CN102220296A - 从蒜片加工废水中提取大蒜超氧化物歧化酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从蒜片加工废水中提取大蒜超氧化物歧化酶的方法,该提取方法经过硅藻土挂膜过滤、加热除去杂蛋白质、超氧化物歧化酶分子印迹树脂吸附、洗脱液浓缩以及冷冻干燥后得到大蒜超氧化物歧化酶干粉。本发明的从蒜片加工废水中提取大蒜超氧化物歧化酶的方法,提取大蒜超氧化物歧化酶纯度高,生产成本低,不但使得大蒜加工废水能够达标排放,而且有效的利用了大蒜加工废水资源,提取废水中的宝贵资源。
Description
技术领域
本发明涉及农产品加工废弃物资源回收和开发利用领域,具体地说是一种从蒜片加工废水中提取大蒜超氧化物歧化酶的方法。
背景技术
大蒜(Allium sativum L)为百合科葱属植物,可药食两用,具有抗菌、消炎、杀虫、预防动脉粥样硬化、降血压、抗风湿、防治肿瘤、调节机体免疫力等功效。大蒜的化学成分主要分为硫代亚磺酸酯类、S-烷(烯)-L-半胱氨酸衍生物、性成分、γ-L-谷氨酸多肽、甙类、多糖、脂类、酶类、皂苷类化合物。目前大蒜的开发利用是国内外医药研究的热点之一。
目前中国是全球最大的大蒜生产国、消费国和出口国,大蒜已出口到美、德、日等131个国家和地区。据有关资料介绍,2009年我国大蒜产量1057.8万吨,占全球的75%。目前国内大蒜总量的70%-80%通过冷藏出口海外,大蒜的销售渠道主要依赖蒜头出口。剩余20%-30%的小蒜、次蒜、蒜楔子通过加工蒜片、蒜粒、蒜粉等就地消化。大蒜初级加工产业主要有蒜片、蒜粒、蒜粉等产品的加工。在蒜片加工过程中,大蒜多糖、大蒜素、蛋白质、酶等许多营养物质流失到废水里,被企业直接排放。该废水属于食品加工业废水,废水中的有机污染物含量高,并含有特别含硫化合物——大蒜素,废水被微生物分解后水色墨黑,臭气熏天,所流之处,寸草不生,更无生物,非常难治理。不仅浪费了宝贵的资源,而且还造成了严重的环境污染,严重影响了广大人民群众的生产生活和身体健康。大蒜加工废水中所谓的“有机污染物”实际是宝贵的物质大蒜多糖、大蒜素等,并不含有其他有害化学污染物质,直接用生物化学方法处理排放,造成宝贵资源的严重浪费。大蒜加工废水是一种非常特殊的废水,其中的大蒜素是一种广谱杀菌剂,采用普通的活性污泥曝气法处理,大蒜素对活性菌有强烈的抑制作用,污泥活性很低,水体COD的绛解能力很差。大蒜加工废水属于高浓度废水,COD约20000mg/L左右,远高于活性污泥的耐受量(<3000mg/L左右),再加之大蒜素的抑制作用,如采用活性污泥曝气法处理,必须把原废水10-20倍后方可使用,每吨蒜片消耗自来水约20-40立方,造成水资源的严重浪费。
超氧化物歧化酶(SOD)是一种广泛存在于生物体内,能催化超氧负离子发生歧化反应的金属酶类。由于该类酶能有效清除机体内的超氧自由基,从而有效地预防活性氧对生物品的毒害作用,因而具有抗辐射、抗肿瘤及延缓机体内的超氧自由基,从而有效地预防活性氧对生物体的毒害作用,因而具有抗辐射、抗肿瘤及延缓机体衰老等功能,在保健品、医药和化妆品行业中有重要的应用价值SOD。目前我国传统工业大多从动物的血液和内脏器官中提取SOD,但这类原料来源有限,成分复杂,且在储存、运输等方面存在诸多不便,因此容易导致生产工艺复杂化,使生产成本大幅度上升。