CN117820440A - 一种毒蕈中鹅膏毒肽类毒素的分离纯化方法 - Google Patents
一种毒蕈中鹅膏毒肽类毒素的分离纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117820440A CN117820440A CN202311872764.5A CN202311872764A CN117820440A CN 117820440 A CN117820440 A CN 117820440A CN 202311872764 A CN202311872764 A CN 202311872764A CN 117820440 A CN117820440 A CN 117820440A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- amatoxin
- effluent
- purifying
- separating
- separation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims abstract description 56
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 title claims abstract description 46
- 231100000729 Amatoxin Toxicity 0.000 title claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- WVHGJJRMKGDTEC-WCIJHFMNSA-N 2-[(1R,4S,8R,10S,13S,16S,27R,34S)-34-[(2S)-butan-2-yl]-8,22-dihydroxy-13-[(2R,3S)-3-hydroxybutan-2-yl]-2,5,11,14,27,30,33,36,39-nonaoxo-27lambda4-thia-3,6,12,15,25,29,32,35,38-nonazapentacyclo[14.12.11.06,10.018,26.019,24]nonatriaconta-18(26),19(24),20,22-tetraen-4-yl]acetamide Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H]1NC(=O)CNC(=O)[C@@H]2Cc3c([nH]c4cc(O)ccc34)[S@](=O)C[C@H](NC(=O)CNC1=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1C[C@H](O)C[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)[C@H](C)O)C(=O)N2 WVHGJJRMKGDTEC-WCIJHFMNSA-N 0.000 title claims abstract description 23
- 108010014709 amatoxin Proteins 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000746 purification Methods 0.000 title abstract description 12
- 238000010262 high-speed countercurrent chromatography Methods 0.000 claims abstract description 29
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 26
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims abstract description 12
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 38
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 36
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 24
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 17
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 17
- 238000004262 preparative liquid chromatography Methods 0.000 claims description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 claims description 9
