ES2339326T3 - Receptor de quimioquina. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la identificación de moduladores de la unión de CCX CKR a una quimioquina, que comprende: (a) poner en contacto un polipéptido CCX CKR aislado o recombinante y la quimioquina en presencia de un compuesto de ensayo; en el que: el polipéptido CCX CKR (i) comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2, o es un fragmento o variante de la misma, en el que la variante presenta una identidad de secuencias de por lo menos el 90% respecto de la secuencia SEC ID nº 2, e (ii) puede unirse a la quimioquina en ausencia del compuesto de ensayo; y la quimioquina se selecciona de entre el grupo constituido por quimioquina de ligando EBI-1 (ELC), quimioquina de órgano linfoide secundario (SLC), quimioquina expresada en el timo (TECK), quimioatrayente de linfocito B (BLC), quimioquina atrayente de célula T cutánea (CTACK), proteína-Iγ inflamatoria de macrófagos murinos (mMIP-Iγ) y proteína II inflamatoria de macrófagos (vMIPII); y (b) comparar el nivel de unión de la quimioquina y el polipéptido CCX CKR en (a) con el nivel de unión en ausencia del compuesto de ensayo; en el que una reducción de la unión indica que el compuesto de ensayo es un inhibidor de la unión, e indicando un incremento que el compuesto de ensayo es un intensificador de la unión.

Description

Receptor de quimioquina.

Campo de la invención

La invención se refiere a un receptor de quimioquina humana, y a composiciones y procedimiento que resultan útiles para diagnosticar y tratar condiciones fisiológicas y patológicas mediadas por el receptor y su ligando. La invención encuentra aplicación en las ciencias biomédicas.

Referencia cruzada con solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica la prioridad con respecto a las solicitudes provisionales de patentes US nº 60/
159015 (presentada el 12 de octubre de 1999), nº 60/159210 (presentada el 13 de octubre de 1999), nº 60/172979 (presentada el 20 de diciembre de 1999), nº 60/173389 (presentada el 28 de diciembre de 1999) y nº 60/186626 (presentada el 3 de marzo de 2000).

Antecedentes de la invención

Las quimioquinas son una clase de citoquinas que desempeña importantes papeles en las respuestas inflamatorias, tráfico de leucocitos, angiogénesis y otros procesos biológicos relacionados con la migración y activación de las células. Como mediadores de la quimotaxis y la inflamación, las quimioquinas desempeñan papeles en algunas condiciones patológicas. Por ejemplo, la concentración de la quimioquina MCP-1 es más alta en el líquido sinovial de pacientes que sufren artritis reumatoide que en pacientes que sufren otras enfermedades artríticas.

Las quimioquinas conocidas típicamente se clasifican en cuatro subfamilias basándose en la disposición de los motivos de cisteína. En las denominadas quimioquinas alfa, por ejemplo, las primeras dos de las cuatro cisteínas (partiendo del extremo amino-terminal) se encuentran separadas por un aminoácido intermedio (es decir, que presenta el motivo C-X-C). Las quimioquinas beta se caracterizan por la ausencia de un aminoácido intermedio entre las dos primeras cisteínas (es decir, que comprenden el motivo C-C). Las familias de quimioquinas gamma y delta, más pequeñas, se caracterizan por un único residuo de C (gamma) o por un par de cisteínas separadas por tres residuos (delta, es decir, que comprende el motivo CX_{3}C). Para una revisión reciente de las quimioquinas, ver Ward et al., Immunity 9:1-11, 1998, y Baggiolini et al., Nature 392:565-568, 1998, y las referencias citadas en las mismas.

La actividad de las quimioquinas puede encontrarse mediada por aceptores. Por ejemplo, se han clonado varios receptores de siete dominios transmembranales acoplados a proteína G para las quimioquinas C-C: un receptor 1 de quimioquina C-C que reconoce MIP-I\alpha, RANTES, MCP-2, MCP-3 y MIP-5 (Neote et al., Cell 72:415-415, 1993); CCR2, que es un receptor de MCP1, 2, 3 y 4 ó 5; CCR3, que es un receptor de RANTES, MCP-2, 3, 4, MIP-5 y eotaxina; CCR5, que es un receptor de MIP-1\alpha, MIP-1\beta y RANTES; CCR4, que es un receptor de MDC o TARC; CCR6, que es un receptor de LARC; y CCR7, que es un receptor de SLC y ELC (MIP-3\beta; revisado en Sallusto et al., Immunol. Today 19:568, 1998, y Ward et al., Immunity 9:1-11, 1998).

Debido a la importancia de las quimioquinas y de sus receptores como mediadores de la quimotaxis y la inflamación, existe una necesidad de identificar, aislar y caracterizar los miembros de la familia de receptores de quimioquina con el fin de facilitar la modulación de las respuestas inflamatorias e inmunológicas.

Sumario de la invención

En la presente memoria, se describe un nuevo receptor de quimioquina, CCX CKR.

En la presente memoria, se describe un polipéptido CCX CKR sustancialmente puro o recombinante, o un fragmento inmunogénico del mismo. En un caso descrito en la presente memoria, la secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica a la secuencia SEC ID nº 2. En otro descrito en la presente memoria, el polipéptido con una secuencia de aminoácido que difiere de la secuencia SEC ID nº 2 en mutaciones conservadoras, que es idéntico por lo menos al 60%, 80% o 90% a la secuencia SEC ID nº 2, y/o que presenta reactividad inmunológica cruzada con el polipéptido de longitud completa codificado por la secuencia SEC ID nº 2.

En un caso descrito en la presente memoria, el polipéptido es una proteína de fusión. En algunos casos descritos en la presente memoria, el polipéptido presenta una actividad del CCX CKR, tal como la unión a una quimioquina (por ejemplo ELC, SLC, TECK, BLC o vMIPII). En un caso descrito en la presente memoria, el polipéptido se une a ELC, SLC y TECK con alta afinidad.

En un aspecto relacionado, se describe en la presente memoria un polinucleótido aislado que codifica, o que es complementario a una secuencia que codifica, el polipéptido CCX CKR. En algunos casos descritos en la presente memoria, el polipéptido presenta por lo menos 10, 15, 25, 50 ó 100 bases contiguas idénticas o exactamente complementarias a la secuencia SEC ID nº 1. En diversos casos descritos en la presente memoria, el polinucleótido es la secuencia de longitud completa de la secuencia SEC ID nº 1, codifica un polipéptido CCX CKR de la invención (por ejemplo que presenta la secuencia de SEC ID nº 2 o un fragmento de la misma), o que se hibrida selectivamente bajo condiciones de hibridación altamente astringentes a una secuencia polinucleótida de secuencia SEC ID nº 1. El polinucleótido puede unirse operablemente a un promotor. En la presente memoria se describe un vector recombinante (por ejemplo un vector de expresión) que expresa los polipéptidos CCX CKR. En un aspecto, se describe en la presente memoria un polinucleótido que presenta una secuencia codificante de un polipéptido que presenta una actividad (por ejemplo una actividad de unión a quimioquina) o un polipéptido CCX CKR y que es: (a) un polinucleótido que presenta la secuencia SEC ID nº 1 o SEC ID nº 3, o (b) un polinucleótido que se hibrida bajo condiciones astringentes a (a), o (c) una secuencia polinucleótida degenerada como resultado del código genético respecto de las secuencias definidas en (a) o (b).

Se describe adicionalmente una célula (por ejemplo una célula bacteriana, eucariótica, de mamífero o humana) que contiene un polinucleótido CCX CKR recombinante y proporciona un procedimiento para producir una proteína CCX CKR, péptido o proteína de fusión mediante el cultivo de una célula que contiene el polinucleótido CCX CKR recombinante bajo condiciones en las que se expresa el polipéptido.

En otro caso, la memoria describe un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, o fragmento ligante (por ejemplo producido mediante expresión fágica) que se une específicamente al polipéptido CCX CKR de la invención. El anticuerpo puede ser monoclonal y puede unirse con una afinidad de por lo menos aproximadamente 10^{8} M^{-1}. También se describe una célula aislada o un hibridoma capaz de secretar el anticuerpo. El anticuerpo puede ser humano o humanizado.

En la presente memoria, se describe un procedimiento para detectar un producto génico CCX CKR en una muestra mediante: (a) la puesta en contacto de la muestra con una sonda que se une específicamente al producto génico, en el que la sonda y el producto génico forman un complejo, y detectar la formación del complejo, o (b) amplificar específicamente el producto génico en la muestra biológica, en la que dicho producto génico es un polinucleótido, y detectar el producto de amplificación; en el que la formación del complejo o la presencia del producto de amplificación se correlaciona con la presencia del producto génico CCX CKR en la muestra biológica. En un caso descrito en la presente memoria, el producto génico es un polipéptido y la sonda es un anticuerpo. En un caso diferente descrito en la presente memoria, el producto génico es un ARN y la sonda es un polinucleótido.

En la presente memoria, se describe un procedimiento para determinar si un compuesto interacciona o no directamente con el polipéptido CCX CKR, mediante la puesta en contacto de una quimioquina y el polipéptido CCX CKR o un fragmento del mismo que se una a ligandos, la adición de un compuesto de ensayo y la medición de cualquier reducción de la unión de la quimioquina. En diversos casos la quimioquina es ELC, SLC, TECK, BLC, mCTACK, mMIP-I\gamma o vMIPIII u otro ligando natural que se una a CCX CKR. En algunos casos, la quimioquina se marca radiactivamente. De esta manera, en un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para identificar un modulador de la unión de CCX CKR a una quimioquina mediante: (a) la puesta en contacto de un polipéptido CCX CKR y la quimioquina en presencia de un compuesto de ensayo, y (b) la comparación entre el nivel de unión de la quimioquina y el polipéptido en (a) con el nivel de unión en ausencia del compuesto de ensayo, en el que una reducción de la unión indica que el compuesto de ensayo es un inhibidor del a unión y un incremento de la unión indica que el compuesto de ensayo es un intensificador de la unión. En una realización, la quimioquina es ELC, SLC, TECK, BLC, mCTACK, mMIP-I\gamma o vMIPII. En una realización, el polipéptido CCX CKR es expresado por una célula.

En un aspecto relacionado, la invención proporciona un procedimiento para identificar un modulador de la actividad de CCX CKR mediante la puesta en contacto de una célula que expresa un polipéptido CCX CKR recombinante y un compuesto de ensayo y someter a ensayo para un efecto biológico que se produce en presencia, pero no en ausencia, del compuesto de ensayo, en el que un compuesto de ensayo que induce un efecto biológico se identifica como un modulador de la actividad de CCX CKR. En un caso, el efecto biológico sometido a ensayo es la internalización del receptor. El procedimiento de la invención también incluye la etapa de poner en contacto la célula con una quimioquina que se une al receptor (por ejemplo ELC, SLC, TECK, BLC, mCTACK, mMIP-I\gamma o vMIPII) durante el ensayo.

También se describe en la presente memoria un procedimiento para preparar una composición farmacéutica mediante la formulación de un modulador de la actividad de CCX CKR (por ejemplo la unión) para el uso farmacéutico.

Se describe en la presente memoria un procedimiento para identificar compuestos que resultarán útiles para el tratamiento de enfermedades y condiciones mediadas por CCX CKR, mediante la determinación de si el compuesto interacciona con CCX CKR.

En la presente memoria, se describe un procedimiento para tratar una condición mediada por CCX CKR en un mamífero mediante la reducción o el incremento de la actividad o expresión de CCX CKR en una célula o tejido en el mamífero o mediante la administración de un modulador de la función de CCX CKR en el mamífero. En diversos casos descritos en la presente memoria, el modulador de la función de CCX CKR es un inhibidor de la unión de una quimioquina (por ejemplo, ELC) a CCX CKR, o un intensificador de la unión de una quimioquina (por ejemplo, ELC) a CCX CKR. En la presente memoria se describe un procedimiento para tratar una condición o enfermedad mediada por CCX CKR en un sujeto que necesita dicho tratamiento, mediante la administración de una cantidad efectiva de un compuesto que inhibe la unión de CCX CKR a una quimioquina. En diversos casos, la condición o enfermedad mediada por CCX CKR es una enfermedad inflamatoria o alérgica, una enfermedad autoinmunológica, rechazo del injerto, cánceres, enfermedades neoplásicas, retinopatía, degeneración macular, una enfermedad infecciosa, o una enfermedad inmunosupresora.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos para un CCX CKR humano (SEC ID nº 1) y la secuencia de aminoácidos predicha del polipéptido CCX CKR humano (SEC ID nº 2).

La figura 2 muestra la secuencia de CCX CKR alineada con las secuencias de otros receptores de quimioquina, el patrón de expresión del ARN de CCX CKR, y la generación de una línea celular estable que expresa CCX CKR. La figura 2A muestra la homología de secuencias de la región codificante de CCX CKR con otros receptores de quimioquina. La figura 2B muestra células y tejidos que expresan el ARN de CCX CKR, según el análisis de RT-PCR de ARN citoplasmático procedente de un cultivo de células primarias y de tejidos completos procedentes de diversos órganos, tal como se indica. La figura 2C muestra una población de células HEK-293 transfectadas que expresan establemente proteína CCX CKR que contiene un epítopo Flag N-terminal, comparando la intensidad de la tinción de mAb anti-Flag con la tinción en células HEK293 de tipo salvaje.

La figura 3 muestra la identificación de ligandos de CCX CKR mediante la adhesión de estalcoquinas. La figura 3A muestra la interrogación de estalcoquina (SK) inmovilizada por células HEK293-CCX CKR, en las que "control"=la adhesión de fondo de células HEK293-CCX CKR a pocillos que no contienen estalcoquina (en presencia de anticuerpos de anclaje y medio); ELC-estalcoquina (SK)=adhesión fuerte de células HEK293-CCX CKR a localizaciones que contienen ELC-estalcoquinas inmovilizadas mediante anticuerpos de anclaje; ELC-SK + ELC soluble, TECK soluble o SLC soluble=ablación de la adhesión en presencia de concentraciones en exceso de quimioquinas de "forma nativa" recombinantes solubles, tal como se muestra; ELC-SK + MCP-3 soluble=sin disminución de la adhesión en presencia de MCP-3 como representativa de muchas quimioquinas no competitivas. Las células HEK293 de tipo salvaje no mostraron adhesión a ninguno de los sitios (no mostrado). La figura 3B muestra la cuantificación de la adhesión de las células HEK293-CCX CKR a ELC-estalcoquina en ausencia y en presencia de quimioquinas solubles de un experimento representativo. La figura 3C muestra los resultados de un ensayo de unión competitiva homóloga utilizando ELC marcado radiactivamente en presencia de concentraciones crecientes de ELC frío en células HEK293-CCX CKR (cuadrados negros) o en células HEK293 de tipo salvaje (cuadrados blancos).

La figura 4 muestra la huella de unión de ligandos de CCX CKR. Figura 4: definición de actividad de unión de proteína CCX CKR, tal como indica la utilización de ^{125}I-ELC contra una serie completa de quimioquinas víricas, humanas y murinas en competencia de unión. El porcentaje de inhibición de la unión específica se muestra en forma de gráfico de columnas para subrayar que las quimioquinas pueden clasificarse como de potencialmente "alta" afinidad (columnas negras), potencialmente de afinidad "moderada a baja" (columnas sombreadas) o "sin" afinidad (columnas blancas). Los resultados son de medias de tres determinaciones, el SEM en todos los casos fue \leq20%; las barras de error se omiten por claridad. Debido a que el error experimental intraensayo era \pm \sim20%, las determinaciones dentro de este intervalo a izquierda o a derecha de la línea de 0% no es probable que sean estadísticamente significativas. Figura 4B: orden de rangos de la unión de alta afinidad de ligandos de CCX CKR. La determinación de múltiples puntos refleja la competencia de quimioquinas no marcadas con la unión de ^{125}I-ELC a CCX CKR. En el fondo de la tabla se proporcionan resultados representativos de la unión en el equilibrio utilizando ELC, SLC, TECK, BLC y vMIP-II fríos (no marcados), comparando las IC_{50} calculadas.

La figura 5 muestra la secuencia de ADN en posición 5' respecto al sitio de inicio de traducción del gen CCX CKR, según determinación en un clon genómico.

La figura 6 muestra la internalización inducida por ligando de CCX CKR en células 293 transfectadas con un plásmido de fusión receptor-epítopo Flag. La figura 6(A) muestra los escaneos FACS de células incubadas durante 45 minutos en presencia o en ausencia de quimioquinas (ELC, SLC, TECK, CTACK o MCP4 1 nM, 10 nM o 100 nM) o un control de anticuerpo isotipo. La figura 6(B) muestra el mismo experimento con una incubación de 15 minutos.

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Descripción detallada I. Definiciones

Las definiciones siguientes se proporcionan con el fin de ayudar al lector en la práctica de la invención.

Las expresiones "alelo" o "secuencia alélica", tal como se utilizan en la presente memoria, se refieren a una forma alternativa natural de un gen codificante del polipéptido CCX CKR (es decir, un polinucleótido codificante de un polipéptido CCX CKR). Los alelos resultan de mutaciones (es decir, cambios de la secuencia de ácidos nucleicos) y en ocasiones producen ARNm alterados y/o de regulación diferente, o polipéptidos cuya estructura y/o función puede encontrarse alterada o no. Los cambios mutacionales comunes que dan lugar a alelos generalmente se atribuyen a deleciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleótidos que pueden afectar o no a los aminoácidos codificados. Cada uno de dichos tipos de cambio puede producirse solo, en combinación con los demás, o una o más veces dentro de un gen, cromosoma u otro polinucleótido celular dado. Cualquier gen dado puede presentar una, ninguna o muchas formas alélicas. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "alelo" se refiere a cualquiera de entre un gen o un ARNm, o a ambos, transcritos a partir del gen.

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Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales y sintéticos, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos naturales. Los aminoácidos naturales son aquellos codificados por el código genético, así como los aminoácidos que resultan posteriormente modificados, por ejemplo hidroxiprolina, \gamma-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que presentan la misma estructura química básica que el aminoácido natural, es decir, un carbono alfa que se encuentra unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil-sulfonio. Dichos análogos presentan grupos R modificados (por ejemplo norleucina) o esqueletos peptídicos modificados, aunque conservan la misma estructura química básica que un aminoácido natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que presentan una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de una manera similar a un aminoácido natural.

La expresión "secuencias antisentido" se refiere a polinucleótidos que presentan una secuencia complementaria a una secuencia de ARN. Estos términos comprenden específicamente secuencias de ácidos nucleicos que se unen a un ARNm o a partes del mismo, bloqueando la transcripción del ARNm por los ribosomas. Los procedimientos antisentido son generalmente bien conocidos de la técnica (ver, por ejemplo, la publicación de patente PCT WO 94/12633, y Nielsen et al., Science 254:1497, 1991; OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES, A PRACTICAL APPROACH, editado por F. Eckstein, IRL Press at Oxford University Press, 1991; ANTISENSE RESEARCH AND APPLICATIONS (CRC Press, 1993)).

El término "composición" tal como se utiliza en la presente memoria pretende incluir un producto que comprende los ingredientes especificados en las cantidades especificadas, así como cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de la combinación de los ingredientes especificados en las cantidades especificadas.

La expresión "sustitución conservadora", en la descripción de un polipéptido, se refiere a un cambio de la composición de aminoácidos del polipéptido, que no altera sustancialmente la actividad del mismo, es decir, la sustitución de aminoácidos por otros aminoácido que presentan propiedades similares, de manera que las sustituciones de aminoácidos incluso críticos no altera sustancialmente la actividad. Las tablas de sustituciones conservadoras, que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas de la técnica. Cada uno de los seis grupos siguientes contiene aminoácidos que son sustituciones conservadoras de uno por otro: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W) (ver también Creighton, Proteins, 1984, W.H. Freeman and Company).

Además de las sustituciones conservadoras anteriormente definidas, otras modificaciones de residuos aminoácidos pueden resultar en "variantes modificadas conservadoramente". Por ejemplo, todos los aminoácidos cargados pueden considerarse sustituciones mutuas, presenten carga positiva o negativa. Además, las variantes modificadas conservadoramente también pueden resultar de sustituciones, deleciones o adiciones individuales que alteren, añadan o delecionan un único aminoácido o un porcentaje reducido de aminoácidos, por ejemplo con frecuencia menos de 5%, en una secuencia codificada. Además, puede prepararse una variante modificada conservadoramente a partir de un polipéptido recombinante mediante la sustitución de un codón para un aminoácido utilizado por el gen nativo o de tipo salvaje, por un codón diferente para el mismo aminoácido.

