15层析柱各洗脱组分ABTS检测结果图；
图10 本发明苦杏仁肽Mx-4的总离子流色谱图；
图11 本发明Q SepharoseTMFast Flow阴离子交换柱上样、流穿图谱；
图12 本发明Q SepharoseTMFast Flow阴离子交换柱洗脱图谱；
图13 本发明Mx-4过Q SepharoseTMFast Flow阴离子交换柱ABTS抗氧化检测结果图；
图14 本发明Mx-4过C18柱各组分ABTS检测结果图；
图15 本发明苦杏仁肽FPLC-2的总离子流色谱图；
图16 本发明苦杏仁肽FPLC-3的总离子流色谱图；
图17a本发明苦杏仁肽分离物Mx浓度为2.5 mmol/L时，Raw264.7细胞增殖情况SEM图；
图17b本发明苦杏仁肽分离物Mx浓度为5 mmol/L时，Raw264.7细胞增殖情况SEM图；
图17c本发明苦杏仁肽分离物Mx浓度为10 mmol/L时，Raw264.7细胞增殖情况SEM图；
图18a本发明苦杏仁肽分离物Mx-4浓度为0 mmol/L时，Raw264.7细胞增殖情况SEM图；
图18b本发明苦杏仁肽分离物Mx-4浓度为1.25 mmol/L时，Raw264.7细胞增殖情况SEM图；
图18c本发明苦杏仁肽分离物Mx-4浓度为2.5 mmol/L时，Raw264.7细胞增殖情况SEM图；
图18d本发明苦杏仁肽分离物Mx-4浓度为5 mmol/L时，Raw264.7细胞增殖情况SEM图；
图18e本发明苦杏仁肽分离物Mx-4浓度为10 mmol/L时，Raw264.7细胞增殖情况SEM图；
图19苦杏仁蛋白木瓜蛋白酶酶解物3kDa以下过SuperdexTM30 prep grade（XK1.6cm×70cm）凝胶过滤层析柱A220nm图谱；
图20苦杏仁蛋白木瓜蛋白酶酶解物3kDa以下过SuperdexTM30 prep grade（XK1.6cm×70cm）凝胶过滤层析柱A280nm图谱；
图21苦杏仁蛋白木瓜蛋白酶酶解物3#峰过Sephadex G-15（TRICORN 1cm×30cm）凝胶过滤层析柱A220nm图谱；
图22苦杏仁蛋白木瓜蛋白酶酶解物3#峰过Sephadex G-15（TRICORN 1cm×30cm）凝胶过滤层析柱A280nm图谱。
具体实施方式
1.材料、试剂与仪器
1.1材料、试剂
脱脂苦杏仁粉，市场购买；HCl、过硫酸钾、乙酸钠、乙酸等其它试剂均为国产分析纯；NaOH，生工生物工程（上海）股份有限公司；PBS，生工生物工程（上海）股份有限公司，B548117-0500；CCK-8试剂盒，DMEM All培养液（90%DMEM，10%胎牛血清，100×Anti-anti，100×谷氨酰胺）；另外一些主要试剂如表1所示；
Sephadex G-15（sigma，11081-40-6）；ColumnXK 16/70（GE，28988946）；C18 柱；3kDa超滤管（millipore，Amicon ultra-15，ultracel-3K）；8%-16%梯度胶（Genscript，M00659）。
表1
1.2仪器与设备
电子天平（OHAUS,CP114）；磁力搅拌器（IKA，RH basic）；超声波清洗机（新芝，SB25-12 DTD）；低温冷冻离心机（Eppendorf，Centrifuge 5810 R）；水浴恒温振荡器（上海博讯，SHZ-A）；酶标仪（PerkinElmer，Ewvision HTS）；低温冷冻离心机（SORVALL，RC5CPLUS）；紫外可见分光光度计（Thermo，GENESYS 10uv）；垂直电泳仪（BIO-RAD，Mini-PROTEANTetra System）；GE AKTA pure； FPLC；细胞培养箱（Thermo，HERAcell Vios160i）；AIrstream 1级A2型生物安全柜（ESCO，AC2-6S1）；微型移液枪（Eppendorf Researchplus，P18818D：0.5-10微升）；电动移液枪 （Eppendorf Easypet 3，N37147B）；细胞计数仪（Invitrogen，REF:AMQAX1000，Singapore）；多道移液枪（RAININ，(20-200)A0403411A）。