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 7
- KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N Phalloidin Natural products N1C(=O)[C@@H]([C@@H](O)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C[C@@](C)(O)CO)NC(=O)[C@H](C2)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]3C[C@H](O)CN3C(=O)[C@@H]1CSC1=C2C2=CC=CC=C2N1 KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N 0.000 claims description 7
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- IEQCUEXVAPAFMQ-SXZCQOKQSA-N g729ypp47l Chemical compound O=C1N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N2C[C@H](O)C[C@H]2C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)[C@@H](O)CO)C(=O)N[C@@H](C2)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@H]1C[S@@](=O)C1=C2C2=CC=C(O)C=C2N1 IEQCUEXVAPAFMQ-SXZCQOKQSA-N 0.000 claims description 6
- 230000003551 muscarinic effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims description 5
- 108010009711 Phalloidine Proteins 0.000 claims description 5
- HQVFCQRVQFYGRJ-UHFFFAOYSA-N formic acid;hydrate Chemical compound O.OC=O HQVFCQRVQFYGRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000010992 reflux Methods 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 238000002137 ultrasound extraction Methods 0.000 claims description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- 241000134916 Amanita Species 0.000 abstract description 17
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 abstract description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 abstract description 3
- 238000004185 countercurrent chromatography Methods 0.000 description 16
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 10
- CIORWBWIBBPXCG-SXZCQOKQSA-N alpha-amanitin Chemical compound O=C1N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N2C[C@H](O)C[C@H]2C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)[C@@H](O)CO)C(=O)N[C@@H](C2)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@H]1C[S@@](=O)C1=C2C2=CC=C(O)C=C2N1 CIORWBWIBBPXCG-SXZCQOKQSA-N 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 208000001907 Mushroom Poisoning Diseases 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 239000000469 ethanolic extract Substances 0.000 description 3