大蒜是目前已知的SOD含量较高的植物之一,近来的研究发现,大蒜细胞中含有丰富的超氧化物歧化酶(SOD),其分子量约为32000,与从牛血等动物血红蛋白中所提取的SOD十分接近,而且其来源丰富、易于处理而使生产成本大大降低,而且生产工艺也能得到很大的简化,这对于扩大生产规模,实现SOD的广泛应用将是十分有益的。从大蒜中提取超氧化物歧化酶(SOD)多采用分步盐析法、有机溶剂沉淀法等传统分离技术。近年来,堪威等(膜分离提取大蒜S0D及其水溶性多肽研究,化学工程与装备,208年第10期)采用膜分离技术,考察磷酸缓冲液pH值、浸提时间、热变性温度、热变性时间因素对SOD活性的影响,提取大蒜中的SOD及其水溶性多肽。刘建国等(专利申请号200810159697.1)利用超滤分离技术,经过粉碎、热击、离心和超滤等四个简单步骤,从大蒜中提取高纯度的超氧化物歧化酶(SOD)。
由于膜分离技术是根据膜孔径所截留分子量得大小不同,对分离物进行截留分离,单纯使用膜分离无法实现超氧化物歧化酶(SOD)分子量(32000)与相近分子量的大蒜多糖、杂蛋白等物质的分离,选择性差,无法制得高纯度大蒜超氧化物歧化酶(SOD)。
分子印迹技术(MIT Molecular Imprinting Technology)也叫分子模板技术,是指以某一特定的目标分子(或离子)为模板分子,将结构上具有互补性的功能单体通过相互作用(共价、非共价键等)与模板分子结合,加入交联剂进行聚合反应,反应完成后将模板分子洗脱出来,形成一种具有固定空穴大小和形状,及有确定排列功能团的刚性聚合物,并能高选择性地识别模板分子的过程。分子印迹聚合物以其优良的性能已经在化学传感器、天然抗体模拟、选择性催化、药物手性分离、药物控制释放、农残分析、色谱固定相、固相萃取剂等方面得到广泛的应用。目前,未见利用分子印迹技术从大蒜加工废水中提取大蒜超氧化物歧化酶(SOD)的报道。
发明内容
本发明的技术任务是提供一种从蒜片加工废水中提取大蒜超氧化物歧化酶的方法。
本发明的技术任务是按以下方式实现的,该提取方法步骤如下:
A、硅藻土挂膜过滤:以多个400目的不锈钢筛网为支撑材料,以200目的硅藻土为过滤介质,将硅藻土料液通过泵循环,预先在不锈钢筛网上均匀涂上5~10毫米厚的硅藻土过滤层,然后对蒜片加工废水进行过滤,可除去蒜片加工废水中的大颗粒杂质和胶体物质;
B、加热除去杂蛋白质:对过滤后的蒜片加工废水加热到65℃~75℃,加热时间15~20分钟,使蒜片加工废水中的杂蛋白变性絮凝,冷却至30℃,再经硅藻土挂膜过滤后,去除蒜片加工废水中的杂蛋白质;
C、超氧化物歧化酶分子印迹树脂吸附:去除杂蛋白质的蒜片加工废水,经过滤澄清后,利用超氧化物歧化酶分子印迹树脂选择性吸附蒜片加工废水中的大蒜超氧化物歧化酶,实现与大蒜多糖等杂质的分离;
D、超氧化物歧化酶分子印迹树脂洗脱:超氧化物歧化酶分子印迹树脂吸附饱和后,用洗脱剂洗脱;
E、洗脱液浓缩:上述洗脱液经截留分子量20000的聚砜膜浓缩后,得到大蒜超氧化物歧化酶质量百分比浓度为5~10%的浓缩液;
F、冷冻干燥:将上述大蒜超氧化物歧化酶浓缩液经-55℃~-15℃的低温冷冻干燥10~14小时后得到大蒜超氧化物歧化酶干粉。