2. 苦杏仁蛋白的提取
2.1 苦杏仁蛋白的提取方法
提取流程为：脱脂苦杏仁粉→碱溶（PH9.0，1:10（W/V料液比），50℃、250W、75min超声→离心，取上清→酸沉（PH5.0）→静置沉淀→离心，取沉淀→超纯水洗沉淀→调PH至7.0→冷冻干燥→Bradford蛋白定量蛋白→SDS-PAGE；具体操作步骤如下：
步骤A-1：按照脱脂苦杏仁粉与NaOH溶液的固液比为1:10的比例（即NaOH溶液的体积与脱脂苦杏仁粉的质量之比为10mL/g），取脱脂苦杏仁粉置于pH为9.0的NaOH溶液中，在超声功率250W、超声温度50℃的条件下超声提取75min，得到苦杏仁提取液；
步骤A-2：将苦杏仁提取液离心后取上清液，将上清液注入pH为5.0的盐酸溶液中进行酸沉，静置后离心，得到沉淀物；
步骤A-3：用超纯水洗涤上述沉淀物，并调节沉淀物洗涤液的pH至7.0，将洗涤后的沉淀物冷冻干燥，得到苦杏仁蛋白。
2.2 苦杏仁蛋白的提取结果
将2.1提取得到的苦杏仁蛋白冻干粉采用Bradford蛋白定量法测定其蛋白含量，并对提取的苦杏仁蛋白进行SDS-PAGE。经检测和计算，本实施例中，苦杏仁蛋白提取率为24%，Bradford蛋白定量测得提取的苦杏仁蛋白中可溶性蛋白纯度为95.04%，具体参见表2和表3；图1为蛋白标准品的标准曲线，图2为SDS-PAGE的电泳结果。
表2
表3
3. 苦杏仁蛋白的酶解
3.1 水解苦杏仁蛋白最佳用酶的筛选
3.1.1 水解苦杏仁蛋白
称取0.5g上述苦杏仁蛋白冻干粉，按照底物质量浓度30g/L加入适宜pH的磷酸盐缓冲液，震荡溶解。将蛋白溶液置于适当温度的恒温震荡水浴锅中平衡10min，每克蛋白质加入10000U蛋白酶，酶解时间为5小时。设置空白酶对照，空白酶对照不加杏仁蛋白，其它条件同试验组；各酶解参数具体参见表4。水解结束后酶解液经95-100℃水浴加热10min以钝化蛋白酶。用1mol/L的NaOH溶液或HCl溶液调节酶解液的pH至7.0。将pH为7的酶解液于4℃、10000rpm的离心条件下离心15min，取上清液冷冻干燥得到酶解液冻干品。
表4
3.1.2 酶解液冻干品的抗氧化活性检测
将步骤3.1.1各种酶水解得到的酶解液冻干品配制成不同浓度的水解肽；分别以DPPH抗氧化检测、ABTS自由基清除率以及铁离子还原能力（FRAP）作为衡量苦杏仁肽的抗氧化活性参考依据，具体测定方法如下：
（1）DPPH抗氧化检测（DPPH法）
参考brand-williams（1995）的方法，文献“Brandwilliams W, Cuvelier ME,&Berset C. Use of a Free-Radical Method to Evaluate Antioxidant Activity [J].Food Science and Technology-Lebensmittel-Wissenschaft and Technologie, 1995,28(1): 25-30.”，用0.14mmol/L的DPPH溶液和不同浓度的水解肽/同等稀释倍数的空白酶对照/空白（ddH2O）1:1等体积混合，混匀后避光室温孵育30min，用无水乙醇和超纯水（体积比为1:1）进行调零，在517 nm处测吸光值。
DPPH自由基清除率（%）=（A空白酶对照-A水解肽）/ A空白酶对照*100%；
其中，A空白酶对照：与水解肽稀释相同倍数的空白酶对照与DPPH反应后在517nm吸光值。
A水解肽：水解肽与DPPH反应后在517nm吸光值。
（2）ABTS自由基清除率（ABTS法）
