CN1187371C

CN1187371C - 海水藻蓝蛋白的制备方法

Info

Publication number: CN1187371C
Application number: CN 03113940
Authority: CN
Inventors: 向文洲; 何慧; 林坚士; 董俊德; 何妙娟; 吴伯堂; 曾呈奎
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2003-03-19
Filing date: 2003-03-19
Publication date: 2005-02-02
Anticipated expiration: 2023-03-19
Also published as: CN1438240A

Abstract

本发明涉及以海水螺旋藻为原料提取藻蓝蛋白的制备方法。目前所报道的藻蓝蛋白的制备方法，均采用低盐度的淡水培养基培养螺旋藻，经反复冻融破碎细胞后，用冷冻高速离心方法进行固液分离，硫酸铵盐析、0-4℃透析、上色谱柱、多次梯度洗脱、洗脱液用硫酸铵盐析、0-4℃透析、低温冷冻干燥等工艺，虽然能达到高纯度，但工艺路线长、大部分过程需在低温下进行、提取周期长，因而成本高、效率低，生产应用价值不高。本发明的目的是通过海水培养螺旋藻，以此为原料大量、低成本提取较高纯度的藻蓝蛋白，应用于天然色素、保健食品和海洋新药的研究开发，本方法具有原料特殊、工艺简单、提取率高和成本低的特点。

Description

海水藻蓝蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及一种以海水螺旋藻为原料提取藻蓝蛋白的制备方法。

技术背景

海水螺旋藻(Spirulina，seawater strain)是蓝藻门(Cyanophyta)、段殖藻目(Homogoneles)、颤藻科(Oscillatoniaceae)、螺旋藻属(Spirulina)或节旋藻属的海水培养品系，我国已在国际上率先实现产业化养殖。通过对海水胁迫条件的适应，海水螺旋藻中的藻蓝蛋白含量、稳定性和生物学活性得以明显提高。

目前所报道的藻蓝蛋白的制备方法，均采用低盐度的淡水培养基培养所得的螺旋藻为原料，未见有用海水或人工海水为培养基的报道；另外现有的藻蓝蛋白的制备方法，见“中国科学(C缉)“第30卷、第5期PP449-454中所报道的藻细胞通过反复冻融破碎细胞、冷冻高速离心方法进行固液分离，硫酸铵盐析、0-4℃透析、上色譜柱、多次梯度洗脱、洗脱液用硫酸铵盐析、0-4℃透析、低温冷冻干燥等，虽然能达到高纯度，但工艺路线长、大部分过程需在低温下进行、提取周期在一个星期左右，因而成本高、效率低，生产应用价值不高。

本发明的目的是通过海水培养螺旋藻，以此为原料大量、低成本提取较高纯度的藻蓝蛋白，应用于天然色素、保健食品和海洋新药的研究开发。

发明内容

本发明所述的藻蓝蛋白产品，是以海洋植物中的蓝藻门(Cyanophyta)、段殖藻目(Homogoneles)、颤藻科(Oscillatoniaceae)、螺旋藻属(Spirulina)或

节旋藻属的海水培养品系(seawater strain)的藻类，经海水驯化和培养所得的藻体为原料，分离提取所得的蓝色蛋白成分，包括C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白两个主要组分，分子量在30,000-40,000道尔顿之间，可见光最大吸收峰分别在620和652nm、波长处，产品为亮蓝色的固体。

本发明主要特点是，经海水中多种离子的刺激诱导作用，海水螺旋藻的细胞壁变得十分疏松，由于细胞内外渗透压的较大差异，使细胞壁快速破裂；同时，由于海水多种离子的作用使得藻蓝蛋白的稳定性提高，因而可以在较高温度下提取藻蓝蛋白；此外，本工艺采用了添加稳定剂、超滤浓缩和向提取液直接浸泡色谱材料的“一步法快速纯化”等工艺，使整个工艺的大部分操作可在较高温度下进行，由于这些特点，不仅提高了提取效率，大幅度缩短工艺周期(2-3天)、降低提取成本、而且能使产品达到较高纯度，因而具有较高的生产应用价值。目前尚未见其它工艺采用海水螺旋藻为材料提取藻兰蛋白的报道。