Las expresiones "elementos de control" o "secuencias reguladoras" incluyen intensificadores, promotores, terminadores de transcripción, orígenes de replicación, secuencias de integración cromosómica, regiones 5' y 3' no traducidas, con las que los polipéptidos u otras biomoléculas interaccionan para llevar a cabo la transcripción y la traducción. Para las células eucarióticas, las secuencias de control incluirán un promotor y preferentemente un intensificador, por ejemplo derivado de genes de inmunoglobulina, SV40, citomegalovirus y una secuencia de poliadenilación, y puede incluir secuencias donantes y aceptoras de procesamiento. Dependiendo del sistema vector y huésped utilizados, puede utilizarse cualquier número de elementos de transcripción y de traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Al hacer referencia a CCX CKR, un promotor diferente del asociado naturalmente a la secuencia codificante de CCX CKR puede denominarse "heterólogo".

Tal como se utiliza en la presente memoria, un polinucleótido, oligonucleótido o ácido nucleico "derivatizado" se refiere a oligonucleótidos y polinucleótidos que comprenden un sustituyente derivatizado. En algunas formas de realización, el sustituyente es sustancialmente no interfiriente con respecto a la hibridación de polinucleótidos complementarios. Los oligonucleótidos o polinucleótidos derivatizados que han sido modificados con sustituyentes químicos colgantes (por ejemplo mediante la modificación de un oligonucleótido o polinucleótido sintetizado, o mediante la incorporación de una base modificada o de un análogo de la cadena principal durante la síntesis) pueden introducirse en una célula eucariótica metabólicamente activa para hibridarse con un ADN, ARN o proteína CCX-CKR, en el que producen una alteración o modificación química en un ADN, ARN o proteína local. Alternativamente, los oligonucleótidos o polinucleótidos derivatizados pueden interaccionar con los polipéptidos CCX CKR y alterarlos, o con proteínas que interaccionan con el ADN de CCX CKR o con los productos génicos CCX CKR, o alterar o modular la expresión o la función del ADN, ARN o proteína de CCX CKR. Entre los sustituyentes químicos unidos ilustrativos se incluyen: texafirina de europio (III), agentes entrecruzantes, soralén, quelatos metálicos (por ejemplo quelato de hierro/EDTA para el corte catalizado por hierro), topoisomerasas, endonucleasas, exonucleasas, ligasas, fosfodiesterasas, porfirinas fotodinámicas, fármacos quimioterapéuticos (por ejemplo adriamicina y doxirubicina), agentes intercalantes, agentes de modificación de bases, cadenas de inmunoglobulina y oligonucleótidos. Los quelatos de hierro/EDTA son sustituyentes químicos utilizados frecuentemente en el caso de que se desee el corte local de una secuencia de ácidos nucleicos (Hertzberg et al., J. Am. Chem. Soc. 104:313, 1982; Hertzberg y Dervan, Biochemistry 23:3934, 1984; Taylor et al., Tetrahedron 40:457, 1984; Dervan, Science 232:464, 1986). Entre las reacciones de unión ilustrativas se incluyen: el enlace directo, por ejemplo mediante un grupo amino reactivo colgante (Corey y Schultz, Science 238:1401, 1988, que se incorpora en la presente memoria como referencia) y otras reacciones de unión directa, aunque también pueden utilizarse procedimientos de unión estreptavidina/biotina y digoxigenina/anticuerpo anti-digoxigenina. Los procedimientos para la unión de sustituyentes químicos se proporcionan en las patentes US nº 5.135.720, nº 5.093.245 y nº 5.055.556, que se incorporan en la presente memoria como referencia. Pueden utilizarse otras reacciones de unión a discreción del médico.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "marcaje detectable" presenta el significado ordinario en la técnica y se refiere a un átomo (por ejemplo un radionucleido), molécula (por ejemplo fluoresceína) o complejo que se utiliza, o que puede utilizarse, para detectar (por ejemplo debido a una propiedad física o química), indicar la presencia de una molécula, o permitir la unión de otra molécula a la que se encuentra unido covalentemente, o asociado de otra manera. El término "marcaje" también se refiere a moléculas unidas covalentemente o asociadas de otra manera (por ejemplo, una biomolécula, tal como una enzima) que actúan sobre un sustrato produciendo un átomo, molécula o complejo detectable. Entre los marcajes detectables adecuados para la utilización en la presente invención se incluye cualquier composición detectable mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos, químicos y similares.

El término "epítopo" presenta su significado ordinario, de un sitio en un antígeno que resulta reconocido por un anticuerpo. Los epítopos típicamente son segmentos de aminoácidos que son una parte reducida del polipéptido completo. Los epítopos pueden ser conformacionales (es decir, discontinuos). Es decir, pueden formarse a partir de aminoácidos codificados por partes no contiguas de una secuencia primaria que han sido yuxtapuestas por el plegamiento de la proteína.

La expresión "proteína de fusión" se refiere a un polipéptido compuesto, es decir, una única secuencia de aminoácidos contigua que consta de dos (o más) polipéptidos heterólogos diferentes que normalmente no se encuentran fusionados entre sí en una única secuencia de aminoácidos. De esta manera, una proteína de fusión puede incluir una única secuencia de aminoácidos que contiene dos secuencias de aminoácidos completamente diferentes o dos secuencias polipeptídicas similares o idénticas, con la condición de que dichas secuencias no se encuentren normalmente juntas en la misma configuración en una única secuencia de aminoácidos de origen natural. Las proteínas de fusión generalmente pueden prepararse utilizando procedimientos de ácidos nucleicos recombinantes, es decir, como resultado de la transcripción y traducción de un producto de fusión de gen recombinante, comprendiendo dicha fusión un segmento codificante de un polipéptido de la invención y un segmento codificante de un polipéptido heterólogo, o mediante procedimientos de síntesis química bien conocidos de la técnica.

La expresión "producto génico" se refiere a una molécula de ARN transcrita de un gen, o un polipéptido codificado por el gen o traducido a partir del ARN.

La expresión "afinidad elevada" para un anticuerpo IgG, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una constante de asociación (Ka) de por lo menos aproximadamente 10^{6} M^{-1}, preferentemente de por lo menos aproximadamente 10^{8} M^{-1}, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 10^{9} M^{-1} o superior, por ejemplo hasta 10^{12} M^{-1} o superior. Sin embargo, la unión de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpo.

Los términos "inmunógeno" e "inmunogénico" presentan sus significados ordinarios en la técnica, es decir, un inmunógeno es una molécula, tal como un polipéptido u otro antígeno, que puede inducir una respuesta inmunológica adaptativa tras la inyección en una persona o en un animal.

Los términos "modulador" y "modulación" de la actividad de receptor de quimioquina, tal como se utilizan en la presente memoria en sus diversas formas, pretenden comprender antagonismo, agonismo, antagonismo parcial y/o agonismo parcial de la actividad asociada a un receptor de quimioquina particular, preferentemente el receptor de CCX CKR. En diversas formas de realización, los "moduladores" pueden inhibir o estimular la expresión o actividad de CCX CKR. Las expresiones "ácido nucleico" y "polinucleótido" se utilizan intercambiablemente y se refieren a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma de cadena única o de cadena doble. A menos que se limite específicamente, la exposición de una secuencia polinucleótida también pretende referirse a la secuencia complementaria. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "polinucleótido" incluye los oligonucleótidos.

Los términos "oligonucleótidos" u "oligómeros" se refieren a una secuencia de ácidos nucleicos de aproximadamente 7 nucleótidos o mayores, y hasta aproximadamente 100 nucleótidos, que pueden utilizarse como cebador o sonda. Los oligonucleótidos con frecuencia presentan una longitud comprendida entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 nucleótidos, más frecuentemente entre aproximadamente 12 y aproximadamente 50 nucleótidos, muy frecuentemente entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 nucleótidos.

La expresión "operablemente ligado" se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos polinucleótidos (por ejemplo ADN): por ejemplo un promotor o intensificador se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que estimule la transcripción de la secuencia en una célula huésped apropiada u otro sistema de expresión. Generalmente, las secuencias que se encuentran operablemente ligadas son contiguas, y en el caso de una secuencia de señal, tanto contiguas como en el mismo marco de lectura. Sin embargo, los intensificadores no necesariamente deben encontrarse localizados en estrecha proximidad a las secuencias codificantes cuya transcripción intensifican.

Los términos "peptidomimético" y "mimético" se refieren a un compuesto químico sintético que presenta sustancialmente las mismas características estructurales y funcionales de los polipéptidos CCX CKR de la invención. Los análogos de péptidos se utilizan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a las del péptido molde. Estos tipos de compuesto no peptídico se denominan "miméticos de péptido" o "peptidomiméticos" (Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29, 1986; Veber y Freidinger, TINS, página 392, 1985; y Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229, 1987), que se incorporan en la presente memoria como referencia). Los miméticos de péptido que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles pueden utilizarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente o incrementado. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que presenta una actividad biológica o farmacológica), tal como CCX CKR, pero que presentan uno o más enlaces peptídicos opcionalmente sustituidos por un enlace seleccionado de entre el grupo constituido por, por ejemplo, -CH_{2}NH-, -CH_{2}S-, -CH_{2}-CH_{2,} -CH=CH- (cis y trans), -COCH_{2}-, -CH(OH)CH_{2}- y -CH_{2}SO-. El mimético puede estar compuesto totalmente de análogos sintéticos no naturales de aminoácidos, o es una molécula quimérica de aminoácidos de péptidos parcialmente naturales y análogos parcialmente no naturales de aminoácidos. El mimético también puede incorporar cualquier cantidad de sustituciones conservadoras de aminoácidos naturales con la condición de que dichas sustituciones tampoco alteren sustancialmente la estructura y/o actividad del mimético. Por ejemplo, una composición mimética se encuentra comprendida dentro del alcance de la invención en el caso de que sea capaz de llevar a cabo la unión o las actividades enzimáticas de CCX CKR.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a que el portador, diluyente o excipiente debe ser compatible con los demás ingredientes de la formulación y no perjudicial para el recipiente de la misma.

El término "polipéptido" se utiliza intercambiablemente en la presente memoria con el término "proteína", y se refiere a un polímero compuesto de residuos aminoácidos unidos mediante enlaces amida, incluyendo análogos sintéticos naturales y no naturales de los mismos (aminoácidos y enlaces). Los péptidos son ejemplos de polipéptidos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, una "sonda", utilizada en el contexto de polinucleótidos y anticuerpos, se refiere a una molécula que se une específicamente a otra molécula. Un ejemplo de una sonda es una "sonda de ácidos nucleicos", que puede ser un ADN, ARN u otro polinucleótido. En el caso de que se proporcione una secuencia específica de una sonda de ácidos nucleicos, se entiende que la cadena complementaria también se encuentra identificada e incluida. La cadena complementaria funcionará igualmente bien en situaciones en las que la diana es un ácido nucleico de doble cadena que se une específicamente (por ejemplo se aparea o se hibrida) a un ácido nucleico sustancialmente complementario. Otro ejemplo de una sonda es una "sonda anticuerpo" que se une específicamente a un antígeno o epítopo correspondiente.

El término "recombinante" se refiere a un polinucleótido sintetizado o manipulado de otra manera in vitro (por ejemplo "polinucleótido recombinante"), a procedimientos de utilización de polinucleótidos recombinantes para producir productos génicos en células u otros sistemas biológicos, o a un polipéptido ("proteína recombinante") codificada por un polinucleótido recombinante. De esta manera, un polinucleótido "recombinante" se define mediante su procedimiento de producción o su estructura. En referencia a su procedimiento de producción, el procedimiento es la utilización de técnicas de ácidos nucleicos recombinantes, por ejemplo, que implican la intervención humana en la secuencia de nucleótidos, típicamente la selección o la producción. Alternativamente, puede ser un polinucleótido preparado mediante la generación de una secuencia que comprende la fusión de dos fragmentos que no son naturalmente contiguos, sino que pretende excluir productos naturales. De esta manera, por ejemplo, los productos preparados mediante la transformación de células con cualquier vector no natural se encuentran comprendidos, al igual que los polinucleótidos que comprenden secuencias derivadas utilizando cualquier procedimiento sintético de oligonucleótidos. De manera similar, un polipéptido "recombinante" es uno expresado a partir de un polinucleótido recombinante.

La expresión "hibridante selectivamente" se refiere a una sonda polinucleótida que se hibrida, se aparea o se une a una secuencia de ADN o ARN diana particular al encontrarse presentes las secuencias diana en una preparación de ADN o ARN celular total.

La expresión "específicamente inmunorreactivo", o "se une específicamente" en referencia a la interacción entre un anticuerpo y una proteína o polipéptido, se refiere a un anticuerpo que reconoce específicamente y se une con afinidad relativamente elevada a la proteína de interés, por ejemplo CCX CKR, de manera que esta unión es determinante de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteína y otros compuestos biológicos. De esta manera, bajo condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados se unen a un polipéptido particular y no se unen en una cantidad significativa a otros polipéptidos presentes en la muestra. Puede utilizarse una diversidad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con un polipéptido particular. Por ejemplo, los inmunoensayos ELISA de fase sólida se utilizan rutinariamente para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunorreactivos con un polipéptido. Ver Harlow, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988 (en lo sucesivo "Harlow"), para una descripción de formatos y condiciones de inmunoensayo que pueden utilizarse para determinar la inmunorreactividad específica.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "identidad sustancial de secuencias" se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que presentan una identidad de nucleótidos o de residuos aminoácidos de por lo menos 60%, preferentemente 80%, más preferentemente 90%, 95%, 98% o 99%, al compararlas y alinearlas para la máxima correspondencia, según la medición con uno de los algoritmos de comparación de secuencia siguiente o mediante inspección visual. Dos secuencias (de aminoácidos o de nucleótidos) pueden compararse a lo largo de su longitud completa (por ejemplo la longitud del más corto de los dos, en el caso de que presenten longitudes sustancialmente diferentes o a lo largo de una subsecuencia, tal como por lo menos aproximadamente 50, aproximadamente 100, aproximadamente 200, aproximadamente 500 o aproximadamente 1.000 nucleótidos contiguos o por lo menos aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 50 o aproximadamente 100 residuos aminoácidos contiguos.

Para la comparación entre secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan secuencias de ensayo. Al utilizar un algoritmo de comparación entre secuencias, se introducen en un ordenador la secuencia de ensayo y la de referencia, se designan coordenadas de subsecuencia, en caso necesario, y se designan parámetros del programa de algoritmo de secuencias. El algoritmo de comparación de secuencias seguidamente calcula el porcentaje de identidad de secuencias para la secuencia o secuencias de ensayo respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros de programa designados.

La alineación óptima de secuencias para la comparación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981, mediante el algoritmo de alineación de homologías de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, mediante el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante inspección visual (ver generalmente Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, con suplemento desde 1999). Cada una de estas referencias y algoritmos se incorpora como referencia en la presente memoria en su totalidad. Al utilizar cualquiera de los algoritmos anteriormente indicados, se utilizan los parámetros por defecto de longitud de "ventana", penalización por hueco, etc.

Un ejemplo de algoritmo que resulta adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y la similitud de secuencias es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990. El software para llevar a cabo los análisis de BLAST se encuentra disponible públicamente del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica, en primer lugar, identificar parejas de secuencias de alta puntuación (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de búsqueda que se corresponden o que satisfacen alguna puntuación T umbral de valor positivo al alinearse con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se denomina umbral de puntuación de palabras vecinas (Altschul et al., supra). Estos aciertos iniciales de palabras vecinas actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largas que contengan las mismas. Los aciertos de palabra seguidamente se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta que ya no pueda incrementarse más la puntuación acumulativa de alineación. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene a una cantidad X de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulativa baja a cero o menos debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquiera de las dos secuencias. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLAST utiliza como parámetros por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989), alineaciones (B) de 50, predicción (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación entre ambas cadenas.

Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencias, el algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad a la que se produciría aleatoriamente una correspondencia entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia en el caso de que la probabilidad de la suma más pequeña en una comparación entre el ácido nucleico de ensayo y el ácido nucleico de referencia sea inferior a aproximadamente 0,1, más preferentemente inferior a aproximadamente 0,01, y más preferentemente inferior a aproximadamente 0,001.

Una indicación adicional de que dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el primer polipéptido (por ejemplo un polipéptido codificado por el primer ácido nucleico) presenta reactividad inmunológica cruzada con el segundo polipéptido (por ejemplo un polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico). De esta manera, un polipéptido típicamente es sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, en el caso de que dos péptidos difieran únicamente en sustituciones conservadoras.

Otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibridan entre sí bajo condiciones astringentes. Existe una identidad sustancial en el caso de que los segmentos se hibriden ajo condiciones de hibridación astringente a una cadena, o a su complemento, típicamente utilizando una secuencia de por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos contiguos derivados de la secuencia de nucleótidos de la sonda.

La expresión "condiciones de hibridación astringentes" se refiere a condiciones comprendidas en un intervalo de entre aproximadamente 5ºC y aproximadamente 20ºC o 25ºC por debajo de la temperatura de disociación (Tm) de la secuencia diana y una sonda que presenta una complementariedad exacta o prácticamente exacta respecto de la diana. Tal como se utiliza en la presente memoria, la temperatura de disociación es la temperatura a la que se ha disociado en cadenas individuales la mitad de una población de moléculas de ácidos nucleicos de doble cadena. Los procedimientos para calcular la Tm de los ácidos nucleicos son bien conocidos de la técnica (ver, por ejemplo, Berger y Kimmel, Methods in Enzymology, vol. 152: Guide To Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press Inc., 1987; y Sambrook et al., supra, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, vols. 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Tal como indican las referencias estándares, puede calcularse una estimación simple del valor de Tm utilizando la ecuación siguiente: Tm=81,5 + 0,41 (% G+C), encontrándose el ácido nucleico en solución acuosa a NaCl 1 M (ver, por ejemplo, Anderson y Young, "Quantitative Filter Hybridization", en: Nucleic Acid Hybridization, 1985). Otras referencias incluyen cálculos más sofisticados que consideran características estructurales, así como las secuencias, para el cálculo de la Tm. La temperatura de disociación de un híbrido (y, de esta manera, las condiciones para la hibridación astringente) resulta afectada por diversos factores, tales como la longitud y la naturaleza (ADN, ARN, composición de bases) de la sonda y la naturaleza de la diana (ADN, ARN, composición de bases, presente en solución o inmovilizada, y similares) y la concentración de sales y de otros componentes (por ejemplo la presencia o ausencia de formamida, dextrano sulfato, polietilenglicol). Los efectos de estos factores son bien conocidos y se comentan en referencias estándares de la técnica; ver, por ejemplo, Sambrook, supra, y Ausubel, supra. Típicamente, las condiciones de hibridación astringente son concentraciones salinas inferiores a aproximadamente 1,0 M de ión sodio, típicamente entre aproximadamente 0,01 y 1,0 M de ión sodio a un pH entre 7,0 y 8,3, y temperaturas de por lo menos aproximadamente 30ºC para sondas cortas (por ejemplo de 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60ºC para sondas largas (por ejemplo de más de 50 nucleótidos). Tal como se ha indicado, las condiciones astringentes también pueden conseguirse con la adición de agentes desestabilizantes, tales como formamida, en cuyo caso pueden utilizarse temperaturas inferiores.

Las expresiones "sustancialmente puro" o "aislado" en referencia a proteínas y polipéptidos, por ejemplo CCX CKR, se refieren a aquellos polipéptidos que se separan de proteínas o de otros contaminantes con los que se encuentran naturalmente asociados. Una proteína o polipéptido se considera sustancialmente pura en el caso de que dicha proteína constituya más de aproximadamente 50% del contenido total de proteínas de la composición que contiene la proteína, y típicamente más de aproximadamente 60% del contenido total de proteínas. Más típicamente, una proteína o polipéptido sustancialmente puro o aislado constituirá por lo menos 75%, más preferentemente por lo menos 90% de las proteínas totales. Preferentemente, la proteína constituirá más de aproximadamente 90%, y más preferentemente, más de aproximadamente 95% de las proteínas totales en la composición. En referencia a polinucleótidos, las expresiones "sustancialmente puro" o "aislado" se refieren generalmente al polinucleótido separado de contaminantes con los que se encuentra asociado generalmente, por ejemplo lípidos, proteínas y otros polinucleótidos. Los polinucleótidos sustancialmente puros o aislados de la presente invención presentarán una pureza superior a aproximadamente 50%. Típicamente, estos polinucleótidos presentarán una pureza superior a aproximadamente 60%, más típicamente de entre aproximadamente 75% y aproximadamente 90%, y preferentemente de entre aproximadamente 95% y aproximadamente 98%.