所述的超氧化物歧化酶分子印迹树脂的合成方法如下:在装有搅拌器及温度计的的反应器中,将壳聚糖溶解在质量百分比浓度2%的乙酸溶液中,该乙酸溶液中壳聚糖的质量百分比含量为5%;加入超氧化物歧化酶,使超氧化物歧化酶在壳聚糖乙酸混合溶液中的质量百分比含量为5%;在上述混合液中加入液体石蜡,使液体石蜡与上述混合液的体积比为5∶3;常温下控速搅拌10min,然后升温60℃,滴加乙二醛,乙二醛的添加量为壳聚糖添加量的30%,反应0.5h;调节体系的pH=10,再加入环氧氯丙烷,环氧氯丙烷的添加量为壳聚糖添加量的20%,升温到70℃;之后用滴管缓慢滴加质量百分比浓度10%的NaOH水溶液,使溶液的pH始终保持在10左右,反应2h;过滤后依次经质量百分比浓度0.1%的盐酸溶液、质量百分比浓度0.1%的NaOH溶液、去离子水洗脱处理,制得对超氧化物歧化酶具有高选择性吸附的超氧化物歧化酶分子印迹树脂微球。
所述的洗脱剂为PH=8.0的磷酸盐溶液,该磷酸盐溶液由0.2mol/L磷酸氢二钠溶液、0.2mol/L磷酸二氢钠溶液以及0.2mol/L氯化钠溶液混合制备,各溶液的质量百分比含量如下:0.2mol/L磷酸氢二钠溶液85.2%;0.2mol/L磷酸二氢钠溶液4.8%;0.2mol/L氯化钠溶液10%。
本发明的从蒜片加工废水中提取大蒜超氧化物歧化酶的方法和现有技术相比,具有以下特点:
1)以蒜片加工废水为原料提取大蒜超氧化物歧化酶(SOD),从废水中提取天然活性物质,与利用大蒜为原料提取大蒜超氧化物歧化酶(专利申请号200810159697.1)相比,产品生产成本低,市场竞争力强。
2)采用硅藻土挂膜过滤系统处理,对蒜片加工废水进行预处理,除去原水中大颗粒杂质和胶体物质,解决了此类废水的预处理难题;通过硅藻土挂膜过滤系统处理热变性蛋白絮凝废水,有效去除了废水中的杂蛋白。
3)采用超氧化物歧化酶(SOD)分子印迹树脂,高选择性地从蒜片加工废水中吸附超氧化物歧化酶(SOD),与超滤膜分离(专利申请号200810159697.1)相比,实现了目标分离物与大蒜多糖等杂质的分离,有利于制得高纯度的大蒜超氧化物歧化酶(SOD)。
4)从蒜片加工废水中提取天然活性物质大蒜超氧化物歧化酶(SOD),降低了废水中的COD,通过后续深度处理,可使废水达标排放,实现了资源回收与废水治理的完美结合。
具体实施方式
实施例1:
以多个400目的不锈钢筛网为支撑材料,以200目的硅藻土为过滤介质,将硅藻土料液通过泵循环,预先在不锈钢筛网上均匀涂上5毫米厚的硅藻土过滤层,然后对10立方蒜片加工废水进行过滤,除去蒜片加工废水中的大颗粒杂质和胶体物质;对过滤后的蒜片加工废水打入反应釜,加热到75℃,加热时间20分钟,使蒜片加工废水中的杂蛋白变性絮凝,冷却至30℃,再经硅藻土挂膜过滤后,去除蒜片加工废水中的杂蛋白质;然后将蒜片加工废水经过滤澄清后,用泵打入装有1000公斤超氧化物歧化酶(SOD)分子印迹树脂的树脂柱,控制进样流速500立升/小时,选择性吸附废水中的大蒜超氧化物歧化酶(SOD),大蒜多糖等杂质随废水流出,实现了大蒜超氧化物歧化酶(SOD)与大蒜多糖等杂质的分离;超氧化物歧化酶(SOD)分子印迹树脂吸附饱和后,先用0.5立方去离子水冲洗树脂,然后用200公斤洗脱剂洗脱,控制洗脱流速100立升/小时,收集到含大蒜超氧化物歧化酶(SOD)的洗脱液250公斤;洗脱液经截留分子量20000的聚砜膜浓缩至固体质量百分比含量5%的大蒜超氧化物歧化酶(SOD)浓缩液50公斤;将质量百分比含量5%的大蒜超氧化物歧化酶(SOD)浓缩液,经-55℃的低温冷冻干燥10小时后,得到粉状大蒜超氧化物歧化酶(SOD)3公斤。