本发明所涉及的海水螺旋藻是指将淡水培养基培养的螺旋藻属中藻类，如钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)或极大螺旋藻(Spirulina maxima)等任一藻种通过海水驯化而得，其驯化方法为：通过逐步增加螺旋藻培养基的盐度，先用NaCl驯化，盐度每次增加幅度为3-5‰，待藻细胞生长正常后，再次添加，直至达到天然海水盐度(30-35‰)，然后逐步用粗盐取代NaCl，并逐步减少Ca、Mg、K离子的用量，最后用天然海水取代粗盐，完成海水驯化过程利用该驯化过程，可以得到适应更高盐度(35-80‰)的海水螺旋藻。海水螺旋藻藻种可从以下单位获取：中国科学院南海海洋研究所、中国科学院海洋研究所、福建水产研究所、国家海洋局第三研究所、意大利佛罗伦萨大学、墨西哥大学等，海水螺旋藻已由中国科学院南海海洋研究所、国家海洋局第三研究所等单位完成工厂化养殖，藻粉可大量购买获得。采用海水螺旋藻藻种生产藻蓝蛋白和硒化藻蓝蛋白是本发明最重要的特征之一。

本发明所述的海水螺旋藻藻蓝蛋白的制备方法为：

(1)采收藻体，冲洗，干燥。将海水螺旋藻干品加入含有食用稳定剂(如水扬酸、苯甲酸钠、山梨酸钾)、无机盐类、糖类、pH调节剂等保护成分的水溶液中。

(2)混合液在0-50℃条件下搅拌提取。去除残渣，得藻蓝蛋白粗提物上清液。

(3)藻蓝蛋白的纯化由下列A、B两步进行，A、B两步可颠倒顺序进行：

A.粗提物上清液经超滤脱盐浓缩后，采用“一步法快速纯化”去除异藻蓝蛋白和其它杂蛋白：即向提取物中直接加入用0.015-0.05M磷酸缓冲溶液(pH6-7，含0.1-0.5MNaCl)平衡过的羟基磷灰石(色谱分离材料)，使溶液的浓度和pH等参数刚好使C-藻蓝蛋白不被吸附，搅拌，去除羟基磷灰石。

B.提取液加入硫酸铵搅拌，使藻蓝蛋白盐析沉淀。离心收集藻蓝蛋白沉淀。超滤脱盐。

(4)所得脱盐溶液进一步超滤浓缩，得藻蓝蛋白液态制品；将浓缩液低温冷冻干燥或喷雾干燥，得藻蓝蛋白固体制品。

为了增加产品的稳定性，产品干燥前可加入安全无毒\的糖类、盐类等成分作为稳定剂。同时，为了进一步提高产品的纯度，上述步骤(3)完成后所收集的藻蓝蛋白溶液可继续采用类似上述“一步法快速纯化”的方法对藻蓝蛋白进行纯化：直接加入加入用0.001-0.01M磷缓冲溶液平衡过的羟基磷灰石混合，然后去除上清液，收集色谱材料，加入0.015-0.05M磷酸缓冲溶液浸泡，溶液的浓度和pH等参数刚好使硒化C-藻蓝蛋白大量溶解，所得的藻蓝蛋白的纯度可接近或达到生化试剂标准。

本方法还可用于特殊离子富集藻蓝蛋白的制备，如硒化藻蓝蛋白、富铁藻蓝蛋白或富锌藻蓝蛋白，这些离子可以通过在海水螺旋藻培养基中添加它们的无机态成分，通过培养过程中螺旋藻的生物富集作用，与藻蓝蛋白有机结合。