参考re.1999的方法，文献“Re R, Pellegrini N, Proteggente A, et al.Antioxidant activity applying animproved ABTS radical cation decolorizationassay [J]. Free Radical Biology andMedicine, 1999, 26(9-10):1231-1237.”，向500μL稀释后的ABTS.+溶液中加入5μL不同浓度的水解肽/同等稀释倍数的空白酶对照/空白（PBS缓冲液），混合均匀，30℃避光孵育10min，用PBS缓冲液调零，在734 nm处测吸光值。
ABTS自由基清除率（%）=（A空白酶对照-A水解肽）/ A空白酶对照*100%；
其中，A空白酶对照：与水解肽稀释相同倍数的空白酶对照与ABTS反应后在734nm吸光值。
A水解肽：水解肽与ABTS反应后在734nm吸光值。
（3）铁离子还原能力（FRAP法）
根据benzie的方法，文献“Benzie IFF,&Strain JJ. The Ferric reducingability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: The FRAP assay[J]. Analytical Biochemistry, 1996, 239(1): 70-76. ”，配置FRAP工作液： 0.3mol/L醋酸缓冲液（pH为3.6）：10mmol/L TPTZ：20mmol/L FeCl3溶液=10:1:1（体积比），现配现用。标准品FeSO4稀释浓度范围为100～1600μmol/L，向10μL水解肽样品/标准品/空白液内依次加入30μL超纯水和300μL FRAP工作液，混匀后至37℃恒温箱内反应10min，593nm处测定吸光值。
3.1.3 酶解液冻干品的抗氧化活性检测结果
（1）DPPH抗氧化（DPPH法）检测结果
苦杏仁蛋白各个酶水解物的DPPH抗氧化活性见图3。从图3可以看出，由α-糜蛋白酶和木瓜蛋白酶水解得到的酶解液冻干品的抗氧化活性较高；风味蛋白酶水解物的抗氧化活性较差。
（2）ABTS自由基清除率（ABTS法）检测结果
苦杏仁蛋白各个酶水解物的ABTS自由基清除率检测结果如图4所示。从图4中可以看出，α-糜蛋白酶水解物的ABTS自由基清除率效果较差，而风味蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解物的ABTS自由基清除率较高。
（3）铁离子还原能力（FRAP法）的检测结果
苦杏仁蛋白各个酶水解物的铁离子还原能力检测结果如图5所示。从图5中可以看出，不同酶酶解得到的水解物的铁离子还原能力差别不显著，无法区分优劣，因此，不以铁离子还原能力作为衡量苦杏仁蛋白肽的抗氧化活性指标。
从图3至图5的结果可以看出，不同的酶解物采用不同的是测试方法表现出了不同的抗氧化活性，这主要是因为：DPPH•是一种稳定的以氮为中心的自由基，其醇溶液呈深紫色,在517nm 处有一吸收峰。当反应系统中存在自由基清除剂时，它可以和DPPH• 的单电子配对而使517nm 处的吸收峰渐渐消退。而且，这种颜色变浅的程度与配对电子数成化学计量关系。因此，根据吸光度的变化可测得抗氧化剂的活性。通过计算DPPH自由基剩余一半时所需抗氧化剂的浓度(EC50)以及时间(TEC50)反应抗氧化物的活性。DPPH 法快速、简单，仅需要一台紫外分光光度计就可以测定，但DPPH 方法存在的不足是：当被测物与DPPH 紫外吸收有重叠时，将会影响测定结果，比如类胡萝卜素；此外，由于空间位阻决定反应的倾向，小分子化合物由于更易接近自由基而拥有相对较高的抗氧化能力。此外该方法线性范围也相对较窄，而且所有还原剂都能够对DPPH 起作用，因此该结果并不能完全代表抗氧化能力。而且苦杏仁蛋白酶解物属于水溶性物质，与醇溶的DPPH反应时有沉淀析出。