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 108010027164 Amanitins Proteins 0.000 description 2
- BDNVAHNPDXGBIR-UHFFFAOYSA-N Amarin Natural products CC(=O)OCC(=C)C(=O)OC1CC(C)=CCCC(CO)=CC2OC(=O)C(=C)C12 BDNVAHNPDXGBIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 2
- CIORWBWIBBPXCG-JZTFPUPKSA-N amanitin Chemical compound O=C1N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N2CC(O)C[C@H]2C(=O)N[C@@H](C(C)[C@@H](O)CO)C(=O)N[C@@H](C2)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@H]1CS(=O)C1=C2C2=CC=C(O)C=C2N1 CIORWBWIBBPXCG-JZTFPUPKSA-N 0.000 description 2
- DOAOYJIOTYDTNV-UHFFFAOYSA-N butan-1-ol;ethyl acetate;hydrate Chemical compound O.CCCCO.CCOC(C)=O DOAOYJIOTYDTNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 2
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 240000007440 Agaricus campestris Species 0.000 description 1
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 1
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- KTUQUZJOVNIKNZ-UHFFFAOYSA-N butan-1-ol;hydrate Chemical compound O.CCCCO KTUQUZJOVNIKNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- GLYLMXARZJNUEY-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;methanol;hydrate Chemical compound O.OC.ClCCl GLYLMXARZJNUEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000002481 ethanol extraction Methods 0.000 description 1
- HZQXXYJHLCSUGQ-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate hexane methanol hydrate Chemical compound O.OC.CCCCCC.CCOC(C)=O HZQXXYJHLCSUGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 description 1
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 description 1
- 239000001648 tannin Substances 0.000 description 1
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种毒蕈中鹅膏毒肽类毒素的分离纯化方法，具体步骤包括，S1.采用高速逆流色谱法对含鹅膏毒肽类蘑菇提取物进行初次分离；S2.采用制备液相色谱法对初次分离后的产物进行二次分离；本发明利用HSCCC结合Pre‑HPLC对鹅膏菌中的鹅膏毒肽类毒素进行分离纯化，并对目标物分组收集，最后进行纯度分析和结构确证，建立了一套鹅膏菌属蘑菇中分离纯化α‑AMA、β‑AMA、羧基三羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽四种成分的方法，该方法操作简单、快速高效、纯度高、重现性好、样品回收率高。
