JPH04325092A - 核酸分離法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、各種の核酸を含む混合
液から、数種の核酸を同時に分離できる核酸分離法に関
する。本発明の核酸分離法は、遺伝子工学の分野におい
て、特に、各種一本鎖ＤＮＡの調製や一本鎖ＤＮＡライ
ブラリーの作成などに有効である。

【０００２】

【従来の技術】高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）用ビーズに固定化されたＤＮＡプローブで、試料核酸
混合液から１種類の一本鎖ＤＮＡを回収し、ついで、こ
の一本鎖ＤＮＡの特定領域にプライマーＤＮＡをつけ、
ＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ＤＮＡにすることに
より、目的遺伝子をクローニングする方法が提案されて
いる（鶴井博理ほか、細胞工学、Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．７
，１９８９）。しかしながら、この方法では、一度に１
種類の一本鎖ＤＮＡしか回収できないこと、二本鎖ＤＮ
Ａを作成する際、回収した一本鎖ＤＮＡの全領域を二本
鎖ＤＮＡにできないこと、プライマーＤＮＡの付着点以
降しか二本鎖ＤＮＡにならないこと、などの問題点があ
る。

【０００３】また、制限酵素処理等で得られた二本鎖Ｄ
ＮＡ断片をＭ１３ファージベクターにＤＮＡリガーゼを
用いて導入し、ついで大腸菌に形質転換した後、Ｍ１３
一本鎖ＤＮＡ分子の形態でＤＮＡを回収して一本鎖ＤＮ
Ａライブラリーとする方法が知られている。しかし、こ
の方法では、使用できるベクターが限られること、ベク
ターに組み込めるＤＮＡ断片の大きさが限られること、
すべてのＤＮＡが大腸菌に形質転換しているか不明なこ
と、などの問題がある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、各種
の核酸混合液から数種の特定の一本鎖核酸を一度に分離
・回収できる方法を提供することにある。本発明者らは
、前記従来技術の有する問題点を克服するために鋭意研
究した結果、物理的に分離可能な複数種類の支持体であ
って、各支持体上にそれぞれ塩基配列の異なる一本鎖核
酸を固定化したもの（複数種の固定化核酸）を用い、こ
れを試料核酸混合液と接触させて、各支持体上の一本鎖
核酸（固定化核酸）と試料溶液中のそれと相補的な塩基
配列を持つ一本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）とをハイブリ
ダイゼーションさせると、試料核酸混合液から一度に複
数の一本鎖核酸が分離できることを見出した。固定化核
酸とハイブリッドを形成した試料核酸混合液の一本鎖核
酸は、各支持体を分離した後、加熱やアルカリ処理によ
り再び一本鎖核酸として回収することができる。この方
法によれば、各支持体に塩基配列の異なる一本鎖核酸を
固定化した固定化核酸を用いるため、試料核酸混合液か
ら数種の一本鎖核酸を一度に回収することができる。

【０００５】また、試料核酸混合液中の目的の二本鎖Ｄ
ＮＡ断片を２つの一本鎖ＤＮＡとしてから、２種類の固
定化核酸を用いて、それぞれとハイブリッドを形成させ
て回収し、ついで回収した２つの一本鎖ＤＮＡをアニー
リングすれば、目的ＤＮＡ断片の全領域をカバーした二
本鎖ＤＮＡを得ることができる。さらに、種々のベクタ
ーＤＮＡに特異的塩基配列を有するＤＮＡを、ベクター
ＤＮＡの二本鎖のそれぞれについて、プローブＤＮＡと
して各支持体に固定化した固定化核酸を用いると、様々
なベクターに対して特異的な塩基配列を有する一本鎖Ｄ
ＮＡライブラリーを作成できるので、ベクターに組み込
めるＤＮＡ断片の大きさが限定されず、しかも数種のベ
クターについてＤＮＡ断片の導入、大腸菌への形質転換
を行なうことで、全てのＤＮＡが形質転換している可能
性を高めることができる。本発明は、これらの知見に基
づいて完成するに至ったものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】かくして、本発明によれ
ば、分離可能な複数種類の支持体の各々に塩基配列の異
なる一本鎖核酸を固定化して成る固定化核酸を試料核酸
混合液と接触させて、各固定化核酸と該混合液中のそれ
らに相補的な塩基配列を持つ一本鎖核酸とでハイブリッ
ドを形成させることを特徴とする核酸分離法が提供され
る。ハイブリッドを形成させた後、各支持体を分離し、
ついで前記相補的な塩基配列を持つ一本鎖核酸を分離・
回収することができる。以下、本発明について詳述する
。

