CN102690348A

CN102690348A - 试剂级藻蓝蛋白规模化制备方法

Info

Publication number: CN102690348A
Application number: CN2012101854842A
Authority: CN
Inventors: 韩士群
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-06-06
Filing date: 2012-06-06
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2032-06-06
Also published as: CN102690348B

Abstract

本发明涉及一种试剂级藻蓝蛋白规模化制备方法，包括以下步骤：第一步、冻融破壁；第二步、絮凝提取；第三步、分段盐析；第四步、透析；第五步、纯化。本发明采用从湖泊打捞的蓝藻作为原料，来源丰富，价格低廉；所用试剂均为价格低廉的市售品；整个方法成本低廉，且产率高，能获得高纯度藻蓝蛋白。本发明各步骤均可直接应用于规模化生产，有利于实现产业化。

Description

试剂级藻蓝蛋白规模化制备方法

技术领域

本发明涉及一种试剂级藻蓝蛋白规模化制备方法，属于环保和资源化技术领域。

背景技术

近年来太湖蓝藻暴发的规模越来越大，暴发期越来越长，所造成的危害也越来越高。2007年太湖沿岸数千米蓝藻厚度达10cm左右，致使无锡贡湖水厂等无法正常供应水，引发了饮用水危机。通过机械和人工打捞已成为防止富营养化湖泊暴发蓝藻所导致水质恶化的重要应急措施，但打捞蓝藻可能造成二次污染，导致新的环境问题。太湖每年打捞藻水数十万吨，堆放的蓝藻已造成环境污染。

蓝藻富含氮磷等营养物质，只有将捞起的蓝藻无害化、资源化才能从根本上解决蓝藻问题，实现蓝藻的长效治理。国内外关于蓝藻资源化利用主要进行了如下研究和开发：(1)厌氧发酵，采用蓝藻厌氧发酵技术生产沼气和肥料；(2)好氧堆肥，主要包括蓝藻堆肥和蓝藻直接做肥料；(3)提取藻蓝蛋白(C-phycocyanin，C-PC)等生物活性物质；(4)蓝藻饲料化，主要包括蓝藻处理后加工成饲料或提取氨基酸作为饲料添加剂等。其中，前两种属于蓝藻的低附加值产品开发和利用技术，后两种属于蓝藻的高价值产品开发和利用技术。目前蓝藻资源化的主要途径主要是前两种，虽然这两种措施适合大规模处理暴发蓝藻，但其产品(沼气和肥料)附加值较低，经济效益勉强与处理成本持平，使其很难实现市场化推广。

蓝藻中含有非常丰富的蛋白质资源，藻蓝蛋白就是其中最有价值的一种，其主要应用是作为生物学研究中细胞和大分子的荧光标记物、以及高灵敏度荧光试剂。现有研究显示，藻蓝蛋白可应用于免疫诊断并具有抗癌活性，同时可作为食品和化妆品中的天然染料来代替合成染料。

藻蓝蛋白纯度通常以A₆₂₀/A₂₈₀的数值来表示，其等级划分为：0.7＜食品级＜3.0＜药品级＜4.0＜试剂级。藻蓝蛋白的售价随纯度增高而成倍增加，试剂级藻蓝蛋白的市场售价为150～180美元/毫克，约是黄金价格的一万倍。

传统的藻蓝蛋白纯化方法是盐析、一步或多步柱层析，近来又出现了膨化床吸附、利凡诺沉淀和双水相萃取等新的纯化方法。

目前有关藻蓝蛋白提取的研究大多集中于螺旋藻，只有少数研究者以水华蓝藻为原料提取藻蓝蛋白。专利号为200410012934.3的中国发明专利公开了一种水华蓝藻制备藻蓝蛋白的方法(授权公告号CN1259335C)，通过抽提、粗过滤、微滤、超滤、低温静置离心、羟基磷灰石柱层析等提纯步骤从水华蓝藻中提取藻蓝蛋白。该方法的不足之处是产率低、纯度低、成本高，存在微滤、超滤、柱层析等难以应用于规模化生产的步骤，使该方法难以实现产业化。