La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del compuesto de la invención que inducirá la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o ser humano que busca el investigador, veterinario, doctor en medicina u otro responsable clínico.

Tal como se utiliza en la presente invención, un "efecto biológico" mediado por un receptor se refiere a un cambio de la función o estructura celular que resulta de la unión del receptor a un ligando natural (por ejemplo, la unión de CCX CKR a ELC) y puede incluir la internalización del receptor, la señalización mediada por un receptor (por ejemplo la activación de una proteína G de mamífero, la inducción de un incremento rápido y transitorio de la concentración de calcio citosólico libre), una función de respuesta celular (por ejemplo la estimulación de la quimotaxis o la liberación de mediadores inflamatorios), y similares.

II. Polipéptidos CCX CKR

En la presente invención se describen polipéptidos CCX CKR aislados, sustancialmente puros, o recombinantes y fragmentos inmunológicos de polipéptidos CCX CKR de mamífero. En un caso indicado en la presente memoria, el polipéptido CCX CKR o fragmento presenta una secuencia de aminoácidos idéntica, o sustancialmente idéntica, a la secuencia proporcionada en SEC ID nº 2 o a una subsecuencia de la misma.

A. Polipéptidos CCX CKR y variantes

En la presente memoria, se describen polipéptidos CCX CKR sustancialmente puros, aislados, o recombinantes. En algunos casos indicados en la presente memoria, el polipéptido CCX CKR presenta una secuencia de aminoácidos idéntica o sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 2. En otros casos indicados en la presente memoria, los polipéptidos CCX CKR son variantes y mutantes caracterizados por sustituciones conservadoras de residuos aminoácidos de la secuencia SEC ID nº 2.

El polipéptido puede ser de longitud completa (por ejemplo que contenga aproximadamente 350 aminoácidos para la especie mostrada en la figura 1) o puede codificar un fragmento de la proteína de longitud completa (por ejemplo que comprende por lo menos 20, por lo menos 40, por lo menos 60 o por lo menos 100 residuos de los polipéptidos CCX CKR y variantes de la invención). También se indican en la presente memoria polipéptidos CCX CKR que se encuentran modificados, respecto a la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2, de alguna manera, por ejemplo truncados, mutados, derivatizados o fusionados con otras secuencias (por ejemplo formando una proteína de fusión). Algunos polipéptidos CCX CKR comprenden inserciones, deleciones o sustituciones de residuos aminoácidos respecto a la secuencia SEC ID nº 2. Por ejemplo, pueden realizarse algunas sustituciones conservadoras de aminoácidos, es decir, la sustitución de aminoácidos seleccionados por aminoácidos diferentes que presentan características estructurales similares, por ejemplo carga neta, hidrofobicidad y similares.

Típicamente, las variantes de CCX CKR son estructural y funcionalmente similares al alelo de CCX CKR que presenta la secuencia SEC ID nº 2. La similitud estructural está indicada por, por ejemplo, una identidad de secuencia sustancial (tal como se ha definido anteriormente) o la reactividad inmunológica cruzada. La similitud funcional está indicada por, por ejemplo, una especificidad de unión de ligando similar o igual a la del alelo natural de CCX CKR, presentando dicho alelo la secuencia SEC ID nº 2 (por ejemplo ligante de ELC, SLC y TECK con elevada afinidad). En algunos casos indicados en la presente memoria, el polipéptido CCX CKR es una proteína de fusión o un fragmento (por ejemplo un fragmento de unión a ligando) del polipéptido de longitud completa codificado en la secuencia SEC ID nº 2. Tal como se utiliza en el presente contexto, un "fragmento de unión a ligando" de CCX CKR es un fragmento del polipéptido receptor que se une a ELC (por ejemplo ELC humano o de ratón), SLC (humano o de ratón) o TECK (humano o de ratón) con elevada afinidad (por ejemplo una Ki aparente o una IC_{50} relacionada inferior a aproximadamente 15 nM) o afinidad moderada (por ejemplo una Ki aparente o IC_{50} relacionada de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 200 nM). Los ensayos adecuados para detectar la unión son bien conocidos de la técnica (ver, por ejemplo, E.C. Hulme, "Receptor-Ligand Interactions", en: A PRACTICAL APPROACH/THE PRACTICAL APPROACH SERIES (editores de la serie: D. Rickwood y B.D. Hames), IRL Press at Oxford University Press, 1992, especialmente el capítulo 6, Wang et al., "The use of the filtration technique in in vitro radioligand binding assays for membrane-bound and solubilized receptors", y el capítulo 7, Hulme et al., "Centrifugation binding assays"; ver también Sissors et al., "A Homologous Receptor Binding Assay for HTS on FlashPlate plusNEN", Life Science Products Inc., Boston, MA 02118, 1999.

En un caso indicado en la presente invención, la unión se detecta tal como describen Dairaghi et al., J. Biol. Chem. 272:28206-209, 1997 (incorporada como referencia en su totalidad a todos los fines), sustituyendo los transfectantes de CCX CKR por los transfectantes de CCR3). En un caso indicado en la presente memoria, la unión se detecta utilizando la técnica basada en un filtro descrita por Dairaghi et al., J. Biol. Chem. 274:2156, 1999 (incorporada como referencia en su totalidad a todos los fines), por ejemplo tal como se muestra en la figura 4. Brevemente, esta tecnología utiliza la unión de ligando radioactivo expandida de eficiencia maximizada utilizando protocolos de filtración. En estos ensayos, se incuban 1x10^{5} células 293 HEK-CCXCKR con ELC marcado con ^{125}I (MIP3beta) (concentración final: \sim0,05 nM) en presencia de quimioquina no marcada durante 3 horas a 4ºC en HEPES 25 mM, NaCl 140 mM, CaCl_{2} 1 mM, Mac12 5 mM y albúmina de suero bovino al 0,2%, ajustado a pH 7,1. Las reacciones se aspiraron sobre filtros de fibra de vidrio GF/B tratados con PEI utilizando un recolector de células (Packard). Los filtros se lavaron dos veces (HEPES 25 mM, NaCl 500 mM, CaCl_{2} 1 mM, Mac12 5 mM, ajustado a pH 7,1) y se añadió líquido de centelleo (por ejemplo MicroScint 20; 50 \mul) a los filtros secos y se realizaron los conteos (por ejemplo utilizando un contador de centelleo Packard Topcount). Las curvas de dosis-respuesta competitiva se analizaron mediante procedimientos estándares para determinar los valores de IC_{50} (pro ejemplo utilizando el software GraphPad Prism, San Diego, CA). Además, puede utilizarse una transformación de Scatchard para estimar los sitios de los receptores en cada célula (por ejemplo utilizando el programa WaveMetrics Igor, Lake Oswego, OR).

Tal como se ha indicado, los ensayos de unión son bien conocidos y se apreciará que la unión puede detectarse utilizando diferentes condiciones de tamponado y tiempos de incubación y temperaturas. Por ejemplo, pueden llevarse a cabo ensayos a temperaturas comprendidas entre 37ºC y 4ºC, preferentemente entre aproximadamente 4ºC y aproximadamente 25ºC, más preferentemente a 4ºC, o también en tiempos de incubación de entre 1 hora y toda la noche (por ejemplo 3 horas). El pH del tampón puede encontrarse comprendido entre 6,8 y 7,6, y las concentraciones de NaCl pueden encontrarse comprendidas entre 0 y 160 mM (por ejemplo condiciones de tampón fisiológico). El porcentaje de BSA incluido también puede variar entre 0,1% y 0,5%. Las condiciones ejemplificativas son la incubación con 0,05 nM de ELC marcado con ^{125}I en presencia de quimioquina no marcada durante 3 horas a 4ºC en HEPES 25 mM, NaCl 140 mM, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 5 mM y albúmina de suero bovino al 0,2%, ajustado a pH 7,1. Otras variaciones son conocidas de la técnica.

Tal como se utiliza en la presente memoria, una quimioquina se une específicamente a un polipéptido CCX CKR en el caso de que se una al receptor por lo menos tan bien como una quimioquina de referencia especificada (por ejemplo ELC, SLC, TECK, mMIP-I\gamma, hBLC-1, mMIP-I\gamma, CTACK) que es conocido que se une a CCX CKR de tipo salvaje con afinidad elevada o, alternativamente, con afinidad moderada.

El polipéptido CCX CKR indicado en la presente memoria puede utilizarse como inmunógeno (por ejemplo para producir anticuerpos anti-CCX CKR). Típicamente, los fragmentos de CCX CKR inmunogénicos de la invención comprenden por lo menos aproximadamente 6 residuos contiguos de secuencia SEC ID nº 2, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 8, aproximadamente 10, aproximadamente 12 o aproximadamente 16 residuos contiguos.

Los polipéptidos CCX CKR sustancialmente puros, aislados o recombinantes indicados en la presente memoria también pueden caracterizarse por su capacidad de unirse a anticuerpos que son específicamente inmunorreactivos con un polipéptido que presenta la secuencia mostrada en la secuencia SEC ID nº 2. La inmunorreactividad específica habitualmente se caracteriza por una afinidad de unión específica de un anticuerpo para su ligando (por ejemplo CCX CKR) de por lo menos 10^{7}, 10^{8}, 10^{9} ó 10^{10} M^{-1}.

Para muchas aplicaciones, también resulta deseable proporcionar los polipéptidos CCX CKR en forma de entidades marcadas, es decir, unidas o enlazadas covalentemente a un marcaje o grupo detectable, o grupo entrecruzable, para facilitar la identificación, detección y cuantificación del polipéptido en una circunstancia dada. Estos grupos detectables pueden comprender un grupo polipeptídico detectable, por ejemplo, una enzima o epítopo de anticuerpo que pueden someterse a ensayo. Alternativamente, el grupo detectable puede seleccionarse de entre una diversidad de otros grupos o marcajes detectables, tales como marcajes radioactivos (por ejemplo ^{125}I, ^{32}P, ^{35}S) o un grupo quimioluminiscente o fluorescente. De manera similar, el grupo detectable puede ser un sustrato, cofactor, inhibidor o ligando de afinidad.

Además, puede modificarse un polipéptido CCX CKR mediante la sustitución de uno o más residuos aminoácidos por un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo D-lisina en lugar de L-lisina) para generar péptidos más estables. De manera similar, la modificación de los extremos amino-terminal o carboxi-terminal también puede utilizarse para proporcionar propiedades estabilizadoras a los polipéptidos de la invención, por ejemplo la amidación del extremo carboxilo-terminal o la acilación del extremo amino-terminal o derivados pegilados.

B. Producción y aislamiento de polipéptidos CCX CKR

Los polipéptidos CCX CKR indicados en la presente memoria pueden prepararse utilizando procedimientos recombinantes o sintéticos, o pueden aislarse a partir de un origen celular natural.

Las técnicas recombinantes adecuadas para expresar los polipéptidos CCX CKR a partir de polinucleótidos CCX CKR se dan a conocer infra (ver, también, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2a edición), vols. 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, y en Ausubel, supra. Los procedimientos sintéticos para sintetizar polipéptidos tales como los polipéptidos CCX CKR, variantes o fragmentos se describen en Merrifield, Amer. Chem. Soc. 85:2149-2456, 1963; Atherton et al., SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press, 1989; y Merrifield, Science 232:341-347, 1986.

El aislamiento y purificación de los polipéptidos CCX CKR indicados en la presente memoria puede llevarse a cabo mediante procedimientos que son generalmente bien conocidos de la técnica. Entre estos procedimientos se incluyen, aunque sin limitación, el intercambio iónico, la interacción hidrofóbica, la HPLC o cromatografía de afinidad, para conseguir la pureza deseada. En un caso indicado en la presente memoria, los polipéptidos CCX CKR se purifican utilizando cromatografía de inmunoafinidad. Por ejemplo, se acoplan anticuerpos cultivados contra un polipéptido CCX CKR o fragmento inmunogénico del mismo (por ejemplo que presenta una secuencia o subsecuencia de SEC ID nº 2) a un soporte sólido adecuado y se ponen en contacto con una mezcla de polipéptidos que contiene el polipéptido CCX CKR (por ejemplo un homogenado de tejido cerebral) bajo condiciones conducentes a la asociación de dicho polipéptido con el anticuerpo. Tras unirse el polipéptido CCX CKR al anticuerpo inmovilizado, el soporte sólido se lava para eliminar el material no unido y/o los polipéptidos unidos no específicamente. A continuación, el polipéptido deseado puede eluirse del soporte sólido en forma sustancialmente pura mediante, por ejemplo, un cambio del pH o de la concentración salina del tampón.

C. Análogos de péptidos y miméticos de péptidos de CCX CKR

Aunque descrito principalmente en términos de "proteínas" o "polipéptidos", el experto en la materia entenderá que pueden utilizarse análogos y derivados estructurales de los polipéptidos anteriormente indicados, por ejemplo peptidomiméticos, y similares, como sustitutos de CCX CKR, por ejemplo como agonistas de CCX CKR o, alternativamente, como antagonistas de la actividad de CCX CKR. Los peptidomiméticos, o miméticos de péptidos, son análogos de péptidos utilizados comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades (por ejemplo una actividad biológica) análogas a las del péptido molde (Fauchere, Adv. Drug Res. 15:29, 1986; Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229, 1987). Habitualmente se desarrollan con ayuda de modelos moleculares por ordenador. Los miméticos de péptidos que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles pueden utilizarse para producir un efecto terapéutico equivalente. Los miméticos de péptidos pueden presentar ventajas significativas sobre realizaciones de polipéptidos, incluyendo, por ejemplo, la producción más económica y una mayor estabilidad química.

III. Polinucleótidos CCX CKR

En la presente memoria, se describe un polinucleótido que presenta una secuencia o subsecuencia de un gen o ARN de CCX CKR de mamífero (por ejemplo de rata o humano). Los polinucleótidos indicados en la presente memoria (por ejemplo ARN, ADN, APN o quimeras) pueden ser de una cadena, de doble cadena o un híbrido mixto. En un caso descrito en la presente memoria, el polinucleótido presenta una secuencia de SEC ID nº 1 (figura 1) o subsecuencias de la misma (por ejemplo que comprenden por lo menos 15, por lo menos 25, por lo menos 50, por lo menos 100, por lo menos 200 o por lo menos 500 bases de los polinucleótidos y variantes de la invención). También se describen polinucleótidos con una identidad de secuencias sustancial respecto de los polinucleótidos CCX CKR dados a conocer en la presente memoria. De esta manera, se describen en la presente memoria alelos naturales de genes CCX CKR de mamífero (por ejemplo humanos), tales como variantes alélicas humanas de los polinucleótidos CCX CKR de secuencia SEC ID nº 1.

Tal como se describe infra, en algunos casos descritos en la presente memoria, el polinucleótido de la invención codifica un polipéptido con una similitud de secuencia sustancial respecto de la secuencia SEC ID nº 2 (figura 1) o codifica un fragmento de dicho polipéptido (por ejemplo una proteína de fusión). También se encuentran contemplados polinucleótidos que, debido a la degeneración del código genético, no son sustancialmente similares a la secuencia SEC ID nº 1, sino que codifican el polipéptido de secuencia SEC ID nº 2 o un fragmento del mismo. En otros casos indicados en la presente memoria, la invención proporciona polinucleótidos CCX CKR que no codifican necesariamente el polipéptido CCX CKR pero que resultan útiles, tales como, por ejemplo, sondas, cebadores, reactivos antisentido, tríplex o ribozimas, y similares.

También se describen vectores de expresión, líneas celulares y organismos transgénicos que comprenden los polinucleótidos CCX CKR. En algunos casos, los vectores, células y organismos de la invención son capaces de expresar los polipéptidos CCX CKR codificados.

Mediante la utilización de las directrices proporcionadas en la presente exposición, pueden producirse los polinucleótidos CCX CKR por medios recombinantes (ver, por ejemplo, Sambrook et al., Berger y Kimmel, Methods in Enzymology, Vol. 152: Guide To Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press Inc., 1987; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1999). Alternativamente, pueden sintetizarse químicamente polinucleótidos CCX CKR o fragmentos de los mismos utilizando procedimientos rutinarios bien conocidos de la técnica (ver, por ejemplo, Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90, 1979; Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979; Beaucage et al., Tetra. Lett. 22:1859, 1981). En algunos casos, los polinucleótidos CCX CKR de la invención contienen bases no naturales, por ejemplo desoxinosina (ver Batzer et al., Nucleic Acids Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994) o residuos o enlaces esqueléticos modificados.

A. Polinucleótidos codificantes de CCX CKR

En la presente memoria, se describen polinucleótidos codificantes de polipéptidos CCX CKR, tales como un polipéptido CCX CKR que presenta la secuencia SEC ID nº 2, un fragmento del mismo, una variante del mismo (por ejemplo una variante conservadora o alélica), o un polipéptido de fusión CCX CKR. En un caso descrito en la presente memoria, el polinucleótido de la invención comprende la secuencia SEC ID nº 1, o un fragmento de la misma. En otro caso descrito en la presente memoria, el polinucleótido codifica un polipéptido CCX CKR natural o un fragmento del mismo, pero presenta una secuencia que difiere de la secuencia SEC ID nº 1 (por ejemplo como resultado de la degeneración del código genético). En algunos casos, el polinucleótido no es ninguna de las etiquetas de secuencia expresadas H67224, AI131555, AA215577, AW190975 o AI769466 o el polinucleótido codificante de la PPR1 bovina (Matsuoka et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 194:540-11, 1993).

Los polinucleótidos resultan útiles para la expresión de polinucleótidos CCX CKR (por ejemplo ARN sentido o antisentido) y polipéptidos. Los procedimientos para la expresión recombinante de polinucleótidos y proteínas son bien conocidos de la técnica. Típicamente, los polinucleótidos CCX CKR de la invención se utilizan en vectores de expresión para la preparación de polipéptidos y polinucléotidos CCX CKR. Entre los vectores de expresión típicamente se incluyen señales de control transcripcional y traduccional (por ejemplo un promotor, un sitio de unión ribosómica, un codón ATG de inicio). Además, la eficiencia de la expresión puede incrementarse mediante la inclusión de intensificadores apropiados para el sistema celular utilizado. Por ejemplo, el intensificador de SV40 o el intensificador de CMV pueden utilizarse para incrementar la expresión en células huésped de mamífero.

En un caso descrito en la presente memoria, se inserta ADN codificante de un polipéptido CCX CKR en constructos de ADN capaces de ser introducidos y expresados en una célula huésped in vitro, tal como los sistemas de cultivo celular bacterianos (por ejemplo E. coli, Bacillus subtilus), de levadura (por ejemplo de Saccharomyces), de insecto (por ejemplo de Spodoptera frugiperda) o de mamífero. Entre los ejemplos de sistemas de cultivo celular de mamífero útiles para la expresión y producción de los polipéptidos de la presente invención se incluyen la línea renal embrionaria humana (293; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59, 1977); CHO (ATCC nº CCL 61 y nº CRL 9618); las células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC nº CCL2) y otras conocidas de la técnica. La utilización de un cultivo celular de tejido de mamífero para expresar polipéptidos se comenta de manera general en Winnacker, FROM GENES TO CLONES (VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987) y en Ausubel, supra.

En algunos casos descritos en la presente memoria, se utilizan promotores de genes de mamífero o de virus de mamífero, por ejemplo para la expresión en líneas celulares de mamífero. Los promotores adecuados pueden ser constitutivos, específicos de un tipo celular, específicos de un estadio y/o modulables o regulables (por ejemplo con hormonas, tales como glucocorticoides). Entre los promotores útiles se incluyen, aunque sin limitación, el promotor metalotioneína, el promotor tardío mayor constitutivo de adenovirus, el promotor MMTV inducible con dexametasona, el promotor de SV40 y las combinaciones de promotor-intensificador conocidas de la técnica.

Los polipéptidos CCX CKR o fragmentos de los mismos también pueden expresarse en animales transgénicos (ratón, oveja, vaca, etc.) y en plantas (tabaco, Arabidopsis, etc.) utilizando vectores de expresión apropiados que se integran en el cromosoma de la célula huésped.