大蒜超氧化物歧化酶(SOD)提取率0.05%,大蒜超氧化物歧化酶(SOD)的酶比活性2670U/mg。
所述的超氧化物歧化酶(SOD)分子印迹树脂的合成方法如下:在装有搅拌器及温度计的的反应器中,将壳聚糖溶解在质量百分比浓度2%的乙酸溶液中,该乙酸溶液中壳聚糖的质量百分比含量为5%;加入超氧化物歧化酶,使超氧化物歧化酶在壳聚糖乙酸混合溶液中的质量百分比含量为5%;在上述混合液中加入液体石蜡,使液体石蜡与上述混合液的体积比为5∶3;常温下控速搅拌10min,然后升温60℃,滴加乙二醛,乙二醛的添加量为壳聚糖添加量的30%,反应0.5h;调节体系的pH=10,再加入环氧氯丙烷,环氧氯丙烷的添加量为壳聚糖添加量的20%,升温到70℃;之后用滴管缓慢滴加质量百分比浓度10%的NaOH水溶液,使溶液的pH始终保持在10左右,反应2h;过滤后依次经质量百分比浓度0.1%的盐酸溶液、质量百分比浓度0.1%的NaOH溶液、去离子水洗脱处理,制得对超氧化物歧化酶具有高选择性吸附的超氧化物歧化酶分子印迹树脂微球。
所述的洗脱剂为PH=8.0的磷酸盐溶液,该磷酸盐溶液由0.2mol/L磷酸氢二钠溶液、0.2mol/L磷酸二氢钠溶液以及0.2mol/L氯化钠溶液混合制备,各溶液的质量百分比含量如下:0.2mol/L磷酸氢二钠溶液85.2%;0.2mol/L磷酸二氢钠溶液4.8%;0.2mol/L氯化钠溶液10%。
实施例2:
以多个400目的不锈钢筛网为支撑材料,以200目的硅藻土为过滤介质,将硅藻土料液通过泵循环,预先在不锈钢筛网上均匀涂上10毫米厚的硅藻土过滤层,然后对10立方蒜片加工废水进行过滤,除去蒜片加工废水中的大颗粒杂质和胶体物质;对过滤后的蒜片加工废水打入反应釜,加热到65℃,加热时间15分钟,使蒜片加工废水中的杂蛋白变性絮凝,冷却至30℃,再经硅藻土挂膜过滤后,去除蒜片加工废水中的杂蛋白质;然后将蒜片加工废水经过滤澄清后,用泵打入装有1000公斤超氧化物歧化酶(SOD)分子印迹树脂的树脂柱,控制进样流速500立升/小时,选择性吸附废水中的大蒜超氧化物歧化酶(SOD),大蒜多糖等杂质随废水流出,实现了大蒜超氧化物歧化酶(SOD)与大蒜多糖等杂质的分离;超氧化物歧化酶(SOD)分子印迹树脂吸附饱和后,先用0.5立方去离子水冲洗树脂,然后用200公斤洗脱剂洗脱,控制洗脱流速100立升/小时,收集到含大蒜超氧化物歧化酶(SOD)的洗脱液250公斤;洗脱液经截留分子量20000的聚砜膜浓缩至固体质量百分比含量10%的大蒜超氧化物歧化酶(SOD)浓缩液50公斤;将质量百分比含量10%的大蒜超氧化物歧化酶(SOD)浓缩液,经-15℃的低温冷冻干燥14小时后,得到粉状大蒜超氧化物歧化酶(SOD)3公斤。
大蒜超氧化物歧化酶(SOD)提取率0.04%,大蒜超氧化物歧化酶(SOD)的酶比活性2860U/mg。
