RU2349331C1 - Способ получения дигидрокверцетина - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к хроматографическому выделению биофлавоноидов. Проводят экстракцию измельченной древесины лиственницы алифатическим спиртом, отгонку спирта, по меньшей мере, один цикл хроматографического выделения целевого продукта на колонке, заполненной гидрофобным сорбентом при элюировании сорбента спиртосодержащей подвижной фазой, причем в качестве экстрагента и подвижной фазы используют водный раствор одного и того же спирта, выбранного из группы: метиловый, этиловый, изопропиловый. Цикл хроматографического выделения осуществляют в термостатированной колонке при 30-50°С в две стадии, причем на первой стадии концентрацию спирта в растворе, наносимом на колонку, и в подвижной фазе поддерживают одинаковой, равной 20-40 об.%, а на второй стадии нанесение раствора на колонку осуществляют при концентрации спирта в растворе 1-20 об.%. Элюирование сорбента осуществляют при концентрации спирта в подвижной фазе, по меньшей мере на 3% превышающей концентрацию спирта в растворе, из которого осуществлено нанесение раствора, но не выше концентрации, равной 30 об.%, полученный при хроматографии элюат подвергают упариванию и осадок высушивают. Изобретение позволяет обеспечить получение продукта высокой степени чистоты с высоким выходом. 3 з.п. ф-лы.

Description

Изобретение относится к области выделения и очистки биофлавоноидов из лиственницы и может быть использовано для получения высокоочищенного дигидрокверцетина, предназначенного для медицинских и фармацевтических целей.

На промежуточных стадиях процесса могут быть выделены также другие компоненты: биофлаваноидный комплекс, арабиногалактан и эфирные масла.

Известен способ выделения антоцианидов из растительного сырья путем экстракции с последующей хроматографической очисткой на бромированных полистирольных сорбентах с использованием 70% этилового спирта (US 6780442, 2004).

Известен способ выделения флавоноидов из растительного сырья путем экстракции с последующей хроматографической очисткой на стиролдивинилбензольном сорбенте с использованием в качестве элюента водноспиртовых растворов (US 5912363, 15.06.1999).

Однако указанные способы предназначены для выделения комплекса биофлаваноидов, а не их отдельных компонентов.

Известен способ получения высокоочищенного дигидрокверцетина, включающий экстракцию опилок лиственницы водно-ацетоновой смесью, очистку водно-ацетонового экстракта высокоэффективной жидкостной хроматографией на обращенно-фазовых сорбентах с размером частиц 5-10 мкм с использованием в качестве подвижной фазы раствора ацетона с добавкой трифторуксусной кислоты. Способ позволяет выделять продукт с чистотой более 99% для получения стандартных образцов (RU 2114631, 10.07.1998).

Недостатком способа является его сложность и использование дорогостоящих ВЭЖХ сорбентов, что не позволяет эффективно его масштабировать для промышленной наработки высокоочищенного дигидрокверцетина.

Наиболее близким к заявленному является способ получения дигидрокверцетина в составе биофлавоноидного комплекса путем экстракции измельченной древесины лиственницы 96,5% спиртом этиловым с последующей реэкстракцией пропиленгликолем (пропандиол-1,2), смешиванием пропиленгликолевого экстракта с раствором хлорида натрия в воде, отделением смолы и эфирных масел, нанесением дигидрокверцетинсодержащего сырья на полиамидный сорбент, промывкой сорбента и элюированием смеси биофлаваноидов 96,5% спиртом этиловым, упариванием спирта, кристаллизацией и сушкой продукта (RU 2186097, 27.07.2002).

Однако данный способ не позволяет выделить дигидрокверцетин в качестве самостоятельного компонента.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения высокоочищенного монокомпонентного дигидрокверцетина из лиственницы с высоким выходом и чистотой целевого продукта.