试剂级藻蓝蛋白的供应基本被国外供应商垄断，价格极为昂贵。亟需具有自主知识产权的试剂级藻蓝蛋白规模化制备方法来打破国外供应商的垄断。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的问题，提出一种试剂级藻蓝蛋白规模化制备方法，能以规模化生产获得高纯度藻蓝蛋白，而且成本低廉，产率高。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种试剂级藻蓝蛋白规模化制备方法，其特征是，包括以下步骤：

第一步、冻融破壁：将蓝藻脱水分，制得藻泥；将藻泥先冷冻冻结，再取出融化，冻融至少两次；

第二步、絮凝提取：用水稀释冻融后的藻泥，混匀得到藻浆，其中藻泥与水的质量比为0.5-1.5∶100；向藻浆中加入质量浓度5-15％的聚合氯化铝溶液并混匀得到混合液，其中聚合氯化铝溶液与藻浆的质量比为0.5-1.0∶100；混合液静置分层，取蓝色上清液即得藻蓝蛋白粗提液；

第三步、分段盐析：向藻蓝蛋白粗提液中加入固体硫酸铵或硫酸铵溶液使硫酸铵饱和度达到15-25％；随后静置、离心后弃去沉淀得上清液，向其中加入固体硫酸铵或硫酸铵溶液使硫酸铵饱和度达到45-55％；随后静置、离心后弃去上清液得沉淀；将所得沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，得藻蓝蛋白溶液；

第四步、透析：将所得藻蓝蛋白溶液置透析袋中，以磷酸盐缓冲液为透析液进行透析；透析后将藻蓝蛋白溶液离心弃去沉淀得上清液，即得透析后藻蓝蛋白溶液；

第五步、纯化：向透析后藻蓝蛋白溶液中加入聚乙二醇和混合磷酸钾盐，使聚乙二醇的质量浓度达到10-13％、并使混合磷酸钾盐的质量浓度达到10-12％，所述混合磷酸钾盐由磷酸二氢钾和磷酸氢二钾构成；搅拌均匀，静置分层后取深蓝色上清液，即得试剂级藻蓝蛋白溶液。

本发明采用从湖泊打捞的蓝藻作为原料，来源丰富，价格低廉；所用试剂均为价格低廉的市售品；整个方法成本低廉，且产率高，能获得高纯度藻蓝蛋白。本发明各步骤均可直接应用于规模化生产，有利于实现产业化。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。

具体实施的试剂级藻蓝蛋白规模化制备方法包括以下步骤：

第一步、冻融破壁：将蓝藻脱水分，制得干物质含量为质量比2-15％的藻泥；将藻泥先置于-18℃～-35℃下冷冻冻结，再取出融化，冻融至少两次；

第二步、絮凝提取：用水稀释冻融后的藻泥，混匀得到藻浆，其中藻泥与水的质量比为0.5-1.5∶100；向藻浆中加入质量浓度5-15％的聚合氯化铝溶液并混匀得到混合液，其中聚合氯化铝溶液与藻浆的质量比为0.5-1.0∶100；混合液静置至少12小时分层，取蓝色上清液即得藻蓝蛋白粗提液(可选择缓慢倾出、虹吸吸出等方式取出)；

第三步、分段盐析：向藻蓝蛋白粗提液中加入固体硫酸铵或硫酸铵溶液使硫酸铵饱和度达到15-25％；随后静置至少12小时，离心(优选转速5000转/分钟，离心3分钟)后弃去沉淀得上清液，向其中加入固体硫酸铵或硫酸铵溶液使硫酸铵饱和度达到45-55％；随后静置至少12小时，离心(优选转速5000转/分钟，离心3分钟)后弃去上清液得沉淀；将所得沉淀用磷酸盐缓冲液(优选含有0.001-0.002mol/L PBS，0.002-0.03mol/L NaCl，0.001-0.002mol/L EDTA，pH＝6.8的缓冲液)溶解，得藻蓝蛋白溶液；

第四步、透析：将所得藻蓝蛋白溶液置透析袋(优选10万道尔顿透析袋)中，以磷酸盐缓冲液为透析液(优选含有0.001-0.002mol/L PBS，0.002-0.03mol/L NaCl，0.001-0.002mol/L EDTA，pH＝6.8的缓冲液；更优选含有0.001mol/L PBS，0.002mol/L NaCl，0.001mol/L EDTA，pH＝6.8的缓冲液)，透析至少12小时，透析过程中至少更换三次透析液；透析后将藻蓝蛋白溶液离心(优选转速5000转/分钟，离心5分钟)弃去沉淀(沉淀为杂质蛋白)得上清液，即得透析后藻蓝蛋白溶液；