[实例1]将螺旋藻接种于盐度为60‰的自然海水培养基中，室外大池培养，采收藻泥，海水冲洗，30-60℃低温烘干后得干藻210克，加入5升0.005M磷酸缓冲溶液(含1％NaCl、50ppm苯甲酸钠、100ppm甘油)、于25-35℃浸泡，搅拌抽提12小时，离心去残渣，得4.3升上清液，超滤浓缩至0.5升，调节缓冲溶液浓度达0.075M(pH6.7，含0.2MNaCl)，加入0.075M磷酸缓冲溶液(pH6.7，含0.2MNaCl)平衡的羟基磷灰石，搅拌后，离心去除羟基磷灰石，所得上清液加入硫酸铵达饱和度60％，形成沉淀，离心收集沉淀，超滤，不断补充0.005M磷酸缓冲溶液(pH6.7，含0.2MNaCl)，超滤浓缩至0.6升，加入经0.005M磷酸缓冲溶液(pH6.7，含0.2MNaCl)平衡过的羟基磷灰石，搅拌，离心收集羟基磷灰石，用浓度为0.025至0.075磷酸缓冲溶液(pH6.7，含0.2MNaCl)的多个浓度分别反复浸泡羟基磷灰石，收集纯化的藻蓝蛋白溶液，超滤脱盐并浓缩，加入0.5克葡萄糖，超低温真空冷冻干燥，得藻蓝蛋白干品12.3克。

[实例2]将螺旋藻接种于盐度为35‰的人工海水培养基中，室外扩大培养至10平方米，采收藻泥，淡水冲洗，阴干后得干藻1.8公斤，加入20升0.04M磷酸缓冲溶液(含5％NaCl、50ppm苯甲酸钠、100ppm甘油)、于10-25℃浸泡，搅拌抽提24小时，离心去残渣，得20升上清液，经超滤浓缩至5升，加入约200ml经0.05M磷酸缓冲溶液(pH6.7，含0.2MNaCl)平衡的羟基磷灰石，搅拌后，离心去除羟基磷灰石，所得上清液加入硫酸铵达饱和度60％，形成沉淀，离心收集沉淀，超滤脱盐并浓缩，加入5克葡萄糖，1克NaCl，超低温真空冷冻干燥，得193藻蓝蛋白藻蓝蛋白干品。

[实例3]将螺旋藻接种于盐度为42‰的自然海水培养基中，室外扩大培养至100平方米，采收藻泥，淡水冲洗，30-60℃低温烘干后得干藻6公斤，加入80升0.04M磷酸缓冲溶液(含5％NaCl、50ppm苯甲酸钠、100ppm甘油)、于10-15℃浸泡，搅拌抽提24小时，离心去残渣，得55升上清液，经超滤浓缩至20升，加入约一升经0.04M磷酸缓冲溶液(pH6.7，含0.2MNaCl)平衡的羟基磷灰石，搅拌后，离心去除羟基磷灰石，所得上清液加入硫酸铵达饱和度60％，形成沉淀，离心收集沉淀，超滤脱盐并浓缩，加入30克葡萄糖，5克NaCl，喷雾干燥，得625克藻蓝蛋白干品。

[实例4]将螺旋藻接种于盐度为60‰的自然海水培养基中，添加20ppm亚硒酸钠，室外扩大培养至100升，采收藻泥，海水冲洗，30-60℃低温烘干后得干藻130克，加入5升0.005M磷酸缓冲溶液(含1％NaCl、50ppm苯甲酸钠、100ppm甘油)、于25-35℃浸泡，搅拌抽提12小时，离心去残渣，得4.3升上清液，超滤浓缩至0.5升，调节缓冲溶液浓度达0.075M(pH6.7，含0.2MNaCl，加入0.075M磷酸缓冲溶液(pH6.7，含0.2MNaCl)平衡的羟基磷灰石，搅拌后，离心去除羟基磷灰石，所得上清液加入硫酸铵达饱和度60％，形成沉淀，离心收集沉淀，超滤，不断补充0.005M磷酸缓冲溶液(pH6.7，含0.2MNaCl)，浓缩至0.6升，加入经0.005M磷酸缓冲溶液(pH6.7，含0.2MNaCl)平衡过的羟基磷灰石，搅拌，离心收集羟基磷灰石，用0.025至0.075的多个浓度磷酸缓冲溶液(pH6.7，含0.2MNaCl)分别反复浸泡羟基磷灰石，离心收集纯化的硒化C-藻蓝蛋白溶液，超滤脱盐并浓缩，加入0.5克葡萄糖，超低温真空冷冻干燥，得硒化C-藻蓝蛋白藻蓝蛋白干品5.6克。产品的硒含量为43ppm。