所述的超氧化物歧化酶(SOD)分子印迹树脂的合成方法如下:在装有搅拌器及温度计的的反应器中,将壳聚糖溶解在质量百分比浓度2%的乙酸溶液中,该乙酸溶液中壳聚糖的质量百分比含量为5%;加入超氧化物歧化酶,使超氧化物歧化酶在壳聚糖乙酸混合溶液中的质量百分比含量为5%;在上述混合液中加入液体石蜡,使液体石蜡与上述混合液的体积比为5∶3;常温下控速搅拌10min,然后升温60℃,滴加乙二醛,乙二醛的添加量为壳聚糖添加量的30%,反应0.5h;调节体系的pH=10,再加入环氧氯丙烷,环氧氯丙烷的添加量为壳聚糖添加量的20%,升温到70℃;之后用滴管缓慢滴加质量百分比浓度10%的NaOH水溶液,使溶液的pH始终保持在10左右,反应2h;过滤后依次经质量百分比浓度0.1%的盐酸溶液、质量百分比浓度0.1%的NaOH溶液、去离子水洗脱处理,制得对超氧化物歧化酶具有高选择性吸附的超氧化物歧化酶分子印迹树脂微球。
所述的洗脱剂为PH=8.0的磷酸盐溶液,该磷酸盐溶液由0.2mol/L磷酸氢二钠溶液、0.2mol/L磷酸二氢钠溶液以及0.2mol/L氯化钠溶液混合制备,各溶液的质量百分比含量如下:0.2mol/L磷酸氢二钠溶液85.2%;0.2mol/L磷酸二氢钠溶液4.8%;0.2mol/L氯化钠溶液10%。
实施例3:
以多个400目的不锈钢筛网为支撑材料,以200目的硅藻土为过滤介质,将硅藻土料液通过泵循环,预先在不锈钢筛网上均匀涂上8毫米厚的硅藻土过滤层,然后对10立方蒜片加工废水进行过滤,除去蒜片加工废水中的大颗粒杂质和胶体物质;对过滤后的蒜片加工废水打入反应釜,加热到70℃,加热时间18分钟,使蒜片加工废水中的杂蛋白变性絮凝,冷却至30℃,再经硅藻土挂膜过滤后,去除蒜片加工废水中的杂蛋白质;然后将蒜片加工废水经过滤澄清后,用泵打入装有1000公斤超氧化物歧化酶(SOD)分子印迹树脂的树脂柱,控制进样流速500立升/小时,选择性吸附废水中的大蒜超氧化物歧化酶(SOD),大蒜多糖等杂质随废水流出,实现了大蒜超氧化物歧化酶(SOD)与大蒜多糖等杂质的分离;超氧化物歧化酶(SOD)分子印迹树脂吸附饱和后,先用0.5立方去离子水冲洗树脂,然后用200公斤洗脱剂洗脱,控制洗脱流速100立升/小时,收集到含大蒜超氧化物歧化酶(SOD)的洗脱液250公斤;洗脱液经截留分子量20000的聚砜膜浓缩至固体质量百分比含量8%的大蒜超氧化物歧化酶(SOD)浓缩液50公斤;将质量百分比含量8%的大蒜超氧化物歧化酶(SOD)浓缩液,经-25℃的低温冷冻干燥12小时后,得到粉状大蒜超氧化物歧化酶(SOD)3公斤。
大蒜超氧化物歧化酶(SOD)提取率0.04%,大蒜超氧化物歧化酶(SOD)的酶比活性2800U/mg。
所述的超氧化物歧化酶(SOD)分子印迹树脂的合成方法如下:在装有搅拌器及温度计的的反应器中,将壳聚糖溶解在质量百分比浓度2%的乙酸溶液中,该乙酸溶液中壳聚糖的质量百分比含量为5%;加入超氧化物歧化酶,使超氧化物歧化酶在壳聚糖乙酸混合溶液中的质量百分比含量为5%;在上述混合液中加入液体石蜡,使液体石蜡与上述混合液的体积比为5∶3;常温下控速搅拌10min,然后升温60℃,滴加乙二醛,乙二醛的添加量为壳聚糖添加量的30%,反应0.5h;调节体系的pH=10,再加入环氧氯丙烷,环氧氯丙烷的添加量为壳聚糖添加量的20%,升温到70℃;之后用滴管缓慢滴加质量百分比浓度10%的NaOH水溶液,使溶液的pH始终保持在10左右,反应2h;过滤后依次经质量百分比浓度0.1%的盐酸溶液、质量百分比浓度0.1%的Na0H溶液、去离子水洗脱处理,制得对超氧化物歧化酶具有高选择性吸附的超氧化物歧化酶分子印迹树脂微球。