【０００７】（支持体）本発明においては、分離可能な
複数種類の支持体を用いる。支持体の種類としては、以
下のものが例示できる。■天然または合成の有機化合物
の膜状のもの。具体例としては、ナイロンメンブラン、
ニトロセルロースメンブラン、ポリテトラフルオロエチ
レンメンブラン、ポリエチレンメンブラン、ポリイソプ
レンメンブラン、ポリスチレンメンブラン等、天然また
は合成有機高分子メンブラン（膜状体）を挙げることが
できる。ニトロセルロースルのように、有機高分子（例
；セルロース）を化学的に処理し、改質して得たメンブ
ランを含む。同様に、表面を核酸が結合しやすいように
、また、使用しやすいように加工（化学的、物理的）し
たものを含む。

【０００８】■天然または合成有機化合物の粒子状のも
の。具体例としては、ナイロン、ニトロセルロース、セ
ルロース、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン
、ポリイソプレン、ポリスチレン等の有機高分子粒子を
挙げることができる。これらの有機高分子粒子は、例え
ば酸化、還元、加水分解などの化学的処理、あるいは例
えばプラズマ照射などの物理的処理で改質したものを含
む。

【０００９】■無機化合物の膜状のもの。具体例として
は、グラファイト、多孔質ガラス、シリカ等の無機高分
子メンブラン；アルミニウム、アパタイト等の金属メン
ブラン；アルミナ、窒化珪素等のセラミックスメンブラ
ン；食塩等の結晶を挙げることができる。さらに、これ
らの表面を化学的、物理的に表面処理することで改質さ
れれたものも使用できる。■無機化合物の粒子状のもの
。具体例としては、グラファイト、多孔質ガラス、シリ
カ等の無機高分子粒子；アルミニウム、アパタイト等の
金属粒子；アルミナ等のセラミック粒子；等を挙げるこ
とができる。これらの無機化合物粒子は、例えばイオン
プレーティングなどの物理的、化学的に表面処理を行な
うことで改質されたものも使用できる。■ポリアクリル
アミド、アガロース等の性状がゲル状のもの。

【００１０】これら各種の支持体を分離可能とするには
、次のような方法が挙げられる。 ｉ）比重の異なる支持体を用い、ハイブリダイゼーショ
ン後、中間の比重をもつ溶液を加えて、重い支持体と軽
い支持体に分離する方法。 ｉｉ）複数の膜状支持体やそれぞれ粒径の異なる複数種
類の粒状支持体、あるいは膜状支持体と粒状支持体との
組み合わせなど、形状的に容易に分離可能なものを用い
て行なう方法。 ｉｉｉ）鉄等の磁石（または磁力）により回収できる支
持体と、磁石で回収できない支持体を用いて、磁石で分
離する方法。 ｉｖ）上記各種方法を適宜組み合わせた方法。 なお、本発明において、複数種類の支持体とは、材質が
同じ複数の膜状支持体や材質が同じで粒径の異なる粒状
支持体なども包含する。

【００１１】（支持体上への核酸の固定化法）支持体に
一本鎖核酸（以下、「一本鎖ＤＮＡ」と略記）を固定化
する方法としては、例えば、支持体とＤＮＡの親和力を
利用した非特異的吸着による方法、紫外線で活性化した
支持体にＤＮＡのアミノ基を共有結合させる方法など各
種の方法がある。本発明においては、各支持体上に一本
鎖ＤＮＡをその末端で固定化したものを使用することが
好ましい。一本鎖ＤＮＡとしては、その末端に１若しく
はそれ以上の余分のヌクレチオド分子を含んでいるか、
あるいは一本鎖ＤＮＡの末端にあるヌクレオチド分子が
化学的修飾を受けているものを用いれば、該余分のヌク
レオチドまたは化学的修飾を受けたヌクレオチドを介し
て支持体上への結合を行なうことができる。以下、支持
体上への一本鎖ＤＮＡの固定化法の具体例について、順
を追って詳細に説明する。

【００１２】一本鎖ＤＮＡの末端を化学的に修飾する場
合 １）まず、末端に固定化に適した官能基（例えば−ＮＨ
２、−ＣＯＯＨ）を導入した一本鎖ＤＮＡを調製する。 ＤＮＡを合成する場合、その合成自体は、市販のＤＮＡ
合成装置〔例えばＡｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ　　Ｉｎｃ．（以下、ＡＢＩ社と略記）製３９１型
ＰＣＲ−ＭＡＴＥなど〕を使用し、常法によって行なう
ことができる。官能基の導入は、例えば次のような方法
で行うことができる。