FRAP 法在低pH 的溶液中，Fe3+-TPTz(Fe3+-三吡啶三嗪)被抗氧化剂还原成有色的Fe2+-TPTZ。反应的结果常以Fe2+当量或标准物质的抗氧化能力表示。该法快速简便、易于操作、重复性好，但FRAP 反应属于电子转移(SET)反应，因此FRAP 方法不能够测定氢转移反应(HAT) 起作用的物质，而且该法实际测定的是待测生物活性物质将Fe3+还原为Fe2+的能力，因此没有抗氧化能力的生物学相关性。ABTS与过氧化物酶和氢过氧化物在一起形成ABTS+阳离子自由基。在抗氧化剂存在时，这种自由基混合物的光吸收值下降，下降程度取决于抗氧化剂的抗氧化能力。ABTS法十分简单，适用于大量样品的分析检测。
考虑到DPPH的检测是在在乙醇溶液的环境进行，而高浓度的乙醇容易使蛋白或肽类物质变性沉淀，而ABTS是水溶液环境，所以选择ABTS自由清除率作为后续衡量苦杏仁肽抗氧化活性的参考依据。
3.1.4 水解苦杏仁蛋白最佳用酶的确定
按照3.1.1 水解苦杏仁蛋白的方法，用表4所示的蛋白酶水解苦杏仁蛋白，将得到的不同酶的酶解液使用装有3kDa超滤膜的超滤管AmiconUltra-15分离上述酶解液，离心温度4℃，离心力5000G。冷冻干燥各滤出组分和截留组分，每种酶的酶解液经超滤后均得到分子量小于或等于3kDa的酶解物和分子量大于3kDa的酶解物；将不同酶水解得到的分子量小于或等于3kDa的酶解物记为“X酶水解物3K以下”，将分子量大于3kDa的酶解物记为“X酶水解物3K以上”。例如，木瓜蛋白酶水解得到的酶解物，分子量小于或等于3kDa的酶解物记为“木瓜蛋白酶水解物3K以下”，分子量大于3kDa的酶解物记为“木瓜蛋白酶水解物3K以上”。
对不同酶的酶解物进行ABTS抗氧化检测，具体方法同3.1.2。各酶解物的检测结果见图6。从图6中可以看出，不同酶的酶水解物分子量在3kDa以下组分的IC50均小于分子量在3kDa以上组分，说明分子量在3kDa以下组分酶解物的自由基清除率更高，其中IC50最低的是木瓜蛋白酶3kDa以下组分的水解物，因此，确定以木瓜蛋白酶作为苦杏仁蛋白水解的蛋白酶。
3.2 用木瓜蛋白酶水解苦杏仁蛋白
3.2.1 苦杏仁蛋白的水解
步骤B-1：称取10g苦杏仁蛋白冻干粉至500mL锥形瓶中，按照W/V固液比为30g/L的比例（即苦杏仁蛋白冻干粉的质量与磷酸盐缓冲液的体积之比为30g/L），加入pH为7.0、浓度为10mmol/L的磷酸盐缓冲液333mL，震荡溶解得到苦杏仁蛋白溶液；
步骤B-2：先将上述苦杏仁蛋白溶液置于50℃的恒温震荡水浴锅中水浴10min，然后按照每克蛋白质添加10000U木瓜蛋白酶的比例加入木瓜蛋白酶进行酶解，酶解时间为5h；
步骤B-3：将酶解后的混合溶液置于沸水中水浴10min，使木瓜蛋白酶钝化；用1mol/L的NaOH溶液调节水浴后的混合溶液的pH至7.0；
步骤B-4：将步骤B-3中pH为7.0的混合溶液进行低温离心，离心温度为4℃、离心速率为13800 rpm、离心时间为15min；离心结束后取上清液，即得到苦杏仁蛋白酶解液。
3.2.2 苦杏仁蛋白酶解产物的抗氧化活力测定
（1）测定方法
首先，采用分子量截留范围为3kDa超滤管进行超滤分离；超滤后得到的分子量小于或等于3kDa的苦杏仁蛋白酶解物和分子量大于3kDa的苦杏仁蛋白酶解物；
其次，将上述两部分苦杏仁蛋白酶解物采用3.1.2的方法进行ABTS自由基清除率的检测：向320μL ABTS.+工作液中加入3.2μL不同浓度的待测样品，混合均匀；30℃ 避光孵育10min，用PBS缓冲液调零，在734nm处测吸光值。
ABTS自由基清除率（%）=（A空白-A样品）/A空白*100%。
A空白：样品稀释液与ABTS反应后734nm吸光值。
A样品：样品与ABTS反应后734nm吸光值。
（2）测定结果
木瓜蛋白酶酶解苦杏仁蛋白后得到木瓜蛋白酶水解物 3K以下组分和木瓜蛋白酶水解物 3K以上组分，其ABTS自由基清除检测结果见图7，具体检测数据见表5和表6。