Description
技术领域
本发明涉及鹅膏毒肽类毒素分离技术领域，特别是一种毒蕈中鹅膏毒肽类毒素的分离纯化方法。
背景技术
蘑菇中毒已成为食源性疾病中病死率最高的一类急症。蘑菇中毒事件呈季节性和广地域性分布特点，总体病死率为11.69％～42.30％，该疾病进展快、病情复杂、病死率高，已成为食源性疾病病死率最高的一类急症。其中，灰花纹鹅膏、致命鹅膏、裂皮鹅膏、淡红鹅膏、假淡红鹅膏等具有肝毒性的鹅膏菌属中毒病死率高达80％，含鹅膏毒肽类毒素的蘑菇中毒直接占据死亡病例的95％以上，是最常见也是致死率最高的蘑菇种类与蘑菇毒素。
鹅膏毒肽类毒素是由7～8个氨基酸组成的环肽化合物，根据结构可分为鹅膏毒肽(amanitin，AMA)、鬼笔环肽和毒伞肽三类，毒伞肽暂无对人体有害证据，鬼笔环肽为速发毒性，AMA为迟发毒性。目前已从自然界中分离鉴定出AMA 9种，其中α-AMA是含量和毒性最高的一种，被认为是造成患者肝损伤和死亡的主要原因。此外，在生命科学领域α-AMA还被用作真核生物RNAPⅡ的特异性抑制剂，广泛用于研究从DNA到mRNA的转录过程，具有重要价值。
目前，科学界对毒蘑菇种类及其毒素认知尚不完全，缺乏快速区分有毒与可食用蘑菇的有效办法，对蘑菇毒素的认识及检测方法都存在一定不足。物质的分离纯化一直以来都是科学研究必不可少的手段和基础。然而，现有的鹅膏毒肽类毒素的提取工艺主要为溶剂提取，硅胶柱色谱分离等传统技术为主，制备周期长、杂质不易去除、纯度低，且固体填料的使用会带来样品不可逆吸附及样品损失。因此，利用新技术建立一种蘑菇中快速提取高纯度鹅膏毒肽类毒素的纯化制备方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种毒蕈中鹅膏毒肽类毒素的分离纯化方法，该方法能够简便快捷地从含鹅膏毒肽蘑菇中提取4种鹅膏毒肽类毒素，为高纯鹅膏毒肽的分离纯化提供技术解决方案。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种毒蕈中鹅膏毒肽类毒素的分离纯化方法，包括如下步骤：
S1.采用高速逆流色谱法对含鹅膏毒肽类蘑菇提取物进行初次分离；
S2.采用制备液相色谱法对初次分离后的产物进行二次分离。
作为本申请的一些可实施方式，所述蘑菇提取物经无水乙醇提取所得；
其中，提取时的固液质量比为1：20～30；
提取的方法为超声提取30～120min或加热回流60～120min；
作为本申请的一些可实施方式，所述蘑菇提取物先经无水乙醇提取，再经石油醚萃取所得。
作为本申请的一些可实施方式，所述步骤S1中，采用高速逆流色谱法初次分蘑菇离提取物，并根据色谱峰或时间收集含有β-鹅膏毒肽和羧基三羟鬼笔毒肽混合物的流出液A、含有α-鹅膏毒肽的流出液B和含有羧基二羟鬼笔毒肽的流出液C。
作为本申请的一些可实施方式，所述高速逆流色谱法的溶剂体系包括正丁醇、水和辅助溶剂；所述正丁醇、水和辅助溶剂的体积比为3～7:5:0.5～2。
所述辅助溶剂包括甲酸、乙酸、乙酸乙酯中的任意一种或多种。
作为本申请的一些可实施方式，所述正丁醇、水和辅助溶剂的体积比为4:5:1。
作为本申请的一些可实施方式，所述高速逆流色谱法中溶剂体系的上相为固定相，下相为流动相；流速为10～50mL/min，转速为800～2000转/分钟，检测波长为254nm与300nm。
作为本申请的一些可实施方式，所述步骤S2中，按制备液相色谱条件，采用制备型液相色谱法对浓缩后的流出液A进行二次分离，按色谱峰分别接收流出组分，将各流出组分分别浓缩后干燥，得β-鹅膏毒肽和羧基三羟鬼笔毒肽。
作为本申请的一些可实施方式，所述流出液B和C的处理方式为直接浓缩处理或者按制备液相条件进行二次分离。
作为本申请的一些可实施方式，所述制备液相色谱法条件如下：
流动相为乙腈-0.1％甲酸水，体积比为8～20:92～80。
流速为5～40mL/min，检测波长为254与300nm。
相较现有技术，本发明的有益效果是：
本发明利用HSCCC结合Pre-HPLC对鹅膏菌中的鹅膏毒肽类毒素进行分离纯化；通过优化溶剂分离条件，并对目标物分组收集，最后进行纯度分析和结构确证，建立了一套鹅膏菌属蘑菇中分离纯化α-AMA、β-AMA、羧基三羟鬼笔毒肽(phallisacin，PSC)、羧基二羟鬼笔毒肽(phallacidin，PCD)四种成分的方法，该方法操作简单、快速高效、纯度高、重现性好、样品回收率高。
附图说明：
图1为本发明的工艺流程图；
图2为本发明获得的蘑菇提取物高效液相色谱图；
图3为本发明蘑菇提取物分离的HSCCC色谱图；
图4为本发明制备液相分离的各组分；
图5为本发明HSCCC与制备液相分离得到的各流份浓缩后的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
