CN114316088A - 亲和树脂、制备方法及其在分离纯化藻蓝蛋白中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种亲和树脂、制备方法及其在分离纯化藻蓝蛋白中的应用，属于生物化学和海洋产物资源开发利用领域，所述亲和树脂是氨基树脂的氨基和植物色素分子的羧基共价连接形成，植物色素分子作为亲和基团通过酰胺键结合到氨基树脂上。本发明还提供所述亲和树脂的制备方法，同时还提供了利用所述树脂能够分离纯化藻蓝蛋白至分析级以上级别。

Description

亲和树脂、制备方法及其在分离纯化藻蓝蛋白中的应用

技术领域

本发明属于生物化学和海洋产物资源开发利用领域，特别是涉及一种亲和树脂、制备方法及其在分离纯化藻蓝蛋白中的应用。

背景技术

亲和层析是蛋白质纯化的一种重要方法，具有很高的选择性、分离效果以及较大的载量。亲和层析填料的配基在一定条件下可特异性识别并结合目标蛋白，之后改变结合条件将目标蛋白从亲和填料中洗脱下来，即可实现的目标蛋白的纯化。往往一次层析即可从混合物获得较高纯度的目的蛋白，并保持较高的活性。亲和层析纯化的关键在于层析填料中配基的选择。目前市场上可选购多种类型的亲和填料商品试剂，为亲和纯化的广泛应用提供了便利。具体应用于纯化特定蛋白时，常需要在现有亲和填料的基础上连接特定分子(配基)，构成某一类蛋白亲和纯化的专用亲和填料(树脂)。

藻蓝蛋白(phycocyanin,PC)是蓝藻和红藻在水中捕获和传递光能的色素蛋白。藻蓝蛋白可以作为天然色素用于食品、化妆品行业，也可以作为荧光探针用于免疫检测、流式细胞荧光测定、荧光激活细胞分选、共聚焦荧光显微镜和单分子检测等多项技术中，在临床诊断、免疫化学及生物工程等研究领域发挥作用；藻蓝蛋白还具有抗氧化和抗肿瘤活性。藻蓝蛋白具有很高的开发利用价值，其应用与其纯度(最大吸收峰处的光吸收和280nm光吸收的比值)密切相关。一般认为纯度大于0.7为食品级,大于1.5为化妆品级,大于4.0为分析级。藻蓝蛋白用于荧光标记物时，需要其纯度达到4以上。

目前藻蓝蛋白的制备纯化方法主要是从藻类中分离提取天然蛋白，制备工艺有离子交换、羟基磷灰石和凝胶过滤柱层析，疏水作用膨胀床色谱，聚偏氟乙烯膜层析法等。这些工艺普遍存在流程繁冗，重复性不佳，纯度不够高，难以放大等问题，仍需研发新的从藻体中快速纯化藻蓝蛋白的工艺。

发明内容

本发明目的在于根据上述分析，制备出植物色素亲和树脂并建立用其纯化藻蓝蛋白的柱层析工艺。所述方法制备的藻蓝蛋白的纯度达到4以上，符合分析级的标准。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种亲和树脂，其特征在于所述亲和树脂是氨基树脂的氨基和植物色素(phytochromobilin，CAS：143392-71-6)分子的羧基共价连接形成，植物色素分子作为亲和基团通过酰胺键结合到氨基树脂上。

所述亲和树脂的制备方法，取植物色素溶于有机溶剂，浓度40-50mmol/L，用相同有机溶剂清洗过的氨基树脂，将清洗后的氨基树脂和植物色素溶液混合，体积比为1：0.6-1：2.5，向混合物中加入终浓度为0.05-0.1mol/L的N，N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)偶联剂粉末，避光振荡混匀4-24h，植物色素结合到氨基树脂上，离心去除上清，以相同的有机溶剂清洗沉淀物，再以纯水清洗，之后以酸性和碱性溶液交替清洗，获得亲和树脂，用0.02％叠氮钠溶液保藏亲和树脂。

进一步，所述的有机溶剂为无水乙醇或无水异丙醇。

本发明还提供利用所述亲和树脂分离纯化藻蓝蛋白的方法，所述方法具体如下：

1)制备藻蓝蛋白粗提液，以pH偏酸性的结合缓冲液流过亲和树脂的层析柱，平衡两个以上柱体积，将藻蓝蛋白粗提液加到亲和树脂层析柱上，先以结合缓冲液冲洗去杂蛋白，平衡至蛋白检测基线(280nm吸光值)稳定，再加入pH 4-5的洗脱缓冲液，以不超过2ml/min的流速洗脱，根据洗脱液的颜色变蓝或检测到620nm吸光值形成吸收峰，收集洗脱液，向收集液加入高浓度的pH缓冲液使溶液pH升至中性，计算含藻蓝蛋白的收集液的620nm和280nm吸光值的比值，确定藻蓝蛋白的纯度；