第五步、纯化：向透析后藻蓝蛋白溶液中加入聚乙二醇(优选PEG4000)和由磷酸二氢钾和磷酸氢二钾构成的混合磷酸钾盐(磷酸二氢钾和磷酸氢二钾可按任意比例混合，优选质量比1∶1.5-2.5)，使聚乙二醇的质量浓度达到10-13％、并使混合磷酸钾盐的质量浓度达到10-12％，搅拌至少1小时，静置分层后取深蓝色上清液，即得试剂级藻蓝蛋白溶液。该溶液可直接使用，也可冻干成固体粉末后使用。

以下提供四个实施例，各实施例第一步和第二步参数列于表1，第三步和第五步参数列于表2。

表1、各实施例第一步和第二步参数

表2、各实施例第三步和第五步参数

实验数据表明，各实施例第四步所得透析后藻蓝蛋白溶液的A₆₂₀/A₂₈₀值至少为4.20，已达到试剂级标准；各实施例第五步所得试剂级藻蓝蛋白溶液的A₆₂₀/A₂₈₀值至少为4.60，A₆₅₀/A₆₂₀至多为0.28，浓度为16-20mg/mL，回收率达到91.3％。

由Sigma公司出品的螺旋藻来源藻蓝蛋白，浓度≥10mg/mL，A₆₂₀/A₂₈₀≥4.5，A₆₅₀/A₆₂₀＜0.3。相比之下，本发明各实施例所得试剂级藻蓝蛋白溶液的对应指标均优于该产品。

本制备方法采用从湖泊打捞的蓝藻作为原料，来源丰富，价格低廉；所用试剂均为价格低廉的市售品；整个制备方法成本低廉，且产率高，能获得高纯度藻蓝蛋白。本制备方法各步骤均可直接应用于规模化生产，有利于实现产业化。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims

1.试剂级藻蓝蛋白规模化制备方法，其特征是，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的试剂级藻蓝蛋白规模化制备方法，其特征是，第一步中，所述藻泥的干物质含量为质量比2-15％，所述藻泥置于-18℃～-35℃下冷冻冻结。

3.根据权利要求2所述的试剂级藻蓝蛋白规模化制备方法，其特征是，第二步中，混合液静置至少12小时；第三步中，两次静置分别至少12小时。

4.根据权利要求3所述的试剂级藻蓝蛋白规模化制备方法，其特征是，第三步中，离心转速分别为5000转/分钟，离心时间分别为3分钟；第四步中，离心转速为5000转/分钟，离心时间为5分钟。

5.根据权利要求4所述的试剂级藻蓝蛋白规模化制备方法，其特征是，第四步中，透析至少12小时，透析过程中至少更换三次透析液。

6.根据权利要求5所述的试剂级藻蓝蛋白规模化制备方法，其特征是，第五步中，搅拌至少1小时。

7.根据权利要求1至6任一项所述的试剂级藻蓝蛋白规模化制备方法，其特征是，第三、第四步中，磷酸盐缓冲液分别为含有0.001-0.002mo l/L PBS，0.002-0.03mol/L NaCl，0.001-0.002mol/L EDTA，pH＝6.8的缓冲液。

8.根据权利要求7所述的试剂级藻蓝蛋白规模化制备方法，其特征是，第四步中，磷酸盐缓冲液为含有0.001mol/L PBS，0.002mol/L NaCl，0.001mol/L EDTA，pH＝6.8的缓冲液。

9.根据权利要求1至6任一项所述的试剂级藻蓝蛋白规模化制备方法，其特征是，第五步中，所述混合磷酸钾盐中，磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的质量比为1∶1.5-2.5。

10.根据权利要求1至6任一项所述的试剂级藻蓝蛋白规模化制备方法，其特征是，第四步中，所述透析袋为10万道尔顿透析袋；第五步中，聚乙二醇溶液为PEG4000。