现有技术中，鹅膏毒肽类毒素的提取工艺主要为溶剂提取，硅胶柱色谱分离等传统技术为主，制备周期长、杂质不易去除、纯度低，且固体填料的使用会带来样品不可逆吸附及样品损失。
基于此，本发明提出了一种毒蕈中鹅膏毒肽类毒素的分离纯化方法，包括如下步骤：
S1.采用高速逆流色谱法对含鹅膏毒肽类蘑菇提取物进行初次分离；
S2.采用制备液相色谱法对初次分离后的产物进行二次分离。
上述方案中，制备液相色谱(pre-HPLC)具有分离效率高、收集准确的优势，适合工业化的制备，在高纯度天然产物分离制备中的应用较为广泛。但是，该方法对样品要求较高，在进样前需要对样品进行较好的预处理以保证制备柱安全，提高分离效率。
基于此，本发明在使用制备液相色谱法进行分离之前，先采用高速逆流色谱(HSCCC)进行初次分离。
高速逆流色谱是一种根据被分离物质在互不相溶的两相溶液中的分配系数不同而进行分离的高效色谱技术。无需固体填料，避免了样品的不可逆吸附等样品损失，具有洗脱方式灵活、回收率高、制备量大、经济成本低、重现性好等独特优势，在生物医药研发、天然产物分离、化工和食品生产等领域有广泛的应用前景，特别适合复杂成分样品的预处理。因此，将HSCCC技术和制备液相色谱技术联用，可成为实验室同时分离制备多种高纯度单体的有效方法。
本发明利用HSCCC结合Pre-HPLC对鹅膏菌中的鹅膏毒肽类毒素进行分离纯化，并对目标物分组收集，最后进行纯度分析和结构确证，建立了一套鹅膏菌属蘑菇中分离纯化α-AMA、β-AMA、羧基三羟鬼笔毒肽(phallisacin，PSC)、羧基二羟鬼笔毒肽(phallacidin，PCD)四种成分的方法，该方法操作简单、快速高效、纯度高、重现性好、样品回收率高。
为了进一步提高提取物的提取纯度，作为本申请的一些可实施方式，对提取物的提取方式作出了限定，即所述蘑菇提取物经无水乙醇提取所得。
因鹅膏毒肽类毒素为多肽类成分，极性偏大，水溶性佳，已报道的提取方法多为醇+水提取，溶剂难以回收，还会将蘑菇中鞣质与糖分一并提取，引入杂质，造成后续分离纯化困难，如逆流色谱上样量低等。因此，本发明采用无水乙醇进行超声提取，简便易得，避免了水溶性杂质，工业化生产时溶剂可回收再利用。
其中，在提取时，限定了提取时的固液质量比为1：20～30；提取的方法为超声提取30～120min或加热回流180min；提取次数为3—5次。
通过限定上述提取条件，能够有效提高鹅膏毒肽提取率。
进一步的，经过单因素考察确定最佳提取条件为固液质量比为1：30，超声60分钟，提取3次，如此，可使鹅膏毒肽提取率达95％以上。
为了进一步提高逆流色谱上样量，作为本申请的一些可实施方式，对提取物作出了限定，即所述蘑菇提取物先经无水乙醇提取，再经石油醚萃取所得。本方案中，将经过无水乙醇提取后的产物再经石油醚萃取，不仅可以保持蘑菇提取物的高提取率，还可提升逆流色谱上样量。
为了进一步提高初次分离效果，作为本申请的一些可实施方式，对步骤S1中收集的流出液作出了限定，即所述步骤S1中，采用高速逆流色谱法初次分蘑菇离提取物，并根据色谱峰或时间收集含有β-鹅膏毒肽和羧基三羟鬼笔毒肽混合物的流出液A、含有α-鹅膏毒肽的流出液B和含有羧基二羟鬼笔毒肽的流出液C。其中，流出液A需经步骤S2进行进一步分离，而流出液B和流出液C既可以选择直接浓缩干燥，也可以选择继续经步骤S2进一步分离，以提高纯度。
为了进一步提高初次分离效果，作为本申请的一些可实施方式，对高速逆流色谱法的溶剂体系作出了进一步限定，即所述高速逆流色谱法的溶剂体系包括正丁醇、水和辅助溶剂；所述辅助溶剂包括甲酸、乙酸、乙酸乙酯中的任意一种或多种。通过实验发现，本发明要对提取物进行有效分离，则溶剂体系中必须含有正丁醇、水，以及甲酸、乙酸、乙酸乙酯中的任意一种或多种，否则分离效果极差，甚至不能分离(如溶剂体系中只有正丁醇和水时，不能进行分离)。其中，所述正丁醇、水和辅助溶剂的体积比为3～7:5:0.5～2。
为了进一步提高初次分离效果，作为本申请的一些可实施方式，对高速逆流色谱法的溶剂体系中各组分用量作出了进一步限定，即所述正丁醇、水和辅助溶剂的体积比为4:5:1。
为了进一步提高初次分离效果，作为本申请的一些可实施方式，对高速逆流色谱法的相关条件作出了进一步限定，即所述高速逆流色谱法中溶剂体系的上相为固定相，下相为流动相；流速为10～50mL/min，转速为800～2000转/分钟，检测波长为254nm与300nm。
截至目前，国内外均无逆流色谱用于鹅膏毒肽类毒素分离纯化的报道，其原因在于所用逆流色谱溶剂体系未被发明，相关工艺与技术细节不明，因此未能采用逆流色谱分离。目前，鹅膏毒肽类毒素分离纯化主要对α-鹅膏毒肽进行研究，所得品种少；采用溶剂提取、大孔吸附树脂、柱色谱等传统的方法提取，步骤多、成分高；且由于鹅膏毒肽类毒素多为水溶性，采用常规硅胶柱色谱等效果通常不佳，难以避免因固体填料带来的样品不可逆吸附，最终产品纯度不高、回收率不佳。