表5
表6
由表5-6的数据并结合图7可以看出，经木瓜蛋白酶酶解后得到的分子量小于或等于3kDa的苦杏仁蛋白酶解物的ABTS自由基清除能力要明显高于分子量大于3kDa的苦杏仁蛋白酶解物，由此也说明，分子量小于或等于3kDa的苦杏仁蛋白酶解物的抗氧化活性更好。
4. 凝胶过滤层析法分离苦杏仁蛋白酶解物
在对3.2.1制备的分子量小于或等于3kDa的苦杏仁蛋白酶解物进行分离时，本发明技术人员试验采用SuperdexTM30 prep grade（XK 1.6cm×70cm）凝胶过滤层析柱进行分离，但分离效果并不理想：采用GE AKTA pure纯化系统，设定流速1 mL/min，检测波长280nm和220nm，洗脱液PBS，收集得到5个组分（分别参见图19和图20），然后将3#组分用SephadexG-15（TRICORN10/300）进一步分离，分离结果见图21和图22。由于Sephadex G-15（TRICORN10/300）柱子小，分离效率低，又因洗脱液中含大量缓冲液盐，不能正确的定量多肽的含量；且在对分离样品280nm下的ABTS自由基清除率检测时，由于蛋白、多肽在280nm的紫外吸收与其含芳香族氨基酸酪氨酸和色氨酸的量有关，如果多肽序列中没有或仅有少数几个这样的氨基酸，这种方法就容易给出错误的结果。所以更换凝胶过滤层析柱为SephadexG-15（Column XK 16/70），并用超纯水作为洗脱液分离，发现分离效果较好，且分离量大、没有盐的干扰。具体方法和结果如下：
4.1 凝胶过滤层析法分离方法
采用GE AKTA pure纯化系统，凝胶过滤层析柱Sephadex G-15（Column XK 16/70），采用5mL上样环上样，对3.2.1制备的分子量小于或等于3kDa的苦杏仁蛋白酶解物进行分离。分离条件：上样量为1mL；洗脱液为超纯水；洗脱液流速为0.5 mL/min；检测波长为280nm。收集洗脱液，并对各组分进行冷冻干燥；将冷冻干燥后的各洗脱组分采用3.1.2的方法进行ABTS自由基清除率检测。
4.2 凝胶过滤层析法分离结果
经4.1的凝胶过滤层析法分离的检测图谱见图8。从图8中可以看出，对分子量小于或等于3kDa的苦杏仁蛋白酶解物分离后收集得到了6种组分，分别为92-100min洗脱组分Mx-1、104-132min洗脱组分Mx-2、133-144min洗脱组分Mx-3、146-172min洗脱组分Mx-4、173-192 min洗脱组分Mx-5或196-264 min洗脱组分Mx-6；将这6种组分分别编号为1#、2#、3#、4#、5#、6#；6种组分的出峰时间见下表（上样时洗脱液体积为142mL）：
6种组分进行ABTS自由基清除率的检测结果见图9，检测具体数据参见表7、表8和表9。表中Mx指代分子量小于或等于3kDa的苦杏仁蛋白酶解物。
表7
表8
表9
从图9和表7-9中可以看出，经凝胶过滤层析法分离得到的6种组分中，4#和6#峰肽的ABTS自由基清除能力最好，且均明显比未经分离的分子量小于或等于3kDa的苦杏仁蛋白酶解物Mx的自由基清除能力强。
从图8中可知，4#峰肽在分子量小于或等于3kDa的苦杏仁蛋白酶的含量较高，且其抗氧化活性较好，因此，采用液质联用（LC-MS/MS）肽段序列分析技术对4#峰肽（即Mx-4）进行分析，Mx-4的总离子流色谱图如图10所示，选取得分较高的前5条肽段的信息如表10所示。
表10
5. FPLC法进一步分离苦杏仁蛋白酶解物
5.1 采用阴离子交换层析柱分离Mx-4
5.1.1 分离方法和分离条件
Q SepharoseTMFast Flow 阴离子交换填料填装5mL层析柱，连接阴离子交换柱至GEAKTA pure纯化系统，用大量超纯水冲洗阴离子交换柱。
A液：20 mM PB；B液：20 mM PB+1M NaCl；
