CN1243095C - 猕猴桃蛋白酶的提取方法 - Google Patents

Abstract

一种猕猴桃蛋白酶的提取方法，本发明是将猕猴桃果汁采用食盐进行盐析沉淀，并配合使用等电点沉淀法，经过固液分离，得到猕猴桃蛋白酶的湿酶，再经干燥粉碎得到猕猴桃蛋白酶的干粉。本发明具有工艺简单，设备成本低，收益快捷的优点，可以进行工业化生产。克服了硫酸铵工艺中的缺陷，能应用于食品和医药上，整套工艺符合绿色洁净生产的要求。所生产出的猕猴桃蛋白酶，经检验符合食品添加剂的卫生质量标准。通过本发明可以对猕猴桃进行深层次加工，一方面有效地解决猕猴桃残次果出路，延伸其产业链，提高猕猴桃的附加值，增加果农收入，还可以生产出市场需求的猕猴桃蛋白酶产品，填补市场空白。

Description

猕猴桃蛋白酶的提取方法

技术领域

本发明属于从猕猴桃果实中提取猕猴桃蛋白酶方法的改进。

背景技术

猕猴桃成熟果实中除含有丰富的维生素C、多糖、矿物元素等营养成分外，还含有猕猴桃蛋白酶(Actinidin)(祝晨等.猕猴桃类果实营养成分分析《广东药学》1996，6(3)5-6)。

在已发现具有高含量蛋白酶的植物中(有菠萝、木瓜、无花果、剑麻，猕猴桃)猕猴桃是其中之一(黄惠华等，植物蛋白酶资源的研究概况.《广东食品工业科技》1993，(2)1-5)。猕猴桃蛋白酶在食品、医药、纺织印染、皮革制造、祛斑美容、生化试剂等领域有着广泛的用途。在食品上可用于啤酒澄清，防止啤酒冷混浊(梁楚泗等.中华猕猴桃蛋白酶的研制及其在啤酒工业上的应用《食品与发酵工业》1989，(1)76-82)。在肉类加工上可作为肉类嫩化剂(谢超等.几种肉类蛋白酶嫩化剂的比较《肉类工业》2003，(2)29-31)。在医药上有抗炎消肿作用(梁楚泗，中华猕猴桃蛋白酶的性质及抗炎作用《医药工业》1985，16(10)24-28)。

中国是猕猴桃生产大国，也是猕猴桃适宜生长区。据统计，目前全国猕猴桃的人工栽培面积已达87万亩，年产猕猴桃鲜果33万吨(黄贞光等.《优质高档猕猴桃生产技术》中原农民出版社，2003，郑州)。但在生产过程中，猕猴桃果实的商品率并不高，一般约有20％左右的残次果，商品价值低。同时，猕猴桃作为桨果类果品，贮藏期较短，若成熟时不能及时销售或加工，将造成资源上的浪费和经济上的损失。

猕猴桃蛋白酶是一种巯基植物蛋白水解酶，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等。在医药上具有抗炎消肿的作用；在洗涤用酶上，可以分解瓜果蔬菜上的残留农药。近年来的研究还发现，猕猴桃蛋白酶还具有抗癌作用及减肥作用，因此具有较高的药用价值。猕猴桃蛋白酶在啤酒工业上可用于啤酒的澄清处理。由于猕猴桃蛋白酶使用方便，操作简单，溶解性极好，因而比其它溶解性差的蛋白酶作用时间相对延长，更能充分发挥其作用，因而有望代替菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶用于啤酒生产。在肉类嫩化剂方面，由于热带植物的植物蛋白酶容易使肉类嫩化“过头”，使肉类松软，产生肉糊，而猕猴桃蛋白酶作为亚热带植物蛋白酶，作用适中，可作为一种新的酶源用在肉类嫩化方面。

