JP2609317B2 - Ｄｎａフラグメントの伸長及び標識化方法 - Google Patents

Ｄｎａフラグメントの伸長及び標識化方法

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、検出のための核酸フラグメントの標識化方
法に関する。
〔背 景〕
現在、生物学は、多くの点で、蛋白質および核酸科学
といえる。核酸は、全ての生体中に見い出される。それ
ぞれの種または宿主には、特定の宿主の遺伝子型および
表現型を与える独自の核酸配列が存在する。多くの場合
に、大多数の系統は、他の系統または種と異なるような
共通の核酸配列を共有するので、それらのあるもので特
定の系統だけを検出することはできないが、必要によ
り、亜種、種または属を検出することはできる。その
上、そのものは特定の遺伝子が発現されているか否か、
１以上の対立遺伝子が存在するか否かおよび発現の程度
がどうであるか等を決定するようなRNAまたはDNA間の識
別をすることができる。Ｂ細胞およびＴ細胞のような細
胞がゲノム再配列物を含む場合、その核酸配列は、プロ
ーブを利用することにより前述の再配列物の有無を検出
することができる。従って、特定の核酸配列の検出は、
疾病状態の診断、セットもしくはサブセット細胞の存
在、細菌もしくは原生生物もしくはウイルスなどのよう
な特定の病原体の種もしくは株の検出にとって有力な手
段である。
配列の検出および同定は、また、分子生物学分野で重
要である。従って、プローブの使用は、構造遺伝子、調
節配列、イントロン、エキソン、リーダー配列ならびに
翻訳されるものおよび翻訳されないもののいかんを問わ
ず、いろいろな目的配列の検出を可能にする。
また、遺伝子工学の分野では配列の検出に実質的な目
的が存在する。転写程度のモニター、完全な状態の構造
物の検出、変異もしくは切除の程度のモニターまたはマ
ッピングなどは、核酸のスクリーニングおよび検出の機
会をも与える。
多くの場合、目的の配列は、核酸の総量が単に非常に
小さな分画として、そして／または非常に少量、例え
ば、アト（10-18）モル量で存在している可能性があ
る。さらに、目的の配列は、その配列と実質的に相同性
を有する多くの配列を伴っているかも知れない。従っ
て、さらに目的の配列の有効濃度を限定し得る好ましく
ないヘテロ二重鎖が存在しないことを確認するにはかな
り高い厳密性が要求されるであろう。
その上、同一または類似配列がいろいろな大きさの核
酸フラグメント上に発現する可能性があり、特定の大き
さの断片上でのある配列の発現は特定の表現型の存在と
相関し得る。
また、技術者に要求される時間およびエネルギーの極
小化ならびに手動操作に帰因する誤差を極小化するよう
に、自動化することができる分析系の開発にも興味が存
在する。ほとんどの系では、配列の検出を可能にする目
的で試料が標識されている。標識することは、放射性ヌ
クレオチド三リン酸を用いるニック・トランスレーショ
ンのように時間がかかりそして標識の種類を限定する可
能性がある。別の場合にも、ターミナルデオキシトラン
スフェラーゼを使用するときのように、特定の種類の標
識に限定され得る。他の方法は、一貫性のない置換をも
たらす。従って、標識成分が市場で入手可能であり、そ
して必要であるとすれば、試料を標識するために用いら
れる技術的熟練度の必要性が少ないような、核酸試料の
迅速かつ簡潔で制御された標識方法に対する要望が存在
する。
〔関連した文献〕
ケンプ（Kempe）ら、Nucl.Acids Res.（1985）13:45
〜57ページは、リガーゼによってDNA断片とビオチン化
オリゴヌクレオチドの連結を記載する。ゲンパー（Gamp
er）ら、Nucl.Acids Res.（1985）14:9943〜9954ページ
は、ハイブリッド化および光化学的架橋が生じる場合の
標的DNAを標識するプローブとしてプソラレンで機能化
したオリゴマーを利用している。ザポルスキー（Zapols
ki）ら、Electrophoresis（1987）８:255〜261ページ
は、自動的なサザーン型の核酸ハイブリッド化分析用の
自動装置を検討している。ゴールドコーン（Goldkorn）
およびプロコップ（Prockop）、Nucl.Acids Res.（198
6）14:9171〜9191ページは、ハイブリッド化制限分析用
のセルロース系担体にDNAプローブを共有結合せしめる
方法を記載する。シバネン（Syvanen）ら、Nucl.Acids
Res.（1986）14:5037〜5048は、アフィニティー塩基ハ
イブリッドコレクションにより核酸ハイブリッドを修飾
している。フォースター（Forster）ら、Nucl.Acids Re
s.（1985）13:745〜761ページは、ビオチンと核酸を光
化学的に共有結合標識している。
〔発明の要約〕
二重鎖DNA（「dsDNA」という）フラグメントを、標識
される前記二重鎖DNAフラグメントの少なくとも一の末
端と相補的な末端を有し、検出し得る二重鎖核酸で標識
する。標識二重鎖配列は、その後検出するかまたは単離
することができる標識または配列のいずれかが含まれ
る。標識化反応は、相補的末端どうしを連結するリガー
ゼ、ならびにDNAフラグメント上に相補的末端を供給
し、かつ相互にそれらのフラグメントの意図しない連結
を防ぐ制限酵素を使用して行われる。前記dsDNAへの核
酸標識セグメントの結合は、制限酵素の認識配列の欠損
をもたらす。
〔具体的な態様の記述〕
本発明の方法は、試料中の核酸フラグメントを標識す
るために提供される。この方法は、制限酵素の存在下で
前記フラグメント上に標識を連結することを含み、そし
てこの連結は制限酵素の認識配列の欠損をもたらす。
本発明の方法は、多種多様な態様での使用が見い出さ
れる。一の適用例は、DNA試料の検出に用いるものであ
って、固体支持体に標識した試料の核酸配列を連結する
ために役立つようにプローブが標識されるものである。
他の態様は、制限配列に特定の配列を付加する場合であ
って制限配列のオリゴメリ化を防ぎ、同時に目的の配列
を含有する実質的に化学量論的量の前記成分を使用する
ものである。前記配列は、鋳型もしくはプロモーターで
配列、検出用もしくはDNAの増幅系で使用されるよう
な、例えばポリメラーゼ連鎖反応における使用などを目
的とする特殊な配列であることができる。
他の使用は、制限部位を除去すると同時に、その末端
の性質を変化せしめるものである。この標識方法は、ま
た、DNA領域をマッピングするために大きさが調整され
そして検出され得るDNA制限フラグメントを標識するた
めにも有用である。
通常、用いられる試料は、複数の異なる制限フラグメ
ント、一般に少なくとも２種のフラグメントを、より一
般的には５種以上のフラグメントを含むゲノムまたはcD
NAであり、また、50個以上または数千もしくは数万のフ
ラグメントであってもよい。制限酵素と組み合わせてリ
ガーゼを使用し、リガンドで二重鎖DNAを標識するため
の前記方法は、非常に普遍的であり、dsDNAにリガンド
を共有結合する必要があるときは、すべての方法に使用
することができる。リガンドとは、関連のある全ての成
分を意図し、検出に使用できる標識、目的の機能を提供
する核酸配列、カップリング分子などであってもよい。
本明細書では、前述のような配列に対するプローブを使
用して、特定の核酸配列を検出するためのアッセイに、
前述の標識方法がどのように適用されるかが記載され
る。種々の色または蛍光発光波長を有する種々の検出可
能な標識の使用は、大きさの標準および同一もしくは異
なる制限酵素により切断されるような他の１種（もしく
は１種を越える）の試料に結合される一の色を使用する
ことにより、高い効率で生ずるマッピングを可能にす
る。従って、この連結反応／制限標識化方法は、以下の
いずれかの鎖長分析用の標識フラグメントの調製に有用
である。
他方、同じ連結反応／制限標識化方法を使用して検出
される成分を付加する代りに、DNAフラグメントの末端
に与えたオリゴヌクレオチド配列またはその配列鎖を付
加することができる。かかるオリゴヌクレオチド配列
は、例えば、挿入DNAフラグメントを転写または再生す
るためのプライマー配列のように、非常に役立つことが
判明するであろう。かかる態様では、DNAフラグメント
をプライマーに連結することができ、次いでポリメラー
ゼ連鎖反応により増幅することができる〔Saikiら、Sci
ence（1985）230:1350ページ〕。これらの付加した特定
の配列領域は、また、挿入フラグメントの固定または引
き抜きに使用されるプローブに対する標的配列としても
使用することができる。このものおよび他のすべての実
施例の連結反応／制限方法において添加される連結した
二重鎖フラグメントは、有機化学的に、酵素的に、生物
学的にまたはそれらの組み合わせ方法で合成され得る。
本発明の方法の使用は、第一に診断系において説明さ
れ、そこではDNA試料をエンドヌクレアーゼ開裂（制限
反応）を用いてフラグメント化し、次いで標識される。
試料源としては、核酸を含んでなるいずれの材料また
は物質であってもよい。核酸は、天然の核酸である必要
はなく、化学的、酵素的または生物学的に合成されたも
のであってもよく、さらに天然のプリンおよびピリミジ
ン以外のものを含んでいてもよい。試料源は、細胞質ま
たは非細胞質であってもよく、臨床試料または単離物で
あってもよく、それらの生理媒体（例えば、血液、血
清、血漿、便通、膿、擦過洗液もしくは尿など）であっ
てもよく、さらに、新生物細胞、リンパ球（例えば、Ｔ
細胞もしくはＢ細胞）、単球、好中球のようなセットも
しくはサブセット細胞、あるいはウイルス、細菌、マイ
コプラズマ、カビ、原生生物などを含む病原体であって
もよく、また、プラスミド、ウイルスまたはDNAもしく
はRNAフラグメントなどを含む構成物が包含され得る。
核酸試料には、染色体もしくは染色体外に存在し得るDN
A、例えば、プラスミド、ウイルス、もしくは合成構成
物など、またはdsDNAに転写されるRNA、例えば、メッセ
ンジャーRNA、転移RNA、リボソームRNA、もしくはウイ
ルスが包含され得る。核酸配列には、構造遺伝子、翻訳
されない領域、調節領域、イントロンまたはエキソンな
どが包含され得る。
この測定は、多様な目的に向けることができる。測定
には、植物または動物の疾病状態の診断、例えば、新生
もしくは異所性の細胞状態、セットもしくはサブセット
細胞、例えば、分化のいろいろな段階における白血球の
測定、病原体の種もしくは株の測定、および遺伝子工学
のモニターなどが包含される。本発明で試料を使用する
前に、その試料を種々の化学的または物理的処理、例え
ば、タンパク質の加水分解、抽出、沈澱、他成分（例え
ば、脂質、または蛋白質など）からの核酸の分離、RNA
の加水分解、ヌクレアーゼの不活化、濃縮、クロマトグ
ラフィー、脱水、加熱など、にかけてもよい。試料は、
種々の目的、例えば、妨害物の除去、貯蔵もしくは輸
送、濃縮など、に応じて処理してもよい。
通常、組成物は、制限酵素を利用してフラグメント化
される。この制限酵素は、一般に４〜8bpの認識部位を
有するその部位を開裂する。ここでは、試料の性質に応
じて１種以上の制限酵素を利用することができ、フラグ
メントは50bp〜200kbpまたはそれ以上、より一般的には
約0.5〜25kbpの多様なものが供給され得る。３′または
５′のいずれかに張り出すフラッシュ末端または付着端
をもたらすような種々の制限酵素を使用することができ
る。あるい状況下では，連結用の特異的部位として付着
端の存在が望まれるかも知れない。ある状況下では２種
以外の酵素が使用され得るとはいえ、殆んどただ１種の
制限酵素が使用されるだろう。
ある場合には、メッセンジャーRNAの逆転転写産物を
試料は含む可能性があり、そのときは、相対的に小さな
DNAおよびRNA配列が混合物に存在し得る。必要に応じ
て、このRNAを加水分解してDNA配列だけを残こしてもよ
い。こうして、混合物は、単に一重鎖DNA成分だけを有
することになる。この一重鎖DNAは、その後DNAポリメラ
ーゼのような酵素を用いてdsDNAに転化することができ
る。
試料が、消化または適当な方法で処理され目的の末端
を供給すると、dsDNAは標識することができる。末端お
よびすぐ隣接するヌクレオチド類以外の配列の選択は、
一般に、恣意的であり得る。制限エンドヌクレアーゼ認
識部位（例えば、相補ブラント末端、付着端または突出
部分）の部分以外の標識成分は、通常、少なくとも３個
の塩基対（bp）および50個以上、より一般的には約200b
p未満かそれ以上を有するであろう。標識成分の末端
は、リン酸が欠損している可能性があるので、標識成分
はオリゴメリ化ができず、リン酸化した試料についてだ
け連結能が存在する。
標識には、相補末端を有する種々の成分を使用するこ
とができ、例えば、短い二重鎖配列、より具体的には、
二重鎖に連結しかつ一の鎖または両方の鎖のいずれかに
標識するように、制限酵素により生ずる付着端またはブ
ラント末端のいずれかの末端を有する分子を使用するこ
とができる。この二重鎖配列は、一対のオリゴヌクレオ
チドのハイブリッド化から、配列内部に相補性を有する
一本鎖オリゴヌクレオチド配列のスナップ・バック（sn
ap−back）またはヘアーピン構造から、または相互に隣
接して位置し、そして前述のような二重鎖を創製するよ
うに相互に交差するような直線状で相互にハイブリッド
する３つ以上のオリゴヌクレオチドのハイブリッドから
でさえも創製することができる。これらの二重鎖配列
は、また、それら自体が制限フラグメントであるか、ま
たは配列としての必要な条件を満たしそして標識されて
いる末端に付着端が存在する末端を有する誘導した制限
フラグメントであってもよい。制限酵素の存在下で標識
成分の連結反応を実施することにより、標識成分が過剰
になることを避けることができる。
一般に、標識組成物は、１〜３本のオリゴヌクレオチ
ド鎖を有する。前述のごとく、殆んどは二本鎖である。
しかしながら、三本鎖が、一定の適合性を提供し、制限
酵素消化が３′に突出部をもたらす場合には特殊な用途
が見い出される可能性がある。三本鎖のうち、１本は鎖
の架橋に利用し、そして２本の残りの鎖は、１本が架橋
鎖（標識鎖）の３′端に近いほうでそして他の１本が架
橋鎖（アダプター鎖）の５′端に近いほうで、架橋鎖の
隣接部とそれぞれハイブリッドする。この標識鎖は、標
識または目的の配列（例えば、プロモーター）を供給
し、前記アダプター鎖は、通常、同じ５′−３′方向を
有するフラグメント鎖にその他端で隣接するであろう。
このアダプター鎖は、リン酸化されているその５′端
を有し、目的とする制限酵素の認識部位を破壊するのに
必要な特殊な配列を含むにちがいない。リガーゼの導入
により、前記標識鎖は、そのアダプター鎖および前記フ
ラグメントに対するアダプターに連結されるようにな
る。
三本鎖を使用することによって、核制限部位に対して
一本の鎖を変化させるだけでよい実質的に万能型の配列
を得ることができる。このように、標識鎖を変えずに相
補末端を提供するのに関与するアダプター鎖のみを変化
させればよい。架橋鎖にハイブリダイズするアダプター
鎖は、アダプター鎖が突出部であるかまたは架橋鎖が突
出部である付着末端を、或いはフラッシュ末端を提供す
ることで、フラグメントへの連結を提供することができ
る。
以下に示される具体例では、核酸試料に添加される、
少なくとも１つの標識（ここでは染料）を含む２つのオ
リゴヌクレオチドが合成される。この例では、５′の突
出付着端を伴うフラグメントを調製する目的で制限酵素
Hind IIIが使用された。
前記オリゴヌクレオチドは、相互に相補的になるよう
に、そして相互にハイブリッドする場合には、標識され
る試料核酸フラグメントの付着端に対して相補的な突出
端を有するように合成される。他方、合成オリゴヌクレ
オチドは、フリッシュ末端フラグメントに連結し得るこ
とでハイブリッドする場合には、フラッシュ末端を有し
てもよい。従って、連結酵素が添加された場合には、試
料核酸フラグメントに標識オリゴヌクレオチドが共有結
合することになる。
前述の例におけるオリゴヌクレオチド配列は、正しい
連結が生じた後、前記酵素の認識部位が破壊されるよう
に選ばれた。この選択は、連結標識を使用する上で特殊
な利点を提供する。すなわち、連結反応の間に認識制限
酵素が存在しそして機能し得るならば、試料核酸同士の
連結はすべて再切断される。この特性は、２つの主要な
利点を与える。第１点は、同一容器中で制限活性および
連結標識化を同時に生じさせるので取扱いや操作を最小
限にできること、そして第２点は、試料核酸同士の連結
を防止するために標識部分を大過剰に使用する必要がな
くなることである。例に示した標識は、合成オリゴヌク
レオチドが開裂制限酵素部位に連結され得る場合には、
すべての制限酵素に普遍化でき、 そしてこのオリゴヌクレオチドは、その酵素の認識部位
が破壊されている配列を含む。かかる配列は、１個の塩
基の変化、例えば、シトシンからチミジンを伴うか、あ
るいは、おそらく５−メチルシトシンもしくは３−メチ
ルアデノシンのような誘導した塩基で置換するか、また
はイノシン様アナログの置換による変化であってもよ
い。
前記および下記の例では、特定の認識配列において核
酸鎖を切断するために制限酵素が使用されるが、天然の
アナログ、金属イオン複合体およびペプチドフラグメン
トなど配列特異的DNA開裂分子をも使用することができ
る〔例えば、MoserおよびDervan,Science（1987）238:6
45〜650ページ、参照〕。
標識化は、直接的である必要はなく、間接的であって
もよい。すなわち、前記核酸配列は、その後、検出可能
なシグナルまたは他の望ましい性質を供給し得る第２の
分子に結合し得る分子により変性されていてもよい。例
えば、核酸配列はビオチンで変性され、続いてこの核酸
配列は、種々の検出可能な標識に対して接合され得るア
ビジンまたはストレプトアビジンと組み合わされてもよ
い。他方、前記リガンドに対するそれらの天然の受容体
または特異的免疫グロブリンとの接合では、ビオチン以
外の種々のリガンドを使用してもよい。
多種多様な検出できる標識、特に、簡潔な検出を可能
とするものが使用され得る。検出は、結果物として、電
子磁気照射、例えば、紫外部もしくは可視領域の吸収、
蛍光、または化学発光、あるいは検出し得る生成物もし
くは検出し得る基質の分解を惹起する酵素、安定フリー
ラジカルなどであってもよい。これらの性質を示す種々
の分子が、個々の標識の状態に応じて、直接的または間
接的ないずれかの常法に従い前記配列に結合され得る。
検出し得る標識としては、種々の放射活性元素（例え
ば、32P,127I,14C,3H,35S）が使用でき；蛍光体（例え
ば、フルオレセイン、ローダミン、フィコビリタンパ
ク、希土類キレート、これらの誘導体など）であって、
この蛍光体は、単独分子またはタンデム（tandem）にお
いて核酸もしくは非−（核酸骨格）と結合しているもの
であってもよく；酵素（例えば、ワサビペルオキシダー
ゼ、それ自体またはグルコースオキシダーゼ、キサンチ
ンオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、もしくは
グルコース−６−フォスフェートデヒドロゲナーゼなど
との組み合せ物）、そして一般に、蛍光または光吸収生
成物を生成する基質と反応する酵素を利用したもの；特
異的バインディング成分−受容体対の構成成分（例え
ば、ビオチン−アビジンもしくはストレプトアビジン、
または相補的核酸配列）；ならびに検出用として提供さ
れ本発明において使用し得る他のすべての標識を挙げる
ことができる。
以下の実施例は、本発明を具体的に説明するためのも
のであって、限定するためのものでない。
〔実施例〕
例1. リガンドビオチンによるプローブ標識化への連結
反応の使用 1. 構造ＩおよびIIを有するオリゴデオキシヌクレオチ
ドは、製造業者の指示に従って、アプライド・ビオシス
テム・モデル381A DNAシンセサイザー（Applied Biosys
tem Model 381A DNA synthesizer）により合成した。構
造Ｉは、示されるＸ位にＣ（シトシン）を有するように
合成した。次に、アミノ基転移反応〔Draper,Nucleic A
cids Research（1984）12:988ページ、参照〕にかけ、
続いて製造業者（Pierce Chemical Co.,Rockford,IL）
の指示に従って長鎖アームビオチンと反応せしめて、前
記ＣをＸで以下に示される構造の化合物に転化した。
2. 反応混合物は、次の試薬の組合せにより調製した。
−10mMのトリスHCl、1mM EDTA、pH8.0（TE）中、１ピコ
モル／μのpSP64プラスミド（Promega,Madison,WI）
１μ、 −10xメディウム・サルト（Medium salt）緩衝液（Mani
atisら、前述）１μ、 −10mMのATP1μ、 −１単位／μのT4リガーゼ（Boehringer Mannheim,In
dianapolis,IN）１μ、 −ビオチン化オリゴヌクレオチド（構造Ｉを、TE中2.5
ピコモル含有）１μ、 −相補オリゴヌクレオチド（構造IIを、TE中2.5ピコモ
ル含有）１μ、 −水３μ、 −10単位／μHind III制限酵素（Boehringer Mannhei
m,Indianapolis,IN）１μ。
3. 前記化合物を37℃で１時間インキュベーションし
た。
4. 反応は、0.2MのEDTA1μを添加することにより停
止した。
構造II ５′−AGCTACAACATCATAACT 例2. 蛍光染料による試料核酸標識化への連結反応の使
用 1. アプライド・ビオシステム・モデル381A DNAシンセ
サイザーを使用して、18塩基のヌクレオチドオリゴマー
を合成し、次いで製造業者の指示に従って精製した。
５′端をアミノリンク（Amino−LinkTM）（Applied Bio
systems）を用いてアミノ基を有する末端とした。再び
製造業者（Applied Biosystems）の指示に従い、このア
ミノ基をフルオロセインＮ−ヒドロキシスクインイミド
と連結した。
2. アプライド・ビオシステム・モデル381DNAシンセサ
イザーを使用して、20塩基のヌクレオチドオリゴマーを
合成し、次いで製造業者の指示に従い精製した。こうし
て合成した配列は、 ５′AGC TAC AAC GTC GTG ACT GG3′ であった。
この配列は、最初の14塩基のヌクレオチド（５′端か
ら）がフルオレセイン標識18塩基のオリゴマーの３′端
に相補的であり、かつ18塩基のオリゴマーの３′端にお
ける４塩基のヌクレオチドが、制限酵素Hind IIIにより
生じる５′付着端の突出し部に相補的になるように選ん
だ。この選ばれた特異的な配列は、18塩基のオリゴマー
/20塩基のオリゴマーの二重鎖が形成され、その後Hind
III制限酵素に切断された標的DNAの付着末端に連結され
たとき、Hind IIIの認識配列が破壊される。
3. 反応混合物は、次の試薬と混合することにより調製
した。
−TE1μ中のλファージ標的DNA1μｇ、 −10xHind III反応緩衝液（BRL Gaithersberg,MD）0.9
μ、 −TE中18塩基のオリゴマー3.0μ（モル数は、Hind II
Iが標的DNA1μｇを消化した場合に生ずる予期される付
着末端数の２倍にした）、 −TE中20塩基のオリゴマー2.0μ（モル数は、18個オ
リゴマーのそれと同一にした）、 −10mMのジチオスレイトール1.0μ、 −3mMのリボースATP1.0μ、 −Hind III酵素（12単位／μ）0.5μ、 −リガーゼ酵素（0.5単位）0.5μ。
4. 37℃で１時間インキュベーションした。
5. 0.2MのEDTAおよび20μg/μ（水中グリコーゲン）
1.0μを添加した。
6. フェノール／クロロホルム抽出を２度行い、混合物
を浄化した。フェノールとクロロホルムはそれぞれ10μ
添加した。混合しそして遠心した。下相を除去および
廃棄した。繰り返した（前述のManiatisら、参照）。
7. 3MのNaAc（pH5.5）１μ以上および95％のエタノ
ール25μを添加した。混合し、30分間静置した。次
に、遠心した。
8. 70％のエタノール500μで沈澱を洗浄した。
9. 減圧遠心を使用し、試料を乾燥した。
10. 10mMのトリス50μ、1mMのEDTA（pH8.0）中に再
懸濁した。
11. 0.6％のアガロースゲルに反応混合物の既知小量を
かけ、1xTBE（トリス−硼酸EDTA）緩衝液中、３ボルト/
cmで４時間流した。アプライド・ビオシステム370A DNA
シーケンサーでゲルを通して移動する蛍光吸収帯を検出
し、水平アガロースゲルの読みに適合させた。蛍光ピー
クは、Hind III切断λDNAにおける560,2027,2322,4361,
6557,9416および23,130塩基対に相当するものが検出さ
れた。
前記結果から、二重鎖DNAの末端の標識化または変性
のための簡潔で効果的な方法が提供されることが明らか
である。少量の標識成分で足り、その上試料のオリゴメ
リ化は実質的に防がれる。同一の反応容器中で制限反応
または特異的なフラグメント化が実施され、標識化を生
ぜしめることができる。従って、精確な大きさ、検出お
よびさらなる操作の容易さを提供する均質な生成物が得
られる。
本明細書に記載されるすべての刊行物および特許出願
が、本発明の属する当業者の技術水準を示す。すべての
刊行物および特許出願は、それぞれが明確かつ個別に引
用により本明細書の内容となると示されているのと同じ
ように、引用により本明細書の内容となる。
前述した本発明は、理解を明瞭にする目的で具体的か
つ例示によりかなり詳細に記載されているが、一定の変
更および改良を本発明の範囲内で実施し得ることは自明
であろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リンカーン ジェー．マクブライド アメリカ合衆国，カリフォルニア 94062，レッドウッド シティ，アイリ ス ストリート 311 (72)発明者 ノーマン エム．ホワイトレイ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94070，サン カルロス，ハイランド アベニュ 151

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】目的の部分によるDNAフラグメントの伸長
    方法において、 リガーゼ及び制限酵素の存在下、反応混合物中で、前記
    DNAフラグメントと、その制限フラグメントの末端に相
    補的な末端を有し且つ前記部分を含む二重鎖DNAとを組
    み合わせる際に、前記制限フラグメントは前記制限酵素
    による制限消化の結果所定の末端を有し、前記制限フラ
    グメントは末端リン酸を有するが前記二重鎖DNAの前記
    相補的末端は末端リン酸を欠損しており、そして前記二
    重鎖DNAが連結すると前記制限酵素により切断される配
    列とは異なる別の配列が生じ、よって前記制限フラグメ
    ントと二重鎖DNAとが共有結合することを特徴とするDNA
    フラグメントの伸長方法。
  2. 【請求項２】前記部分がリガンドを含んでなる請求項１
    記載の方法。
  3. 【請求項３】前記リガンドが検出し得るシグナルを供給
    することが可能な標識である請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】前記部分が目的のDNA配列である請求項１
    記載の方法。
  5. 【請求項５】前記共有結合した制限フラグメント及び二
    重鎖DNAの画分を選択する工程、 前記選択された画分にDNAポリメラーゼと、ヌクレオチ
    ド三リン酸と、前記二重鎖DNAに相補的な配列とを添加
    する工程、ならびに ポリメラーゼ連鎖反応を実施して前記選択された画分を
    増幅する工程、 からなる追加工程を含む請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】前記選択工程が電気泳動により大きさを選
    択するものである請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】前記DNAフラグメントが、フラグメント化
    される前駆体DNAを前記反応混合物に添加することによ
    り得られ、よって前記前駆体DNAを前記制限酵素により
    切断する請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】リガンドによるDNAフラグメントの標識化
    方法において、 リガーゼ及び制限酵素の存在下、前記DNAフラグメント
    と、その制限フラグメントの末端に相補的な末端を有し
    且つ約200bp未満のリガンド標識化二重鎖DNAとを組み合
    わせる際に、前記制限フラグメントは前記制限酵素によ
    る制限消化の結果所定の末端を有し、前記制限フラグメ
    ントは末端リン酸を有するが前記二重鎖DNAの前記相補
    的末端は末端リン酸を欠損しており、そして前記二重鎖
    DNAが連結すると前記制限酵素により切断される配列と
    は異なる別の配列が生じ、よって前記制限フラグメント
    と二重鎖DNAとが共有結合して前記DNAフラグメントを標
    識化することを特徴とする前記方法。
  9. 【請求項９】前記リガンドがビオチンである請求項８記
    載の方法。
  10. 【請求項１０】前記リガンドが放射性核種、蛍光体また
    は酵素である請求項８記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記末端が付着末端である請求項８記載
    の方法。
  12. 【請求項１２】少なくとも１種の制限酵素でゲノムDNA
    を消化して約200kbp未満のフラグメントを提供する工程
    により前記DNAフラグメントが得られる請求項記載の方
    法。
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