【００１３】■　　アミノリンク２（ＡＢＩ社製）の導
入以下の反応式にしたがい、ＤＮＡ合成装置を使って、
ヘキシルアミノ基をＤＮＡ末端に導入することができる
（ＡＢＩ社のＵｓｅｒ　　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，Ｎｏ．４
９，Ａｕｇｕｓｔ　　１９８８、参照）。

【００１４】

【化１】

【００１５】

【化２】 で示されるリンカーを、ＤＮＡ合成装置（ＡＢＩ社製、
Ａ−３９１ＥＰ　　ＰＣＲ−ＭＡＴＥなど）を用いてＤ
ＮＡ末端に導入し、これを処理することにより、このリ
ンカー末端を反応性のあるアルデヒド基またはカルボキ
シ基に導き、さらにアルデヒド基の場合は、ビオチンの
ヒドラシド化合物と反応させることにより、アビジンと
特異的に結合して複合体を形成し得るビオチンを導入す
ることができる（Ｊｏｎａｔｈａｎ　　Ｎ．Ｋｒｅｍｓ
ｋｙ　　ｅｔ　　ａｌ．，　　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　１９８７，Ｖｏｌ．１５，ｐ
．２８９１〜参照）。

【００１６】■　　ＤＮＡ合成装置を用い、アミノ基を
もつ塩基のヌクレオチド１〜数１０個を相補部分のＤＮ
Ａ末端に付加する。■　　ターミナルトランスフェラー
ゼにより、支持体との結合に適した塩基、またはその反
応性誘導体をＤＮＡ末端に導入する（Ｄｅｕｇ　　Ｇ．
ａｎｄ　　ＷｕＲ．，　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，　　Ｖｏｌ．１００，ｐ．９６
−１１６，１９８３、参照）。

【００１７】２）次に、１）で得た一本鎖ＤＮＡの相補
鎖を１）と同様の合成装置を用いて調製し、両者をアニ
ーリングさせて、二本鎖ＤＮＡとする。 ３）上で得た二本鎖ＤＮＡを含む溶液に固定化用支持体
を加え、両者を結合させる。ＤＮＡと支持体との結合法
は、ＤＮＡおよび支持体の両者の化学的修飾の種類によ
って異なり、例えば、次のような各種の方法を用いるこ
とができる。

【００１８】■　　ＤＮＡまたは支持体上の水酸基（主
としてジオール基）をトリフロオロエタンスルフォニル
クロライド（以下、トレシルクロライドと略記）（Ｋ．
Ｎｉｌｌｓｏｎ　　ａｎｄ　　Ｋ．Ｍｏｓｂａｃｈ，　
　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ
ｕｎ．，１０２，４４９，１９８１）、ＣＮＢｒ（Ｒ．
Ａｘｅｎ　　ｅｔ　　ａｌ．，　　Ｎａｔｕｒｅ，２１
４，１３０２，１９６７）、トリクロロトリアジン（Ｔ
．Ｈ．Ｆｉｎｌａｙ　　ｅｔ　　ａｌ．，　　Ａｎａｌ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８７，７７，１９７８）、エピク
ロロヒドリン（Ｉ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ　　ｅｔ　　ａ
ｌ．，　　Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８５，１０９１，１
９７９）、ビスオキシラン（Ｌ．Ｓｕｎｄｂｅｒｇ　　
ａｎｄ　　Ｊ．Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒ．，９０，８７，１９７４）、ジビニルスルホン酸（
Ｊ．Ｐｏｒａｔｈ，　　Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，
３４，２７，１９７４）、ベンゾキノン（Ｊ．Ｂｒａｎ
ｄｔ　　ｅｔ　　ａｌ．，　　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，３８６，１９６，１９７５）、
カルボニルジイミダゾール（Ｇ．Ｓ．Ｂｅｔｈｅｌｌ　
　ｅｔ　　ａｌ．，　　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２
５４，２５７２，１９７９）などで活性化し、支持体上
、またはＤＮＡの主としてアミノ基と結合させる。

【００１９】■　　ＤＮＡまたは支持体上の主としてカ
ルボキシル基（−ＣＯＯＨ基）を水溶性カルボジイミド
等のカルボジイミド（Ａ．Ｔｅｎｇｂｌａｄ，　　Ｂｉ
ｏｈｅｍ．Ｊ．，１９９，２９７，１９８１；Ｍ．Ｆｕ
ｎａｂａｓｈｉ　　ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．　　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．，１２６，４１４，１９８２）または２−エ
トキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキ
ノリン（ＥＥＤＱ）（Ｇ．Ｓａｃｃｏｍａｎｉ　　ｅｔ
　　ａｌ．，　　Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５６，１２
４０５，１９８１；Ｂ．Ｂｅｌｌｅｕａｕ　　ａｎｄ　
　Ｇ．　　Ｍａｌｅｋ，　　Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．，９０，１６５１，１９６８）で活性化し、支持上
またはＤＮＡの主としてアミノ基（−ＮＨ２　　）と縮
合結合させる。■　　従来の非特異的または末端とは限
らない状態で支持体に結合したＤＮＡに、所望のＤＮＡ
をＤＮＡリガーゼ（連結酵素）を用いて結合させる。