通过对近20年来猕猴桃蛋白酶研究工作的资料检索，就猕猴桃蛋白酶的分离提取方法，厦门大学林沁瑛等人在1986年最早进行了研究(林沁瑛等，中华猕猴桃蛋白酶分离提纯及性质研究.《厦门大学学报(自然版)》.1986，25(3)347-353)，其分离提纯方法是采用Arcus AC.在1959年创建的猕猴桃蛋白酶分离纯化的方法(Arcus AC，Biochem，BiopHys，Acta 33(1959)242-249)。而后人在近20年来对猕猴桃蛋白酶的研究工作中，一直沿用这种方法。Arcus A C.建立的猕猴桃蛋白酶分离提取方法的主要步骤为：猕猴桃果实加入缓冲溶液进行匀浆，滤液在低温条件下进行高速离心，上清液加入硫酸铵进行沉淀，再进行低温高速离心，得到粗酶，然后进行透析脱盐，柱层析纯化，得到单一峰的猕猴桃蛋白酶。

多年来这种方法作为实验研究的惟一手段方法，所使用的设备非常昂贵，如匀浆机、低温高速离心机、柱层析等，而且处理和制备的样品量也非常少，只有微克级及毫克级，仅供理化性质分析研究用，所以该方法只用于实验研究，不适合规模化生产。

在现有的植物蛋白酶的提取方法中，较为成熟并已用于生产的工艺技术有：木瓜蛋白酶的提取技术(邓春梅等.番木瓜的开发与利用.《广州食品工业科技》1996，12(4)16-18)，和菠萝蛋白酶的提取方法(专利文献号CN 87 1 00106 A.)。木瓜蛋白酶的提取技术主要采用中性盐沉淀法，如用硫酸铵进行盐析沉淀，然后进行离心分离和真空干燥。菠萝蛋白酶的提取方法则采用高分子化合物聚丙烯酸盐作为沉淀剂，然后进行离心分离和真空干燥。虽然猕猴桃蛋白酶和木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶同属植物蛋白酶，所采用的分离方法基本类似。但由于这三种蛋白酶来自不同种属的植物，酶的分子量、等电点、理化性质等方面存在一定的差异，因此分离方法上并不完全相同，也就是说现有的木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶的分离方法对于猕猴桃蛋白酶而言并不完全适用，而每种酶都应该具有相应的分离方法和具体的实验参数。包括对原料的前处理、中性盐的种类和用量选择，尤为重要的是加入中性盐后酶的等电点的确定(因为蛋白酶纯酶理论上的等电点在加入中性盐以后一般都会向酸性范围偏移，而偏移程度随着中性盐的种类和用量的不同而变化)。同时上述方法中采用硫酸铵作为沉淀剂生产出的酶制剂有不良气味和杂质，需进行严格的脱盐操作。而猕猴桃蛋白酶主要用于食品、医药等领域，选用硫酸铵工艺显然达不到食品卫生标准。因此，有必要研发出安全有效、可用于工业化生产的猕猴桃蛋白酶的提取方法。

经检索，能够用于工业化生产猕猴桃蛋白酶的提取方法，目前还未见到公开报道，也未有产品销售。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够用于工业生产的猕猴桃蛋白酶的提取方法，其具有简单实用、易于操作、生产成本低、设备投资少、便于推广应用的优点；并使所生产的猕猴桃蛋白酶达到食品级和医药原料级的产品质量标准，以填补该产品在市场上的空白。

本发明的目的是按以下技术方案实现，所提出的猕猴桃蛋白酶的提取方法采用有中性盐沉淀、固液分离、干燥粉碎的步骤，本发明的特征在于：是将猕猴桃果汁采用食盐进行盐析沉淀，并配合使用等电点沉淀法，经过固液分离，得到猕猴桃蛋白酶的湿酶，再经干燥粉碎得到猕猴桃蛋白酶的干粉。