因此，发明一种适用的溶剂体系是开发逆流色谱方法的关键，经过三类溶剂体系1)正己烷-乙酸乙酯-甲醇一水；2)二氯甲烷－甲醇一水；3)正丁醇一水不同比例组合的系统筛选，最终选择了以乙酸乙酯-正丁醇一水(1:4:5)为溶剂体系，α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、羧基三羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽分配系数(K值)适宜(0～2.5)；随后，进一步对洗脱方法、转速、温度与检测波长进行考察，通过液相色谱确定各成分洗脱时间，结合制备液相色谱获得了四种成分高纯度单体。
为了使流出液A中的混合物进行再次分离，作为本申请的一些可实施方式，将流出液A经制备型液相色谱法进行再次分离，即所述步骤S2中，按制备液相色谱条件，采用制备型液相色谱法对浓缩后的流出液A进行二次分离，按色谱峰分别接收流出组分，将各流出组分分别浓缩后干燥，得β-鹅膏毒肽和羧基三羟鬼笔毒肽。
所述流出液B和C的处理方式为直接浓缩处理或者按制备液相条件进行二次分离。
具体的，流出液B直接浓缩干燥后得α-鹅膏毒肽，流出液C直接浓缩干燥后得羧基二羟鬼笔毒肽。
而为了进一步提高α-鹅膏毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽的纯度，需将流出液B和流出液C通过制备液相色谱法进行再次纯化，即所述步骤S2中，按制备液相色谱条件，采用制备型液相色谱法分别对浓缩后的流出液B和C进行二次分离，按色谱峰接收流出组分，并将流出组分浓缩干燥，相较浓缩处理，二次分离可以得到纯度更高的α-鹅膏毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽。
为了进一步提高二次分离效果，作为本申请的一些可实施方式，对制备液相色谱法的条件作出了进一步限定，即所述制备液相色谱法条件如下：
流动相为乙腈-0.1％甲酸水，体积比为8～20:92～80；流速为5～40mL/min，检测波长为254与300nm。
制备液相色谱是常见的制备分离仪器，洗脱条件是分离成功的关键，因鹅膏毒肽类毒素极性大，特别是β-鹅膏毒肽会随pH变化液相出峰时间产生偏移，如何有效洗脱与检测是技术难点。本发明开发了流动相为pH＝4.0的甲酸水和乙腈的液相检测方法和流动相为0.1％甲酸水溶液和乙腈的制备液相洗脱方法，对逆流色谱分离所得馏份进行二次分离，所得成分纯度高，分离时间短，方法简便。
下面结合具体实施方式对本申请所述鹅膏毒肽类毒素的分离纯化方法进行更进一步地详细说明。
值得说明的是：α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、羧基三羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽的液相检测方法中，高效液相色谱法检测条件：色谱柱C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相A(pH＝4.0的甲酸水)和流动相B(乙腈)梯度洗脱：0-10min，流动相B(5-15％)；10-25min，B(15-25％)；25-30min，B(25-90％)；30-35min，B(90％)；流速为1.0mL/min；进样量为10μL；检测波长254与300nm。
实施例1(具体工艺流程见图1)
S1制备蘑菇提取物
取鹅膏菌属干燥蘑菇粉50g，以无水乙醇为提取溶剂，固液比1：30，超声60分钟提取3次，过滤，合并提取液，减压回收乙醇，浓缩至干的乙醇提取物8g，以α-鹅膏毒肽计算，提取率达95％以上。
S2高速逆流色谱法分离蘑菇乙醇提取物
取蘑菇提取物，采用高速逆流色谱条件：以乙酸乙酯-正丁醇一水(1:4:5)为溶剂体系，反相洗脱(上相作固定相，下相作流动相)，流速10mL/min，转速1000rpm，温度20℃，检测波长300nm。以溶剂体系下相溶液溶解至50mg/mL，待CCC建立流体力学平衡后上样，上样量体积为40mL；该条件下，固定相保留率为40％～80％间，HSCCC分离图谱详见图2。
收集35～57，79～92，109～114分钟的洗脱流份(或根据图谱中色谱峰进行收集)，分别记为流出液A、流出液B和流出液C，HSCCC色谱图如图3所示。
流出液A继续进行步骤S3制备液相分离；流出液B和流出液C可直接浓缩干燥，得到α-鹅膏毒肽90.4mg和羧基二羟鬼笔环肽36.8mg，纯度＞96％，或选择再次进行步骤S3，使纯度＞99.5％，结果见图5。
S3制备型液相色谱法精制化合物
取流出液A，采用制备型液相色谱条件：色谱柱C18(20ID×250mm)，流动相为含乙腈体积比12.5％的0.1％甲酸水溶液，流速为10mL/min，检测波长为254和300nm，照色谱峰收集洗脱流份(见图4)，浓缩干燥，可分别得到β-鹅膏毒肽48.8mg，羧基三羟鬼笔毒肽56.5mg，经HPLC进行检测，纯度均大于98％(以面积归一化法计)，见图5。
S4化合物的确定