【００２０】■　　支持上およびＤＮＡのヒドラジド基
とアルデヒド基、またはヒドラジド基とカルボキシル基
を用いて結合させる。ヒドラジド基とアルデヒド基の場
合は、混合するとヒドラゾン結合を形成する。これを還
元操作を行うと共有結合化する（Ｊｏｎａｔｈａｎ　　
Ｎ．Ｋｒｅｍｓｋｙ　　ｅｔ　　ａｌ．，上掲文献参照
）。ヒドラジドとカルボキシル基の場合は、■のように
カルボジイミド等を用いる。■　　ＤＮＡおよび支持体
上に互いに親和力のある物質を導入し（例えば、ビオチ
ンとアビジン）、その親和力に基づいて固定化を行う（
Ｊｏｎａｔｈａｎ　　Ｎ．Ｋｒｅｍｓｋｙ　　ｅｔ　　
ａｌ．，上掲文献参照）。■　　ＤＮＡと支持体上のチ
オール基どうしを活性化、固定化する（Ｋ．Ｂｒｏｃｋ
ｌｅｈｕｒｓｔ　　ｅｔ　　ａｌ．，　　Ｂｉｏｃｈｍ
．Ｊ．，１３３，５７３，１９７３）。■　　ＤＮＡと
支持体上のアミノ基どうしをブリモアセタミド法にて結
合させる（Ｐ．Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ，　　Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４５，３０５９，１９７０）

【００２１】４）上で得た固定化二本鎖ＤＮＡを２．４
Ｍテトラエチルアンモニウムクロライド水溶液、適宜希
釈した１０×ＳＳＣ（１．５Ｍ　　ＮａＣｌおよび０．
１５Ｍクエン酸ナトリウム；ｐＨ７．０）、０．１〜２
Ｍ　　ＮＡＣｌ水溶液等の塩溶液中、熱（約４０℃以上
）またはアルカリを加えることにより変性させ、遠心し
て固相と液相を分離することにより、固定化一本鎖ＤＮ
Ａを得る。

【００２２】二本鎖ＤＮＡをそのまま、あるいは末端を
化学的に修飾して用いる場合 二本鎖ＤＮＡの一方の鎖に１若しくはそれ以上のヌクレ
チオド分子が付加した形の二本鎖ＤＮＡは、そのままあ
るいは化学的な修飾を施した後支持体に末端で結合させ
ることができるので、上記の工程３）以降の操作を施せ
ば、上と同様の目的を達成することができる。このよう
な二本鎖ＤＮＡは、次のようにして調製することができ
る。

【００２３】■　　ターミナルトランスフェラーゼを使
用して、片方のＤＮＡ鎖の末端にのみ支持体との結合に
適した塩基またはその反応性誘導体を導入する。■末端
に一本鎖部分ができるように制限酵素で切断する。■　
　官能基を持つＤＮＡ分子と、二本鎖ＤＮＡをＤＮＡリ
ガーゼにより結合させる。例えば、二本鎖ＤＮＡの両端
の切断端が異なる配列を持つように２種の制限酵素で処
理する。そこで、一方の切断端に特異的に結合できる配
列を有する官能基を有するＤＮＡを加え、そこにＤＮＡ
リガーゼを作用させることにより目的ＤＮＡ断片の末端
に官能基を導入できる。この場合、除去したい方の鎖の
５′末端を脱リン酸化しておいてもよい。即ち、目的と
する二本鎖ＤＮＡの一端だけが出た長い二本鎖ＤＮＡを
調製し、この状態で脱リン酸化酵素により５′末端を脱
リン酸化し、その後二本鎖ＤＮＡを切断して目的断片を
つくると一方の５′末端は脱リン酸化されたものができ
る。 ■　　二本鎖ＤＮＡの３′末端−ＯＨ基にトリクロロト
リアジン基を導入することでＯＨ基を活性化する。５′
末端−ＯＨ基には、■で述べた脱リン酸化を行い−ＯＨ
基を露出させトリクロロトリアジンを反応させて活性化
する。３′末端の−ＯＨ基と５′末端の−ＯＨ基では、
反応性が５′末端の方が良いため、５′末端−ＯＨ基を
特異的に活性化できる。