B. Polinucleótidos u oligonucléotidos sondas y cebadores

En la presente memoria, se describen oligonucleótidos o polinucleótidos sondas y/o cebadores para detectar o amplificar polinucleótidos CCX CKR. En diversas formas de realización, los polinucleótidos (por ejemplo sondas y cebadores) comprenden por lo menos 10 bases contiguas idénticas o exactamente complementarias a la secuencia SEC ID nº 1, habitualmente por lo menos 12 bases, típicamente por lo menos 15 bases, generalmente por lo menos 18 bases y con frecuencia por lo menos 25, por lo menos 50 o por lo menos 100 bases. En el caso de que se utilicen los polinucleótidos CCX CKR de la invención como sondas o cebadores, generalmente presentan una longitud inferior a aproximadamente 3.000 bases; típicamente contienen entre aproximadamente 12 y aproximadamente 100 nucleótidos contiguos idénticos o exactamente complementarios a la secuencia SEC ID nº 1, más frecuentemente entre aproximadamente 12 y aproximadamente 50 nucleótidos contiguos, todavía más frecuentemente entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 nucleótidos contiguos.

En algunos casos descritos en la presente memoria, las sondas y los cebadores se modifican, por ejemplo, mediante la adición de sitios de restricción a las sondas o cebadores. En otros casos descritos en la presente memoria, los cebadores o sondas de la invención comprenden secuencias adicionales, tales como secuencias conectoras. En todavía algunos otros casos descritos en la presente memoria, los cebadores o sondas de la invención se modifican con marcajes detectables. Por ejemplo, los cebadores y sondas se modifican químicamente, por ejemplo se derivatizan, incorporando bases nucleótidas modificadas o que contienen un ligando capaz de unirse a un anti-ligando (por ejemplo la biotina).

Las sondas y cebadores CCX CKR pueden utilizarse para varios fines, por ejemplo para detectar o amplificar un polinucleótido CCX CKR en una muestra biológica, tal como se comenta en más detalle infra. Por ejemplo, provisto de la guía proporcionada en la presente memoria, el experto en la materia será capaz de seleccionar parejas de cebadores que amplifiquen específicamente la totalidad o una parte del gen, ARNm o ADNc de CCX CKR en una muestra. En un caso preferente descrito en la presente memoria, las parejas de cebadores y condiciones de amplificación se seleccionan para no amplificar otros ARN de receptor de quimioquina presentes en la muestra, por ejemplo debido a una no correspondencia en el extremo 3' entre los cebadores CCX CKR y otras secuencias génicas.

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C. Polinucleótidos inhibidores CCX CKR

Se describen en la presente memoria polinucleótidos inhibidores, tales como reactivos antisentido, tríplex y ribozima que presentan como diana, o que se hibridan, a polinucleótidos CCX CKR.

1. Polinucleótidos antisentido

Se describen en la presente memoria oligonucleótidos y polinucleótidos antisentido que pueden utilizarse para inhibir la expresión del gen CCX CKR. Algunos procedimientos terapéuticos de la invención, descritos en detalle adicional infra, implican la administración de un oligonucleótido que funciona inhibiendo o estimulando la actividad de CCX CKR bajo condiciones fisiológicas in vivo, y es relativamente estable bajo dichas condiciones durante un periodo de tiempo suficiente para que se produzca un efecto terapéutico. Los polinucleótidos pueden modificarse para proporcionar dicha estabilidad y para facilitar la administración dirigida del oligonucleótido en el tejido, órgano o célula deseado.

Los polinucleótidos antisentido comprenden una secuencia antisentido de por lo menos aproximadamente 10 bases, típicamente de por lo menos 12 ó 14 y hasta aproximadamente 3.000 nucleótidos contiguos que se hibrida específicamente a una secuencia de ARNm codificante de CCX CKR o de ARNm transcrito a partir del gen CCX CKR. Más frecuentemente, el polinucleótido antisentido presenta una longitud de entre aproximadamente 12 y aproximadamente 50 nucleótidos, o entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 nucleótidos. En general, el polinucleótido antisentido debe presentar una longitud suficiente para formar un dúplex estable, aunque suficientemente corto, dependiendo de la vía de administración, para la administración in vivo, si se desea. La longitud mínima de un polinucleótido necesaria para la hibridación específica con una secuencia diana depende de varios factores, tales como el contenido de G/C, la posición de las bases desapareadas (en caso de encontrarse alguna), el grado de unicidad de la secuencia en comparación con la población de polinucleótidos diana, y la naturaleza química del polinucleótido (por ejemplo esqueleto metilfosfonato, ácido nucleico péptido, fosforotioato), entre otros factores.

Generalmente, para garantizar la hibridación específica, la secuencia antisentido es sustancialmente complementaria a la secuencia diana de ARNm de CCX CKR. En determinados casos, la secuencia antisentido es exactamente complementaria a la secuencia diana. Entre los polinucleótidos antisentido también pueden incluirse, sin embargo, sustituciones, adiciones, deleciones, transiciones, trasposiciones o modificaciones de nucleótidos, u otras secuencias de ácidos nucleicos o grupos no ácidos nucleicos, con la condición de que la unión específica a la secuencia diana relevante correspondiente al ARN de CCX CKR o al gen del mismo se conserve como propiedad funcional del polinucleótido.

En un caso descrito en la presente memoria, la secuencia antisentido es complementaria a secuencias relativamente accesibles del ARNm de CCX CKR (por ejemplo relativamente carente de estructura secundaria). Lo anterior puede determinarse mediante el análisis de estructuras secundarias predichas del ARN utilizando, por ejemplo, el programa MFOLD (Genetics Computer Group, Madison, WI) y el ensayo in vitro o in vivo tal como es conocido de la técnica. Otro procedimiento útil para identificar las composiciones antisentido efectivas utiliza series de combinación de oligonucleótidos (ver, por ejemplo, Milner et al., Nature Biotechnology 15:537, 1997).

También se describe en la presente memoria un polinucleótido antisentido que presenta secuencias además de la secuencia antisentido (es decir, además de la secuencia de sentido anti-CCX CKR). En este caso, la secuencia antisentido se encuentra contenida dentro de un polinucleótido de secuencia más larga. En otro caso, la secuencia del polinucleótido consiste esencialmente, o es, la secuencia antisentido.

Los ácidos nucleicos antisentido (ADN, ARN, modificados, análogos y similares) pueden prepararse utilizando cualquier procedimiento adecuado para la producción de un ácido nucleico, tal como la síntesis química y procedimientos recombinantes dados a conocer en la presente memoria. En un caso descrito en la presente memoria, por ejemplo, pueden prepararse moléculas de ARN antisentido de la invención mediante síntesis química de novo o mediante clonación. Por ejemplo, puede construirse un ARN antisentido que se hibride al ARNm de CCX CKR mediante la inserción (ligación) de una secuencia de ADN de CCX CKR (por ejemplo la secuencia SEC ID nº 1 o un fragmento de la misma) en orientación inversa operablemente ligada a un promotor dentro de un vector (por ejemplo un plásmido). Con la condición de que el promotor y, preferentemente señales de terminación y de poliadenilación, se encuentren correctamente situadas, la cadena de la secuencia insertada correspondiente a la cadena no codificante será transcrita y actuará como oligonucleótido antisentido de la invención. Los oligonucleótidos antisentido de la invención pueden utilizarse para inhibir la actividad de CCX CKR en extractos libres de células, células y animales, incluyendo mamíferos y seres humanos.

Para procedimientos generales referentes a polinucleótidos antisentido, ver ANTISENSE RNA AND DNA, D.A. Melton, editor, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988). Ver también Dagle et al., Nucleic Acids Research 19:1805, 1991. Para una revisión de la terapia antisentido ver, por ejemplo, Uhlmann et al., Chem. Reviews 90:543-584, 1990.

2. Oligonucleótidos y polinucleótidos tríplex

Se describen en la presente memoria oligonucleótidos y polinucleótidos (por ejemplo ADN, ARN, APN y similares) que se unen a ácidos nucleicos de doble cadena o dúplex de CCX CKR (por ejemplo en una región plegada del ARN de CCX CKR o en el gen de CCX CKR), formando un ácido nucleico que contiene una triple hélice o "tríplex". La formación de triple hélice resulta en la inhibición de la expresión de CCX CKR mediante, por ejemplo, el bloqueo de la transcripción del gen de CCX CKR, reduciendo o eliminando de esta manera la actividad de CCX CKR en una célula. Sin pretender limitarse a ningún mecanismo particular, se cree que el apareamiento de triple hélice compromete la capacidad de la doble hélice de abrirse suficientemente para que se produzca la unión de las polimerasas, los factores de transcripción o las moléculas reguladoras.

Los oligonucleótidos y polinucleótidos tríplex de la invención se construyen utilizando las reglas de apareamiento de bases de formación de triples hélices (ver, por ejemplo, Cheng et al., J. Biol. Chem. 263:15110, 1988; Ferrin y Camerini-Otero, Science 354:1494, 1991; Ramdas et al., J. Biol. Chem. 264:17395, 1989; Strobel et al., Science 254:1639, 1991, y Rigas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:9591, 1986, cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria como referencia) y el ARNm de CCX CKR y/o la secuencia génica. Típicamente, los oligonucleótidos formadores de tríplex de la invención comprenden una secuencia específica de entre aproximadamente 10 y por lo menos aproximadamente 25 nucleótidos o "complementariedad" más larga respecto de una secuencia específica en el ARN o gen de CCX CKR (es decir, suficientemente grande para formar una triple hélice estable, aunque suficientemente pequeña, dependiendo de la vía de administración, para la administración in vivo, si se desea). En este contexto, "complementario" se refiere a que es capaz de formar una triple hélice estable. En un caso descrito en la presente memoria, los oligonucleótidos se diseñan para unirse específicamente a las regiones reguladoras del gen CCX CKR (por ejemplo la secuencia 5'-flanqueante, promotores e intensificadores de CCX CKR) o al sitio de inicio de transcripción (por ejemplo, entre -10 y +10 del sitio de inicio de transcripción). Para un revisión de los recientes avances terapéuticos utilizando ADN tríplex, ver Gee et al., en: Huber y Carr, MOLECULAR AND IMMUNOLOGIC APPROACHES, Futura Publishing Co., Mt Kisco NY, 1994; y Rininsland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5854, 1997, ambas incorporadas como referencia en la presente memoria.

3. Ribozimas

También se describen en la presente memoria ribozimas útiles para la inhibición de la actividad de CCX CKR. Las ribozimas de la invención se unen, y cortan e inactivan específicamente el ARNm de CCX CKR. Las ribozimas útiles pueden comprender secuencias 5' y 3'-terminales complementarias al ARNm de CCX CKR y pueden ser manipuladas por un experto en la materia basándose en la secuencia de ARNm de CCX CKR dada a conocer en la presente memoria (ver la publicación de patente PCT WO 93/23572, supra). Entre las ribozimas indicadas en la presente memoria se incluyen las que presentan características de las ribozimas intrones de grupo I (Cech, Biotechnology 13:323, 1995) y otros, de ribozimas de cabeza de martillo (Edgington, Biotechnology 10:256, 1992).

Entre las ribozimas indicadas en la presente memoria se incluyen las que presentan sitios de corte, tales como GUA, GUU y GUC. Entre otros sitios de corte óptimos para la inhibición mediada por ribozimas de la actividad de CCX CKR de acuerdo con la presente invención se incluyen aquellos indicados en las publicaciones de patentes PCT WO 94/02595 y 93/23569, ambas incorporadas en la presente memoria como referencia. Pueden evaluarse oligonucleótidos cortos de ARN, de longitud comprendida entre 15 y 20 ribonucleótidos, correspondientes a la región del gen CCX CKR diana que contenía el sitio de corte, para características de estructura secundaria que pueden provocar que el oligonucleótido resulte más deseable. La idoneidad de los sitios de corte también puede evaluarse analizando la accesibilidad a la hibridación con oligonucleótidos complementarios utilizando ensayos de protección frente a ribonucleasa, o mediante el ensayo para actividad de ribozimas in vitro de acuerdo con procedimientos estándares conocidos de la técnica.

Tal como describen Hu et al., publicación PCT WO 94/03596, pueden combinarse las funciones antisentido y de ribozima en un único oligonucleótido. Además, las ribozimas pueden comprender uno o más nucleótidos modificados o enlaces modificados entre nucleótidos, tal como se ha descrito anteriormente conjuntamente con la descripción de oligonucleótidos antisentido ilustrativos de la invención.

En un caso descrito en la presente memoria, las ribozimas se generan in vitro y se introducen en una célula o paciente. En otro caso, se utilizan procedimientos de terapia génica para la expresión de ribozimas en una célula diana ex vivo o in vivo.

4. Administración de oligonucleótidos

Típicamente, los procedimientos terapéuticos descritos en la presente memoria implican la administración de un oligonucleótido que funciona inhibiendo o estimulando la actividad de CCX CKR bajo condiciones fisiológicas in vivo, y resulta relativamente estable bajo dichas condiciones durante un periodo de tiempo suficiente para un efecto terapéutico. Tal como se ha indicado anteriormente, algunos ácidos nucleicos modificados pueden resultar útiles para proporcionar dicha estabilidad, así como para el direccionamiento de la liberación del oligonucleótido en el tejido, órgano o célula deseado.

Pueden administrarse oligonucleótidos y polinucleótidos directamente en forma de fármaco en una formulación farmacéutica adecuada, o indirectamente mediante la introducción de un ácido nucleico en una célula, incluyendo liposomas, inmunoliposomas, balísticos, incorporación directa en células y similares, tal como se indica en la presente memoria. Para el tratamiento de la enfermedad, los oligonucleótidos de la invención se administran en un paciente en una cantidad terapéuticamente efectiva. Una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad suficiente para mejorar los síntomas de la enfermedad o para modular la actividad de CCX CKR en la célula diana. Los procedimientos útiles para la administración de oligonucleótidos con fines terapéuticos se describen en la patente US nº 5.272.065. Se proporcionan posteriormente otros detalles sobre la administración de compuestos farmacéuticamente activos. En otro caso, los oligonucleótidos y polinucleótidos pueden administrarse mediante terapia génica y plásmidos de expresión de ADN recombinante de la invención.

D. Terapia génica

La terapia génica se refiere a la introducción de un polinucleótido de otra manera exógeno que produce un efecto fenotípico médicamente útil en la célula o células (típicamente) de mamífero en las que se transfiere. En la presente memoria, se describen procedimientos y composiciones de terapia génica para el tratamiento de condiciones asociadas a CCX CKR. En casos ilustrativos indicados en la presente memoria, la terapia génica implica la introducción en una célula de un vector que expresa un producto génico CCX CKR (tal como una proteína CCX CKR sustancialmente similar al polipéptido CCX CKR que presenta una secuencia SEC ID nº 2, por ejemplo para incrementar la actividad de CCX CKR, o un polipéptido CCX CKR inhibidor para reducir la actividad), expresa un ácido nucleico que presenta un gen o secuencia de ARNm de CCX CKR (tal como un ARN antisentido, por ejemplo para reducir la actividad de CCX CKR), expresa un polipéptido o polinucleótidos que de otra manera afecta a la expresión de los productos del gen CCX CKR (por ejemplo una ribozima dirigida a ARNm de CCX CKR para reducir la actividad de CCX CKR) o sustituye o perturba una secuencia endógena de CCX CKR (por ejemplo la sustitución génica y la desactivación génica, respectivamente). Numerosos otros caso resultarán evidentes para el experto en la materia tras la revisión de la exposición contenida en la presente memoria.

Los vectores útiles en la terapia génica de CCX CKR pueden ser víricos o no víricos, e incluyen aquellos indicados supra en relación a los sistemas de expresión de CCX CKR de la invención. El experto en la materia entenderá que los vectores de terapia génica pueden comprender promotores y otras secuencias reguladoras o de procesamiento, tales como las indicadas en la presente exposición. Habitualmente el vector comprenderá un promotor y, opcionalmente, un intensificador (separado de cualquier otro contenido dentro de las secuencias de promotor) que sirve para impulsar la transcripción de un oligorribonucleótido, así como otros elementos reguladores que proporcionan el mantenimiento episómico o la integración cromosómica y para la transcripción de nivel elevado, si se desea. Un plásmido útiles para la terapia génica puede comprender otros elementos funcionales, tales como marcadores seleccionables, regiones de identificación y otras secuencias. Las secuencias adicionales pueden presentar funciones en la provisión de estabilidad tanto en el exterior como en el interior de una célula, direccionando la liberación de las secuencias de nucleótidos de CCX CKR (sentido o antisentido en un órgano, tejido o población celular especificado, mediando en la entrada en una célula, mediando entre la entrada en el núcleo de una célula y/o mediando la integración en el ADN nuclear. Por ejemplo, las estructuras de ADN similares a un aptámero, u otros sitios de grupos de unión a proteína, pueden utilizarse para mediar en la unión de un vector a receptores de superficie celular o a proteínas séricas que se unen a un receptor, incrementado de esta manera la eficiencia de la transferencia del ADN en la célula. Otros sitios y estructuras de ADN pueden unirse directa o indirectamente a receptores en la membrana nuclear o a otras proteínas que se introducen en el núcleo, facilitando de esta manera la incorporación nuclear de un vector. Otras secuencias de ADN pueden afectar directa o indirectamente la eficiencia de la integración.

Los vectores de terapia génica adecuados pueden presentar o no un origen de replicación. Por ejemplo, resulta útil incluir un origen de replicación en un vector para la propagación del vector previamente a la administración en un paciente. Sin embargo, el origen de replicación con frecuencia puede eliminarse antes de la administración en el caso de que el vector se haya diseñado para integrarse en el ADN cromosómico del huésped o para unirse al ARNm o ADN del huésped.

Tal como se ha indicado, se describen en la presente memoria procedimientos y reactivos para la terapia de sustitución génica (es decir, la sustitución mediante recombinación homóloga de un gen CCX CKR endógeno con un gen recombinante). Pueden utilizarse vectores diseñados específicamente para la integración mediante recombinación homóloga. Entre los factores importantes para optimizar la recombinación homóloga se incluyen el grado de identidad de secuencia y la longitud de la homología con secuencias cromosómicas. La secuencia específica que media en la recombinación homóloga también resulta importante, debido a que la integración se produce mucho más fácilmente en el ADN transcripcionalmente activo. Los procedimientos y materiales para construir constructos de direccionamiento homólogos se describen en, por ejemplo, Mansour et al., Nature 336:348, 1988; Bradley et al., Bio/Technology 10:534, 1992. Ve también las patentes US nº 5.627.059, nº 5.487.992, nº 5.631.153 y nº 5.464.764. En un caso descrito en la presente memoria, la terapia de sustitución génica implica alterar o sustituir la totalidad o una parte de las secuencias reguladoras que controlan la expresión del gen CCX CKR que debe ser reglado. Por ejemplo, las secuencias de promotor de CCX CKR (figura 5) pueden interrumpirse (para reducir el nivel de expresión de CCX CKR o para eliminar un sitio de control transcripcional) o sustituirlas por un promotor exógeno (por ejemplo para incrementar la expresión de CCX CKR).

También se describen en la presente memoria procedimientos y reactivos para la "inactivación génica" de CCX CKR (es decir, la deleción o interrupción mediante recombinación homóloga de un gen CCX CKR endógeno utilizando un vector producido por recombinación). En la desactivación génica, las secuencias diana pueden ser secuencias reguladoras (por ejemplo el promotor de CCX CKR) o ARN o secuencias codificantes de proteína. La utilización de la recombinación homóloga para alterar la expresión de genes endógenos se describe en detalle en la patente US nº 5.272.071, WO 91/09955, WO 93/09222, WO 96/29411, WO 95/31560 y WO 91/12650. Ver también Moynahan et al., Hum. Mol. Genet. 5:875, 1996.

Los vectores de terapia génica pueden introducirse en células o tejidos in vivo, in vitro o ex vivo. Para la terapia ex vivo, los vectores pueden introducirse en células, por ejemplo células madre obtenidas del paciente y propagadas clonalmente para el trasplante autólogo nuevamente en el paciente (ver, por ejemplo, las patentes US nº 5.399.493 y nº 5.437.994).