取上述S2、S3得到的HSCCC与制备液相洗脱流出液，以α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、羧基三羟鬼笔环肽和羧基二羟鬼笔环肽标准品进行比对，其保留时间与紫外吸收光谱图均一致。
本实施例中，单次提取鹅膏菌属致命鹅膏干燥子实体粉末50g，可获得8g乙醇提取物，逆流色谱单次上样量达2g，经制备液相分离后可获得90.4mgα-鹅膏毒肽、48.8mgβ-鹅膏毒肽、56.5mg羧基三羟鬼笔毒肽、36.8mg羧基二羟鬼笔毒肽，纯度依次为99.6％、98.2％、99.5％、99.2％。
实施例2
相较实施例1，将逆流色谱溶剂体系更改为乙酸乙酯、正丁醇、水三者的体积比为0.5:3:5，经逆流色谱分离后直接浓缩干燥流出液B、C分别可得达α-鹅膏毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽，纯度分别为85％、88％，再经制备液相二次提纯可达98.6％、98.2％。
本实施例中，更改逆流色谱溶剂体系后α-鹅膏毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽纯度相较实施例1有所下降，但是依然能够实现本发明效果。
实施例3
相较实施例1，在无水乙醇提取的基础上再进行石油醚萃取，具体如下：
取鹅膏菌属干燥蘑菇粉50g，以无水乙醇为提取溶剂，固液比1：30，超声60分钟提取3次，过滤，合并提取液，减压回收乙醇，浓缩至干的浸膏，其后将浸膏采用石油醚萃取(固液比为1：5-10)，弃去石油醚层，干燥后进行逆流色谱分离，再进行制备液相分离，结果显示可实现本发明分离纯化效果，即α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、羧基三羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽纯度与实施例1大体一致，还可提升逆流色谱上样量，约10％～30％，石油醚层为蘑菇中脂溶性物质，也可留待后续分析。
对比例1
相较实施例1，采用超声法提取蘑菇粉，固液比1:10，提取时间30分钟，经液相检测提取三次提取率为55％。
由此说明，提取时固液比对提取率有较大影响。
对比例2
相较实施例1，采用回流提取法提取蘑菇粉，固液比1:30，提取时间30分钟，经液相检测提取二次提取率为70％～80％。
由此说明，回流提取时间较短，严重影响提取率。
对比例3
相较实施例1，将逆流色谱溶剂体系更改为乙酸乙酯、正丁醇、水三者的体积比为0.2:2:5，结果显示不能实现本发明结果，四种成分不能有效分离。
对比例4
相较实施例1，蘑菇粉提取后不经过逆流色谱分离，直接进行制备液相分离，结果显示不能实现本发明结果，四种成分不能有效分离。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种毒蕈中鹅膏毒肽类毒素的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.采用高速逆流色谱法对含鹅膏毒肽类蘑菇提取物进行初次分离；
S2.采用制备液相色谱法对初次分离后的产物进行二次分离。
2.根据权利要求1所述的一种毒蕈中鹅膏毒肽类毒素的分离纯化方法，其特征在于，所述蘑菇提取物经无水乙醇提取所得；
其中，提取时的固液质量比为1：20～30；
提取的方法为超声提取30～120min或加热回流60～120min。
3.根据权利要求2所述的一种毒蕈中鹅膏毒肽类毒素的分离纯化方法，其特征在于，所述蘑菇提取物先经无水乙醇提取，再经石油醚萃取所得。
4.根据权利要求1所述的一种毒蕈中鹅膏毒肽类毒素的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤S1中，采用高速逆流色谱法初次分蘑菇离提取物，并根据色谱峰或时间收集含有β-鹅膏毒肽和羧基三羟鬼笔毒肽混合物的流出液A、含有α-鹅膏毒肽的流出液B和含有羧基二羟鬼笔毒肽的流出液C。
5.根据权利要求4所述的一种毒蕈中鹅膏毒肽类毒素的分离纯化方法，其特征在于，所述高速逆流色谱法的溶剂体系包括正丁醇、水和辅助溶剂；
所述正丁醇、水和辅助溶剂的体积比为3～7:5:0.5～2；
所述辅助溶剂包括甲酸、乙酸、乙酸乙酯中的任意一种或多种。
6.根据权利要求5所述的一种毒蕈中鹅膏毒肽类毒素的分离纯化方法，其特征在于，所述正丁醇、水和辅助溶剂的体积比为4:5:1。
7.根据权利要求4所述的一种毒蕈中鹅膏毒肽类毒素的分离纯化方法，其特征在于，所述高速逆流色谱法中溶剂体系的上相为固定相，下相为流动相；流速为10～50mL/min，转速为800～2000转/分钟，检测波长为254nm与300nm。
8.根据权利要求4所述的一种毒蕈中鹅膏毒肽类毒素的分离纯化方法，其特征在于，
所述步骤S2中，按制备液相色谱条件，采用制备型液相色谱法对浓缩后的流出液A进行二次分离，按色谱峰分别接收流出组分，将各流出组分分别浓缩后干燥，得β-鹅膏毒肽和羧基三羟鬼笔毒肽。