【００２４】（試料核酸混合液）試料核酸混合液は、次
のような各種の核酸を含有する溶液である。■　　細胞
から抽出された（天然の）２本鎖ＤＮＡ、およびこのＤ
ＮＡを制限酵素や物理的剪断力等で切断したもの、■　
　天然の１本鎖ＤＮＡ（上記■のＤＮＡを熱またはアル
カリ等で変性させたものも含む）、■　　ポリメラーゼ
チェーンリアクション（ＰＣＲ法）等でｉｎ　　ｖｉｔ
ｒｏで増幅された１本鎖または２本鎖ＤＮＡ、および該
２本鎖ＤＮＡを熱またはアルカリ等で変性させたもの、
■　　合成ＤＮＡ、■　　天然のＲＮＡ、■　　合成Ｒ
ＮＡ、■　　■〜■の任意の核酸の混合物。

【００２５】（核酸分離法）本発明の核酸分離法におい
ては、先ず、分離可能な複数種類の支持体の各々に塩基
配列の異なる一本鎖核酸を固定化したもの（固定化核酸
）を作成する。次いで、この固定化核酸を試料核酸混合
液と接触させて、各固定化核酸と該混合液中のそれらに
相補的な塩基配列を持つ一本鎖核酸とでそれぞれハイブ
リッドを形成させる。

【００２６】ハイブリダイゼーションは、公知の各種の
方法および反応条件を採用することができる。この場合
、固定化核酸として、その末端で支持体上に固定化され
ているものを用いると、固定化によるＤＮＡ塩基の破壊
がなく、液相中でのＤＮＡとほぼ同じ挙動が期待され、
相補的な塩基配列を有する核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）と効
率よく、かつ、完全にハイブリッドを形成させることが
可能である。したがって、試料核酸混合液から各固定化
一本鎖核酸に相補的な塩基配列を有する特定の一本鎖核
酸をそれぞれ分離することができる。固定化核酸とハイ
ブリッドを形成した試料核酸混合液からの一本鎖核酸は
、各支持体を分離した後、常法にしたがって加熱やアル
カリ処理することにより再び一本鎖核酸として回収する
ことができる。

【００２７】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明についてさらに
具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例にのみ
限定されるものではない。

【００２８】［実施例１］ １．固定化一本鎖ＤＮＡの調製 （１）以下の塩基配列を有する４種のＤＮＡをＤＮＡ合
成装置〔ＡＢＩ社の３９１　　ＥＰ　　ＰＣＲ−ＭＡＴ
Ｅ）にて合成し、ＨＰＬＣにて精製することで調製した
。

【００２９】配列はｐＵＣ１８ベクターのポリクローニ
ングサイトから２５塩基を選んで用いた。

【００３０】上記の各塩基配列は、５′末端から３′末
端方向に一本鎖で左から右へ記載した。なお、Ｘは、Ａ
ＢＩ社製のアミノリンク２であり、最終段階で５′末端
に導入した。１μＭスケールで合成し、各ＤＮＡは、精
製後１．３〜１．８ｍｇの範囲で回収された。

【００３１】（２）次に、以下の操作により、各支持体
上に一本鎖ＤＮＡ■および■をその末端で固定化した固
定化核酸を作成した。

【００３２】＜固定化ＤＮＡ（ａ）＞■および■のＤＮ
Ａをそれぞれ１００μｇ分とって減圧下で乾固した。次
に、■のＤＮＡ１００μｇを１Ｍ　　ＮａＣｌ（１００
μｌ）に溶かし、■のＤＮＡ１００μｇと混合した。こ
の溶液を９５℃の水浴上で２分間あたためた後、１時間
かけて３５℃にまで冷却した。ついで、０．４Ｍ　　Ｎ
ａＨＣＯ３　　（ｐＨ７．５）を１００μｌ加えた。

【００３３】これに、後に説明する方法で調製したトレ
シル活性化シリカゲル２０ｍｇを加え、室温で２４時間
反応させた。反応終了後、シリカゲルを１ＭＮａＣｌで
３回洗浄し、最後に、１Ｍ　　ＮａＣｌ　　１ｍｌに懸
濁した。これを９５℃で５分間加温し、直ちに１２００
０ｒｐｍで遠心し、上清を除去し、これを３回繰返して
、一本鎖ＤＮＡ■をシリカゲルに固定化した固定化ＤＮ
Ａ（ａ）を得た。