Поставленная задача решается описываемым способом получения высокоочищенного дигидрокверцетина, включающим экстракцию измельченной древесины лиственницы алифатическим спиртом с получением спиртового раствора дигидрокверцентинсодержащего сырья, отгонку спирта, по меньшей мере, один цикл хроматографического выделения целевого продукта на колонке, заполненной гидрофобным сорбентом при элюировании сорбента спиртосодержащей подвижной фазой, упаривание элюата, сушку полученного продукта, причем в качестве экстрагента и подвижной фазы используют водный раствор одного и того же спирта, выбранного из группы: метиловый, этиловый, изопропиловый, цикл хроматографического выделения осуществляют в две стадии, причем на первой стадии концентрацию спирта в дигидрокверцетинсодержащем растворе, наносимом на колонку, и в подвижной фазе поддерживают одинаковой, равной 20-40 об.%, а на второй стадии нанесение дигидрокверцетинсодержащего раствора на колонку осуществляют при концентрации спирта в растворе не выше 20 об.%, а элюирование сорбента осуществляют при концентрации спирта в подвижной фазе, по меньшей мере на 3% превышающей концентрацию спирта в растворе, из которого осуществлено нанесение раствора, но не выше концентрации, равной 30 об.%.

На стадии экстракции и отгонки спирта.

Предпочтительно, отгонку спирта осуществляют после добавления к экстракту пропиленгликоля в количестве около 1 об.%, от его объема, что предотвращает комкование и слипание сырья при недостаточном контроле за процессом упаривания спирта и позволяет получить сырье в виде концентрированного раствора.

Предпочтительно, пропиленгликолевый концентрат обрабатывают 5%-ным раствором хлорида натрия, что позволяет удалить часть смолистых веществ.

На первой стадии:

Предпочтительно, нанесение и элюирование пробы на колонку осуществляют при концентрации спирта в растворе 20-40 об.%. При осуществлении цикла хроматографии после элюирования, колонку промывают концентрированным раствором спирта и уравновешивают водным раствором спирта с концентрацией, соответствующей концентрации спирта в растворе для нанесения пробы, и осуществляют следующий цикл хроматографии.

Предпочтительно, хроматографию осуществляют в термостатируемой колонке при температуре 30-50°С.

Выбранные концентрации спирта обусловлены следующим.

При концентрации спирта в растворе менее 20% увеличивается время процесса и уменьшается концентрация целевого компонента в растворе.

При концентрации спирта в растворе более 40% происходит недостаточная очистка от примесей.

На второй стадии:

Предпочтительно, нанесение пробы на колонку осуществляют при концентрации спирта в растворе 1-20 об.%, а элюирование осуществляют при концентрации спирта в растворе 12-30 об.%.

При осуществлении цикла хроматографии после элюирования колонку промывают спиртом и уравновешивают водным раствором спирта с концентрацией, соответствующей концентрации спирта в растворе для нанесения пробы, и осуществляют следующий цикл хроматографии.

Предпочтительно, хроматографию осуществляют в термостатируемой колонке при температуре 30-50°С.

Выбранные концентрации спирта обусловлены следующим.

При концентрации спирта менее 1% растворимость дигидрокверцетина недостаточна, что обусловливает снижение нагрузочной емкости колонки. При увеличении концентрации спирта выше 20% дигидрокверцетин плохо удерживается на сорбенте, что снижает нагрузочную емкость колонки или приводит к проскоку уже на стадии нанесения.

Концентрация спирта при элюировании не превышает 30%, так как в этом случае происходит одновременное элюирование сопутствующих дигидрокверцетину примесей.

Уменьшение разницы в концентрации спирта между раствором для нанесения и раствором для элюирования менее 3% значительно увеличивает время элюирования и снижает производительность процесса.

Выбранный температурный интервал обусловлен следующим.

При температуре ниже 30°С растворимость дигидрокверцетина недостаточна для высоких нагрузок. При температуре выше 50°С также снижаются нагрузочные характеристики и селективность из-за снижения сорбционного связывания.

Способ получения высокоочищенного дигидрокверцетина иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1

В колонку с рубашкой размером 50×1000 мм загружают 400 г щепы лиственницы. 2 литра этилового 96%-ного спирта пропускают циклически через колонку снизу вверх со скоростью 500 мл/мин в течение 1 часа при температуре 60°С. Насос прокачки отключают и подключают насос к верхней части колонны. Сверху вниз пропускают 500 мл этилового спирта и объединяют с экстрактом. Получают экстракт в объеме 2,2 л.

Раствор помещают в вакуум-испаритель и упаривают до полного удаления спирта, а затем растворяют в 250 мл 20%-ного этилового спирта (20% объемных в расчете на 96% этиловый спирт).