2)亲和树脂的再生，收集藻蓝蛋白洗脱峰后，改用结合缓冲液冲洗亲和树脂至流出液pH为中性，以含1mol/L NaCl的结合缓冲液冲洗亲和树脂，洗去结合的杂蛋白；再以结合缓冲液冲洗至流出液电导稳定，即可进行下次藻蓝蛋白粗提液纯化；如暂不使用，则以纯水冲洗，再以0.02％叠氮钠冲洗，4℃冷藏。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明提供了一种亲和树脂，所述树脂能够分离纯化藻蓝蛋白至分析纯以上级别。

附图说明

图1在植物色素亲和层析柱上分别以pH 6和pH 4(柠檬酸)缓冲液结合和洗脱藻蓝蛋白。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明保护范围并非限于下列实施例。

植物色素(phytochromobilin，CAS：143392-71-6)或英文名:3-[(2E,5Z)-2-[[4-(2-carboxyethyl)-5-[(Z)-[(3Z,4R)-3-ethylidene-4-methyl-5-oxopyrrolidin-2-ylidene]methyl]-3-methyl-1H-pyrrol-2-yl]methylidene]-5-[(4-ethenyl-3-methyl-5-oxopyrrol-2-yl)methylidene]-4-methylpyrrol-3-yl]propanoic acid。

实施例1

亲和树脂及其制备方法：取伯乐(Bio-rad)公司Affi gel 102氨基琼脂糖5mL(含氨基约75μmol)转入15mL离心管中，倾倒或吸取上清，使用10mL分析纯的无水异丙醇洗五次，去除上清。加入现配的5mL 50mmol/L植物色素的异丙醇溶液(含植物色素250μmol)，再加入50mg DIC，不断搅拌，避光，摇床振荡过夜。离心除去上清即植物色素溶液，保留新合成的亲和树脂，再以过量异丙醇洗，以洗去植物色素，再以含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L pH 4乙酸盐缓冲液和pH 8Tris-HCl缓冲液交替洗三次。水洗亲和树脂，再以0.02％叠氮钠水溶液避光4℃保存。

实施例2

亲和树脂及其制备方法：取东曹(Tosoh Bioscience)公司TOYOPEARL AF-Amino-650M氨基树脂5克(含氨基约500微摩尔)转入15mL离心管中，倾倒或吸取上清，使用10mL分析纯的无水乙醇洗五次，去除上清。加入12.5mL40mmol/L植物色素的乙醇溶液(含植物色素500μmol)，加入DIC粉末0.15克，不断混匀，25℃避光反应24h。离心，弃去上清即植物色素溶液，保留植物色素树脂并以过量无水乙醇清洗，再以纯水洗几次植物色素树脂，去除无水乙醇。向植物色素树脂中加入0.2mol/L乙酸钠4mL和乙酸酐2mL，0℃(冰水)摇动振荡混匀30min，加入乙酸酐2mL，在25℃振荡混匀30min。使用纯水清洗填料后，再使用0.1mol/LNaOH清洗，最后再次使用纯水清洗。转入0.05％叠氮钠水溶液避光暂存。

实施例3

藻蓝蛋白粗提液制备：向冷冻的钝顶螺旋藻藻泥中加入纯水，于室温解冻，以湘仪H2050R离心机10000rpm低温离心20min，去上清，收集藻泥沉淀。取7g藻泥加入70mL pH 7的10mmol/L磷酸钠缓冲液，充分混匀后反复冻融：在-20℃和室温之间冻融两次，每次2h，最后冷冻-20℃过夜，第二天加入1％果胶酶，在4℃放置24h。低温离心10000rpm，20min，取上清即为藻蓝蛋白粗提液，测得藻蓝蛋白纯度(A615/A280)为0.9，含量为0.49mg/mL，4℃保存。

实施例4

藻蓝蛋白粗提液制备：将1.25L螺旋藻培养液以湘仪H2050R离心机10000rpm低温离心20min，去上清，收集藻体沉淀约10g，加入70mL pH 7的10mmol/L磷酸钠缓冲液，充分混匀后反复冻融：在-20℃冷冻过夜后置于室温复溶2h，再置于-20℃冷冻过夜。3次冻融处理后，加入5％果胶酶，在4℃放置24h。以10000rpm低温离心20min，取上清即为藻蓝蛋白粗提液，测得藻蓝蛋白纯度0.8，含量为0.38mg/mL，4℃保存。

实施例5

藻蓝蛋白粗提液的亲和树脂柱层析纯化工艺：取5mL伯乐公司Affi gel 102氨基琼脂糖制备的亲和树脂，装入重力流塑料层析柱。先用50ml水冲洗平衡，待液面降至高于亲和树脂0.5cm(下同)，加入20mL 20mmol/L pH 5.5磷酸钠缓冲液(以下简称A液)冲洗平衡。加入10ml A液，同时加入5ml藻蓝蛋白粗提液。再加入30ml的A液冲洗平衡。之后加入40mL20mmol/L pH 4的乙酸盐缓冲液洗脱藻蓝蛋白。当蓝色溶液流出时用10mL离心管收集。收集后立即加入0.5mL 0.5mol/L pH 8磷酸钠缓冲液调至中性。