【００３４】＜固定化ＤＮＡ（ｂ）＞■および■のＤＮ
Ａをそれぞれ１００μｇ分とって減圧下で乾固した。次
に、■のＤＮＡ１００μｇを１Ｍ　　ＮａＣｌ　　１０
０μｌに溶かし、乾固した■のＤＮＡ１００μｇと混合
した。これを９５℃の水浴上で２分間あたため、１時間
かけて３５℃に冷却した。これに蒸留水１００μｌを加
えた。また、ＴＯＳＯＨ社製ＣＭ−５ＰＷ３０ｍｇを４
０ｍｇ　　ＷＳＣ（水溶性カルボジイミド：ＤＯＪＩＮ
社製）を溶かした５００μｌ　　ＨＣｌ水（ｐＨ４．０
）に加え、４℃で、２時間活性化した。

【００３５】その後、蒸留水で３回洗浄し、得たゲルを
前記核酸液と混合し、４℃で、５時間撹拌反応させた。 次いで、９５℃の水温で５分間加熱し、直ちに１２００
０ｒｐｍで遠心した後、上清を除去し、再び０．５Ｍ　
　ＮａＣｌに懸濁し、加熱（９５℃、５分間）、遠心（
１２０００ｒｐｍ）を３回繰り返して、一本鎖ＤＮＡ■
をＣＭ−５ＰＷに固定化した固定化ＤＮＡ（ｂ）を得た
。

【００３６】２．トレシル活性化シリカゲルの調製以下
の操作は、ドライボックスもしくは乾燥窒素を満たした
無菌パックなどを適宜利用し、水分の混入を防ぎながら
行なった。なお、シリカゲルを単にゲルと略称すること
がある。 １）アセトン、ピリジンを予めモレキュラーシーブで脱
水しておく。 ２）１ｍｌの脱水アセトン、１００μｌのピリジン、お
よび小さなスターラーチップを１０ｍｌのメスフラスコ
に入れておく。

【００３７】３）１ｇのゲルをガラスフィルター（＃５
メッシュ）上でアスピレーターで吸収しながら、アセト
ン、脱水アセトンで素早く洗浄し、直ちに２）で用意し
たメスフラスコに入れる。 ４）乾燥窒素で外気が混入しないようにしながら、スタ
ーラーでゲルを激しく撹拌しつつ、１００〜２００μｌ
のトレシルクロライド（Ｆｌｕｋａ社製）を１分ほどか
けて滴下する。この際、氷を詰めたビニール袋などでメ
スフラスコを０℃付近に保っておく。 ５）メスフラスコに蓋をし、ゲルを破砕させないように
スターラーの速度を落し２０分間反応させる。メスフラ
スコは０℃付近に保っておく。

【００３８】６）反応後、ガラスフィルター上に移し、
アセトン、アセトン＋５ｍＭ　　ＨＣｌ（１：１）およ
び５ｍＭ　　ＨＣｌで洗浄する。 ７）さらにアセトンで洗浄し、フィルター上で十分アセ
トンを揮散させる。 ８）ナスフラスコに移し、減圧下にアセトンを揮散させ
る。トレシルは高温では不安定なので、５）で用いた氷
入りビニールなどで低温に保ちつつ乾燥させると、トレ
シル化シリカゲルが得られる。

【００３９】３．サンプルの調製 市販のｐＵＣ１８ＤＮＡ（Ｔｋａｒａ酒造社製）１００
μｇを用い、以下の操作により試料核酸混合液を調製し
、固定化ＤＮＡ（ａ）および（ｂ）と接触させて、ハイ
ブリダイゼーション処理を行なった。（１）以下の組成
の液でＤＮＡを切断する。 　　　　ｐＵＣ１８（Ｔａｋａｒａ酒造製）（５００μ
ｇ／ｍｌ）　　　　２００μｌ　　　　Ｅｃｏ　　ＲＩ
（Ｔａｋａｒａ酒造製）（２０単位／ｍｌ）　　　　　
　２０μｌ　　　　Ｅｃｏ　　ＲＩ緩衝液（Ｔａｋａｒ
ａ酒造製）（×１０倍濃度）　　５０μｌ　　　　滅菌
蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
３０μｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　合計　　５００μｌ３７℃で１時
間反応させた後、０．５Ｍ　　エチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ；ｐＨ８．０）を１０μｌ加え反応を停止す
る。

【００４０】（２）（１）の反応液に５Ｍ酢酸ナトリウ
ム５０μｌを加え、さらにエタノールを１ｍｌ加え、−
８０℃で２０分間放置する。 （３）４℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する
。 （４）上清を除去し、−２０℃で冷却した７０％エタノ
ールで沈殿を洗浄し、４℃、１２０００ｒｐｍで３０秒
間遠心した後、上清を除去する。 （５）デシケーター中で減圧乾燥する。