Колонну с рубашкой размером 24×45 мм, заполненную гидрофобным сорбентом Диасфер-СТ-500 на основе стиролдивинилбензола с удельной поверхностью 600-1000 м²/г, с размером частиц 150-300 мкм, уравновешивают 20%-ным этиловым спиртом при температуре 40°С и наносят подготовленную выше пробу со скоростью 20 мл/мин. Далее через колонну пропускают 250 мл 20%-ного спирта со скоростью 20 мл/мин.

Первые 250 мл собирают в виде целевой фракции, разбавляют до содержания спирта в воде 10 об.% и наносят на колонну размером 24×70 мм, заполненную гидрофобным сорбентом Диасорб-130-Фенил на основе силикагеля с удельной поверхностью 280-350 м²/г с привитыми фенильными группами с размером частиц 40-60 мкм, термостатированную при 30°С и уравновешенную 10%-ным водным этанолом (10% объемных в расчете на 96% этиловый спирт), наносят пробу со скоростью 20 мл/мин. Элюирование осуществляют 13%-ным раствором этилового спирта. Объем элюированной пробы составляет 500 мл.

Элюат упаривают до 125 мл, затем охлаждают до 4-7°С, выпавший осадок отбрасывают на стеклянный фильтр и сушат в сушильном вакуумном шкафу.

Получают 6,2 грамма дигидрокверцетина чистотой 98,2% по данным ВЭЖХ.

Перед очередным хроматографическим циклом колонны промывают концентрированным раствором спирта этилового и уравновешивают раствором этилового спирта с концентрацией 20% (первую колонну) и 10% (вторую колонну).

Пример 2.

В колонку с рубашкой размером 50×1000 мм загружают 400 г щепы лиственницы. 2 литра метилового спирта пропускают циклически через колонку снизу вверх со скоростью 500 мл/мин в течение 1 часа при температуре 60°С. Насос прокачки отключают и подключают насос к верхней части колонны. Сверху вниз пропускают 500 мл метилового спирта и объединяют с экстрактом. Получают экстракт в объеме 2,2 л.

К полученному экстракту добавляют 20 мл пропиленгликоля и осуществляют вакуум-выпаривание до полного удаления спирта и воды. Получают 35 мл сиропообразного концентрата. К концентрату добавляют 60 мл 5%-ного хлорида натрия и перемешивают в течение 30 минут до образования осадка смолистых веществ. Образовавшуюся эмульсию декантируют растворяют в 150 мл 30%-ного метилового спирта и подвергают хроматографической очистке.

Колонну с рубашкой размером 24×45 мм с рубашкой, заполненную гидрофобным сорбентом Диасфер-СТ-500 на основе стиролдивинилбензола с удельной поверхностью 600-1000 м²/г, с размером частиц 150-300 мкм, уравновешивают 30%-ным метиловым спиртом при температуре 30°С и наносят подготовленную выше пробу со скоростью 20 мл/мин. Далее через колонну пропускают 150 мл 30%-ного спирта со скоростью 20 мл/мин.

Первые 200 мл собирают в виде целевой фракции, разбавляют водой до содержания спирта в воде 1 об.% и наносят на колонну размером 24×70 мм, заполненную гидрофобным сорбентом Диасфер-СТ-500 на основе стиролдивинилбензола с удельной поверхностью 600-1000 м²/г, с размером частиц 150-300 мкм, термостатированную при 30°С и уравновешенную 1%-ным метиловым спиртом со скоростью 50 мл/мин. Элюирование осуществляют 11%-ным метанолом. Целевую фракцию собирают в объеме 600 мл. Раствор упаривают до объема 150 мл и охлаждают до 1-4°С и выдерживают 4 часа до выпадения осадка дигидрокверцетина. Осадок отфильтровывают и высушивают в вакуум-сушильном шкафу при 40°С над безводным гранулированным гидроксидом калия.

Получают 7,8 грамма дигидрокверцетина чистотой 99,5% по данным ВЭЖХ.

Перед очередным хроматографическим циклом колонны промывают концентрированным раствором спирта метилового и уравновешивают раствором метилового спирта с концентрацией 30% (первую колонну) и 1% (вторую колонну).

Пример 3.

В колонку с рубашкой размером 50×1000 мм загружают 400 г щепы лиственницы. 2 литра изопропилового спирта пропускают циклически через колонку снизу вверх со скоростью 500 мл/мин в течение 1 часа при температуре 60°С. Насос прокачки отключают и подключают насос к верхней части колонны. Сверху вниз пропускают 500 мл изопропилового спирта и объединяют с экстрактом. Получают экстракт в объеме 2,2 л.