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IV. Anticuerpos

Se describen en la presente memoria anticuerpos que son específicamente inmunorreactivos con el polipéptido CCX CKR humano. De acuerdo con ello, los anticuerpos reconocen específicamente y se unen a polipéptidos que presentan una secuencia de aminoácidos idéntica, o sustancialmente idéntica, a la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2, o a un fragmento inmunogénico de la misma. Los anticuerpos habitualmente muestran una afinidad de unión específica para CCX CKR de por lo menos aproximadamente 10^{7}, 10^{8}, 10^{9} ó 10^{10} M^{-1}.

Los anticuerpos anti-CCX CKR presentan una diversidad de usos, por ejemplo el aislamiento de polipéptidos CCX CKR (por ejemplo mediante cromatografía de inmunoafinidad), la detección de polipéptidos CCX CKR y para la inhibición de la actividad de CCX CKR (por ejemplo in vivo o in vitro).

A. Producción de anticuerpos anti-CCX CKR

Pueden prepararse anticuerpos anti-CCX CKR mediante una diversidad de medios bien conocidos por el experto en la materia, por ejemplo tal como se ha descrito supra. Tal como se ha indicado en la Sección I, supra, los anticuerpos se definen ampliamente en la presente memoria e incluyen específicamente fragmentos, quimeras y agentes de unión similares (por ejemplo los productos de la tecnología de expresión fágica) que se unen específicamente a un polipéptido o epítopo de CCX CKR. Sin embargo, el término "anticuerpo" no pretende referirse a quimioquinas (por ejemplo ELC, SLC, TECK, BLC y vMIPII) que se unen (son ligandos) a CCX CKR.

Los procedimientos para la producción de anticuerpos policlonales o monoclonales son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991; Stites et al. (editores), BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7a edición), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y referencias citadas en las mismas ("Stites"); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2a edición), Academic Press, New York, NY (1986); Kohler y Milstein, Nature 256:495-97, 1975, y Harlow y Lane. Entre estas técnicas se incluyen la preparación de anticuerpos mediante la selección de anticuerpos de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares (ver Huse et al., Science 246:1275-81, 1989; y Ward et al., Nature 341:544-46, 1989).

Para la producción de anticuerpos policlonales, se selecciona un sistema inmunológico diana apropiado, típicamente un ratón o conejo, aunque también se incluyen cabras, ovejas, vacas, pollos, cobayas, monos y ratas. Las inmunoglobulinas producidas por el huésped pueden precipitarse, aislarse y purificarse mediante procedimientos rutinarios, incluyendo la purificación por afinidad. Pueden producirse poblaciones de anticuerpos sustancialmente monoespecíficas mediante purificación cromatográfica de los sueros policlonales.

Para los anticuerpos monoclonales, se seleccionan animales apropiados y se sigue el protocolo de inmunización deseado. Los anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier isotipo, por ejemplo IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, siendo más preferentes IgG, IgA e IgM. Los anticuerpos anti-CCX CKR monoclonales preferentes neutralizan (es decir inhiben o bloquean) una o más actividades biológicas de CCX CKR. Dichos anticuerpos pueden obtenerse mediante el cribado de sobrenadantes de hibridomas para la actividad inhibidora deseada. Los anticuerpos monoclonales con afinidades de 10^{8} litros/mol, preferentemente de entre 10^{9} y 10^{10} o más fuertes, pueden producirse mediante los procedimientos descritos posteriormente. La producción de anticuerpos monoclonales no humanos, por ejemplo murinos, lagomorfos o equinos, es bien conocida y puede llevarse a cabo mediante, por ejemplo, la inmunización de un animal huésped con una preparación que contenga CCX CKR o fragmentos del mismo. Las células productoras de anticuerpos obtenidas a partir de los animales inmunizados se inmortalizan y se criban, o se criban en primer lugar para la producción de anticuerpos que se unen al polipéptido CCX CKR y después se inmortalizan.

Algunos anticuerpos anti-CCX CKR monoclonales son humanizados, humanos o quiméricos, con el fin de reducir su potencial antigenicidad sin reducir su afinidad para su diana. Se han descrito en la técnica anticuerpos humanizados. Ver, por ejemplo, Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029, 1989; patentes US nº 5.563.762, nº 5.693.761, nº 5.585.089 y nº 5.530.101. Las secuencias de anticuerpo humano utilizadas para la humanización pueden ser las secuencias de anticuerpos humanos naturales o pueden ser secuencias de consenso de varios anticuerpos humanos (ver Kettleborough et al., Protein Engineering 4:773, 1991; Kolbinger et al., Protein Engineering 6:971, 1993).

También pueden producirse anticuerpos monoclonales humanizados contra CCX CKR utilizando animales transgénicos que presenten elementos de un sistema inmunológico humano (ver, por ejemplo, las patentes US nº 5.569.825, nº 5.545.806, nº 5.693.762, nº 5.693.761 y nº 5.714.350).

También pueden producirse composiciones de unión a CCX CKR útiles utilizando tecnología de expresión fágica (ver, por ejemplo, Dower et al., documento WO 91/17271 y McCafferty et al., documento WO 92/01047). En estos procedimientos, se producen bibliotecas de fagos en las que los miembros expresan diferentes anticuerpos sobre las superficies externas de los mismos. Los anticuerpos habitualmente se expresan en forma de fragmentos Fv o Fab. Se seleccionan los fagos que expresan anticuerpos con una especificidad deseada mediante enriquecimiento por afinidad con un polipéptido CCX CKR.

Tras la expresión, los anticuerpos completos, sus dímeros, cadenas individuales ligeras y pesadas, u otras formas de inmunoglobulina de la presente invención, pueden purificarse siguiendo procedimientos estándares de la técnica, incluyendo la precipitación con sulfato amónico, la cromatografía de afinidad, la electroforesis en gel y similares (ver generalmente PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, 3a edición (Springer-Verlag, N.Y., 1994)).

Un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-CCX CKR) es sustancialmente puro cuando por lo menos aproximadamente 80%, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 90%, todavía más frecuentemente por lo menos aproximadamente 95%, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 99% o más de las moléculas de polipéptido presentes en una preparación se unen específicamente al mismo antígeno (por ejemplo el polipéptido CCX CKR). Para los usos farmacéuticos, se prefieren las inmunoglobulinas anti-CCX CKR de una homogeneidad aproximada comprendida entre 90% y 95%, siendo más preferente una homogeneidad de entre 98% y 99% o más.

B. Modificación de los anticuerpos de CCX CKR

Los anticuerpos pueden utilizarse con o sin modificación. Frecuentemente, los anticuerpos se marcan mediante la unión, covalente o no covalentemente, de una sustancia que proporciona una señal detectable. Entre dichos marcajes se incluyen aquellos que son bien conocidos de la técnica, por ejemplo los marcajes radioactivos, fluorescentes o bioactivos (por ejemplo enzimáticos). Como entidades de unión marcadas, los anticuerpos pueden resultar particularmente útiles en aplicaciones diagnósticas.

También se describen en la presente memoria anticuerpos híbridos que comparten la especificidad de anticuerpos contra un polipéptido CCX CKR, aunque también son capaces de unión específica a un segundo grupo. En los anticuerpos híbridos, una pareja de cadena pesada y cadena ligera procede de un anticuerpo y la otra pareja de un anticuerpo cultivado contra otro epítopo. Lo anterior resulta en la propiedad de la valencia multifuncional, es decir la capacidad de unirse a por lo menos dos epítopos diferentes simultáneamente. Dichos híbridos pueden formarse mediante fusión de hibridomas productores de los anticuerpos-componente respectivos, o mediante técnicas de recombinación.

C. Selección de anticuerpos sin reactividad cruzada

En algunos casos descritos en la presente memoria, se produce un antisuero anti-CCX CKR monoclonal o policlonal que es específicamente inmunorreactivo con CCX CKR y se selecciona para que presente una reactividad cruzada reducida contra otros receptores de quimioquina, y se elimine cualquier nivel de dicha reactividad cruzada mediante inmunoadsorción previamente a la utilización en el inmunoensayo. Los procedimientos para cribar y caracterizar los anticuerpos monoclonales para su especificidad son bien conocidos de la técnica y se describen generalmente en Harlow y Lane, supra.

Con el fin de producir un antisuero policlonal (por ejemplo para la utilización en un inmunoensayo), se prepara la proteína de secuencia SEC ID nº 2 en un antisuero policlonal utilizando procedimientos bien conocidos de la técnica, tales como los descritos supra. Por ejemplo, puede producirse una proteína recombinante en una línea celular de mamífero. Se inmuniza una cepa consanguínea de ratones, tales como balb/c, con la proteína de secuencia SEC ID nº 2 utilizando un adyuvante estándar, tal como adyuvante de Freund, y un protocolo de inmunización de ratones estándar (ver Harlow y Lane, supra). Alternativamente, puede utilizarse como inmunógeno un péptido sintético derivado de las secuencias dadas a conocer en la presente memoria y conjugarse con una proteína portadora. Se recogen sueros policlonales y se titulan contra la proteína inmunógeno en un inmunoensayo, por ejemplo en un inmunoensayo de fase sólida con el inmunógeno inmovilizado sobre un soporte sólido. Los antisueros policlonales con un título de 10^{4} o superior se seleccionan y se someten a ensayo para su reactividad cruzada contra otros receptores de quimioquina humanos (por ejemplo uno o más de entre: CCR1, CCR2, (CCR2A, CCR2B), CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9A/B, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CX3CR1 y XCR1) u otros receptores acoplados a proteína G (por ejemplo PPR1 bovino) utiliznado un inmunoensayo de unión competitiva tal como el descrito en Harlow y Lane, supra, en las páginas 570 a 573. Los inmunoensayos en el formato de unión competitiva pueden utilizarse para las determinaciones de la reactividad cruzada. Por ejemplo, la proteína de secuencia SEC ID nº 2 puede inmovilizarse en un soporte sólido. Las proteínas añadidas al ensayo compiten por la unión de los antisueros con el antígeno inmovilizado. La capacidad de las proteínas anteriormente indicadas se compara con la proteína de secuencia SEC ID nº 2. Se calcula el porcentaje de reactividad cruzada de las proteínas anteriormente indicadas utilizando cálculos estándares. Aquellos antisueros con una reactividad cruzada inferior al 10% con cada una de las proteínas listadas anteriormente se seleccionan y se agrupan. Los anticuerpos que reaccionan cruzadamente seguidamente se eliminan de los antisueros agrupados mediante inmunoadsorción utilizando las proteínas anteriormente listadas.

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V. Identificación de ligandos de CCX CKR

Las quimioquinas a las que se une CCX CKR se identificaron tal como se ha descrito infra, en los Ejemplos 4 a 6. Dentro del espectro de ligandos que se unen a CCX CKR se incluyen ELC, SLC, CTACK y TECK con elevada afinidad, y BLC, mMIP-I\gamma y vMIPII con afinidad más baja. Las quimioquina ELC (también denominada MIP-3beta) y SLC (también denominada 6Cquina) y su receptor afín, CCR7, presentan efectos profundos sobre la regulación de las células dendríticas (DC) y las células T. Se ha demostrado que ELC y SLC son atractores importantes de DC maduras (aunque no de inmaduras), y se ha asugerido que controlan la migración de los nuevamente postulados linfocitos T de memoria central (T_{CM}). Las deleciones genéticas naturales o dirigidas de ELC, SLC o CCR7 resultan en marcadas deficiencias en el tráfico de células DC, T y B, así como en la alteración morfológica de la arquitectura de los órganos linfoides secundarios (Sallusto et al., Nature 401:708, 1999; Forster et al., Cell 99:23, 1999; Gunn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95:258, 1998; Gunn et al., J. Exp. Med. 189:451, 1999; Yanagihara et al., J. Immunol. 161:3096, 1998; Yoshida et al., J. Biol. Chem. 272:13803, 1997; Yoshida et al., J. Biol. Chem. 273:7118, 1998). CCR7 se relaciona con otro receptor de quimioquina, CCR9 (anteriormente denominado clon huérfano GPR9.6), que se ha demostrado que es un receptor de la quimioquina CC TECK (Zabel et al., J. Exp. Med. 190:1241, 1999; Zaballos et al., J. Immunol. 162:5671, 1999). El apareamiento CCR9/TECK se ha informado de que resulta importante para la regulación de los timocitos, así como de los linfocitos con patrones de direccionamiento guiados al tracto gastrointestinal (Youn et al., Blood 94:2533, 1999). Hasta hoy, CCR9 ha sido el único receptor de TECK informado y CCR7, el único receptor verosímil para ELC y SLC, a pesar de que han aparecido informes contradictorios (Jenh et al., J. Immunol. 162:3765, 1999; Soto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8205, 1998) respecto a la unión de SLC.

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VI. Cribado e identificación de moduladores de la actividad de CCX CKR

La invención también proporciona procedimientos de ensayo que son capaces de cribar compuestos que modulan la actividad de CCX CKR. Resultan de particular interés los compuestos que se unen a CCX CKR, incluyendo los compuestos que compiten para la unión con una quimioquina, ELC. La presente invención resulta particularmente útil para cribar compuestos mediante la utilización de un receptor recombinante en una diversidad de técnicas de cribado de fármacos. De esta manera, la presente invención incluye procedimientos para evaluar agonistas o antagonistas específicos putativos de la función de CCX CKR. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente invención se refiere a la utilización de dichos compuestos en la preparación y ejecución de ensayos de cribado para compuestos que modulan la actividad del receptor de quimioquina CCX CKR. Por ejemplo, los compuestos de la presente invención resultan útiles para aislar receptores mutantes, que son excelentes herramientas de cribado para compuestos más potentes. Además, los compuestos de la presente invención resultan útiles para establecer o determinar el sitio de unión de otros compuestos al receptor de quimioquina CCX CKR, por ejemplo mediante inhibición competitiva. Los compuestos de la invención también resultan útiles para la evaluación de moduladores específicos putativos del receptor de quimioquina CCX CKR, respecto de otros receptores de quimioquina, incluyendo CCR-1, CCR-2 (CCR2A, CCR2B), CCR-3, CCR-4, CCR-5 y CXCR-4.

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Puede utilizarse una diversidad de ensayos para evaluar los moduladores de CCX CKR, incluyendo los ensayos de unión de CCX CKR, los ensayos de señalización de CCX CKR, los ensayos de quimotaxis, niveles de segundo mensajero, es decir Ca++, la proliferación celular, cambios del pool de fosfato de inositol y otros ensayos de respuesta celular.

Un procedimiento de cribado de fármacos utiliza células huésped eucarióticas o procarióticas que se transforman establemente con moléculas de ADN recombinante que expresan CCX CKR, por ejemplo la proteína que presenta la secuencia de SEC ID nº 2. Dichas células, en forma viable o fija, pueden utilizarse para ensayos estándares de unión de ligando/receptor (ver, por ejemplo, Parce et al., Science 246:243-247, 1989; y Owicki et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:4007-4011, 1990, que describen procedimientos sensibles para detectar las respuestas celulares). Un compuesto de ensayo puede someterse a ensayo para la unión o para la competencia con otros ligando para la unión. Con frecuencia, el compuesto de ensayo o el "otro ligando" se marcan. En diversas formas de realización, los compuestos de ensayo se evalúan para la competencia con una quimioquina u otro ligando para la unión a CCX CKR o a un fragmento de unión a ligando del mismo. En algunas formas de realización, la quimioquina es ELC, SLC, TECK, BLC, CTACK, mMIP-I\gamma o vMIPII. En formas de realización relacionadas, la quimioquina es una quimioquina diferente de ELC, SLC, TECK, BLC, CTACK, mMIP-I\gamma o vMIPII unido al polipéptido CCX CKR con afinidad elevada o moderada.

En un ensayo adecuado, se utiliza una proteína CCX CKR (aislada o recombinante) que presenta por lo menos una propiedad, actividad o característica funcional de una proteína CCX CKR humana. La propiedad puede ser una propiedad de unión (a, por ejemplo, un ligando o inhibidor), tal como un perfil de unión (por ejemplo de la unión a ELC, SLC y TECK, aunque no de la unión a quimioquinas ligadas con poca o ninguna afinidad por el polipéptido receptor de CCX CKR (por ejemplo de secuencia SEC ID nº 2), por ejemplo de unión tanto a TECK como a ELC o a SLC), una actividad de señalización (por ejemplo la activación de una proteína G de mamífero, la inducción de un incremento rápido y transitorio de la concentración de calcio libre citosólico [Ca^{++}]i), una función de respuesta celular (por ejemplo la estimulación de la quimotaxis o la liberación de mediador inflamatorio por leucocitos) y similares.

En una forma de realización, una composición que contiene una proteína CCX CKR o variante de la misma se mantiene bajo condiciones adecuadas para la unión. El receptor de CCX CKR se pone en contacto con un agente putativo (o una segunda composición que contiene por lo menos un agente putativo) que debe someterse a ensayo, y se detecta o se mide el grado de unión.

En una forma de realización, el ensayo es un ensayo basado en células y se utilizan células que son transfectadas estable o transitoriamente por un vector o casete de expresión que presenta una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el receptor de CCX CKR. Las células se mantienen bajo condiciones apropiadas para la expresión del receptor y se ponen en contacto con un agente putativo bajo condiciones apropiadas para que se produzca la unión. La unión puede detectarse utilizando técnicas estándares. Por ejemplo, pude determinarse el grado de unión respecto a un control adecuado (por ejemplo, respecto al fondo en ausencia de un agente putativo, o respecto a un ligando conocido). Opcionalmente, puede utilizarse una fracción celular, tal como una fracción de membranas, que contenga el receptor en sustitución de células completas.

La detección de unión o la formación de complejo pueden detectarse directa o indirectamente. Por ejemplo, el agente putativo puede marcarse con un marcaje adecuado (por ejemplo marcajes fluorescentes, marcaje quimioluminiscente, marcaje isotópico o marcaje enzimático y similares) y la unión puede determinarse a partir de la detección del marcaje. Puede evaluarse la unión específica y/o competitiva mediante estudios de competencia o de desplazamiento utilizando agente no marcado o un ligando (por ejemplo ELC, SLC, TECK, BLC, mCTACK, mMIP-I\gamma o vMIPII) como competidor.

En otras formas de realización, pueden utilizarse ensayos de inhibición de la unión para evaluar los presentes compuestos. En estos ensayos, los compuestos se evalúan como inhibidores de la unión de ligando utilizando, por ejemplo, ELC, SLC, TECK, BLC o vMIPII. En la presente forma de realización, el receptor de CCX CKR se pone en contacto con un ligando, tal como ELC, SLC, TECK, BLC, mCTACK, mMIP-I\gamma o vMIPII, y se lleva a cabo una medición del grado de unión de ligando. A continuación, el receptor se pone en contacto con un agente de ensayo en presencia de un ligando (por ejemplo ELC, SLC, TECK, BLC, mCTACK, mMIP-I\gamma o vMIPII), y se lleva a cabo una segunda medición del grado de unión. Una reducción del grado de unión de ligando es indicativa de la inhibición de la unión por parte del agente de ensayo. Los ensayos de inhibición del a unión pueden llevarse a cabo utilizando células completas que expresen CCX CKR, o una fracción membranal de las células que expresan CCX CKR.

La unión de un receptor acoplado a proteína G por ejemplo a un agonista puede resultar en un suceso de señalización por parte del receptor. De acuerdo con ello, también pueden utilizarse ensayos de señalización para evaluar los compuestos de la presente invención y puede realizarse un seguimiento de la inducción de la función de señalización utilizando cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, puede someterse a ensayo la actividad de la proteína G, tal como la hidrólisis de GTP a GDP, o sucesos de señalización posteriores desencadenados por la unión de receptor, utilizando procedimientos conocidos (ver, por ejemplo, la patente PCT/US97/15915; Neote et al., Cell 72:415-25, 1993; Van Riper et al., J. Exp. Med. 177:851-56, 1993, y Dahinden et al., J. Exp. Med. 179:751-56, 1994).

También pueden utilizarse los ensayos de quimotaxis para evaluar la función del receptor y para evaluar los compuestos proporcionados en la presente memoria. Dichos ensayos se basan en la migración funcional de células (por ejemplo células que expresan CCX CKR recombinante) in vitro o in vivo inducidas por un agente, y pueden utilizarse para evaluar la unión y/o el efecto sobre la quimotaxis de ligandos, inhibidores o agonistas. Se describen ensayos adecuados en la patente PCT/US97/15915; Springer et al., documento WO nº 94/20142; Berman et al., 1988 Immunol. Invest. 17:625-77, 1988; y Kavanaugh et al., J. Immunol. 146:4149-4156, 1991.

Los compuestos de ensayo, los moduladores de la actividad de CCX CKR o los moduladores putativos y otros compuestos proporcionados en la presente memoria también pueden evaluarse utilizando modelos de inflamación para evaluar la capacidad del compuesto de ejercer un efecto in vivo. Se indican a continuación modelos adecuados: un modelo de oveja para el asma (ver Weg et al., J. Exp. Med. 177:561, 1993) y un modelo de rata de la hipersensbiilidad de tipo retardado (ver Rand et al., Am. J. Pathol. 148:855-864, 1996). Otro modelo útil para evaluar los compuestos de la invención es el modelo de la encefalomielitis autoinmunológica experimental (EAE) para la esclerosis múltiple, que sondea la expresión y función de los receptores de quimioquina (ver Ransohoff et al., Cytokine Growth Factor Rev. 7:35-46, 1996; y Karpus et al., J. Immunol. 161:2667-2671, 1998).

Además, también pueden utilizarse los ensayos de infiltración de leucocitos para evaluar un compuesto (ver Van Damme et al., J. Exp. Med. 176:59-65, 1992; Zachariae et al., J. Exp. Med. 171:2177-2182, 1990; y Jose et al., J. Exp. Med. 179:881-887, 1994).

En los últimos años, se han desarrollado varios procedimientos para automatizar los ensayos de manera que resulte posible cribar decenas de miles de compuestos en un periodo corto de tiempo (ver, por ejemplo, Fodor et al., Science 251:767-73, 1991, y otras descripciones de bibliotecas de diversidad química, que describen medios para someter a ensayo la afinidad de unión de una pluralidad de compuestos). El desarrollo de ensayos adecuados puede resultar muy facilitado por la disponibilidad de grandes cantidades de CCX CKR purificado y/o de células que expresan CCX CKR recombinante, tal como se describe en la presente memoria.

En algunos casos descritos en la presente memoria, de procedimientos de detección y de cribado de la invención, la quimioquina y el polipéptido CCX CKR son la misma especie. En otros casos, la quimioquina se une naturalmente al receptor.

VII. Procedimientos de tratamiento de condiciones o enfermedades mediadas por CCX CKR

En la presente memoria, se describen procedimientos para tratar condiciones o enfermedades mediadas por CCX CKR mediante la administración en un sujeto que presenta dicha enfermedad o condición, de una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador de la función de CCX CKR, es decir agonistas (estimuladores) y antagonistas (inhibidores) de la función o de la expresión génica de CCX CKR. Entre dichos moduladores se incluyen agonistas de molécula pequeña y antagonistas de la función de CCX CKR; polipéptidos inhibidores (por ejemplo mutantes dominantes negativos), polinucleótidos antisentido, ribozimas y tríplex; terapia génica (para la inhibición, por ejemplo la desactivación génica o la sobreexpresión) y similares.

Las enfermedades y condiciones asociadas a la inflamación, infección y el cáncer pueden tratarse con los presentes compuestos y composiciones. En un grupo de formas de realización, pueden tratarse enfermedades o condiciones, incluyendo enfermedades crónicas de seres humanos o de otras especies, con inhibidores de la función de CCX CKR. Entre dichas enfermedades y condiciones se incluyen: (1) enfermedades inflamatorias o alérgicas, tales como la anafilaxis sistémica o las respuestas de hipersensibilidad, alérgicas medicamentosas, alérgicas por picaduras de insecto, enfermedades intestinales inflamatorias, tales como la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, ileitis y enteritis; vaginitis, soriasis y dermatosis inflamatorias, tales como dermatitis, eccema, dermatitis atópica, dermatitis alérgica por contacto, urticaria, vasculitis, espondiloartropatías, esclerodermia; enfermedades alérgicas respiratorias, tales como asma, rinitis alérgica, enfermedades pulmonares por hipersensibilidad, y similares, (2) enfermedades autoinmunológicas, tales como artritis (reumatoide y soriática), esclerosis múltiple, lupus eritematosos sistémico, diabetes, glomerulonefritis y similares, (3) rechazo del injerto (incluyendo el rechazo del aloinjerto y la enfermedad de injerto contra huésped), y (4) otras enfermedades en las que deben inhibirse respuestas inflamatorias no deseadas (por ejemplo la ateroesclerosis o la miositis). En otro grupo de formas de realización, las enfermedades o condiciones se tratan con agonistas de la función de CCX CKR o reactivos o procedimientos para incrementar la expresión de CCX CKR. Entre los ejemplos de enfermedades que deben tratarse con agonistas de CCX CKR se incluyen cánceres, enfermedades en las que la angiogénesis o la neovascularización desempeñan un papel (enfermedades neoplásicas, retinopatía y degeneración macular), enfermedades infecciosas y enfermedades inmunosupresoras. De manera similar, los productos, agonistas y antagonistas del gen CCX CKR, encuentran utilidad en el remodelado, reparación y regeneración de tejidos y órganos.

Por ejemplo, los moduladores de la actividad de CCX CKR pueden inhibir la proliferación y diferenciación de las células implicadas en una respuesta inflamatoria. El término "inflamación" presenta el significado normal de la técnica, y se refiere a respuestas tanto agudas (es decir, respuestas en las que los procesos inflamatorios se encuentran activos) como crónicas (es decir, respuestas marcadas por la progresión lenta y la formación de tejido conectivo nuevo). La inflamación aguda y la inflamación crónica pueden distinguirse por los tipos celulares implicados. La inflamación aguda con frecuencia implica neutrófilos polimorfonucleaares, mientras que la inflamación crónica normalmente está caracterizada porque presenta una respuesta linfohistiocítica y/o granulomatosa. La inflamación incluye reacciones de los sistemas de defensa tanto específicos como no específicos. Una reacción de un sistema de defensa específico es una respuesta de reacción de un sistema inmunológico específico frente a un antígeno (posiblemente incluyendo un autoantígeno). Una reacción de un sistema de defensa no específico es una respuesta inflamatoria mediada por leucocitos incapaces de presentar memoria inmunológica. Entre dichas células se incluyen granulocitos, macrófagos, neutrófilos y eosinófilos. Los ensayos para la inflamación son bien conocidos de la técnica. Los reactivos proporcionados por la presente invención pueden utilizarse para tratar condiciones inflamatorias, tanto crónicas como agudas, incluyendo la inflamación asociada a la infección (por ejemplo el choque séptico, la sepsis o el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS)), el daño isquémico por reperfusión, la letalidad por una endotoxina, la artritis, el rechazo hiperagudo mediado por un complemento, la nefritis, el daño pulmonar inducido por citoquina o quimioquina, la enfermedad intestinal inflamatoria, la enfermedad de Crohn, o que resultan de la sobreproducción de citoquinas (por ejemplo TNF o IL-1). Son ejemplos de tipos específicos de inflamación la inflamación difusa, la inflamación focal, la inflamación cruposa, la inflamación intersticial, la inflamación obliterativa, la inflamación parenquimatosa, la inflamación reactiva, la inflamación específica, la inflamación tóxica y la inflamación traumática.

Los procedimientos y reactivos indicados en la presente memoria pueden utilizarse en el tratamiento de animales, tales como mamíferos (por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejos, ratas o ratones) o en modelos animales o in vitro (por ejemplo en cultivo celular) de enfermedades humanas.

VIII. Composiciones farmacéuticas

También se describen en la presente memoria composiciones terapéuticas que comprenden agonistas, antagonistas o ligandos de CCX CKR, y procedimientos para el tratamiento de condiciones fisiológicas o patológicas mediadas por CCX CKR.

Los polipéptidos CCX CKR, fragmentos de los mismos, polipéptidos sentido y antisentido, anticuerpos anti-CCX CKR o fragmentos ligantes de los mismos, y antagonistas o agonistas (por ejemplo moduladores de molécula pequeña) de la actividad de CCX CKR, pueden administrarse directamente bajo condiciones estériles en el huésped que debe tratarse. Sin embargo, aunque resulta posible que el ingrediente activo se administre solo, con frecuencia resulta preferible presentarlo en forma de una formulación farmacéutica. Las formulaciones típicamente comprenden por lo menos un ingrediente activo conjuntamente con uno o más portadores aceptables del mismo. Cada portador debe ser aceptable tanto farmacéutica como fisiológicamente en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes y no perjudicial para el paciente. Por ejemplo, el agente bioactivo pueden acomplejarse con proteínas portadoras, tales como ovoalbúmina o albúmina sérica previamente a su administración, con el fin de incrementar la estabilidad o las propiedades farmacológicas, tales como la vida media. Además, las formulaciones terapéuticas indicadas en la presente memoria pueden combinarse o utilizarse en asociación con otros agentes quimioterapéuticos o quimiopreventivos.

Pueden prepararse formulaciones terapéuticas mediante cualquier procedimiento bien conocido de la técnica farmacéutica (ver, por ejemplo, Gilman et al. (editores), Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8^{a} edición), Pergamon Press, y Remington's Pharmaceutical Sciences (17^{a} edición), Mack Publishing Co., Easton, P.A., 1990; Avis et al. (editores), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, N.Y., 1993; Lieberman et al. (editores), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, N.Y., 1990; y Lieberman et al. (editores), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, N.Y., 1990.

Dependiendo de la enfermedad que debe tratarse y de la condición del sujeto, los compuestos indicados en la presente memoria pueden administrarse por vía oral, parenteral (por ejemplo intramsucular, intraperitoneal, intravenosa, ICV, inyección intracisternal o infusión, inyección subcutánea, o implante), mediante pulverización inhalada, nasal, vaginal, rectal, sublingual o vías tópicas de administración, y puede formularse, sola o conjuntamente, en formulaciones adecuadas de unidad de dosificación que contengan portadores, adyuvantes y vehículos no tóxicos convencionales farmacéuticamente aceptables, apropiados para cada vía de administración. Las composiciones farmacéuticas que contienen el ingrediente activo pueden encontrarse en una forma adecuada para la utilización oral, por ejemplo como tabletas, trociscos, pastillas, suspensiones acuosas o aceitosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas, o jarabes o elixires. Las composiciones destinadas a la utilización oral pueden prepararse según cualquier procedimiento conocido de la técnica de preparaciones de composiciones farmacéuticas, y dichas composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados de entre el grupo constituido por agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y agentes conservantes, con el fin de proporcionar preparaciones farmacéuticamente elegantes y comestibles. Las tabletas contienen el ingrediente activo mezclado con excipientes no tóxicos farmacéuticamente aceptables que resultan adecuados para la preparación de tabletas. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato sódico, lactosa, fosfato cálcico o fosfato sódico; agentes de granulación y desintegrantes, por ejemplo almidón de maíz o ácido algínico; agentes ligantes, por ejemplo almidón, gelatina o acacia, y agentes lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Las tabletas pueden encontrarse no recubiertas o pueden recubrirse mediante técnicas conocidas para retrasar la desintegración y la absorción en el tracto gastrointestinal y de esta manera proporcionar una acción sostenida durante un periodo más prolongado. Por ejemplo, puede utilizarse un material de retardo temporal tal como el monoestearato de glicerilo o el diestearato de glicerol. También pueden recubrirse mediante técnicas descritas en las patentes US nº 4.256.108, nº 4.166.452 y nº 4.265.874 para formar tabletas terapéuticas osmóticas para la liberación controlada.

Las formulaciones para la utilización oral también pueden presentarse como cápsulas de gelatina dura, en las que el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín, o en forma de cápsulas de gelatina blanda, en las que el ingrediente activo se mezcla con agua o con un medio aceite, por ejemplo aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.

Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos mezclados con excipientes adecuados para la preparación de suspensiones acuosas. Dichos excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato sódico, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma acacia; los agentes dispersantes o humectantes pueden ser un fosfátido natural, por ejemplo lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetilenoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol, tal como monooleato de polioxietilén sorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de polietileno sorbitán. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes, por ejemplo etilo o n-propilo, p-hidroxibenzoato, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes, y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.

Pueden formularse suspensiones aceitosas mediante la suspensión del ingrediente activo en un aceite vegetal, por ejemplo aceite de araquis, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, o en un aceite mineral, tal como parafina líquida. Las suspensiones aceitosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo cera de abeja, parafina dura o alcohol cetílico. Pueden añadirse agentes edulcorantes, tales como los indicados anteriormente, y agentes saborizantes para proporcionar una preparación oral comestible. Estas composiciones pueden conservarse mediante la adición de un antioxidante, tal como ácido ascórbico.

Los polvos y gránulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan el ingrediente activo mezclado con un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión y uno o más conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes adecuados se encuentran ejemplificados por los ya mencionados anteriormente. También pueden encontrarse presentes excipientes adicionales, por ejemplo agentes edulcorantes, saborizantes y colorantes.

Las composiciones farmacéuticas también pueden encontrarse en la forma de emulsiones de aceite en agua. La fase aceitosa puede ser un aceite vegetal, por ejemplo aceite de oliva o aceite de araquis, o un aceite mineral, por ejemplo parafina líquida o mezclas de los mismos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas naturales, por ejemplo goma acacia o goma tragacanto, fosfáticos naturales, por ejemplo soja, lecitina, y ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de sorbitán, y productos de condensación de dichos ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo monooleato de polioxietileno sorbitán. Las emulsiones también pueden contener agentes edulcorantes y saborizantes.

Pueden formularse jarabes y elixires con agentes edulcorantes, por ejemplo glicerol, propilenglicol, sorbitol o sacarosa. Dichas formulaciones también pueden contener un demulcente, un conservante y agentes saborizantes y colorantes.

Las composiciones farmacéuticas pueden encontrase en la forma de una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión puede formularse según la técnica conocida utilizando los agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes de suspensión que han sido mencionados anteriormente. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo en forma de solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y solventes aceptables que pueden utilizarse se encuentran agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico. Además, se utilizan convencionalmente aceites fijos estériles como solvente o como medio de suspensión. Con este fin puede utilizarse cualquier aceite fijo suave, incluyendo monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además, algunos ácidos grasos, tales como el ácido oleico, encuentran utilidad en la preparación de inyectables.

Los compuestos indicados en la presente memoria también pueden administrarse en forma de supositorios para la administración rectal del fármaco. Estas composiciones pueden prepararse mediante la mezcla del fármaco con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperaturas ordinarias pero líquido a la temperatura rectal y por lo tanto se fundirá en el recto, liberando el fármaco. Dichos materiales son manteca de cacao y polietilenglicoles.

Para la utilización tópica, se utilizan cremas, pomadas, gelatinas, soluciones o suspensiones, etc., que contienen los compuestos de la presente invención. Tal como se utiliza en la presente memoria, la aplicación tópica también pretende incluir la utilización de lavados y gárgaras bucales.

La composición y procedimiento farmacéuticos descritos en la presente memoria pueden comprender además otros compuestos terapéuticamente activos, tal como se indica en la presente memoria, que habitualmente se aplican en el tratamiento de las condiciones patológicas anteriormente indicadas.

En el tratamiento o prevención de condiciones que requieren la modulación del receptor de quimioquina, un nivel de dosis apropiado generalmente se encontrará comprendido entre aproximadamente 0,001 y 100 mg por kg de peso corporal del paciente al día, que puede administrarse en una dosis o en múltiples dosis. Preferentemente, el nivel de dosis se encontrará comprendido entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 25 mg/kg al día; más preferentemente, entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 10 mg/kg al día. El nivel de dosis adecuado puede encontrarse comprendido entre aproximadamente 0,01 y 25 mg/kg al día, entre aproximadamente 0,05 y 10 mg/kg al día, o entre aproximadamente 0,1 y 5 mg/kg al día. Dentro de dicho intervalo, la dosis puede encontrarse comprendida entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 0,05, entre 0,05 y 0,5 o entre 0,5 y 5 mg/kg al día. Para la administración oral, las composiciones preferentemente se proporcionan en la forma de tabletas que contienen entre aproximadamente 1 y 1.000 miligramos del ingrediente activo, particularmente aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 750, 800, 900 y 1.000 miligramos del ingrediente activo para el ajuste sintomático de la dosis para el paciente que debe tratarse. Los compuestos pueden administrarse en un régimen de 1 a 4 veces al día, preferentemente de una o dos veces al día.

Sin embargo, se entenderá que el nivel de dosis específico y la frecuencia de la dosificación para cualquier paciente particular puede modificarse y dependerá de una diversidad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico utilizado, la estabilidad metabólica y la duración de la acción de dicho compuesto, la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo, la dieta, el modo y tiempo de administración, la tasa de excreción, la combinación de fármacos, la severidad de la condición particular y el huésped sometido a terapia.

Los compuestos descritos en la presente memoria pueden combinarse con otros compuestos que presenten utilidades relacionadas para prevenir y tratar trastornos y enfermedades inflamatorias e inmunorreguladoras, incluyendo el asma y enfermedades alérgicas, así como patologías autoinmunológicas, tales como artritis reumatoide y ateroesclerosis, y aquellas patologías indicadas anteriormente.

Por ejemplo, en el tratamiento o la prevención de la inflamación, pueden utilizarse los presentes compuestos conjuntamente con un agente antiinflamatorio o analgésico, tal como un agonista opiáceo, un inhibidor de lipooxigenasa, tal como un inhibidor de la 5-lipooxigenasa, un inhibidor de ciclooxigenasa, tal como un inhibidor de la 2-ciclooxigenasa, un inhibidor de interleuquina, tal como un inhibidor de la interleuquina-1, un antagonista de NMDA, un inhibidor del óxido nítrico o un inhibidor de la síntesis del óxido nítrico, un agente antiinflamatorio no esteroideo, o un agente antiinflamatorio supresor de citoquinas, por ejemplo con un compuesto tal como acetaminofeno, aspirina, codieno, fentanilo, ibuprofeno, infometacina, cetorolac, morfina, naproxén, fenacetina, piroxicam, un analgésico esteroideo, sufentanilo, sunlindac, tenidap y similares. De manera similar, los compuestos de la invención pueden administrarse con un calmante del dolor; un potenciador, tal como cafeína, un antagonista H2, simeticona, hidróxido de aluminio o de magnesio; un descongestionante, tal como fenilefrina, fenilpropanolamina, pseudoefedrina, oximetazolina, epinefrina, naftazolina, xilometazolina, propilhexedrina o levo-desoxi-efedrina; un antitutsivo, tal como codeína, hidrocodona, caramfifén, carbetapentano o dextrametorfano; un diurético, y un antihistamínico sedante o no sedante. De manera similar, los compuestos indicados en la presente memoria pueden utilizarse en combinación con otros fármacos que se utilizan en el tratamiento/prevención/supresión o mejora de las enfermedades o condiciones para las que los compuestos de la presente invención resultan útiles. Pueden administrarse dichos otros fármacos mediante una vía y en una cantidad comúnmente utilizados para los mismos, contemporánea o secuencialmente con un compuesto de la presente invención. En el caso de que un compuesto indicado en la presente invención se utilice simultáneamente con uno o más otros fármacos, resulta preferente una composición farmacéutica que contenga dichos otros fármacos además del compuesto de la presente invención. De acuerdo con lo anterior, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente invención incluyen aquéllas que también contienen uno o más otros ingredientes activos además de un compuesto de la presente invención. Entre los ejemplo de otros ingredientes activos que pueden combinarse con un compuesto indicado en la presente memoria, administrados separadamente o en las mismas composiciones farmacéuticas se incluyen, aunque sin limitarse a los mismos: (a) antagonistas de VLA-4; (b) esteroides, tales como beclometasona, metilprednisolona, betametasona, prednisona, dexametasona e hidrocortisona; (c) inmunosupresores, tales como ciclosporina, tacrolimus, rapamicina y otros inmunosupresores de tipo FK-506; (d) antihistamínicos (antagonistas de la histamina H1), tales como bromofeniramina, clorfeniramina, dexclorfeniramina, triprolidina, clemastina, defenhidramina, difenilpiralina, tripelenamina, hidroxicina, metdilazina, prometazina, trimeprazina, azatadina, ciproheptadina, antazolina, feniramina pirilamina, astemizol, terfenadina, loratadina, cetirizina, fexofenadina, descarboetoxiloratadina y similares; (e) antiasmáticos no esteroideos, tales como agonistas beta-2 (terbutalina, metaproterenol, fenoterol, isoetarina, albuterol, bitolterol y pirbuterol), teofilina, cromolin sódico, atropina, bromuro de ipratropio, antagonistas de leucotrieno (zafirlukast, montelukast, pranlukast, iralukast, pobilukast, SKB-106.203), inhibidores de la biosíntesis de leucotrieno (zileuton, BAY-1005); (f) agentes antiinflamatorios no esteroideos (NSAID), tales como derivados del ácido propiónico (alminoprofeno, benoxaprofeno, ácido buclóxico, carprofeno, fenbufeno, fenoprofeno, fluprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indoprofeno, cetoprofeno, miroprofeno, naproxeno, oxaprozin, pirprofén, pranoprofén, suprofén, ácido tiaprofénico y tioxaprofén), derivados de ácido acético (indometacina, acemetacina, alclofenac, clidanac, diclofenac, fenclofenac, ácido fenclózico, fentiazac, furofenac, ibufenac, isoxepac, oxpinac, sulindac, tiopinac, tolmetin, zidometacina y zomepirac), derivados del ácido fenámico (ácido fluofenámico, ácido meclofenámico, ácido mefenámico, ácido niflúmico y ácido tolfenámico), derivados del ácido bifenilcarboxílico (diflunisal y flufenisal), oxicams (isoxicam, piroxicam, sudoxicam y tenoxican), salicilatos (ácido acetilsalicílico, sulfasalazina) y las pirazolonas (aparazona, bezpiperilón, feprazona, mofebutazona, oxifenbutazona, fenilbutazona; (g) inhibidores de la ciclooxigenasa-2 (COX-2); (h) inhibidores de la fosfodiesterasa de tipo IV (PDE-IV); (i) otros antagonistas de los receptores de quimioquina, especialmente CCR-1, CCR-2, CCR-3 y CCR-5; (j) agentes reductores del colesterol, tales como inhibidores de la HMG-CoA reductasa (lovastatina, simvastatina y pravastatina, fluvastatina, atorvastatina y otras estatinas), secuestrantes (colestiramina y colestipol), ácido nicotínico, erivados del ácido fenofíbrico (gemfibrozil, clofibrat, fenofibrato y benzafibrato) y probucol; (k) agentes antidiabéticos, tales como insulina, sulfonilureas, biguanidas (metformina), inhibidores de alfa-glucosidasa (acarbosa) y glitazonas (troglitazona y pioglitazona); (l) preparaciones de interferón beta (interferón beta-1 alfa, interferón beta-1 beta); (m) otros compuestos, tales como ácido 5-aminosalicílico y profármacos del mismo, antimetabolitos tales como azatioprina y 6-mercaptopurina, y agentes quimioterapéuticos del cáncer citotóxicos. La proporción entre el peso del compuesto de la presente invención y el segundo ingrediente activo puede modificarse y dependerá de la dosis efectiva de cada ingrediente. Generalmente se utiliza una dosis efectiva de cada uno. De esta manera, por ejemplo, en el caso de que un compuesto de la presente invención se combine con un NSAID, la proporción en peso entre el compuesto de la presente invención y el NSAID generalmente se encontrará comprendida entre aproximadamente 1.000:1 y aproximadamente 1:1.000, preferentemente entre aproximadamente 200:1 y aproximadamente 1:200. Las combinaciones de un compuesto indicado en la presente memoria y otros ingredientes activos generalmente también se encuentran comprendidas en el intervalo anteriormente indicado, aunque en cada caso debe utilizarse una dosis efectiva de cada ingrediente activo.