【００４１】（６）２．４Ｍテトラエチルアンモニウム
クロライド（ＴＥＡＣｌ）（和光純薬社製）２００μｌ
を加え、よく溶かし、７５℃、５分間放置する。 （７）先に調製した２種の固定化ＤＮＡ（ａ）および（
ｂ）を全量加え、よく撹拌し、２０℃で１５分間放置す
る。 （８）１２０００ｒｐｍで遠心し、上清を別のエッペン
ドルフチューブに移す。 （９）２．４Ｍ　　ＴＥＡＣｌを２００μｌ加え、よく
撹拌し、１２０００ｒｐｍで、数秒間遠心してゲルを沈
殿させ、上清を除去する。

【００４２】（１０）２．４Ｍ　　ＴＥＡＣｌを２００
μｌ加え、そこに比重を１．５に合わせたテトラブロム
エタン／クロロホルムを３００μｌ加え、６０００ｒｐ
ｍで数秒間遠心する。 （１１）分離したゲル（各支持体）をそれぞれ回収する
。 （１２）ゲルを２．４Ｍ　　ＴＥＡＣｌ　　１００μｌ
に各々懸濁する。 （１３）７０℃で１０分間保持し、ハイブリッドしたＤ
ＮＡを液相に溶出させ、液相（サンプルＤＮＡ液）を回
収する。

【００４３】４．回収ＤＮＡの検定 以下の操作により、前項で試料核酸混合液から回収した
一本鎖ＤＮＡの検定を行なった。 （１）２０×ＳＳＰＥ溶液１０ｍｌで濾紙（５．５×５
．５ｃｍ）を湿らせる。 　　＜２０×ＳＳＰＥ溶液＞ 　　　　　　ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１７
４ｇ　　　　　　ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３１．２ｇ　
　　　　　ＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　７．４ｇを８００ｍｌ
の水に溶かし、ＮａＯＨでｐＨ７．４とした後、１リッ
トルにし、オートクレーブ滅菌したもの。

【００４４】（２）（１）の濾紙を９６穴のミニホール
ド装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）に配置する。 （３）５×５ｃｍのＢＩＯＤＹＮＥメンブラン（ＰＡＬ
Ｌ社製）を滅菌水で湿らせた後、２０×ＳＳＰＥに付け
る。その後、ミニホールド装置に装着する。 （４）一度、２０×ＳＳＰＥでミニホールドの各ウェル
を洗浄する。 （５）サンプルＤＮＡ液を各々２ウェルづつ各５μｌづ
つミニホールドのウェルに加える。

【００４５】（６）吸引してＤＮＡをメンブランに吸着
させる。 （７）メンブランを外し、２回２０×ＳＳＰＥで洗浄す
る。 （８）８０℃で真空乾燥し、その後、２つに切る（２ス
ポット）。以下、２枚になったメンブランについて、各
々以下の処理を行なう。 （９）メンブランを２×ＳＳＰＥに浸す。

【００４６】（１０）メンブランを０．５ｍｌハイブリ
ダイゼーション液に浸し、６５℃で２時間保持する。 　　　　＜ハイブリダイゼーション液＞　　　　　　２
０×ＳＳＰＥ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　１５ｍｌ　　　　　　
５０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　２ｍｌ　　　　　　１０％ＳＤ
Ｓ（ドデシル硫酸ナトリウム）　　　　　　　　２．５
ｍｌ　　　　　　１０μｇ／ｍｌ　　サケ精子ＤＮＡ　
　　　　　　　　　　　　　　　０．５ｍｌ　　　　　
　滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０ｍｌ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　合計　　　　　　　　
　　５０ｍｌ

【００４７】（１１）液を捨て、新しく１
２．５ｍｌのハイブリダイゼーション液を加え、そこに
後で述べる一方には（Ａ）、もう一方には（Ｂ）の３２
ＰラベルされたＤＮＡプローブを各５０μｌ加えて、６
５℃で一晩反応させる。 （１２）６５℃に保温した０．２×ＳＳＰＥ、０．１％
ＳＤＳ緩衝液で、１５分間、４回洗浄する。 （１３）メンブランをポリ塩化ビニリデンフィルムの上
に載せる。 （１４）Ｘ線フィルムを挟み、−８０℃で一晩感光する
。

【００４８】（１５）フィルムを現像し、陽性または陰
性を検出する。２つの分画ＤＮＡの分析結果は、それぞ
れの固定化ＤＮＡに相補的な塩基配列を有するＤＮＡが
回収できていることを示している。