К полученному раствору добавляют 20 мл пропиленгликоля и осуществляют вакуум-выпаривание до полного удаления спирта и воды. Получают 35 мл сиропообразного концентрата. К концентрату добавляют 60 мл 5%-ного хлорида натрия и перемешивают в течение 30 минут до образования осадка смолистых веществ. Образовавшуюся эмульсию декантируют, растворяют в 250 мл 40%-ного изопропилового спирта и подвергают хроматографической очистке.

Колонну с рубашкой размером 24×45 мм с рубашкой, заполненную гидрофобным сорбентом Диасфер-СТ-500 на основе стиролдивинилбензола с удельной поверхностью 600-1000 м²/г, с размером частиц 150-300 мкм, уравновешивают 40%-ным изопропиловым спиртом при температуре 50°С и наносят подготовленную выше пробу со скоростью 20 мл/мин. Далее колонну промывают 250 мл 40%-ного спирта со скоростью 20 мл/мин.

Первые 250 мл собирают в виде целевой фракции, разбавляют вдвое до содержания изопропилового спирта в воде 20 об.% и наносят на колонну размером 24×70 мм, заполненную гидрофобным обращенно-фазовым сорбентом Диасфер-130-С8 на основе силикагеля с удельной поверхностью 280-350 м²/г, размером частиц 60-100 мкм, термостатированную при 50°С и уравновешенную 20%-ным раствором изопропилового спирта со скоростью 20 мл/мин. Элюирование осуществляют 30%-ным раствором изопропилового спирта. Объем элюированной пробы составляет 400 мл.

Элюат упаривают до 100 мл, затем охлаждают до 4-7°С, выпавший осадок отбрасывают на стеклянный фильтр и сушат в сушильном вакуумном шкафу.

Получают 6,0 грамма дигидрокверцетина чистотой 98,5% по данным ВЭЖХ.

Перед очередным хроматографическим циклом колонны промывают концентрированным раствором изопропилового спирта и уравновешивают раствором изопропилового спирта с концентрацией 40% (первую колонну) и 20% (вторую колонну).

Таким образом, предложенный способ позволяет получить дигидрокверцетин высокой степени чистоты (более 98%) с использованием хроматографии низкого давления, что обеспечивает удешевление процесса и позволяет его масштабировать.

Claims (4)

1. Способ получения дигидрокверцетина, включающий экстракцию измельченной древесины лиственницы алифатическим спиртом с получением спиртового раствора дигидрокверцетинсодержащего сырья, отгонку спирта, по меньшей мере, один цикл хроматографического выделения целевого продукта на колонке, заполненной гидрофобным сорбентом при элюировании сорбента спиртосодержащей подвижной фазой, упаривание элюата, сушку полученного продукта, отличающийся тем, что в качестве экстрагента и подвижной фазы используют водный раствор одного и того же спирта, выбранного из группы: метиловый, этиловый, изопропиловый, цикл хроматографического выделения осуществляют в термостатированной колонке при 30-50°С в две стадии, причем на первой стадии концентрацию спирта в дигидрокверцетинсодержащем растворе, наносимом на колонку, и в подвижной фазе поддерживают одинаковой, равной 20-40 об.%, а на второй стадии нанесение дигидрокверцетинсодержащего раствора на колонку осуществляют при концентрации спирта в растворе 1-20 об.%, а элюирование сорбента осуществляют при концентрации спирта в подвижной фазе, по меньшей мере, на 3% превышающей концентрацию спирта в растворе, из которого осуществлено нанесение раствора, но не выше концентрации, равной 30 об.%.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед отгонкой алифатического спирта из раствора дигидрокверцетинсодержащего сырья в него вводят пропиленгликоль, а полученный концентрат обрабатывают раствором хлорида натрия.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что на второй стадии хроматографии элюирование осуществляют при концентрации спирта в подвижной фазе, равной 12-30 об.%.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что осуществляют несколько циклов хроматографического выделения, при этом после элюирования колонку промывают спиртом и уравновешивают водным раствором спирта с концентрацией, равной его концентрации в растворе для нанесения пробы, и осуществляют следующий цикл хроматографии.