先用A液充分平衡柱子，并调节OD280为0，然后上样，上样流速为0.5mL/min，检测波长为280nm；上样结束后用A液冲洗柱子至OD280趋于0，上样时流出组分和A液冲洗组分记为流穿组分。
采用60min-100%B的梯度洗脱方式洗脱阴离子交换柱，收集各洗脱组分，并将各洗脱组分进行冷冻干燥，采用3.1.2的方法对各洗脱组分进行ABTS自由基清除检测。
（2）分离和检测结果
Q SepharoseTMFast Flow 阴离子交换对Mx-4再分离的上样、流穿图谱见图11，洗脱图谱见图12，ABTS抗氧化检测结果见图13。从图中结果可以看出，流穿组分和4#峰组分的自由基清除率相差不大，洗脱组分的自由基清除率较差，说明活性肽不和阴离子交换柱结合，苦杏仁蛋白酶解物过阴离子交换柱意义不大。另外，苦杏仁蛋白酶解物过 QSepharoseTMFast Flow阴离子交换柱，需要盐梯度洗脱，洗脱液中含大量盐，不能正确的定量多肽的含量，在对样品280nm吸光度下的ABTS自由基清除率进行检测时，蛋白、多肽在280nm的紫外吸收与其含芳香族氨基酸酪氨酸和色氨酸的量有关，如果多肽序列中没有或仅有少数几个这样的氨基酸，这种方法就会给出错误的结果，因此，本发明放弃采用这种分离方法。
5.2 FPLC法分离Mx-4
采用FPLC法对Mx-4进一步分离，其中，制备分离方法如下：
仪器：Biotage 快速制备液相色谱仪；色谱柱： Teledyne Isco, 150 gram HPC18；柱体积(CV)：130 mL/CV；流动相A：H2O，流动相B：乙腈；流速：60 mL/min；检测波长：220nm 254 nm；梯度/柱体积见下表：
检测方法如下：
仪器：安捷伦1260液相；色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18 4.6*150mm，4μm；流动相A： 0.02% TFA水溶液（流动相A中TFA的体积分数为0.02%），流动相B：0.02% TFA乙腈溶液（流动相B中TFA的体积分数为0.02%）；流速：1.0 mL/min；进样量：5μL；波长：220nm；柱温：40℃；分析时间：72 min；洗脱梯度见下表：
经C18柱分离收集得到4个组分，分别标记为FPLC-1（1-5min收集组分）、FPLC-2（21-32min收集组分）、FPLC-3（33-46min收集组分）、FPLC-4（47-70min收集组分）。将分离得到的4个组分旋蒸并冷冻干燥，得到0.3321g FPLC-1、0.0352g FPLC-2、0.0403g FPLC-3、0.0078g FPLC-4；采用3.1.2的方法检测各组分的ABTS自由基清除率，结果见图14，具体检测数据见表11-13。从图表中可知，FPLC-2、FPLC-3、FPLC-4的ABTS自由基清除率较高，且高于Mx-4的ABTS自由基清除率，对Mx-4中含量较高的FPLC-2、FPLC-3采用液质联用（LC-MS/MS）肽段序列分析技术进行分析。
表11
表12
表13
FPLC-2、FPLC-3组分的总离子流色谱图分别如图15和图16所示，选取FPLC-3得分较高的前5条肽段的信息如表14所示。
表14
6. 利用CCK-8法检测苦杏仁肽对Raw264.7细胞增殖的影响
本实施例制备了具有抗氧化活性的苦杏仁肽，为了考察苦杏仁肽-Mx-4的其它活性，比如免疫活性，本实施例以分子量小于或等于3kDa的苦杏仁蛋白酶解物Mx作为对照，采用CCK-8法检测苦杏仁肽-Mx-4对经LPS刺激的Raw264.7细胞增殖的影响。
6.1 试验步骤
1. Raw264.7细胞以1.2×106的浓度传代至96孔板中，37℃，5%CO2细胞培养箱中培养24h；
2. 24h后加入各浓度的样品100μL/孔；
3. 16h后吸取细胞培养物上清50μL/孔，加LPS培养液50μL/孔至LPS终浓度1μg/mL，37℃，5%CO2细胞培养箱中培养6h；
4．取CCK-8溶液10μL/孔加入细胞培养物上清中，在37℃，5%CO2细胞培养箱中继续孵育0.5h；
5.测定吸光度OD490。
6.2 试验结果
不同浓度的Mx和Mx-4作用下，Raw264.7细胞培养后的吸光度OD490检测结果见表15。
表15
图17a-图17c为不同浓度Mx对Raw264.7细胞增殖的影响结果，从图中可以看出，Mx浓度越大，对细胞增殖的抑制作用越明显，说明Mx对Raw264.7细胞增殖具有一定的抑制作用；图18a-图18e为不同浓度Mx-4对Raw264.7细胞增殖的影响结果，从图中可以看出，随着Mx-4浓度的增大，细胞增殖速率明显增强，当Mx-4的浓度达到5mmol/L时，Mx-4对Raw264.7细胞增殖促进作用达到最佳，说明Mx-4可刺激免疫细胞增殖，可将Mx-4用于制备治疗免疫疾病的药物或用于制备提高免疫力或刺激免疫细胞增殖的药物。

Claims (6)

1.一种具有抗氧化及免疫活性的苦杏仁肽，其特征在于，苦杏仁蛋白酶解后采用凝胶过滤层析法分离，收集到的146-172min洗脱组分Mx-4即为具有抗氧化活性的苦杏仁肽；
苦杏仁蛋白的提取包括如下步骤：
步骤A-1：取脱脂苦杏仁粉于碱溶液中，经超声提取得到苦杏仁提取液；所述碱溶液为氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液pH为9.0；
步骤A-2：将所述苦杏仁提取液离心后取上清液，将所述上清液注入酸溶液中进行酸沉，静置后离心，得到沉淀物；所述酸溶液为盐酸溶液，所述盐酸溶液的pH为5.0；
步骤A-3：用超纯水洗涤所述沉淀物，并调节所述沉淀物洗涤液的pH至7.0，将洗涤后的所述沉淀物冷冻干燥，得到苦杏仁蛋白冻干粉；
苦杏仁蛋白的酶解包括如下步骤：
步骤B-1：向苦杏仁蛋白冻干粉中加入磷酸盐缓冲液，震荡溶解，得到苦杏仁蛋白溶液；
步骤B-2：先将所述苦杏仁蛋白溶液置于恒温震荡水浴锅中水浴，然后加入木瓜蛋白酶进行酶解；
步骤B-3：将酶解后的混合溶液进行水浴，使木瓜蛋白酶钝化；用NaOH溶液或HCl溶液调节水浴后的混合溶液的pH至7.0；
步骤B-4：将步骤B-3中pH为7.0的混合溶液进行低温离心；离心结束后取上清液，即得到苦杏仁蛋白酶解液；采用分子量截留范围为3kDa超滤管对苦杏仁蛋白酶解液进行超滤分离；超滤后得到的所述苦杏仁蛋白酶解物分为分子量小于或等于3kDa的苦杏仁蛋白酶解物和分子量大于3kDa的苦杏仁蛋白酶解物；
凝胶过滤层析法分离的所述苦杏仁蛋白酶解物是所述分子量小于或等于3kDa的苦杏仁蛋白酶解物；
凝胶过滤层析法为：以GE AKTA pure作为纯化系统，采用Sephadex G-15凝胶过滤层析柱进行分离，以超纯水为洗脱液，洗脱液的流速为0.5mL/min。
2.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化及免疫活性的苦杏仁肽，其特征在于，采用FPLC法对146-172min洗脱组分Mx-4进一步分离，收集到的21-32min洗脱组分FPLC-2、33-46min洗脱组分FPLC-3或47-70min FPLC-4即为具有抗氧化活性的苦杏仁肽。
3.根据权利要求2所述的一种具有抗氧化及免疫活性的苦杏仁肽，其特征在于，采用FPLC法进一步分离苦杏仁肽，其检测方法和洗脱梯度如下；
检测方法：色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18；流动相A为含0.02vt%TFA的水溶液，流动相B为含0.02vt%TFA的乙腈溶液；流速为1.0 mL/min；进样量为5μL；柱温为40℃；
洗脱梯度为：0-5 min，5% B；5-25 min，5-30% B；25-35 min，30% B；35-55 min，30-95%B；55-65 min，95%B；65-66 min，95-5%B；66-72 min，5% B。