本发明的具体操作步骤为：在猕猴桃果汁中加入18-30％(W/V)的食盐，该食盐是以水溶液形式加入，调整PH至3.8～4.5，进行盐析沉淀，经固液分离，再经干燥粉碎即得到猕猴桃蛋白酶的粗酶制品。本发明的特征还在于：将上述固液分离后得到的湿酶再经脱盐精制、固液分离、干燥粉碎后即得到猕猴桃蛋白酶的精酶制品；其中脱盐精制中沉淀时调整PH至4.6-4.8。本发明的特征还在于：将上述固液分离后得到的湿酶或上述脱盐精制中经固液分离后得到的湿酶，再经醇沉提纯、固液分离、干燥粉碎后即得到猕猴桃蛋白酶的纯酶制品。本发明的特点还在于，在果汁中加入的食盐量为20-28％(W/V)。

本发明所述的盐析沉淀是：向含有蛋白酶的溶液中加入适量的中性盐后，蛋白酶分子生成固体凝聚物而从溶液中沉淀析出。盐析沉淀广泛用于对蛋白质或酶的初级分离提取中。

本发明所述的固液分离是：从固相与液相的混合物中将两相分离，以得到沉淀物。所采用的方法有离心、压滤、过滤、抽滤等。

本发明所述的干燥粉碎是：使用干燥设备或自然条件，除去湿品中的水分，得到水分含量≤5％的干燥制品。常用的干燥方法有：自然摊晾、真空干燥、喷雾干燥、真空冷冻干燥等，或是几种方法的结合使用。粉碎可采用球磨机磨碎。

本发明所述的脱盐精制是：用水作洗脱液，采用离心或过滤或透析的方法，将粗酶制品中的盐离子除去，以得到精制酶。

本发明所述的醇沉提纯是：将粗酶湿品或精酶湿品，用乙醇溶液进行溶解，以除去醇溶性杂质，而得到较纯的酶制品。

本发明在提取猕猴桃蛋白酶时选择食盐(氯化钠)作为沉淀剂，基于以下考虑：

猕猴桃蛋白酶属于巯基植物蛋白酶，主要应用领域是医药和食品，也可用于制革及生化试剂，所以工业生产过程中首先要考虑所采用的试剂、沉淀剂应符合食品卫生标准和医药原料标准，同时也兼顾分离提取的成本价廉适中。氯化钠是蛋白酶良好的沉淀剂，作用条件温和，不易引起酶的变性失活，同时也符合食品、医药的原料要求。本发明中使用高浓度的食盐水，可以对猕猴桃果汁起到防腐作用，因此在操作过程中再不需额外添加防腐剂。

本发明所采用的中性盐沉淀法的原理为：酶属于蛋白质大分子，是两性离子，其表面带有正、负电荷。而中性盐是离子型化合物，当向蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐溶液后，蛋白质表面电荷被“中和”，其净电荷为零，从而导致蛋白质发生凝聚由溶液中沉淀析出。中性盐引起蛋白质发生沉淀的第二种原因是，中性盐离子与蛋白质分子竞争溶液中的水分子，从而使蛋白质分子失去外层的“水化膜”，导致蛋白质颗粒互相凝聚而沉淀。

本发明所采用等电点沉淀法的原理为：蛋白质分子由氨基酸残基以肽键形式构成，其分子末端及侧链有游离的氨基和羧基存在，是典型的两性物质，即蛋白质或酶分子在酸性条件下带正电荷，在碱性条件下带负电荷。而当溶液的PH值达到其等电点时，所带的正、负电荷相等，净电荷为零，消除了蛋白质分子在远离等电点时带有相同的电荷而互相排斥、溶解在水中的现象，使蛋白质分子发生凝聚作用而沉淀析出。