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IX. Detección y cuantificación de polinucleótidos y polipéptidos CCX CKR

También se describen en la presente memoria varios procedimientos para la detección y cuantificación de los polipéptidos y polinucleótidos CCX CKR en muestras biológicas. En un caso descrito en la presente memoria, la expresión o sobreexpresión del producto del gen CCX CKR (por ejemplo un polipéptido o un ARNm) se correlaciona con una enfermedad o condición mediada o asociada con CCX CKR. Se apreciará a partir del patrón de expresión de ARNm de CCX CKR (ver la figura 2B) que la detección de los productos del gen CCX CKR resulta particularmente útil para identificar el estado celular, por ejemplo para identificar células dendríticas inmaduras (en contraste con las maduras), así como las células T activadas.

Las muestras biológicas pueden incluir, aunque sin limitación, una muestra de sangre, suero, células (incluyendo células completas, fracciones celulares, extractos celulares y células o líneas celulares en cultivo), tejidos (incluyendo tejidos obtenidos mediante biopsia), líquidos corporales (por ejemplo orina, esputo, líquido amniótico, líquido sinovial) o de medios (de células o líneas celulares en cultivo), y similares. Entre los procedimientos para detectar o cuantificar los polinucleótidos CCX CKR se incluyen, aunque sin limitación, ensayos basados en la amplificación con o sin amplificación de señal, ensayos basados en la hibridación, y ensayos de combinación de amplificación-hibridación. Para detectar y cuantificar los polipéptidos CCX CKR, un procedimiento ejemplar es un inmunoensayo que utiliza un anticuerpo u otro agente de unión que se una específicamente a un polipéptido o epítopo de CCX CKR.

A. Ensayos para polinucleótidos CCX CKR 1. Procedimientos basados en la amplificación

La reacción en cadena de al polimerasa (PCR) o sus variaciones es un ensayo basado en la amplificación ejemplar. Se encuentran ejemplos de técnicas suficientes para guiar al experto en la materia en los procedimientos de amplificación in vitro en: PCR TECHNOLOGY: PRINCIPLES AND APPLICATIONS FOR DNA AMPLIFICATION, H. Erlich, Ed. Freeman Press, New York, NY, 1992; PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, editores Innis, Gelfland, Snisky and White, Academic Press, San Diego, CA, 1990. Entre otros procedimientos de amplificación adecuados de dianas se incluyen la reacción en cadena de la ligasa (LCR; por ejemplo Wu y Wallace, Genomics 4:560, 1989), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA; por ejemplo Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:392-396, 1992); la amplificación basada en una secuencia de ácidos nucleicos (NASBA; Cangene, Mississauga, Ontario; por ejemplo Compton, Nature 350:91, 1991) y similares.

Una variante útil de la PCR es la PCR ELISA (por ejemplo Boehringer Mannheim, nº de cat. 1 636 111) en la que se incorpora digoxigenina-dUTP en el producto de PCR. La mezcla de reacción de PCR se desnaturaliza y se hibrida con un oligonucleótido marcado con biotina diseñado para hibridarse con una secuencia interna del producto de PCR. Los productos de hibridación se inmovilizan sobre placas recubiertas con estreptavidina y se detectan utilizando anticuerpos anti-digoxigenina.

2. Procedimientos basados en la hibridación

El experto en la materia conoce una diversidad de procedimientos para la medición de ADN y ARN específicos utilizando técnicas de hibridación de polinucleótidos (ver Sambrook, supra). Los ensayos basados en la hibridación se refieren a ensayos en los que se hibrida una sonda polinucleótida con un polinucleótido diana. Habitualmente las sondas polinucleótidas de hibridación de la invención son completa o sustancialmente idénticas a una secuencia contigua de la secuencia de ácidos nucleicos de CCX CKR. Preferentemente, las sondas polinucleótidas presentan una longitud de por lo menos aproximadamente 10 bases, con frecuencia por lo menos aproximadamente 20 bases, y en ocasiones por lo menos aproximadamente 200 bases o más. Los procedimientos para seleccionar sondas de sonda polinucleótida para la utilización en la hibridación de polinucleótidos se comentan en Sambrook, supra.

Los formatos de hibridación de polinucleótidos son conocidos del experto en la materia. En algunos formatos, se inmoviliza por lo menos uno de entre diana y sonda. El polinucleótido inmovilizado puede ser ADN, ARN u otro oligonucleótido o polinucleótido, y puede comprender nucleótidos naturales o no naturales, análogos o esqueletos de nucleótidos. Dichos ensayos pueden encontrarse en cualquiera de entre varios formatos, incluyendo: transferencias southern, northern, puntiforme y en ranura, matrices de alta densidad de polinucleótidos u oligonucleótidos (por ejemplo GeneChips^{TM}, de Affymetrix), varillas de inmersión, clavos, chips o perlas. Todas dichas técnicas son bien conocidas de la técnica y son la base de muchos kits de diagnóstico disponibles comercialmente. Las técnicas de hibridación se describen de manera general en Hames et al., editor, NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION, A PRACTICAL APPROACH, IRL Press, 1985; Gall y Pardue, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 63:378-382, 1969; y John et al., Nature 223:582-587, 1969.

En un caso descrito en la presente memoria, se utiliza la hibridación in situ para detectar secuencias de CCX CKR en una muestra. Los ensayos de hibridación in situ son bien conocidos y se describen de manera general en Angerer et al., METHODS ENZYMOL. 152:649-660, 1987, y en Ausubel, supra.

B. Ensayos de polipéptido CCX CKR

En un caso descrito en la presente memoria, el polinucleótido CCX CKR se detecta en una muestra utilizando un anticuerpo anti-CCX CKR de la invención. Varios ensayos de unión inmunológica bien establecidos resultan adecuados para detectar y cuantificar el CCX CKR de la presente invención (ver, por ejemplo, las patentes US nº 4.366.241, nº 4.376.110, nº 4.517.288 y nº 4.837.168, y también METHODS IN CELL BIOLOGY, VOLUME 37: ANTIBODIES IN CELL BIOLOGY, Asai, editor, Academic Press, Inc., New York, 1993; BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY, 7^{a} edición, Stites & Terr, editores, 1991; Harlow, supra [por ejemplo, el capítulo 14], y Ausubel, supra [por ejemplo el capítulo 11], cada uno de los cuales se incorpora como referencia en su totalidad y a todos los fines.

Los inmunoensayos para detectar CCX CKR pueden ser competitivos o no competitivos. Habitualmente, el producto del gen CCX CKR sometido a ensayo se detecta directa o indirectamente utilizando un marcaje detectable. El marcaje o grupo detectable particular utilizado en el ensayo habitualmente no es un aspecto crítico de la invención con la condición de que no interfiera significativamente con la unión específica del anticuerpo o anticuerpos utilizados en el ensayo. El marcaje puede unirse covalentemente al agente de captura (por ejemplo un anticuerpo anti-CCX CKR) o puede unirse a un tercer grupo, tal como otros anticuerpo que se une específicamente al polipéptido CCX CKR en un epítopo diferente al reconocido por el agente de captura.

1. Inmunoensayo no competitivo

Los inmunoensayos no competitivos son ensayos en los que se mide directamente la cantidad de analito capturada (en la presente memoria, el polipéptido CCX CKR). Uno de dichos ensayos es un inmunoensayo de dos sitios basado en un anticuerpo monoclonal que utiliza anticuerpos monoclonales reactivos con dos epítopos no interfirientes en el analito capturado (ver, por ejemplo, Maddox et al., J. Exp. Med. 158:1211, 1983 para información sobre los antecedentes). En dicho ensayo, se mide directamente la cantidad de CCX CKR en la muestra. Por ejemplo, utilizando un ensayo denominado de "sándwich", el agente de captura (en la presente memoria, los anticuerpos anti-CCX CKR) pueden unirse directamente a un sustrato sólido en el que se inmovilizan. Estos anticuerpos inmovilizados seguidamente captura el polipéptido presente en la muestra de ensayo. El CCX CKR inmovilizado de esta manera seguidamente se une a un agente de marcaje, tal como un segundo anticuerpo de CCX CKR que porta un marcaje. Alternativamente, el segundo anticuerpo de CCX CKR puede no presentar un marcaje, aunque puede, a su vez, unirse a un tercer anticuerpo marcado específico de los anticuerpos de la especie a partir de la que se derivó el segundo anticuerpo. El segundo puede modificarse con un grupo detectable, tal como biotina, a la que puede unirse específicamente una tercera molécula marcada, tal como estreptavidina marcada enzimáticamente.

2. Inmunoensayo competitivo

En ensayos de competencia, se mide indirectamente la cantidad de polipéptido CCX CKR presente en la muestra mediante la medición de la cantidad de un CCX CKR añadido (exógeno) desplazado (o que pierde en competencia) respecto de un agente de captura (por ejemplo anticuerpo anti-CCX CKR) por el analito presente en la muestra (por ejemplo el polipéptido CCX CKR). En un ensayo de competición, se añade una cantidad conocida de CCX CKR a la muestra y después la muestra se pone en contacto con un agente de captura (por ejemplo un anticuerpo anti-CCX CKR) que se une específicamente a CCX CKR. La cantidad de CCX CKR unida al anticuerpo es inversamente proporcional a la concentración de CCX CKR presente en la muestra.

Preferentemente, el anticuerpo se inmoviliza sobre un sustrato sólido. La cantidad de CCX CKR unida al anticuerpo puede determinarse mediante la medición de la cantidad de CCX CKR presente en un complejo de CCX CKR/anticuerpo, o alternativamente mediante la medición de la cantidad de CCX CKR no acomplejado remanente. La cantidad de CCX CKR puede detectarse mediante la provisión de una molécula de CCX CKR marcado.

Por ejemplo, utilizando el ensayo de inhibición de hapteno, el analito (en este caso CCX CKR) se inmoviliza sobre un sustrato sólido. Se añade una cantidad conocida de anticuerpo anti-CCX CKR a la muestra y después la muestra se pone en contacto con el CCX CKR inmovilizado. En este caso, la cantidad de anticuerpo anti-CCX CKR unido a CCX CKR inmovilizado es inversamente proporcional a la cantidad de CCX CKR presente en la muestra. Nuevamente, la cantidad de anticuerpo inmovilizado puede detectarse mediante la detección de la fracción inmovilizada de anticuerpo o la fracción del anticuerpo que permanece en solución. La detección puede ser directa en el caso de que el anticuerpo se encuentre marcado, o indirecta mediante la adición posterior de un grupo marcado que se une específicamente al anticuerpo tal como se ha indicado anteriormente.

3. Otros ensayos

Además de los inmunoensayos de polipéptido CCX CKR competitivos y no competitivos, también se describen en la presente memoria otros ensayos para la detección y cuantificación de polipéptidos CCX CKR. Por ejemplo, el análisis de transferencia Western (inmunotransferencia) puede utilizarse para detectar y cuantificar la presencia de CCX CKR en la muestra. La técnica comprende generalmente separar polipéptidos de la muestra mediante electroforesis en gel basada en el peso molecular, transferir los polipéptidos separados a un soporte sólido adecuado (tal como un filtro de nitrocelulosa, un filtro de nylon, o filtro de nylon derivatizado) e incubar la muestra con los anticuerpos que se unen específicamente a CCX CKR. Los anticuerpos anti-CCX CKR se unen específicamente a CCX CKR sobre el soporte sólido. Estos anticuerpos pueden marcarse directamente o, alternativamente, pueden detectarse posteriormente utilizando anticuerpos marcados (por ejemplo anticuerpos marcados de oveja antiratón) que se unen específicamente al anti-CCX CKR.

Además, en la presente memoria también se describen ensayos tales como los inmunoensayos con liposoma (LIA). Los LIA utilizan liposomas que se diseñan para unirse a moléculas específicas (por ejemplo anticuerpos) y para liberar reactivos o marcadores encapsulados. Los compuestos químicos liberados seguidamente se detectan según técnicas estándares (ver Monroe et al., Amer. Clin. Prod. Rev. 5:34-41, 1986).

En una forma de realización, la proteína CCX CKR puede detectarse utilizando ligandos de quimioquina marcados detectablemente que se unen al receptor, por ejemplo ELC, SLC, TECK, BLC, mCTACK, mMIP-I\gamma y vMIPII marcados.

X. Kits

Los reactivos que resultan útiles para los procedimientos terapéuticos y diagnósticos (de detección) descritos en la presente memoria se proporcionan convenientemente en forma de kit. De esta manera, la presente memoria comprende kits que contienen polipéptidos, anticuerpos y polinucleótidos tales como los descritos en la presente memoria.

El kit comprende uno o más de los siguientes elementos en un recipiente: (1) polinucleótidos CCX CKR (por ejemplo cebadores o sondas oligonucleótidas correspondientes a la secuencia de ADNc de CCX CKR y capaces de amplificar los polinucleótidos diana), (2) anticuerpos anti-CCX CKR, (3) polipéptidos CCX CKR o fragmentos de los mismos, opcionalmente recubiertos sobre una superficie sólida (tal como un portaobjetos, una placa de múltiples pocillos o un tubo de ensayo), (4) un polinucleótido CCX CKR (por ejemplo para la utilización como controles positivos en ensayos), (5) y tubos. También pueden incluirse instrucciones para poner en práctica los procedimientos de detección de la invención y curvas de calibración.

XI. Referencias de quimioquinas

Las quimioquinas son bien conocidas de la técnica. Entre las quimioquinas ejemplares se incluyen las que se detallan en la figura 4(a) y homólogos de otras especies (por ejemplo de mamífero, ratón, rata, conejo, ser humano, primate no humano y similares). Las referencias siguientes describen determinadas citoquinas. Se proporcionan referencias adicionales que describen dichas quimioquinas y otras conocidas de la técnica, en el catálogo de R&D Systems 1999 y 2000, R&D Systems Inc., 614 McKinley Place N.E.,MN 55413, el catálogo en línea de R&D en www.systems.com (por ejemplo el 10 de octubre de 1999), ambas incorporadas como referencia a todos los fines, la CFB (Cytokine Facts Book, Academic Press Ltd., 1994, Chemokine Facts Book, Academic Press Ltd., 1997, incorporada como referencia a todos los fines, y la base de datos de secuencias de proteína de GenBank: http:www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi).

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B. ELC/MIP-\beta

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Rollins, B.J. (1997) Blood 90(3):909.

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C. TECK

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D. CTACK/CCL27/ALP/ILC/ESkine

Morales et al., 1999, Proc Natl Acad Sci U S A 96:14470-5

Jarmin et al., 2000, J Immunol. 164:3460-4

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Homey et al., J Immunol. 164: 3465-70).

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E. BLC-1BCA-1

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Gunn, M.D. et al., (1998) Nature 391:799.

Legler, D.F. et al., (1998) J. Exp. Med. 187:655.

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F. vMIPII

Boshoff et al., (1997) Science 278:290-4

Kledal et al., (1997) Science 277:1656-9

Sozzani et al., (1998) Blood 92:4036-9

Geras-Raaka et al., (1999), Biochem Biophys Res Commun. 253:725-7

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G. MCP-4

Kim, C. H. and H. E. Broxmeyer. (1999) J. Leuk. Biol. 65:6.

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Zlotnik, A. et al., (1999) Crit. Rev. Immunol. 19:1.

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H. mMIP-l\gamma (CCF 18)

Wang et al., J Clin Immunol (1998) 18:214-22

Hara et al., J Immunol (1995) 155:5352-8.

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XII. Ejemplos

Los ejemplos siguientes se proporcionan para ilustrar, sin limitar, la invención según las reivindicaciones. Se describen algunos experimentos en Gosling et al., J. Imm. 164:2851-56, 2000, que se incorpora como referencia en su totalidad a todos los fines.

A. Abreviaturas

EST: etiqueta de secuencia expresada; ORF: marco de lectura abierto; DC: célula dendrítica; ELC, quimioquina de ligando EBI1; SLC: quimioquina de tejido linfoide secundario; TECK: quimioquina expresada en el timo; HEK293: células 293 renales embrionarias humanas; PEI: polietilenimina; CCR: receptor de quimioquina CC.

B. Materiales y procedimientos

Se obtuvieron quimioquinas recombinantes humanas, víricas y murinas de R&D Systems (Minneapolis, MN; http:cytokine.mdsystems.com/cyt_cat/cyt_cat.html). Se obtuvieron ELC y TECK marcados con ^{125}I de Amersham. Se prepararon constructos de expresión de CCX CKR de longitud completa en vector de expresión pIRESpuro (Clontech, Palo Alto, CA) con una etiqueta epítopo FLAG y una secuencia de señal prolactina, y se utilizaron para generar transfectantes estables en células HEK293. Se realizaron transfecciones transitorias y estables para CCX CKR y estalcoquinas utilizando reactivo Superfect (Qiagen, Valencia, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. Se generaron estables mediante la selección en puromicina 2 \mug/ml durante 7 días, y se confirmó la expresión mediante análisis FACS del epítopo FLAG utilizando MI anti-FLAG (Sigma, St. Louis, MO) y conjugado de anti-PE de ratón 2' (Coulter Immunotech, Miami, FL).

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Ejemplo 1 Identificación y clonación de CCX CKR

El análisis BLAST de los receptores de quimioquina conocidos identificó un receptor bovino, PPR1, designado como receptor gustativo (Matsuoka et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 194:540-11, 1993). Una búsqueda de una base de datos de EST humano utilizando la secuencia de PPR1 identificó dos EST no contiguos: H67224 y AI131555. Se diseñaron cebadores frente al extremo 5' de H67224 (5' AAT TTG GCT GTA GCA GAT TTA CTC C 3' [SEC ID nº 4]) y en la orientación inversa para el extremo 3' de AI131555 (5' GCT AAA AGT ACT GGT TGG C 3' [SEC ID nº 5]) y se utilizaron en la PCR (DMSO al 5%, hibridación a 58ºC) de ADN genómico aislado a partir de capas leucocitarias humanas. La reacción resultó en un producto de 855 pb que contenía las EST y secuencias conectoras. El producto de fragmento de 855 pb se utilizó para diseñar cebadores adicionales para la utilización en un cribado por PCR anclado de una biblioteca de ADNc de bazo en una matriz Rapid Screen^{TM} (Origene, Rockville, MD), rindiendo un clon 5'-extendido; este clon se utilizó finalmente para cribar una biblioteca genómica humana mediante hibridación del filtro. La secuencia codificante de longitud completa se dedujo mediante análisis de secuencias de los clones genómicos utilizando el cebador inverso procedente de la secuencia 5' del clon de la PCR Origene con enzima Pfu con corrección de copia (Stratagene). La secuencia refinada se confirmó en varios clones y se muestra en la figura 1. [Una determinación preliminar de la secuencia difería de la figura 1 en las posiciones siguientes: 47, 64, 78, 120, 131, 545, 571, 574 (utilizando la numeración de la figura 1), que eran G, G, G, C, C, T, A y T, respectivamente [SEC ID nº 3], variante que también se encuentra contemplada por la invención). La secuencia codificante se clonó en vector de expresión pIRESpuro (Clontech, Palo Alto, CA) con una etiqueta epítopo FLAG y una secuencia de señal prolactina.

La secuencia de aminoácidos deducida codificada por el ADNc de CCX CKR se comparó con otros receptores de quimioquina humanos utilizando el programa de alineación de secuencias CLUSTAL (GeneWorks). Se muestra la secuencia de aminoácidos de CCX CKR alineada con CCR6, 7, 9 y STRL33/Bonzo humanos (figura 2A). Las posiciones de las regiones TM1 a TM7 hidrofóbicas transmembranales se indican mediante líneas en la parte superior de la secuencia. Los aminoácidos idénticos en CCX CKR y en otros receptores de quimioquina se han incluido en cajas. La alineación de secuencias múltiples de la proteína codificada por CCX CKR con estas secuencias y con otras secuencias de receptor de quimioquina humana mostró identidades de aminoácidos comprendidas entre 29% y 35%.

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Ejemplo 2 Expresión de CCX CKR en leucocitos y en diversos tejidos

Se determinó la expresión de ARNm de CCKX CKR mediante análisis de PCR de ADNc humanos, así como mediante RT-PCR de ARN aislados de diversos tejidos. En primer lugar, se investigó la expresión de CCX CKR en células y tejidos hematopoyéticos. La expresión de receptores era evidente en células dendríticas (DC) inmaduras (derivadas de monocitos tras el tratamiento con GM-CSF e IL-4), células T primarias procedentes de 2 de entre 3 donantes, y en tejido de bazo y de nódulo linfático (figura 2B). Además, se detectó la expresión en tejidos no linfoides, tales como corazón, riñón, placenta, tráquea y cerebro; los leucocitos no fraccionados en el mismo panel también fueron positivos (figura 2B). Los productos de PCR de control para GAPDH confirmaron la integridad de todos los ARN de partida.

El patrón observado de CCX CKR se solapaba y expandía la distribución informada para las etiquetas de secuencia expresada humanas encontradas en las bases de datos del NCBI. Estas EST han sido aisladas a partir de riñón, corazón fetal, epitelio olfativo y células B de las amígdalas. De esta manera, CCX CKR aparentemente se expresa en células motiles en la periferia, así como en tejidos linfoides y no linfoides.

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Ejemplo 3 Expresión estable de proteína CCX CKR

Para evaluar las propiedades funcionales de la proteína codificada por el ADNc de CCX CKR, incluyendo su perfil potencial de unión de quimioquina, los presentes inventores construyeron plásmidos de expresión codificantes de CCX CKR con un epítopo Flag N-terminal añadido. Lo expuesto anteriormente permitió la detección y selección, utilizando un mAb anti-Flag, de los transfectantes estables más altamente expresados. Se confirmaron mediante FACS las células 293 renales embrionarias (HEK293) humanas que expresaban establemente el CCX CKR etiquetado con epítopo Flag M1 (figura 2C) y se seleccionaron para el análisis posterior. Las líneas celulares transfectadas con el plásmido de fusión Flag-CCX CKR se denominan "célula F-CCR10" (por ejemplo células 293 F-CCR10).

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Ejemplo 4 Adhesión de transfectantes de CCX CKR a ELC-estalcoquinas A. Interrogación de receptores mediante adhesión a estalcoquinas

Se utilizó la tecnología de "estalcoquinas" para identificar las quimioquinas unidas por CCX CKR. Brevemente, las quimioquinas nativas inmovilizadas por sí solas son incapaces de capturas células que portan receptores afines (Imai et al., Cell 91:521, 1997). Los presentes inventores han desarrollado estructuras no nativas de quimioquina, estalcoquinas, que comprenden grupos de quimioquina construidos como grupos enlazados N-terminalmente en mucinas modificadas extendidas (Bazan et al., Nature 385:640, 1997). En una forma de realización, las estalcoquinas, recolectadas en los sobrenadantes de célula HEK293 tras la transfección transitoria, se anclan a sustratos sólidos mediante anticuerpos contra dominios de portador (por ejemplo epítopos poli-His) enlazados en el extremo carboxilo-terminal, dejando libre el dominio quimioquina para que interaccione con los receptores huérfanos candidatos.

Se apreciará que, además de la identificación de ligandos unidos por CCX CKR, la tecnología de estalcoquinas puede utilizarse para identificar ligandos para otros receptores (por ejemplo receptores de quimioquina huérfanos) mediante adhesión.

Para determinar la unión de ligandos a CCX CKR, se utilizaron células HEK293-CCX CKR para interrogar quimioquinas "estalcoquinas" (SK), es decir, moléculas en las que se habían construido dominios de quimioquina discretos para unirlos al extremo de una estructura de tallo extendida. Las estalcoquinas se interrogaron utilizando portaobjetos con cámara de 8 pocillos recubiertos en primer lugar con anticuerpo de anclaje anti-His (10 \mug/ml en PBS durante la noche a temperatura ambiente), que se lavaron y se "bloquearon" (FBS al 2%/BSA al 0,5% en PBS), se trataron con 250 \mul de sobrenadantes de estalcoquinas de células HEK293 (1 hora a 37ºC) y se incubaron 500.000 transfectantes HEK293-CCX CKR (1,5 horas a temperatura ambiente). La inhibición de la adhesión mediante competencia con quimioquinas solubles se realizó mediante la incubación de las células con 5 a 10 \mug/ml de quimioquinas recombinantes. En todos los casos, se eliminaron las células no adherentes mediante lavado en PBS; las células adherentes remanentes se fijaron con glutaraldehído al 1%, se fotografiaron y se contaron. A modo de cribado primario, esta adhesión revelaría interacciones putativas receptor-ligando.

Las células con CCK CKR se adhirieron muy bien a las estalcoquinas ELC (ELC-SK, figura 3A). Además, la adhesión mediada por ELC-SK se eliminó en presencia de ELC nativo soluble como competidor (figura 3A, fila superior). Los presentes inventores también observaron una reducción significativa de la adhesión mediada por ELC-SK de las células HEK293-CCX CKR en presencia de SLC soluble, así como de TECK soluble, aunque no de MCP-3 soluble (figura 3A, fila inferior). Estos experimentos se llevaron a cabo y se cuantificaron en varios ensayos independientes, un ejemplo de los cuales se proporciona en la figura 3B, y se encontró que eran altamente reproducibles. Además, se utilizó ELC marcado radiactivamente en un ensayo de competición homóloga tradicional en presencia de concentraciones crecientes de ELC no marcado. Los resultados revelaron una unión significativa de ELC a células HEK293-CCX CKR, pero no a células HEK293 de tipo salvaje (wt) (figura 3C). Se obtuvieron resultados prácticamente idénticos en la competición homóloga de TECK marcado radiactivamente con TECK frío (no mostrado). Conjuntamente, los ensayos de adhesión basada en estalcoquinas y de unión de ligando marcado radiactivamente/competición homóloga indican que CCX CKR es un nuevo receptor de quimioquina que se une a un nuevo complemento de quimioquinas.

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Ejemplo 5 "Huella" completa de unión de ligandos de CCX CKR

Con el fin de definir rápida y exhaustivamente una huella de unión de ligandos a un receptor de quimioquina dado, los presentes inventores establecieron un enfoque para perfilar exhaustivamente los receptores de quimioquina utilizando una matriz grande de quimioquinas purificadas y variantes de quimioquina. Utilizaron este enfoque para confirmar independientemente la interacción de ELC y de otras quimioquinas con CCX CKR. Mediante la utilización de la unión de ligando radioactivo de ELC marcado con ^{125}I o de ^{125}I-TECK a transfectantes estables de CCX CKR, se determinó la especificidad de quimioquina para el nuevo receptor. Se utilizaron aproximadamente 80 quimioquinas purificadas y variantes de quimioquina diferentes como competidores fríos (inicialmente a una concentración final saturante de 200 nM) frente a ELC marcado con ^{125}I (figura 4A) o contra ^{125}I-TECK (no mostrado) en experimentos de unión; los resultados fueron compatibles para cada uno. Los datos de desplazamiento de unión de ligandos marcados radiactivamente confirmaron que CCX CKR se unía bien a ELC, SLC, TECK murinos y humanos, y moderadamente a mMIP-1 gamma (aunque su homólogo humano no se unía). Además, se revelaron otros ligandos de quimioquina potenciales de afinidad menor, incluyendo la quimioquina BLC de CXC, y vMIPII codificado víricamente procedente del virus herpes HHV8 del sarcoma de Kaposi humano (figura 4A). Todas las demás quimioquinas sometidas a ensayo no pudieron competir consistentemente con ELC marcado radiactivamente.

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Ejemplo 6 Determinación de constantes de unión

Se llevó a cabo un análisis de unión utilizando la unión de ligando radioactivo de eficiencia maximizada, utilizando protocolos de filtración denominados "Displace Max" (Dairaghi et al., J. Biol. Chem. 274:21569, 1999). En estos ensayos, DisplaceMax utilizó la interrogación simultánea de transfectantes de CCX CKR por >80 quimioquinas purificadas diferentes en su capacidad de desplazar ELC o TECK marcados radiactivamente, utilizando el protocolo descrito (Dairaghi et al., J. Biol. Chem. 274:21569, 1999).

Las interacciones de unión identificadas en el cribado primario se examinaron cuantitativamente mediante competición extensiva de unión de ligandos radioactivos a transfectantes estables de CCX CKR y transformación de Scatchard de los datos de desplazamiento (figura 4B). Los resultados confirmaron la unión de elevada afinidad de ELC, SLC y TECK humanos, con afinidades \simKd de entre 5 y 15 nM. En cada caso, las versiones murinas de estas quimioquinas también se unieron, y con afinidad incluso mayor; las Kds aparentes se listan en la figura 4B. Inesperadamente, la quimioquina BLC de CC, aunque de menor afinidad, también se unión bien, mostrando una curva de competencia de infelxión pronunciada. La quimioquina vírica vMIP-II mostró una afinidad moderada a baja, y fue la única quimioquina vírica que muestra ninguna interacción con CCX CKR. En experimentos similares, el CTACK murino también se unió al receptor con una Kd de \sim9 nM (no mostrado). CTACK también se denomina CCL27, ALP, ILC y ESkine.

Las células HEK293-CCX CKR no mostraron señales de calcio citoplasmático robustas en varios ensayos, aunque esto puede deberse a la dilución de la proteína G, debido a que los transfectantes expresan establemente proteína CCX CKR en >250.000 sitios por célula (no mostrado). Además, en análisis preliminares de quimotaxis, los transfectantes de CCX CKR mostraron una migración moderada en respuesta a ELC y a SLC, pero no a quimioquinas que no presentan actividad de unión (no mostrado). Conjuntamente estos datos indican que el espectro fisiológicamente relevante de ligandos para CCX CKR incluye ELC, SLC y TECK, con interacciones posibles de menor afinidad con la quimioquina BLC de CXC y la quimioquina vírica vMIP-II.

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Ejemplo 7 Identificación de moduladores de molécula pequeña de CCX CKR

El presente ejemplo ilustra los procedimientos de cribado utilizados para la identificación de agonistas y antagonistas del receptor. Se obtuvieron placas fuente de bibliotecas químicas de proveedores comerciales y se almacenaron a 5 mg/ml en DMSO. A partir de las mismas, se prepararon placas de múltiples compuestos que contenían 10 compuestos en cada pocillo, y estos se diluyeron en DMSO al 20% a una concentración de 50 \mug/ml. Se introdujo una alícuota de 20 \mul de cada mezcla en las placas de ensayo, que se almacenaron bajo congelación hasta su utilización.

Las células HEK293 que expresaban establemente el CCX CKR etiquetado con epítopo Flag de M1 (descrito en el Ejemplo 3, supra) se cultivaron en DMEM-FBS al 10% y se recolectaron al alcanzar la concentración un valor comprendido entre 0,5 y 1,0 x 10^{6} células/ml. Las células se centrifugaron y se resuspendieron en tampón de ensayo (HEPES 20 mM, NaCl 80 mM, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 5 mM y con albúmina de suero bovino al 0,2%, pH 7,4) hasta una concentración de 5,6 x 10^{6} células/ml.

Mediante la utilización de un sistema automatizado Multi-Probe, se añadieron 0,09 ml de células a cada pocillo de las placas de ensayo que contenían los compuestos, seguido de 0,09 ml de MIP\beta3-^{125}I/ELC (de Amersham Pharmacia Biotech) diluido en tampón de ensayo (concentración final \sim25 a 100 pM, con \sim50.000 cpm por pocillo). La concentración final de los compuestos era de entre 1 y 5 \mug/ml cada uno. Las placas se sellaron y se incubaron durante aproximadamente 3 horas a 4ºC en una plataforma agitadora. Las placas de ensayo se recolectaron utilizando palcas de filtros GP/B de Packard, se presumergieron en solución PEI en el aparato de recogida al vacío. Se añadió líquido de centelleo (50 \mul) a cada uno de los pocillos, las palcas de sellaron y se contaron en un contador de centelleo Top Count. Los pocillos de control contenían o únicamente diluyente (para los pulsos totales) o un exceso de ELC (1 \mug/ml, para la unión no específica) y se utilizaron para calcular el porcentaje de inhibición total de unión de ELC para cada conjunto de compuestos. Se identificaron los compuestos que inhibían o potenciaban la unión entre ELC y CCX CKR.

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Ejemplo 8 Internalización inducida por ligando de CCX CKR

Se incubaron células 293 transfectadas con el plásmido de fusión Flag-CCX CKR (es decir "células 293 F-CCR10"; ver el Ejemplo 3) a 37ºC con concentraciones variables de quimioquinas (ELC, SLC, TECK, CTACK murino y MCP-4) durante 15 ó 45 minutos. Tras la incubación, las células se lavaron y se fijaron con paraformaldehído al 3% durante 15 minutos sobre hielo. Las células se tiñeron con anticuerpo anti-Flag de M1, seguido de un anticuerpo secundario antiratón conjugado con PE. A continuación, se llevó a cabo un análisis FACS para determinar la expresión en superficie del receptor.

Resultados: una reducción de la unión de anticuerpo en presencia de ligando es una indicación de la internalización inducida por ligando del receptor. Las células incubadas con ligando sobre hielo y después lavadas o incubadas con anticuerpo primario en ausencia de ligando no mostraron inhibición del a unión de anticuerpo al receptor sobre la superficie de las células (es decir, ninguna internalización de receptor; datos no mostrados). La internalización del receptor se observó en presencia de ELC, SLC, TECK y CTACK murino 100 nM (ver la figura 6). MCP-4 no causó la internalización. La internalización del receptor se encontró que dependía de la dosis y del tiempo.

Pueden realizarse muchas modificaciones y variaciones de la presente invención, tal como resultará evidente para el experto en la materia. Las formas de realización específicas descritas en la presente memoria se proporcionan únicamente a título de ejemplo, y la invención debe encontrarse limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (16)

1. Procedimiento para la identificación de moduladores de la unión de CCX CKR a una quimioquina, que comprende:

(a) poner en contacto un polipéptido CCX CKR aislado o recombinante y la quimioquina en presencia de un compuesto de ensayo; en el que:

el polipéptido CCX CKR (i) comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2, o es un fragmento o variante de la misma, en el que la variante presenta una identidad de secuencias de por lo menos el 90% respecto de la secuencia SEC ID nº 2, e (ii) puede unirse a la quimioquina en ausencia del compuesto de ensayo; y

la quimioquina se selecciona de entre el grupo constituido por quimioquina de ligando EBI-1 (ELC), quimioquina de órgano linfoide secundario (SLC), quimioquina expresada en el timo (TECK), quimioatrayente de linfocito B (BLC), quimioquina atrayente de célula T cutánea (CTACK), proteína-I\gamma inflamatoria de macrófagos murinos (mMIP-I\gamma) y proteína II inflamatoria de macrófagos (vMIPII); y

(b) comparar el nivel de unión de la quimioquina y el polipéptido CCX CKR en (a) con el nivel de unión en ausencia del compuesto de ensayo;

en el que una reducción de la unión indica que el compuesto de ensayo es un inhibidor de la unión, e indicando un incremento que el compuesto de ensayo es un intensificador de la unión.

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2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha puesta en contacto comprende poner en contacto una célula que expresa el polipéptido CCX CKR.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la quimioquina se encuentra marcada.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el compuesto de ensayo se encuentra marcado.

5. Procedimiento según la reivindicación 3 ó 4, en el que el marcaje se selecciona de entre el grupo constituido por un fluoróforo, un agente quimioluminiscente, un marcaje isotópico y una enzima.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido CCX CKR forma parte de una fracción celular.

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7. Procedimiento para la identificación de un modulador de la actividad de CCX CKR, que comprende:

(a) poner en contacto una célula que expresa un polipéptido CCX CKR con un compuesto de ensayo en presencia de una quimioquina; en el que:

el polipéptido CCX CKR, (i) comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2, o es un fragmento o variante de la misma, en el que la variante presenta una identidad de secuencias de por lo menos 90% respecto de la secuencia SEC ID nº 2, e (ii) puede unirse a la quimioquina en ausencia del compuesto de ensayo; y

la quimioquina se selecciona de entre el grupo constituido por quimioquina de ligando EBI-1 (ELC), quimioquina de órgano linfoide secundario (SLC), quimioquina expresada en el timo (TECK), quimioatrayente de linfocitos B (BLC), quimioquina atrayente de células T cutáneas (CTACK), proteína-I\gamma inflamatoria de macrófagos murinos (mMIP-I\gamma) y proteína II inflamatoria de macrófagos víricos (vMIPII); y

(b) detectar la modulación de la actividad biológica en presencia del compuesto de ensayo, en el que la modulación de la actividad biológica indica que un compuesto de ensayo es un modulador de la actividad de CCX CKR, y en el que la actividad biológica es un cambio de la concentración de calcio citosólico libre o de la quimotaxis.

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8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el polipéptido CCX CKR es un polipéptido recombinante.

9. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 7, en el que la quimioquina es ELC.

10. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 7, en el que la quimioquina es SLC.

11. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 7, en el que la quimioquina es TECK.

12. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 7, en el que la quimioquina es BLC.

13. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 7, en el que la quimioquina es CTACK.

14. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 7, en el que la quimioquina es mMIP-I\gamma.

15. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 7, en el que la quimioquina es vMIPII.

16. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 7, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos el 95% respecto de la secuencia SEC ID nº 2, o en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos el 98% respecto de la secuencia SEC ID nº 2.