Claims

1、一种海水藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于采用海水或人工海水为培养基培养螺旋藻藻种，其具体步骤包括如下：

1)、采收藻体，冲洗，干燥，将海水螺旋藻干品加入含有食用稳定剂、糖类、无机盐类、pH调节剂保护成分的水溶液中；

2)、1)中混合液在0-50℃条件下搅拌提取，去除残渣，得藻蓝蛋白粗提物上清液；

3)、2)中藻蓝蛋白粗提物上清液的纯化由下列A、B两步进行，A、B两步可颠倒顺序进行：

A、粗提物上清液经超滤脱盐浓缩后，向提取物中直接加入用0.075-0.05M磷酸缓冲溶液平衡过的色谱分离材料羟基磷灰石，使溶液的浓度和pH参数刚好使C-藻蓝蛋白不被吸附，搅拌，去除羟基磷灰石；所述的磷酸缓冲溶液是pH6-7，含0.1-0.5MNaCl的磷酸缓冲溶液；

B、提取液加入硫酸铵搅拌，使藻蓝蛋白盐析沉淀，离心收集藻蓝蛋白沉淀，超滤脱盐；

4)、所得脱盐溶液进一步超滤浓缩，得藻蓝蛋白液态制品；将浓缩液低温冷冻干燥或喷雾干燥，得藻蓝蛋白固体制品；

5)、藻蓝蛋白固体产品的进一步纯化，加入用0.001-0.01M磷缓冲溶液平衡过的羟基磷灰石混合，然后去除上清液，收集色谱材料羟基磷灰石，加入0.025-0.075M，含有0.1-0.5MNaCl、pH为6-7的磷酸缓冲溶液浸泡，所得的藻蓝蛋白的纯度可接近或达到生化试剂标准。

2、根据权利要求1中所述的海水藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于所述的稳定剂为水扬酸、苯甲酸钠、或山梨酸钾。

3、根据权利要求1中所述的海水藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于所述的藻蓝蛋白固体产品，干燥前可加入安全无毒的糖类、盐类成分作为稳定剂。

4、根据权利要求1中所述的海水藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于本方法还可用于特殊离子富集藻蓝蛋白的制备，这些离子可以通过在海水螺旋藻培养基中添加它们的无机态成分，通过螺旋藻的生物富集作用，与藻蓝蛋白有机结合。

5、根据权利要求4中所述的海水藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于特殊离子富集藻蓝蛋白的制备中，所述的特殊离子富集藻蓝蛋白是硒化藻蓝蛋白、富铁藻蓝蛋白或富锌藻蓝蛋白。

6、根据权利要求1中所述的海水藻蓝蛋白的制备方法，其特征在于海水螺旋藻是指将淡水培养基培养的螺旋藻属中藻类进行驯化，其驯化方法为：通过逐步增加螺旋藻的盐度，先用NaCl驯化，盐度每次增加幅度为3-5‰，待藻细胞生长正常后，再次添加，直至达到天然海水盐度30-35‰，或更高盐度35-80‰然后逐步用粗盐取代NaCl，并逐步减少Ca、Mg、K离子的用量，最后用天然海水取代粗盐，完成海水驯化过程。