4.一种具有抗氧化及免疫活性的苦杏仁肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤A：苦杏仁蛋白的提取；
在步骤A中，苦杏仁蛋白的提取包括如下步骤：
步骤A-1：取脱脂苦杏仁粉于碱溶液中，在超声功率250W、超声温度50℃的条件下超声提取75min，得到苦杏仁提取液；所述脱脂苦杏仁粉与所述碱溶液的W/V固液比为1:10；所述碱溶液为氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液pH为9.0；
步骤A-2：将所述苦杏仁提取液离心后取上清液，将所述上清液注入酸溶液中进行酸沉，静置后离心，得到沉淀物；所述酸溶液为盐酸溶液，所述盐酸溶液的pH为5.0；
步骤A-3：用超纯水洗涤所述沉淀物，并调节所述沉淀物洗涤液的pH至7.0，将洗涤后的所述沉淀物冷冻干燥，得到苦杏仁蛋白；
步骤B：苦杏仁蛋白的酶解；
在步骤B中，苦杏仁蛋白的酶解包括如下步骤：
步骤B-1：称取10g苦杏仁蛋白冻干粉至500mL锥形瓶中，按照W/V固液比为30g/L的比例，加入pH为7.0、浓度为10mmol/L的磷酸盐缓冲液333mL，震荡溶解得到苦杏仁蛋白溶液；
步骤B-2：先将所述苦杏仁蛋白溶液置于50℃的恒温震荡水浴锅中水浴10min，然后按照每克蛋白质添加10000U木瓜蛋白酶的比例加入木瓜蛋白酶进行酶解，酶解时间为5h；
步骤B-3：将酶解后的混合溶液置于95-100℃的水中水浴10min，使木瓜蛋白酶钝化；用1mol/L的NaOH溶液或1mol/L的HCl溶液调节水浴后混合溶液的pH至7.0；
步骤B-4：将步骤B-3中pH为7.0的混合溶液进行低温离心，离心温度为4℃、离心速率为13800rpm、离心时间为15min；离心结束后取上清液，即得到苦杏仁蛋白酶解液；
步骤C：将苦杏仁蛋白酶解液超滤分离并冷冻干燥，得到苦杏仁蛋白酶解物；采用分子量截留范围为3kDa超滤管对苦杏仁蛋白酶解液进行超滤分离；超滤后得到的所述苦杏仁蛋白酶解物分为分子量小于或等于3kDa的苦杏仁蛋白酶解物和分子量大于3kDa的苦杏仁蛋白酶解物；
步骤D：苦杏仁蛋白酶解物采用凝胶过滤层析法分离，所述凝胶过滤层析法：以GE AKTApure作为纯化系统，采用Sephadex G-15凝胶过滤层析柱进行分离，以超纯水为洗脱液，洗脱液的流速为0.5mL/min；凝胶过滤层析法分离的所述苦杏仁蛋白酶解物是所述分子量小于或等于3kDa的苦杏仁蛋白酶解物；
在280nm下测量，收集到的146-172min洗脱组分Mx-4为具有抗氧化活性的苦杏仁肽。
5.根据权利要求4所述的一种具有抗氧化及免疫活性的苦杏仁肽的制备方法，其特征在于，还包括步骤E：采用FPLC法对146-172min洗脱组分Mx-4进一步分离，收集到的21-32min洗脱组分FPLC-2、33-46min洗脱组分FPLC-3或47-70min FPLC-4即为具有抗氧化活性的苦杏仁肽；采用FPLC法进一步分离苦杏仁肽的检测方法和洗脱梯度如下：检测方法：色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18；流动相A为含0.02vt%TFA的水溶液，流动相B为含0.02vt%TFA的乙腈溶液；流速为1.0 mL/min；进样量为5μL；柱温为40℃；洗脱梯度为：0-5min，5% B；5-25 min，5-30% B；25-35 min，30% B；35-55 min，30-95%B；55-65 min，95%B；65-66 min，95-5%B；66-72 min，5% B。
6.权利要求1-3任一所述的苦杏仁肽在用于制备治疗免疫疾病的药物或用于制备提高免疫力或刺激免疫细胞增殖的药物中的用途。
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