本发明主要使用中性盐沉淀法，同时配合以等电点沉淀法，使沉淀更为彻底有效，以利于提高酶的收率。

使用本发明方法，可以生产出猕猴桃蛋白酶的粗酶、精酶和纯酶制品，具有工艺简单，设备成本低，收益快捷的优点，可以进行工业化生产。其榨汁后的果渣，可以从中提取膳食纤维，或作为饲料添加剂而被利用。而经固液分离后的食盐水废液，可以在工艺中循环使用；醇沉使用过的乙醇溶液可以回收再利用。整套工艺符合绿色洁净生产的要求。同时生产出的猕猴桃蛋白酶，经检验符合食品添加剂的卫生质量标准。通过本发明可以对猕猴桃进行深层次加工，一方面有效地解决了猕猴桃残次果出路，延伸其产业链，提高猕猴桃的附加值，增加果农收入，还可以生产出市场需求的猕猴桃蛋白酶产品，填补市场空白。本发明采用食盐分离提取猕猴桃蛋白酶，克服了硫酸铵工艺中的一些缺陷，如该酶制剂因残留有硫酸铵不良气味而限制了其在食品和医药上的应用，以及硫酸铵在常温下溶解度较低的不足。

附图及其说明

附图1为本发明猕猴桃蛋白酶提取方法的工艺流程框图。

以下结合附图对本发明技术方案作详细说明。

1.猕猴桃蛋白酶粗酶制品的制备

①果汁原料：选择八九成熟的猕猴桃果实，商品果或残次果均可，用榨汁机压榨成汁，经滤布过滤得到果汁。

②盐析沉淀：向猕猴桃果汁中加入20％～28％(W/V)的食盐(水溶液)，调节PH至3.8～4.5(因食盐用量不同而导致沉淀时等电点略有不同)。在0℃～4℃静置不低于8小时，猕猴桃蛋白酶即可沉淀析出。如不能及时进行以下步骤处理，可于低温下贮存3～6天。

③固液分离：经低温沉淀后，果汁混合液明显分二层，除去上清液；下层的稀酶糊可采用布氏漏斗抽滤；也可用离心机在4000r/min转速下离心，以除去食盐水；经离心或抽滤得到沉淀物即为猕猴桃蛋白酶粗酶湿品。

④干燥粉碎：将上述粗酶湿品，经真空干燥或真空冷冻干燥，使水分含量≤5％，再经粉碎，过40目筛，即得到猕猴桃蛋白酶粗酶制品。按果汁质量计算，猕猴桃蛋白酶粗酶的收率为1.2％～1.5％。

2.猕猴桃蛋白酶精酶制品的制备

⑤脱盐精制：在猕猴桃蛋白酶粗酶湿品中加入30～50倍的净化水(以洗脱除盐)，先调节PH至7.0～7.5，搅拌至粗酶完全溶解；再调节PH至4.6～4.8，在0℃-4℃条件下静置3小时以上，使酶再次沉淀析出。

⑥固液分离：除去上清液，进行离心或压滤以除去洗脱液；或用离心机4000r/min离心20分钟，或经220目滤布进行压滤脱水，经脱水后得到的沉淀物即为猕猴桃蛋白酶精酶湿品。

⑦干燥粉碎：将精酶湿品干燥，使水分含量≤5％，再经粉碎过筛，即得到猕猴桃蛋白酶精酶制品。精酶制品的收率为0.8％～1.0％。

3.猕猴桃蛋白酶纯酶制品的制备

⑧醇沉提纯：将猕猴桃蛋白酶精酶(或粗酶)湿品按其重量加入20～30倍的80％(v/v)的乙醇溶液搅拌，以除去醇溶性杂质，猕猴桃蛋白酶因不溶于乙醇溶液而沉淀析出。

⑨固液分离：将上述醇沉溶液进行离心(3500r/min 15分钟)，或常压过滤。若为得到高纯的猕猴桃蛋白酶，可将上述醇沉和固液分离步骤重复1～2次。即得到提纯的猕猴桃蛋白酶纯酶湿品。

⑩干燥粉碎：将纯酶湿品干燥，使水分含量≤5％，粉碎过筛，即为猕猴桃蛋白酶纯酶制品。其收率为0.5％左右。

本发明得到的猕猴桃蛋白酶粗酶制品产品外观为翡翠绿色无定形粉末，带有蓬松感；具有特殊的自然清爽味，极易溶于水。精酶制品和纯酶制品也为绿色粉末，颜色比粗酶稍淡，其它相同。酶的活性单位在50万单位/克以上(50U/克)。