【００４９】５．ＤＮＡプローブの作製下記の操作によ
り、ＤＮＡプローブ（Ａ）および（Ｂ）を作成した。 （１）下記■と■のＤＮＡをＡＢＩ社製ＤＮＡ合成装置
３９１　　ＥＰ　　ＰＣＲ−ＭＡＴＥを用いて合成し、
ＡＢＩ社の方法で精製した。 ■　　ＴＧＣ　　ＡＧＧ　　ＣＡＴ　　ＧＣＡ　　ＡＧ
Ｃ　　ＴＴＧ　　ＧＣＡ　　ＣＴＧ　　Ｇ■　　ＣＣＡ
　　ＧＴＧ　　ＣＣＡ　　ＡＧＣ　　ＴＴＧ　　ＣＡＴ
　　ＧＣＣ　　ＴＧＣ　　Ａなお、上記の各塩基配列は
、５′末端から３′末端方向に一本鎖で左から右へ記載
した。 （２）精製した■と■のＤＮＡをそれぞれ滅菌水に溶か
し、分光光度計で２６０ｎｍの吸光で濃度を測定し、滅
菌水で希釈して１０ｐｍｏｌｅ／μｌにする。

【００５０】（３）以下の組成の溶液で■と■の各ＤＮ
Ａの５′末端をラベル化（γ−３２Ｐで標識）する。 　　　　ＤＮＡ（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ）　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０μｌ
　　　　１０×バクテリオファージＴ４ポリヌクレオチ
ド　　　　　　キナーゼ緩衝液　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　２．０μｌ　　　　［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（ｓ
ｐ．ａｃｔ．５０００Ｃｉ／　　　　　　ｍｍｏｌｅ；
１０ｍＣｉ／ｍｌ水溶液）（１０ｐｍｏｌｅ）５．０μ
ｌ　　　　水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　１１．０μｌ　　　　＜１０×バクテ
リオファージＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液＞　
　　　　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）０．５Ｍ　
　　　　　ＭｇＣｌ２　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１Ｍ　　
　　　　ジチオトレイトール（ＤＴＴ）　　　　　　　
　　　　　　　５０ｍＭ　　　　　　スペルミジンＨＣ
ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１ｍＭ　　　　　　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｍＭ

【００
５１】（４）８単位のバクテリオファージＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼを加え、３７℃で４５分間放置する。 （５）６８℃、１０分間で反応を停止する。 （６）４０μｌの滅菌水を加え、よく混合する。 （７）２４０μｌの５Ｍ酢酸ナトリウムを加え、よく混
合する。 （８）７５０μｌの−２０℃エタノールを加え、０℃に
３０分間放置する。 （９）０℃、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心する。 （１０）５００μｌ　　８０％エタノールを加え、撹拌
し、０℃、１２０００ｒｐｍで１分間遠心し、上清を除
去する。

【００５２】（１１）１００μｌのＴＥ（ｐＨ７．６）
緩衝液を加え、よく溶かす。 ＜ＴＥ＞ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）　　　　　　１０ｍＭ
ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１ｍＭ液体シンチレーションカウン
ターで比放射活性を測定すると、２５４０Ｃｉ／ｍｍｏ
ｌｅであった。このようにして、ＤＮＡ■を標識したＤ
ＮＡプローブ（Ａ）およびＤＮＡ■を標識したＤＮＡプ
ローブ（Ｂ）を作成した。

【００５３】

【発明の効果】本発明の方法により、一度に様々な種類
の一本鎖ＤＮＡを簡単に調製でき、一本鎖ＤＮＡを用い
るサンガー法のＤＮＡシークエンスサンプルの調製に有
用である。従来のＭ１３ファージ系でしか作れなかった
一本鎖ＤＮＡライブラリーをどのようなサイズでもすぐ
に作れる。しかも、二本鎖ＤＮＡのライブラリーから作
ることができる。

【００５４】従来の固定化プローブによるクローニング
法と異なり、ＤＮＡ（核酸）断片全領域をカバーする断
片クローニングができる。つまり、目的断片の２本鎖Ｄ
ＮＡを各々２種の分離可能な固定化プローブで回収した
後、アニーリングすることで目的断片全領域を高効率で
クローニングできる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　分離可能な複数種類の支持体の各々に
   塩基配列の異なる一本鎖核酸を固定化して成る固定化核
   酸を試料核酸混合液と接触させて、各固定化核酸と該混
   合液中のそれらに相補的な塩基配列を持つ一本鎖核酸と
   でハイブリッドを形成させることを特徴とする核酸分離
   法。
2. 【請求項２】　　ハイブリッドを形成させた後、各支持
   体を分離し、ついで前記相補的な塩基配列を持つ一本鎖
   核酸を分離・回収する請求項１記載の核酸分離法。