洗脱液不再呈蓝色后，以20mL含1mol/L NaCl的A液冲洗亲和树脂，再用80ml的水冲洗，进行下一轮上样。如暂不使用，以30mL 0.05％的叠氮钠冲洗，液面降至高于亲和树脂2cm时封住出口，4℃冰箱保存。

藻蓝蛋白收集液可以先用默克公司Amicon Ultra-15离心浓缩管(截留分子量3kDa)浓缩。测得收集液中藻蓝蛋白纯度为4.2，超过分析级藻蓝蛋白纯度要求，可用于荧光标记物等。

实施例6

藻蓝蛋白粗提液的亲和树脂柱层析纯化工艺：将15mL亲和树脂装入思拓凡公司的XK16/20空层析柱，将层析柱连接到思拓凡公司的

10S蛋白质快速纯化工艺开拓系统，检测280nm,620nm和650nm三个波长的吸光值。以20mmol/L pH 6磷酸钠缓冲液作为结合缓冲液，以2mL/min流速冲洗平衡亲和树脂后，加入预先通过0.22微米滤膜过滤的藻蓝蛋白粗提液10mL，约含2.4mg藻蓝蛋白，上样流速1mL/min。继续以该结合缓冲液冲洗亲和树脂，流速2mL/min，穿透峰中杂蛋白被洗去，冲洗至检测基线稳定。以20mmol/L pH4柠檬酸盐缓冲液洗脱，流速2mL/min(图1)，以10mL塑料离心管收集620nm的洗脱峰，收集3管蓝色洗脱液。向每管收集液加入约0.5mL 0.5mol/L pH 8磷酸钠缓冲液使溶液pH升至中性。测得藻蓝蛋白纯度为4.4，超过分析级藻蓝蛋白纯度要求，可用于荧光标记物等。

pH 4缓冲液洗脱至检测基线稳定后，改用结合缓冲液以2mL/min流速冲洗亲和树脂，流出液pH升至中性后，再以含1mol/L NaCl的结合缓冲液冲洗亲和树脂，洗脱杂蛋白，洗脱液电导升至55mS/cm后趋于稳定，改用不含NaCl的结合缓冲液冲洗，待电导降至原基线后停止洗脱，准备进行下次藻蓝蛋白粗提液的纯化。如暂不使用，则以纯水冲洗2个柱体积，再以0.02％叠氮钠冲洗2个柱体积，低温保藏。

Claims (5)

1.一种亲和树脂，其特征在于所述亲和树脂是氨基树脂的氨基和植物色素分子的羧基共价连接形成，植物色素分子作为亲和基团通过酰胺键结合到氨基树脂上，所述的植物色素的英文名称为phytochromobilin，标准登记号CAS：143392-71-6。

2.权利要求1所述亲和树脂的制备方法，其特征在于取植物色素溶于有机溶剂，浓度40-50mmol/L，用相同有机溶剂清洗过的氨基树脂，将清洗后的氨基树脂和植物色素溶液混合，体积比为1：0.6-1：2.5，向混合物中加入终浓度为0.05-0.1mol/L的N，N'-二异丙基碳二亚胺偶联剂粉末，避光振荡混匀4-24h，植物色素结合到氨基树脂上，离心去除上清，以相同的有机溶剂清洗沉淀物，再以纯水清洗，之后以酸性和碱性溶液交替清洗，获得亲和树脂，用0.02％叠氮钠溶液保藏亲和树脂。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的有机溶剂为无水乙醇或无水异丙醇。

4.利用权利要求1所述亲和树脂分离纯化藻蓝蛋白的方法，其特征在于所述方法具体如下：

1)制备藻蓝蛋白粗提液，以pH偏酸性的结合缓冲液流过亲和树脂的层析柱，平衡两个以上柱体积，将藻蓝蛋白粗提液加到亲和树脂层析柱上，先以结合缓冲液冲洗去杂蛋白，平衡至蛋白检测基线稳定，再加入pH 4-5的洗脱缓冲液，以不超过2ml/min的流速洗脱，根据洗脱液的颜色变蓝或检测到620nm吸光值形成吸收峰，收集洗脱液，向收集液加入高浓度的pH缓冲液使溶液pH升至中性，计算含藻蓝蛋白的收集液的620nm和280nm吸光值的比值，确定藻蓝蛋白的纯度；

2)亲和树脂的再生，收集藻蓝蛋白洗脱峰后，改用结合缓冲液冲洗亲和树脂至流出液pH为中性，以含1mol/L NaCl的结合缓冲液冲洗亲和树脂，洗去结合的杂蛋白；再以结合缓冲液冲洗至流出液电导稳定，即能够进行下次藻蓝蛋白粗提液纯化；如暂不使用，则以纯水冲洗，再以0.02％叠氮钠冲洗，4℃冷藏。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的结合缓冲液20mmol/L pH 6磷酸钠缓冲液。

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