所述的洗脱剂为PH=8.0的磷酸盐溶液,该磷酸盐溶液由0.2mol/L磷酸氢二钠溶液、0.2mol/L磷酸二氢钠溶液以及0.2mol/L氯化钠溶液混合制备,各溶液的质量百分比含量如下:0.2mol/L磷酸氢二钠溶液85.2%;0.2mol/L磷酸二氢钠溶液4.8%;0.2mol/L氯化钠溶液10%。
Claims (3)
1.从蒜片加工废水中提取大蒜超氧化物歧化酶的方法,其特征在于该提取方法步骤如下:
A、硅藻土挂膜过滤:以多个400目的不锈钢筛网为支撑材料,以200目的硅藻土为过滤介质,将硅藻土料液通过泵循环,预先在不锈钢筛网上均匀涂上5~10毫米厚的硅藻土过滤层,然后对蒜片加工废水进行过滤,可除去蒜片加工废水中的大颗粒杂质和胶体物质;
B、加热除去杂蛋白质:对过滤后的蒜片加工废水加热到65℃~75℃,加热时间15~20分钟,使蒜片加工废水中的杂蛋白变性絮凝,冷却至30℃,再经硅藻土挂膜过滤后,去除蒜片加工废水中的杂蛋白质;
C、超氧化物歧化酶分子印迹树脂吸附:去除杂蛋白质的蒜片加工废水,经过滤澄清后,利用超氧化物歧化酶分子印迹树脂选择性吸附蒜片加工废水中的大蒜超氧化物歧化酶,实现与大蒜多糖等杂质的分离;
D、超氧化物歧化酶分子印迹树脂洗脱:超氧化物歧化酶分子印迹树脂吸附饱和后,用洗脱剂洗脱;
E、洗脱液浓缩:上述洗脱液经截留分子量20000的聚砜膜浓缩后,得到大蒜超氧化物歧化酶质量百分比浓度为5~10%的浓缩液;
F、冷冻干燥:将上述大蒜超氧化物歧化酶浓缩液经-55℃~-15℃的低温冷冻干燥10~14小时后得到大蒜超氧化物歧化酶干粉。
2.根据权利要求1所述的从蒜片加工废水中提取大蒜超氧化物歧化酶的方法,其特征在于所述的超氧化物歧化酶分子印迹树脂的合成方法如下:在装有搅拌器及温度计的的反应器中,将壳聚糖溶解在质量百分比浓度2%的乙酸溶液中,该乙酸溶液中壳聚糖的质量百分比含量为5%;加入超氧化物歧化酶,使超氧化物歧化酶在壳聚糖乙酸混合溶液中的质量百分比含量为5%;在上述混合液中加入液体石蜡,使液体石蜡与上述混合液的体积比为5∶3;常温下控速搅拌10min,然后升温60℃,滴加乙二醛,乙二醛的添加量为壳聚糖添加量的30%,反应0.5h;调节体系的pH=10,再加入环氧氯丙烷,环氧氯丙烷的添加量为壳聚糖添加量的20%,升温到70℃;之后用滴管缓慢滴加质量百分比浓度10%的NaOH水溶液,使溶液的pH始终保持在10左右,反应2h;过滤后依次经质量百分比浓度0.1%的盐酸溶液、质量百分比浓度0.1%的NaOH溶液、去离子水洗脱处理,制得对超氧化物歧化酶具有高选择性吸附的超氧化物歧化酶分子印迹树脂微球。
3.根据权利要求1所述的从蒜片加工废水中提取大蒜超氧化物歧化酶的方法,其特征在于所述的洗脱剂为PH=8.0的磷酸盐溶液,该磷酸盐溶液由0.2mol/L磷酸氢二钠溶液、0.2mol/L磷酸二氢钠溶液以及0.2mol/L氯化钠溶液混合制备,各溶液的质量百分比含量如下:0.2mol/L磷酸氢二钠溶液85.2%;0.2mol/L磷酸二氢钠溶液4.8%;0.2mol/L氯化钠溶液10%。
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