具体实施方式

实例1  取猕猴桃果汁1升，加入已配制的25％的氯化钠水溶液1升，搅拌使充分混合；用氢氧化钠溶液调PH至4.0，在4℃条件下静置沉淀12小时(一般当日下午进行果汁处理，然后在冰箱中静置过夜)。经盐析沉淀后，果汁混合液明显分出上下二层，下层即为绿色酶糊沉淀物。用虹吸管吸出上层的清液；收集下层的沉淀物约有800ml，转入布氏漏斗中减压抽滤，得粗酶湿品53.6g。

将其中的23.6g湿酶自然摊晾后，进行真空干燥，干燥温度不超过40℃，最终使粗酶含水量在5％以下。将干燥后的粗酶用研钵研细，并过40目筛；得到绿色粗酶干粉5.85g。以果汁质量计算，猕猴桃蛋白酶粗酶干粉的收率为1.33％。

将上述粗酶湿品的15g，加入600ml的纯净水搅拌，用氢氧化钠溶液调PH值为7.2，使粗酶充分溶解后，再用食用盐酸调PH至4.6，在4℃冰箱中静置3小时以上；转入离心管中，在4000r/min转速下离心20分钟。弃去上清液，收集底部绿色沉淀物，进行真空冷冻干燥，粉碎过40目筛，得到脱盐精制的猕猴桃蛋白酶精酶干粉2.4g，精酶收率为0.86％。

将上述粗酶湿品的15g，加入500ml的80％的乙醇溶液充分搅拌，转入玻璃漏斗中，用滤纸进行常压过滤。收集滤纸上的沉淀物，再加入450mi的80％乙醇溶液，重复一次。收集滤纸上的沉淀物，进行真空干燥，研磨过筛，得到猕猴桃蛋白酶提纯的纯酶干粉1.73g，收率为0.62％。

实例2取猕猴桃果汁6升，加入28％的饱和食盐水4.3升，搅拌使食盐水与果汁充分混合。用氢氧化钠溶液调pH至4.3，将混合液转至0℃的冷库中，静置沉淀14小时，直至上层清液澄清透明；移去上清液，将下层绿色酶糊装入220目的滤布袋中，压榨出盐水，完成固液分离。

将上述湿酶用6升净化水混合，调节pH值为7.0，搅拌至完全溶解，再调pH至4.6，在0℃冷库中静置3小时以上；转入离心机中在4000r/min转速下进行离心。收集沉淀物，加入5升80％的乙醇溶液，充分搅拌后，进行常压过滤，再经真空冷冻干燥。然后用球磨机粉碎，过40目筛；得到干粉31.80g，其猕猴桃蛋白酶精酶制品的收率为0.53％。

Claims (6)

1、一种猕猴桃蛋白酶的提取方法，包括有中性盐沉淀、固液分离、干燥粉碎的步骤，其特征在于，是将猕猴桃果汁采用食盐进行盐析沉淀，并配合使用等电点沉淀法，经过固液分离，得到猕猴桃蛋白酶的粗酶湿品，再经干燥粉碎得到猕猴桃蛋白酶的粗酶制品。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的盐析沉淀是在猕猴桃果汁中加入18-30％重量体积比的食盐，该食盐是以水溶液形式加入，调整pH至3.8～4.5。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将得到的粗酶湿品再经脱盐精制、固液分离得到精酶湿品，干燥粉碎后即得到猕猴桃蛋白酶的精酶制品；其中脱盐精制中沉淀时调整pH至4.6-4.8。

4、根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，将得到的粗酶湿品或精酶湿品，再经醇沉提纯、固液分离得到纯酶湿品，干燥粉碎后即得到猕猴桃蛋白酶的纯酶制品。

5、根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在果汁中加入食盐的重量体积比为20-28％。

6、根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的脱盐精制为：在湿酶中加入净化水，先调pH至7.0-7.5，搅拌至粗酶溶解，再调pH至4.6-4.8，在0℃-4℃条件下静置使酶沉淀析出。

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