9.根据权利要求4所述的一种毒蕈中鹅膏毒肽类毒素的分离纯化方法，其特征在于，所述流出液B和C的处理方式为直接浓缩处理或者按制备液相条件进行二次分离。
10.根据权利要求8或9所述的一种毒蕈中鹅膏毒肽类毒素的分离纯化方法，其特征在于，所述制备液相色谱条件如下：
流动相为乙腈-0.1％甲酸水，体积比为8～20:92～80；
流速为5～40mL/min，检测波长为254与300nm。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311872764.5A CN117820440A (zh) | 2023-12-29 | 2023-12-29 | 一种毒蕈中鹅膏毒肽类毒素的分离纯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311872764.5A CN117820440A (zh) | 2023-12-29 | 2023-12-29 | 一种毒蕈中鹅膏毒肽类毒素的分离纯化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117820440A true CN117820440A (zh) | 2024-04-05 |
Family
ID=90515014
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311872764.5A Pending CN117820440A (zh) | 2023-12-29 | 2023-12-29 | 一种毒蕈中鹅膏毒肽类毒素的分离纯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117820440A (zh) |
-
2023
- 2023-12-29 CN CN202311872764.5A patent/CN117820440A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5679806A (en) | Process for the isolation and purification of isoflavones | |
| CN107353201B (zh) | 一种高含量天然莽草酸提取物及其制备方法 | |
| US11981697B2 (en) | Method for preparing delphinium acylated anthocyanin | |
| WO2012061984A1 (zh) | 制备芍药内酯苷和芍药苷的方法 | |
| CN110746302B (zh) | 一种紫锥菊中酚酸类化合物的分离制备方法 | |
| CN109400566B (zh) | 一种从卷柏属植物中提取分离高纯度穗花杉双黄酮的方法 | |
| CN109265494B (zh) | 从滇山茶中提取山奈酚葡萄糖苷类化合物的方法 | |
| CN107573255A (zh) | 一种从辣椒果实中分离纯化辣椒碱和二氢辣椒碱的方法 | |
| CN102086226A (zh) | 一种制备环孢菌素a的方法 | |
| CN117820440A (zh) | 一种毒蕈中鹅膏毒肽类毒素的分离纯化方法 | |
| CN113440547B (zh) | 采用大孔树脂串联动态轴向压缩柱分离纯化大蓟总苷的方法 | |
| CN110240544B (zh) | 一种绿原酸提取纯化方法及应用 | |
| CN114773446A (zh) | 一种蜂毒肽及其分离纯化方法 | |
| CN109320572B (zh) | 从滇山茶中提取黄酮类化合物的方法 | |
| CN106916065A (zh) | 从牛蒡根中制备高纯度绿原酸的方法 | |
| CN107163102A (zh) | 一种亲水性多肽纯化的方法 | |
| CN109609568B (zh) | 一种采用固体发酵法制备苦马豆素的方法 | |
| CN109627153B (zh) | 一种从地木耳提取分离对羟基苯甲醛的方法 | |
| CN102952180B (zh) | 一种高纯度棘白菌素b的制备方法 | |
| CN111909176B (zh) | 一种从他克莫司分离废液中回收子囊霉素、他克莫司8-丙基类似物的方法 | |
| RU2349331C1 (ru) | Способ получения дигидрокверцетина | |
| CN101066906B (zh) | 四区模拟移动床分离纯化发酵液中的1,3-丙二醇的方法 | |
| CN107033198B (zh) | 一种松叶化学成分的分离方法 | |
| CN111349125B (zh) | 一种异迷迭香酸苷和迷迭香酸的制备方法 | |
| CN114316088B (zh) | 亲和树脂、制备方法及其在分离纯化藻蓝蛋白中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |