MXPA97006158A - Quimiocinas novedosas expresadas en pancreas - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona secuencias de nucleótidos y aminoácidos que identifican y codifican quimiocinas novedosas (PANEC-1 y PANEC-2) a partir de células de páncreas humano. La presente invención también proporciona moléculas anti-sentido a las secuencias de nucleótidos que codifican a PANEC-1 y PANEC-2, vectores de expresión para la producción de PANEC-1 y PANEC-2 purificados, anticuerpos capaces de fijarse específicamente a PANEC-1 y PANEC-2, sondas de hibridación u oligonucleótidos para la detección de secuencias de nucleótidos que codifican a PANEC-1óPANEC-2, células huésped genéticamente diseñadas para la expresión de PANEC-1 y PANEC-2, pruebas de diagnóstico para la activación de quimiocina en base a las moléculas deácido nucleico que codifican a PANEC-1 y PANEC-2 y anticuerpos capaces de fijarse específicamente a la proteína.

Description

OUIMIOCINAS NOVEDOSAS EXPRESADAS EN PÁNCREAS TÉCNICA ANTECEDENTE El páncreas es un órgano alargado que queda detrás y debajo del estómago, y consiste en tejidos tanto exócrinos como endocrinos. En orden descendente, la porción exócrina está dividida en lóbulos y unidades secretoras funcionales conocidas como ácinos. Todos los ácinos eventualmente se drenan hacia el conducto pancreático principal que se une con el conducto biliar desde el hígado antes de vaciarse en el duodeno. Las células acinares comprenden el 80 por ciento del páncreas y secretan enzimas bien sea en forma inactiva o activa, las cuales asisten en la digestión. Las células epiteliales de los dúctulos secretan grandes cantidades de iones de bicarbonato y agua que neutralizan el quimo ácido a medida que sale del estómago y entra en el duodeno, así como las enzimas para digerir proteínas, carbohidratos, y grasas. Las enzimas proteolíticas más importantes y abundantes son la tripsina, la quimiotripsina, y la carboxipeptidasa. Las proteasas de serina, la tripsina y la quimiotripsina, dividen las proteínas enteras y parcialmente digeridas en polipéptidos de diferentes tamaños; entonces, la carboxipeptidasa descompone los polipéptidos en aminoácidos individuales. Varias elastasas, que también son proteasas de serina, y nucleasas, que digieren los ácidos nucleicos, también se encuentran en el jugo pancreático. La enzima principal para digerir los carbohidratos en el intestino es la amilasa pancreática. Esta hidroliza los almidones, el glucógeno, y la mayoría de los otros carbohidratos no celulósicos, para formar disacáridos y trisacáridos'. Las principales enzimas para la digestión de grasa son la lipasa pancreática, la esterasa de colesterol, y la fosfolipasa. La lipasa pancreática hidroliza la grasa neutra en ácidos grasos y monoglicéridos . La esterasa de colesterol hidroliza los esteres de colesterol, y la fosfolipasa remueve las moléculas de ácido graso de los fosfolípidos. Las cuatro moléculas que controlan la secreción acinar son acetilcolina y las hormonas, gastrina, colecistoquinina (CCK) , y secretina. La acetilcolina se libera desde el vago parasimpático y otros extremos nerviosos colinérgicos; la gastrina es secretada por las células del estómago, y la colecistoquinina y la secretina son secretadas por el intestino delgado superior. Las hormonas gastrointestinales (Gl) son absorbidas en la sangre y se transportan al páncreas en donde estimulan a los ácinos para secretar enzimas y células ductales, con el fin de secretar el bicarbonato de sodio y el agua que lava las enzimas pancreáticas hacia el duodeno.

El páncreas endocrino consiste en isletas de Langerhans, cuyas células están separadas de los lóbulos exocrinos, y están distribuidas a través de todo el páncreas. La función de los diferentes tipos de células endocrinas que forman las isletas, es secretar las hormonas que participan en el metabolismo de las proteínas, los carbohidratos, y las grasas . Las células endocrinas mayores son las células cu, ß, y d ; las células menores son las células C, las células EC, y las células PP. Aproximadamente el 15 por ciento de la población celular de las isletas son células a, que se localizan a lo largo de la periferia de las isletas, y secretan la hormona glucagon. Las células ß comprenden aproximadamente el 70 por 'ciento de la población celular de las isletas, , se localizan alrededor del centro de las isletas, y secretan la hormona insulina. Las células d comprenden aproximadamente el 10 por ciento de la población, se localizan cerca de las células o;, y secretan dos hormonas diferentes, la somatoestatina y el péptido intestinal vasoactivo (VIP) . Las células C, EC, y PP forman el 5 por ciento final de la población celular de las isletas. Se desconoce la función de las células C, pero las células EC y PP secretan serotonina y el polipéptido pancreático, respectivamente . La inflamación del páncreas o la pancreatitis se puede clasificar como aguda o crónica mediante criterios clínicos. Con un tratamiento, la pancreatitis aguda con frecuencia se puede curar y se puede restablecer la función normal. La pancreatitis crónica con frecuencia da como resultado un daño permanente. No se entienden los mecanismos precisos que desencadenan la inflamación aguda. Sin embargo, algunas causas en el orden de su importancia son la ingestión de alcohol, enfermedad del tracto biliar, trauma post-operativo, y pancreatitis hereditaria. Una teoría propone que la autodigestión, la activación prematura de las enzimas proteolíticas en el páncreas más bien que en el duodeno, provoca la pancreatitis aguda. Cualquier número de otros factores, incluyendo endotoxinas, exotoxinas, infecciones virales, isquemia, anoxia, y trauma directo, pueden activar las proenzimas. En adición, cualquier bloqueo interno o externo de los conductos pancreáticos también puede ocasionar una acumulación de jugos pancreáticos en el páncreas, dando como resultado un daño celular. Como es el caso en la inflamación de otros tejidos, los leucocitos, incluyendo monocitos, macrófagos, basófilos, y eosinófilos, se infiltran en el área inflamada del páncreas. Su papel primario es limpiar el sitio de la inflamación,- sin embargo, los macrófagos pueden producir poderosos oxidantes y proteasas que contribuyen a la destrucción del tejido. Los leucocitos también secretan un rango de citocinas que reclutan a otras células hacia el área. Está en camino la investigación de los procesos reguladores críticos mediante los cuales los glóbulos blancos proceden a su destino apropiado e interactúan con otras células. El modelo actual de movimiento o tráfico de leucocitos desde la sangre hasta los tejidos lesionados o inflamados comprende los siguientes pasos . El primer paso es la adhesión laminada del leucocito a lo largo de las células endoteliales de la pared del vaso sanguíneo. Este movimiento es mediado por las interacciones transitorias entre las selectinas y sus ligandos. Un segundo paso involucra la activación celular, la cual promueve una interacción de leucocito-célula endotelial más estable mediada por las integrinas y sus ligandos. Esta adhesión más fuerte y más estable precipita los pasos finales --la diapedesis del leucocito y la extravasculación hacia los tejidos. La familia de citocinas de polipéptidos, la quimiocina, posee la especificidad celular requerida para explicar el tráfico de leucocitos en diferentes situaciones inflamatorias o enfermas anormales. Primero, las quimiocinas median la expresión de moléculas de adhesión particulares en células endoteliales, y segundo, generan gradientes de factores quimioatrayentes, los cuáles activan tipos específicos de células. En adición, las quimiocinas estimulan la proliferación de tipos específicos de células y regulan la activación de células que portan receptores específicos. Estas actividades demuestran un alto grado de especificidad celular objetivo. Las quimiocinas son polipéptidos pequeños, generalmente de aproximadamente 70-100 aminoácidos (aa) de longitud, 8-11 kD de peso molecular y activas sobre un rango de concentración de 1-100 nanogramos/mililitro. Inicialmente, éstas se aislaron y purificaron a partir de tejidos inflamados y caracterizados con relación a su bioactividad. Más recientemente, se han descubierto quimiocinas a través de técnicas de clonación molecular y se han caracterizado mediante análisis estructurales, así como funcionales. Las quimiocinas están relacionadas a través de un motivo de cuatro cisteínas, el cuál se basa principalmente en el espaciamiento de los dos primeros residuos de cisteína en la molécula madura. Actualmente las quimiocinas están asignadas a una de dos familias, las quimiocinas C-C (a) y las quimiocinas C-X-C (ß) . Aunque existen excepciones, las quimiocinas C-X-C generalmente activan los neutrófilos y los fibroblastos, mientras que las quimiocinas C-C actúan sobre un grupo más diverso de células objetivo que incluyen monocitos/macrófagos, basófilos, eosinófilos, linfocitos T y otros. Las quimiocinas conocidas de ambas familias se sintetizan mediante muchos tipos diferentes de células, como se revisa en Thomson A. (1994) The Cytokine Handbook, 2a Edición, Academic Press, NY. Se describirán a su vez los dos grupos de quimiocinas. En este momento, se han descrito relativamente pocas quimiocinas C-C, y parecen tener menos procesamiento N-terminal que las quimiocinas C-X-C. En seguida tenemos una breve descripción de las quimiocinas C-C humanas (y/o murinas) conocidas. Las proteínas inflamatorias de macrófago alfa y beta (MIP-ICÜ y ß) se purificaron primeramente a partir de la línea celular de macrófago de ratón estimulada, y provocaban una respuesta inflamatoria cuando se inyectaban en tejidos normales. Cuando menos tres genes distintos y no alélicos codifican la MlP-la humana, y siete genes distintos codifican la MlP-lß. Las MIP-la y MlP-lß consisten en 68-69 aminoácidos que son aproximadamente 70 por ciento idénticos en sus formas secretadas maduras acidas. Ambas se expresan en las células T, células B y monocitos estimulados en respuesta a mitógenos, anti-CD3 y endotoxina, y ambos polipéptidos fijan la heparina. Aunque ambas moléculas estimulan los monocitos, la MlP-la quimioatrae al subconjunto CD-8 de linfocitos T y eosinófilos, mientras que la MIP-lß quimioatrae al subconjunto CD-4 de linfocitos T. En el ratón, se sabe que estas proteínas estimulan la mielopoiesis . La 1-309 se clonó a partir de una línea celular T humana y , y muestra identidad de aminoácidos del 42 por ciento con el gen de activación de células T 3 (TCA3) clonado a partir del ratón. Existe una homología de nucleótidos considerable entre las regiones de flanqueo 5' de estas dos proteínas, y comparten un par extra de residuos de cisteína no encontrado en otras quimiocinas. Estas similitudes sugieren que las 1-309 y TCA3 son especies homologas que han divergido a través del tiempo tanto en la secuencia como en la función. RANTES es otra quimiocina C-C que se expresa en las células T (pero no en las células B) , en las plaquetas, en algunas líneas celulares tumorales, y en los fibroblastos sinoviales reumatoides estimulados. En los últimos, es regulada por las interleucinas-1 y -4, transformando el factor nervioso y el interferón-7. El ADNc clonado a partir de las células T codifica una proteína básica de 8 kD que carece de glucosilación N-enlazada, y puede afectar a los linfocitos, los monocitos, los basófilos, y los eosinófilos. La expresión del ARNm de RANTES se reduce sustancialmente en seguida del estímulo de las células T. La proteína quimiotáctica de monocito (MCP-1) es una proteína de 76 aminoácidos que parece estar expresada en casi todas las células y tejidos al ser estimulada por una variedad de agentes. Sin embargo, los objetivos de la MCP-1 están limitados a los monocitos y los basófilos, en donde induce un flujo de receptor de MCP-1: calcio enlazado con proteína G (Charo I, comunicación personal) . Se purificaron otras dos proteínas relacionadas (MCP-2 y MCP-3) a partir de una línea celular de osteosarcoma humana. Las MCP-2 y MCP-3 tienen una identidad de aminoácidos del 62 por ciento y del 73 por ciento, respectivamente, con la MCP-1, y comparten su especificidad quimioatrayente para los monocitos. Las técnicas actuales para el diagnóstico de anormalidades en los tejidos inflamados o enfermos dependen principalmente de la observación de síntomas clínicos o análisis serológicos de tejidos o fluidos del cuerpo para hormonas, polipéptidos o diferentes metabolitos. Frecuentemente los pacientes no manifiestan síntomas clínicos en las etapas tempranas del desarrollo de la enfermedad o el tumor. Por otra parte, los análisis serológicos no siempre diferencian entre enfermedades invasivas y síndromes genéticos que tienen rangos traslapados o muy similares. De esta manera, el desarrollo de nuevas técnicas de diagnóstico que comprendan moléculas pequeñas, tales como las quimiocinas expresadas, es importante para proporcionar diagnósticos oportunos y precisos, con el fin de dar un mejor entendimiento de la patogénesis molecular, y para utilizarse en el desarrollo de terapias efectivas. El páncreas se revisa en Guyton AC (1991) Textbook of Medical Physiology, WB Saunders Co., Filadelfia; y en The Merck Manual of Diagnosis and Therapy (1992) , Merck Research Laboratories, Rahway, NJ. Las moléculas de quimiocina se revisan en Schall TJ (1994) Chemotactic Cytokines : Targets for Therapeutic Development. International Business Communications, Southborough, MA, páginas 180-270; y en Paul WE (1993) Fundamental Immunology, Raven Pess, Ciudad de Nueva York (NYC) , páginas 822-826.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona secuencias de nucleótidos que codifican de una manera única, dos proteínas pacreáticas humanas. Los nuevos genes, que se conocen como quimiocinas expresada en páncreas, o panec-1 y panec-2 (Incyte Clones 223187 y 226152) , codifican polipéptidos designados como PANEC-1 y PANEC-2, de la familia de la quimiocina C-C. La presente invención también comprende pruebas de diagnóstico para el compromiso fisiológico o patológico del páncreas, que incluyen pasos para probar una muestra o un extracto de la misma con ADN de panec-1 ó panec-2, fragmentos u oligómeros de los mismos. Los aspectos de la invención incluyen los ADNs anti-sentido de panec-1 y panec-2; vectores de clonación o expresión que contienen panec-1 ó panec-2; células huésped u organismos transformados con vectores de expresión que contienen panec-1 ó panec-2; un método para la producción y recuperación de PANEC-1 ó PANEC-2 purificado de células huésped; y las proteínas purificadas, PANEC-1 y PANEC-2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 exhibe la secuencia de nucleótidos para panec-1 y la secuencia de aminoácidos (aa) predicha de la quimiocina expresada en páncreas, PANEC-1. La Figura 2 exhibe la secuencia de nucleótidos para panec-2 y la secuencia de aminoácidos (aa) predicha de la quimiocina expresada en páncreas, PANEC-2. La Figura 3 muestra el alineamiento de PANEC-1 y PANEC-2 con otras quimiocinas humanas de la familia C-C. Los alineamientos que se muestran se produjeron usando el programa de alineamiento de secuencia múltiple del software DNASTAR (DNASTAR Inc, Madison Wl) . La Figura 4 exhibe un análisis de la hidrofobicidad de PANEC-1 basado en la secuencia de aminoácidos predicha y en la composición. La Figura 5 exhibe un análisis de hidrofobicidad de PANEC-2 basado en la secuencia de aminoácidos predicha y en la composición. La Figura 6 muestra un árbol relacionado de quimiocinas C-C humanas. El árbol filogenético se generó mediante el programa de árbol filogenético del software DNASTAR (DNASTAR Inc., Madison Wl) usando el método de Clustal con la tabla de peso de residuo PAM250.

MODOS DE REALIZAR LA INVENCIÓN Definiciones Como se usa en la presente, "quimiocinas expresadas en páncreas" o PANECs, se refiere a polipéptidos, PANECs que se presentan de manera natural, o fragmentos activos de los mismos, que son codificados por ARNms transcritos a partir de los ADNCS de la SEQ ID N0:1 y la SEQ ID NO: 3. "Activo" se refiere a aquellas formas de PANEC que retienen las actividades biológicas e/o inmunológicas de cualquier PANEC que se presente de manera natural . "PANEC que se presenta de manera natural" se refiere a PANECs producidos por células humanas que no se han diseñado genéticamente, y específicamente contempla diferentes PANECs que surgen de modificaciones post-traslacionales del polipéptido, incluyendo, pero sin limitarse a acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación. "Derivado" se refiere a polipéptidos derivados de PANECs que se presentan de manera natural, mediante modificaciones químicas tales como ubicuitinación, etiquetación (por ejemplo, con radionúclidos, diferentes enzimas, etc.), pegilación (derivatización con glicol de polietileno) , o mediante inserción o sustitución mediante la síntesis química de aminoácidos tales como ornitina, que no se presentan normalmente en las proteínas humanas . "Variante recombinante" se refiere a cualquier polipéptido que difiere de los PANECs que se presentan de manera natural, mediante inserciones, supresiones, y sustituciones de aminoácidos, que se crean usando técnicas de ADN recombinante . Se puede encontrar guía al determinar qué residuos de aminoácidos se pueden reemplazar, agregar o suprimir sin anular las actividades de interés, tales como la adhesión de células y la quimiotaxis, mediante la comparación de la secuencia del PANEC particular con aquellas de citocinas homologas, y minimizando el número de cambio de secuencia de aminoácidos hechos en regiones de homología elevada. De preferencia, las "sustituciones" de aminoácidos son el resultado del reemplazo de un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como el reemplazo de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, o una treonina con una serina, es decir, reemplazos conservadores de aminoácidos. Las "inserciones" o "supresiones" típicamente están en el rango de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida se puede determinar experimentalmente por medio de hacer inserciones, supresiones, o sustituciones de aminoácidos de manera sistemática, en la molécula de PANEC, usando técnicas de ADN recombinante y haciendo ensayos con las variantes recombinantes resultantes para ver su actividad.

En donde se desee, una "secuencia de señal o líder" puede dirigir al polipéptido a través de la membrana de una célula. Esta secuencia puede estar presente de manera natural en los polipéptidos de la presente invención, o se puede proporcionar a partir de fuentes de proteína heterólogas mediante técnicas de ADN recombinante. Un "fragmento", "porción", o "segmento" de polipéptido es un estiramiento de residuos de aminoácidos, de cuando menos aproximadamente 5 aminoácidos, con frecuencia cuando menos aproximadamente 7 aminoácidos, típicamente cuando menos aproximadamente de 9 a 13 aminoácidos, y en diferentes modalidades, cuando menos aproximadamente 17 ó más aminoácidos. Para ser activo, cualquier polipéptido de PANEC debe tener suficiente longitud para desplegar actividad biológica e/o inmunológica. Un "oligonucleótido" o "fragmento", "porción", o "segmento" de polinucleó ido es cualquier estiramiento de residuos de nucleótidos que sea suficientemente largo para usarse en la reacción de cadena de polimerasa (PCR) , o diferentes procedimientos de hibridización, con el propósito de amplificar o simplemente revelar las partes relacionadas de las moléculas de ARNm ó ADN. La presente invención incluye polipéptidos PANEC-1 y PANEC-2 purificados de fuentes naturales o recombinantes, células transformadas con moléculas de ácido nucleico recombinante que codifican a PANEC-1 y PANEC-2. Se pueden realizar diferentes métodos para el aislamiento de los polipéptidos PANEC-1 y PANEC-2 mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden purificar tales polipéptidos mediante cromatografía de inmunoafinidad, por medio de emplear los anticuerpos proporcionados por la presente invención. Otros métodos diferentes de purificación de proteínas bien conocidos en la técnica incluyen aquellos descritos en Deutscher M (1990) Methods in Enzymology Volumen 182, Academic Press, San Diego; y Scopes R (1982) Protein Purification.- Principies and Practice. Springer-Verlag, Ciudad de Nueva York, ambos incorporados a la presente como referencia. "Recombinante" también puede referirse a un polinucleótido que codifica a PANEC-1 ó PANEC-2, que se prepara usando técnicas de ADN recombinante. Los ADNs que codifican a PANEC-1 y PANEC-2 también pueden incluir variantes y mutantes alélicos o recombinantes de los mismos. Los "oligonucleótidos" o las "sondas de ácido nucleico" se preparan basándose en las secuencias de ADNc que codifican a PANEC-1 y PANEC-2, proporcionadas por la presente invención. Los oligonucleótidos comprenden porciones de la secuencia de ADN que tienen cuando menos aproximadamente 15 nucleótidos, usualmente cuando menos aproximadamente 20 nucleótidos. Las sondas de ácidos nucleicos pueden comprender porciones de la secuencia que tiene menos nucleótidos de aproximadamente 6 kb, usualmente menos de aproximadamente lkb. Después de una prueba apropiada para eliminar los positivos falsos, estas sondas se pueden usar para determinar si los ARNms que codifican a PANEC-1 y PANEC-2 están presentes en una célula o un tejido, o para aislar secuencias similares de ácidos nucleicos de ADN cromosomal, como lo describió Walsh PS y colaboradores (1992 PCR Methods Appl . 1:241-250). Las sondas se pueden derivar a partir de ácidos nucleicos que se presentan de manera natural o recombinantes, de una sola cadena o de doble cadena, o se pueden sintetizar químicamente. Estas se pueden etiquetar mediante traslación de muesca, reacción de relleno de Klenow, PCR u otros métodos bien conocidos en la técnica. En Sambrook J y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; o Ausubel FM y colaboradores (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYC, ambos incorporados a la presente como referencia, se describen las sondas de la presente invención, su preparación y/o etiquetación. De manera alternativa, las variantes recombinantes que codifican a estos mismos polipéptidos o similares, se pueden sintetizar o seleccionar, por medio de hacer uso de la "redundancia" en el código genético. Se pueden introducir diferentes sustituciones de codones, tales como los cambios silenciosos que producen diferentes sitios de restricción, para optimizar la clonación dentro de un plásmido o vector viral o expresión en un sistema procariótico o eucariótico particular. También se pueden introducir mutaciones para modificar las propiedades del polipéptido, para cambiar afinidades de ligando a fijación, afinidades de intercadena, o degradación de polipéptido o índice de rotación.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona secuencias de nucleótidos que identifican de manera única quimiocinas novedosas de la familia C-C, PANEC-1 y PANEC-2, que se expresan de una manera elevada en el páncreas . Debido a que las PANEC-1 y PANEC-2 se expresan específicamente en el páncreas, los ácidos nucleicos (panec-1 y panec-2) , los polipéptidos (PANEC-1 y PANEC-2) , y los anticuerpos para PANEC-1 y PANEC-2, son útiles en los ensayos de diagnóstico basados en la producción de quimiocina en los casos de inflamación o enfermedad que afecte al páncreas . Una expresión excesiva de PANEC-1 ó PANEC-2 puede conducir a la activación de monocitos, macrófagos, basófilos, eosinófilos, linfocitos T, y/u otras células que responden a las quimiocinas mediante la producción de proteasas abundantes y otras moléculas que pueden conducir a daño o destrucción del tejido. Por consiguiente, una prueba de diagnóstico para la expresión excesiva de PANECs puede acelerar el diagnóstico y el tratamiento apropiado de una condición anormal ocasionada por infecciones virales o bacterianas; lesión mecánica asociada con trauma,- enfermedades hereditarias que provoquen pancreatitis; enfermedad biliar,- enfermedades de infiltración tales como leucemias y linfornas,- u otros problemas fisiológicos y patológicos que afectan la función del órgano . Las secuencias de nucleótidos que codifican PANEC-1 y PANEC-2 (o su complemento) tienen numerosas aplicaciones en técnicas conocidas por los expertos en el campo de la biología molecular. Estas técnicas incluyen el uso como sondas de hibridización, el uso como oligómeros para reacción de cadena de polimerasa, el uso para mapeo de cromosomas y genes, el uso en la producción recombinante de PANEC-1 y PANEC-2, y el uso en la generación de ADN ó ARN anti-sentido, sus análogos químicos y similares . Los usos de los nucleótidos que codifican a PANEC-1 y PANEC-2, descritos en la presente, son ejemplos de técnicas conocidas y no se pretende que limiten su uso en ninguna técnica conocida para una persona de experiencia ordinaria en la técnica. Por otra parte, se pueden usar las secuencias de nucleótidos descritas en la presente en técnicas de biología molecular que todavía no se han desarrollado, con la condición de que las nuevas técnicas dependan de las propiedades de las secuencias de nucleótidos que se conocen actualmente, por ejemplo, el código genético de triplete, interacciones específicas de pares de bases, etc. Aquellos expertos en la técnica notarán que como resultado de la degeneración del código genético, se pueden producir una multitud de secuencias de nucleótidos que codifican a PANEC, algunas llevando mínima homología de secuencia de nucleótidos a la secuencia de nucleótidos de cualquier gen conocido y que se presente de manera natural . La invención ha contemplado específicamente cada y toda variación posible de secuencia de nucleótidos que se pudiera hacer mediante la selección de combinaciones basadas en posibles selecciones de codón. Estas combinaciones se hacen de conformidad con el código genético de triplete estándar como se aplica a la secuencia de nucleótidos de los PANECs que se presentan de manera natural, y todas estas variaciones se considerarán como estando descritas específicamente. Aunque las secuencias de nucleótidos que codifican a PANEC-1 y PANEC-2 y/o sus variantes de preferencia son capaces de hibridizar a la secuencia de nucleótidos de los genes PANEC que se presentan de manera natural bajo condiciones estringentes, pudiera ser conveniente producir secuencias de nucleótidos que codifiquen a PANEC-1 y PANEC-2 o sus derivados que posean un uso de codón sustancialmente diferente. Los codones se pueden seleccionar para que incrementen el índice al que se presenta la expresión del péptido en un huésped de expresión procariótico o eucariótico particular, de conformidad con la frecuencia con la que el huésped utiliza los codones particulares. Otras razones para alterar sustancialmente la secuencia de nucleótidos que codifica a PANEC-1 y PANEC-2 y/o sus derivados sin alterar la secuencia de aminoácidos codificada, incluyen la producción de transcritos de ARN que tienen propiedades más deseables, tales como una mayor vida media, que los transcritos producidos a partir de la secuencia que se presenta de manera natural . Las secuencias de nucleótidos que codifican a PANEC- 1 ó PANEC-2 se pueden unir a una diversidad de otras secuencias de nucleótidos por medio de técnicas recombinantes de ADN bien establecidas (cf Sambrook J y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY) . Las secuencias de nucleótidos útiles para unirse a panec incluyen una variedad de vectores de clonación, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, derivados de fago lambda, fagémidos, y similares, que son bien conocidos en la técnica. Los vectores de interés incluyen vectores de expresión, vectores de réplica, vectores de generación de sonda, vectores de secuenciamiento, y similares. En general, los vectores de interés pueden contener un origen de réplica funcional en cuando menos un organismo, sitios de restricción convenientes sensibles a la endonucleasa, y marcadores que se pueden seleccionar para la célula huésped.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar sondas de hibridización de ácido nucleico específicas para panec-1 ó panec-2, capaces de hibridizarse con secuencias de nucleótidos que se presentan de manera natural que codifican a PANEC-1 ó PANEC-2. Tales sondas también se pueden utilizar para la detección de secuencias que codifican quimiocina similares, y deben contener de preferencia cuando menos el 50 por ciento de los nucleótidos de una secuencia de codificación de C-C. Las sondas de hibridización de la presente invención se pueden derivar a partir de las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID N0:1 ó de la SEQ ID NO: 3, a partir de secuencias genómicas que incluyen promotores, elementos incrementadores e intrones de los panecs que se presentan de manera natural respectivos. Se pueden etiquetar las sondas de hibridización mediante una diversidad de grupos reporteros, incluyendo radionúclidos tales como 32P ó 35S, o etiquetas enzimáticas tales como fosfatasa alcalina, acopladas a la sonda mediante sistemas de acoplamiento de avidina/biotina, y similares. La reacción de cadena de polimerasa, según se describe en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,683,195; 4,800,195; y 4,965,188 proporciona usos adicionales para los oligonucleótidos basados en las secuencias de nucleótidos que codifican a cualquiera de PANEC-1 ó PANEC-2. Tales sondas que se usan en la reacción de cadena de polimerasa pueden ser de origen recombinante, se pueden sintetizar químicamente, o una mezcla de ambas, y comprenden una secuencia de nucleótidos discreta para uso de diagnóstico, o un grupo degenerado de posibles secuencias para la identificación de secuencias genómicas muy relacionadas. Otros medios para producir sondas de hibridización específicas para ADNs de panec incluyen la clonación de secuencias de ácidos nucleicos que codifican PANEC-1 y PANEC-2 ó derivados de PANEC-1 y PANEC-2 en vectores para la producción de sondas de ARNm. Tales vectores son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente, y se pueden usar para sintetizar sondas de ARN in vitro, por medio de la adición de la polimerasa de ARN apropiada como polimerasa de ARN T7 ó SP6 y los nucleótidos apropiados etiquetados radioactivamente. Ahora es posible producir una secuencia de ADN, o porciones de la misma, que codifique PANEC-1 y PANEC-2 y sus derivados enteramente mediante química sintética, después de lo cuál se puede insertar el gen dentro de cualquiera de los muchos vectores de ADN disponibles, usando reactivos, vectores y células que son conocidos en la técnica, al momento de la presentación de esta solicitud. Por otra parte, se puede usar química sintética para introducir mutaciones dentro de las secuencias de panec o cualquier porción de las mismas. La secuencia de nucleótidos se puede utilizar para construir un ensayo con el fin de detectar inflamación o enfermedad asociadas con niveles anormales de expresión de PANEC-1 ó PANEC-2. Se puede etiquetar la secuencia de nucleótidos mediante métodos conocidos en la técnica, y añadir a una muestra de fluido o tejido de un paciente, bajo condiciones de hibridización. Después de un período de incubación, se lava la muestra con un fluido compatible que contiene opcionalmente un tinte (u otra etiqueta que requiera de un revelador) si se ha etiquetado el nucleótido con una enzima o con otra etiqueta o molécula reportera. Después de enjuagar el fluido compatible, se cuantifica el tinte y se compara con un estándar. Si la cantidad de tinte es significativamente elevada, la secuencia de nucleótidos se ha hibridizado con la muestra, y el ensayo indica la presencia de inflamación y/o enfermedad. Se puede usar la secuencia de nucleótidos para panec-1 ó panec-2, para construir sondas de hibridización para mapear ese gen. Se puede mapear la secuencia de nucleótidos que se proporciona en la presente a un cromosoma y regiones específicas de un cromosoma, usando técnicas bien conocidas de mapeo genético y/o cromosomal. Estas técnicas incluyen hibridización in situ, análisis de enlace contra marcadores cromosomales conocidos, rastreo por hibridización con genotecas de preparaciones cromosomales seleccionadas por flujo, específicas para cromosomas conocidos, y similares. En Verma y colaboradores (1988) Human Chromosomes : A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, NYC, entre otros lugares, se ha descrito la técnica de hibridización fluorescente in situ de diseminaciones de cromosomas . La hibridización fluorescente in situ de preparaciones cromosomales y otras técnicas de mapeo físico de cromosomas pueden estar correlacionadas con datos de mapas genéticos adicionales. Los ejemplos de datos de mapas genéticos se pueden encontrar en 1994 Genome Issue of Science (265:1981f) . La correlación entre la localización de panec en un mapa cromosomal físico y una enfermedad específica (o predisposición a una enfermedad específica) puede ayudar a delimitar la región de ADN asociada con esa enfermedad genética. Se puede usar la secuencia de nucleótidos de la presente invención para detectar diferencias en la secuencia de genes entre individuos normales y portadores o afectados Se pueden usar las secuencias de nucleótidos que codifican a PANEC-1 y PANEC-2 para producir PANEC-1 y PANEC-2 purificados, usando métodos bien conocidos de tecnología de ADN recombinante. Entre las muchas publicaciones que enseñan métodos para la expresión de genes después de que se han aislado estos, está Goeddel (1990) Gene Expression Technology, Methods and Enzymology, Volumen 185, Academic Press, San Diego. Los PANEC-1 y PANEC-2 pueden estar expresados en una diversidad de células huésped, ya sea procarióticas o eucarióticas . Las células huésped pueden ser de la misma especie, en las cuáles las secuencias de nucleótidos de panec son endógenas, o de una especie diferente. Las ventajas de producir PANEC-1 y PANEC-2 mediante tecnología de ADN recombinante, incluyen la obtención de cantidades adecuadas de la proteína para la purificación, y la disponibilidad de procedimientos de purificación simplificados. Las células transformadas con ADN que codifica PANEC-1 ó PANEC-2 se pueden cultivar bajo condiciones adecuadas para la expresión de quimiocinas y la recuperación de la proteína a partir del cultivo celular. Los PANEC-1 ó PANEC-2 producidos por una célula recombinante se pueden secretar o pueden estar contenidos intracelularmente, dependiendo de la construcción genética particular utilizada. En general, es más conveniente preparar proteínas recombinantes en forma secretada. Los pasos de purificación varían con el proceso de producción y con la proteína particular producida. En adición a la producción recombinante, los fragmentos de PANEC-1 ó PANEC-2 se pueden producir mediante síntesis directa de péptido usando técnicas de fase sólida (cf Stewart y colaboradores (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co. San Francisco,- Merrifield R (1963) J Am Chem Soc 85:2149-2154) . La síntesis de proteínas in vitro se puede realizar usando técnicas manuales, o mediante automatización.

La síntesis automatizada se puede lograr, por ejemplo, usando el Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Foster City, California) , de conformidad con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Se pueden sintetizar químicamente diversos fragmentos de PANEC-1 y PANEC-2 por separado, y se pueden combinar usando métodos químicos para producir la molécula de longitud completa. El PANEC-1 ó PANEC-2 para la inducción de anticuerpos no requiere de actividad biológica; sin embargo, la proteína debe ser inmunogénica . Los péptidos usados para inducir anticuerpos específicos pueden tener una secuencia de aminoácidos que consiste en cuando menos cinco aminoácidos, de preferencia cuando menos 10 aminoácidos . Deben imitar a una porción de la secuencia de aminoácidos de la proteína, y pueden contener toda la secuencia de aminoácidos de moléculas pequeñas que se presentan de manera natural, como PANEC-1 y PANEC-2. Los estiramientos cortos de los aminoácidos de PANEC-1 ó PANEC-2 se pueden fusionar con aquellos de otra proteína tal como la hemocianina limpete de orificio y la molécula quimérica usada para la producción de anticuerpos. Los anticuerpos específicos para PANEC-1 ó PANEC-2 se pueden producir mediante la inoculación de un animal apropiado con el polipéptido o un fragmento antigénico. Un anticuerpo es específico para PANEC-1 ó PANEC-2 si se produce contra un epítopo del polipéptido, y se fija a cuando menos parte de la proteína natural o recombinante. La producción de anticuerpos incluye no solamente la estimulación de una respuesta inmune mediante inyección en animales, sino también pasos análogos en la producción de anticuerpos sintéticos u otras moléculas de fijación específicas, tal como el rastreo de genotecas de inmunoglobulina recombinante (cf. Orlandi R. y colaboradores (1989) PNAS 86:3833-3837, o Huse W.D. y colaboradores (1989) Science 256:1275-1281) o la estimulación in vitro de poblaciones de linfocitos. La tecnología actual (Winter G. y Milstein C. (1991) Nature 349:293-299) permite un número de reactivos de fijación altamente específicos basados en los principios de la formación de anticuerpos. Estas técnicas se pueden adaptar para producir moléculas que fijan específicamente a los PANECs. Una modalidad adicional de la presente invención es el uso de anticuerpos específicos de PANEC-1 ó PANEC-2, inhibidores, receptores o sus análogos, como agentes bioactivos para tratar inflamación o enfermedad del páncreas, incluyendo, pero no limitándose a, infecciones virales o bacterianas; lesión mecánica asociada con trauma,-enfermedades hereditarias que provocan pancreatitis; enfermedad biliar; enfermedades de infiltración tales como leucemias y linfornas,- u otros problemas fisiológicos y patológicos que afectan la función del órgano. Las composiciones bioactivas que comprenden agonistas, antagonistas, receptores o inhibidores de PANEC-1 ó PANEC-2, se pueden administrar en una dosis terapéutica adecuada determinada por cualquiera de varias metodologías, incluyendo estudios clínicos sobre especies de mamíferos para determinar la máxima dosis tolerable y en sujetos humanos normales para determinar la dosis segura. Adicionalmente, el agente bioactivo puede formar complejo con una variedad de compuestos o composiciones bien establecidos que mejoren la estabilidad o las propiedades farmacológicas, tales como la vida media. Se contempla que la composición bioactiva terapéutica se puede aplicar mediante infusión intravenosa en la corriente sanguínea, o mediante cualquier otro medio efectivo que se pueda usar para el tratamiento de problemas del páncreas .

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la presente invención. Estos ejemplos se proporcionan para ilustración y no se incluyen con el propósito de limitar la invención.

EJEMPLOS I Aislamiento del ARNm y Constirucción de Genotecas de ADNc Se identificaron inicialmente las secuencias de ADNc de panec-1 y panec-2 entre las secuencias que comprenden la genoteca de páncreas humano. El páncreas normal utilizado para esta genoteca se obtuvo en Keystone Skin Bank, International Institute for the Advancement of Medicine (Exton, PA) . El tejido de páncreas normal de un hombre caucásico de 56 años de edad (Lote HDS330) se congeló instantáneamente, se molió con un mortero y maja, y se liso inmediatamente en regulador del pH conteniendo isotiocianato de guanidinio. La lisis fue seguida por varias extracciones con fenol-cloroformo y por precipitación en etanol. El ARN de poliA+ se aisló utilizando el cebador oligo d(T) biotinilado y estreptavidina acoplada con una partícula paramagnética (Promega Corp., Madison Wl) , y se envió a Stratagene (11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) . Recientemente ha llegado a estar disponible un método alternativo para purificar el fagémido. Este utiliza el Miniprep Kit (Número de Catálogo 77468, disponible en Advanced Genetic Technologies Corp., 19212 Orbit Drive, Gaithersburg, Maryland) . Este estuche está en el formato de 96 cavidades, y proporciona suficientes reactivos para 960 purificaciones. Cada estuche está provisto con un protocolo recomendado, el cual se ha empleado con la excepción de los siguientes cambios. Primero, las 96 cavidades se llenan cada una con solamente 1 mililitro de caldo terrífico estéril con carbenicilina a 25 miligramos/litro y glicerol al 0.4 por ciento. Después de que se inoculan las cavidades, se cultivan las bacterias durante 24 horas y se lisan con 60 microlitros de regulador de lisis. Se realiza un paso de centrifugación (2900 rpm durante 5 minutos) antes de que se agregue el contenido del bloque al plato de filtro primario. El paso opcional de agregar isopropanol al regulador TRIS no se realiza de una manera rutinaria. Después del último paso del protocolo, las muestras se transfieren a un bloque de 96 cavidades Beckman para su almacenamiento. Stratagene preparó la genoteca de ADNc utilizando cebado con oligo d(T) . Se ligaron los oligonucleótidos adaptadores sintéticos encima de las moléculas del ADNc permitiendo su inserción dentro del sistema del vector UNI-ZApTM (stratagene) . Esto permitió una construcción de la genoteca lambda de alta eficiencia unidireccional (orientación en sentido) y la conveniencia de un sistema de plásmido con la selección de color azul/blanco para detectar clones con inserciones del ADNc. Se rastreó la calidad de la genoteca del ADNc usando F sondas de ADN, y después se extirpó el fagémido pBluescript (Stratagene) . Este fagémido permite el uso de un sistema de plásmido para la caracterización sencilla del inserto, el secuenciamiento, la mutagénesis dirigida al sitio, la creación de supresiones unidireccionales y la expresión de polipéptidos de fusión. Subsecuentemente se infectaron las partículas del fago de la genoteca construida a la medida, dentro de la cepa F huésped de E. coli XL1-BLUE (Stratagene) . La elevada eficiencia de transformación de esta cepa bacteriana aumenta la probabilidad de que la genoteca del ADNc contenga clones raros, sub-representados . Los vectores unidireccionales alternativos podrían incluir, pero no se limitan a, pcDNAI (Invitrogen) y pSHlox-1 (Novagen) .

II Aislamiento de Clones del ADNc Se obtuvieron las formas del fagémido de clones del ADNc individuales mediante el proceso de extirpación in vivo, en el cual se infectó al mismo tiempo el XLI-BLUE con un fago auxiliar fl. Las proteínas derivadas tanto del fago lambda como del fago auxiliar fl iniciaron una nueva síntesis de ADN a partir de las secuencias definidas sobre el ADN lambda objetivo y crearon una molécula más pequeña, de ADN de fagémido circular de una sola cadena, que incluía las secuencias de ADN del plásmido Pbluescript y el inserto del ADNc. Se liberó el fagémido de ADN de las células y se purificó, después se usó para infectar nuevamente células huésped bacterianas frescas (SOLR, Stratagene Ine) , en donde se produjo el ADN fagémido de cadena doble. Debido a que el fagémido porta el gen para la ß-lactamasa, se seleccionaron las bacterias recientemente transformadas sobre un medio que contenía ampicilina. Se purificó el ADN fagémido usando el Sistema de Purificación de Plásmido QIAWELL-8 a partir del Sistema de Purificación QIAGEN DNA (QIAGEN Inc., 9259 Eton Ave., Chats-worth, CA 91311) . Esta técnica proporciona un método rápido y confiable de alto rendimiento para disolver las células bacte-rianas y para aislar el ADN fagémido altamente purificado. El ADN levigado de la resina de purificación fue adecuado para el secuenciamiento de ADN y otras manipulaciones analíticas. Recientemente ha llegado a estar disponible un método alternativo para purificar el fagémido. Este utiliza el Miniprep Kit (Número de Catálogo 77468, disponible en Advanced Genetic Technologies Corp., 19212 Orbit Drive, Gaithersburg, Maryland) . Este estuche está en el formato de 96 cavidades, y proporciona suficientes reactivos para 960 purificaciones . Cada estuche está provisto con un protocolo recomendado, el cual se ha empleado con la excepción de los siguientes cambios. Primero, las 96 cavidades se llenan cada una con solamente 1 mililitro de caldo terrífico estéril con carbenicilina a 25 miligramos/litro y glicerol al 0.4 por ciento. Después de que se inoculan las cavidades, se cultivan las bacterias durante 24 horas y se lisan con 60 microlitros de regulador de lisis. Se realiza un paso de centrifugación (2900 rpm durante 5 minutos) antes de que se agregue el contenido del bloque al plato de filtro primario. El paso opcional de agregar isopropanol al regulador TRIS no se realiza de una manera rutinaria. Después del último paso del protocolo, las muestras se transfieren a un bloque de 96 cavidades Beckman para su almacenamiento.

III Secuenciamiento de los Clones del ADNc Se secuenciaron en parte los insertos del ADNc a partir de aislados aleatorios de la genoteca de páncreas humano. Los métodos para el sececuenciamiento de ADN son bien conocidos en la técnica. Los métodos enzimáticos convencionales emplearon un fragmento de ADN de polimerasa Klenow, SEQUENASER (US Biochemical Corp., Cleveland, OH) o polimerasa Taq, para extender las cadenas del ADN desde un cebador de oligonucleótido templado en la plantilla de ADN de interés. Se han desarrollado métodos para la utilización de plantillas tanto de una sola cadena como de doble cadena. Los productos de reacción de terminación de cadena se pasaron por electroforesis sobre geles de urea-amida acrílica, y se detectaron mediante autorradiografía (para los precursores etiquetados con radionúclido) o mediante fluorescencia (para los precursores etiquetados con fluorescente) . Las recientes mejoras en la preparación de reacción mecanizada, el secuenciamiento y el análisis utilizando el método de detección fluorescente, han permitido la expansión en el número de secuencias que se pueden determinar al día (utilizando máquinas tales como el Catalizador 800 y el secuenciador de ADN Applied Biosystems 373) .

IV Búsqueda de Homología de los Clones del ADNc y Proteínas Deducidas Se comparó cada secuencia así obtenida con las secuencias en el GenBank usando un algoritmo de búsqueda desarrollado por Applied Biosystems Inc. y se incorporaron dentro del Sistema de Análisis de Secuencia INHERIT™. En este algoritmo, se usó el Lenguaje de Especificación de Patrón (desarrollado por TRW Ine) para determinar las regiones de homología. Los tres parámetros que determinaron cómo se corrieron las comparaciones de secuencia fueron el tamaño de ventana, el desfasado de ventana y la tolerancia de error. Usando una combinación de estos tres parámetros, se examinó la base de datos del ADN para buscar secuencias que contuvieran regiones de homología a la secuencia en cuestión, y se etiquetaron con un valor inicial las secuencias apropiadas. Subsecuentemente, se examinaron estas regiones de homología usando diagramas de homología de matriz de punto para distinguir las regiones de homología de los acoplamientos casuales. Se usaron alineamientos de Smith-Waterman para desplegar visualmente los resultados de la búsqueda de homología . Se averiguaron las homologías de secuencia del péptido y la proteína usando el Sistema de Análisis de Secuencia INHERIT 670 de una manera similar a la usada en las homologías de secuencia del ADN. Se usaron el Lenguaje de Especificación de Patrón y las ventanas de parámetro para buscar las bases de datos de la proteína para las secuencias que contenían regiones de homología a las cuales se marcó con un valor inicial . Se examinaron diagramas de homología de matriz de punto para distinguir las regiones de homología significativa de acoplamientos casuales. En la Figura 1 se muestran las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para toda la región de codificación de las quimiocinas expresadas en páncreas, PANEC-1 y PANEC-2, reivindicadas en esta invención.

V Identificación y Secuenciamiento de Longitud Completa de los Genes De todos los clones aleatoriamente recogidos y secuenciados de la genoteca de páncreas humano, las secuencias de panec fueron homologas a, pero claramente diferentes una de la otra y de cualquier molécula de quimiocina C-C conocida.

Las secuencias de nucleótidos completas para panec-1 y panec-2 se trasladaron, y las traslaciones dentro del marco, como se identifican, se muestran en las Figuras 1 y 2, respectivamente. Cuando se buscaron las tres traslaciones predichas posibles de la secuencia contra las bases de datos de la proteína, tales como SwissProt y PIR, no se encontraron acoplamientos exactos con las posibles traslaciones de panec-1 ó panec-2. La Figura 3 muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos de PANEC-1 y PANEC-2 con otras moléculas de quimiocina ß. Las regiones de homología sustancial entre estas moléculas, incluyendo el motivo C-C definitivo, están sombreadas. Las gráficas de hidrofobicidad para PANEC-1 y PANEC-2 se muestran como las Figuras 4 y 5, respectivamente. El análisis filogenético (Figura 6) muestra qué tan estrechamente están los panec-1 y panec-2 relacionados uno con el otro, y con otras quimiocinas C-C humanas bien caracterizadas . Las más relacionadas de estas moléculas se agrupan juntas en el lado derecho de la figura.

VI Análisis Anti-sentido El conocimiento de las secuencias de ADNc correctas, completas de los genes de quimiocina expresados novedosos, permitirá su uso en la tecnología anti-sentido en la investigación del funcionamiento del gen. Se pueden usar ya sea oligonucleótidos, fragmentos genómicos o de ADNc que comprendan la cadena anti-sentido de panec-1 ó panec-2, tanto in vitro como in vivo para inhibir la expresión de la proteína específica. Dicha tecnología es actualmente bien conocida en la técnica, y se pueden designar sondas en varios lugares a lo largo de la secuencia del nucleótido. Se puede desviar de manera efectiva el gen de interés mediante el tratamiento de células o de animales de prueba completos con dichas secuencias anti-sentido. Frecuentemente, se puede averiguar la función del gen por medio de observar el comportamiento a nivel celular, del tejido o del organismo (por ejemplo, mortalidad, pérdida de función diferenciada, cambios en la morfología, etcétera) . Además de usar las secuencias construidas para interrumpir la transcripción del marco de lectura abierto, se pueden obtener modificaciones de la expresión del gen por medio de designar secuencias anti-sentido a regiones de intrón, elementos promotores/incrementadores, y aún a genes reguladores de transacción. De manera similar, se puede lograr la inhibición usando la metodología de pareamiento de base de Hogeboom, también conocida como pareamiento de bases de "triple hélice" .

VII Expresión de PANEC-1 y PANEC-2 Se puede realizar la expresión de panec-1 y panec-2 mediante la subclonación de los ADNcs en los vectores de expresión apropiados, y la transfección de los vectores hacia un huésped de expresión apropiado. En este caso particular, el vector de clonación previamente utilizado para la generación de la genoteca del tejido, también proporciona la expresión directa de las secuencias de panec-1 y panec-2 incluidas en E. coli. Corriente arriba del sitio de la clonación, este vector contiene un promotor para ß-galactosidasa, seguido por la secuencia que contiene el Met amino-terminal, y los siguientes 7 residuos de ß-galactosidasa. Inmediatamente en seguida de estos ocho residuos está un promotor de bacteriófago diseñado útil para el cebado artificial y la transcripción, y un número de sitios de restricción únicos, incluyendo Eco Rl, para la clonación. La inducción de la cepa bacteriana transfectada y aislada con IPTG empleando métodos convencionales, producirá una proteína de fusión correspondiente a los primeros siete residuos de ß-galactosidasa, aproximadamente 15 residuos de "enlazador", y el péptido codificado adentro del ADNc. Ya que se generan insertos del clon del ADNc mediante un proceso esencialmente aleatorio, existe una oportunidad en tres de que el ADNc incluido quede en el marco correcto para la traslación apropiada. Si el ADNc no está en el marco de lectura apropiado, se puede obtener mediante supresión o inserción del número apropiado de bases mediante métodos bien conocidos, incluyendo mutagénesis in vitro, digestión con exonucleasa III o con nucleasa de frijol mungo, o inclusión del enlazador del oligonucleótido. El ADNc de panec-1 ó panec-2 se puede lanzar hacia otros vectores que se sepa que son útiles para la expresión de la proteína en huéspedes específicos. Los amplímeros de oligonucleótido que contienen sitios de clonación, así como un segmento de ADN suficiente para hibridizarse en los estiramientos de ambos extremos del ADNc objetivo (25 bases) , se pueden sintetizar químicamente mediante métodos convencionales. Estos cebadores se pueden utilizar entonces para amplificar los segmentos del gen deseados mediante reacción de cadena de polimerasa. Los nuevos segmentos del gen resultantes se pueden digerir con las enzimas de restricción apropiadas bajo condiciones convencionales, y se pueden aislar mediante electroforesis de gel. De una manera alternativa, se pueden producir segmentos de gen similares mediante digestión del ADNc con enzimas de restricción apropiadas, y rellenando los segmentos del gen faltantes con oligonucleótidos químicamente sintetizados. Los segmentos de la secuencia de codificación a partir de más de un gen se pueden ligar entre sí, y se pueden clonar en los vectores apropiados para optimizar la expresión de la secuencia recombinante . Los huéspedes de expresión adecuados para estas moléculas quiméricas incluyen, pero no se limitan a, células de mamífero, tales como células de Ovario de Hámster Chino (CHO) y células humanas 293, células de insecto tales como células Sf9, células de levadura tales como Saccharomyces cerevisiae, y bacterias tales como E. coli. Por cada uno de estos sistemas celulares, un vector de expresión útil también puede incluir un origen de réplica para permitir la propagación en bacterias, y un marcador seleccionable tal como el gen de resistencia a los antibióticos de ß-lactamasa, para permitir la selección en bacterias. En adición, los vectores pueden incluir un segundo marcador seleccionable tal como el gen de fosfotransferasa de neomicina, para permitir la selección en células huésped eucarióticas transfectadas . Los vectores para utilizarse en huéspedes de expresión eucarióticos pueden requerir de elementos de procesamiento de ARN, tales como secuencias de poliadenilación 3 ' , si éstas no son parte del ADNc de interés . Adicionalmente, el vector puede contener promotores o mejoradores que incrementen la expresión del gen. Estos promotores son específicos del huésped, e incluyen MMTV, SV40, o promotores de metalotionina para células de ovario de hámster chino; promotores trp, lac, tac, ó T7 para huéspedes bacterianos, o factor alfa, oxidasa de alcohol, o promotores de PGH para levadura. Se pueden utilizar mejoradores de transcripción, tales como el mejorador de virus de sarcoma de Rous (RSV) en células huésped de mamífero. Una vez que se obtienen cultivos homogéneos de células recombinantes a través de métodos de cultivo convencionales, se pueden recuperar grandes cantidades de PANEC-1 y PANEC-2 recombinantemente producidos, a partir del medio acondicionado, y se pueden analizar empleando métodos cromatográficos conocidos en este campo .

VIII Aislamiento de PANEC-1 y PANEC-2 Recombinantes La PANEC se puede expresar como una proteína quimérica con uno o más dominios de polipéptido adicionales agregados para facilitar la purificación de la proteína. Estos dominios que facilitan la purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos queladores de metal, tales como módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de extensión/purificación por afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seattle WA) . La inclusión de una secuencia enlazadora disociable tal como Factor XA o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre el dominio de purificación y la secuencia de panec, puede ser útil para facilitar la expresión de PANEC.

IX Producción de Anticuerpos Específicos de PANEC-1 y PANEC-2 Se utilizan dos enfoques para criar anticuerpos para PANEC-1 y PANEC-2, y cada enfoque es útil para generar anticuerpos ya sea policlonales o monoclonales. En un enfoque, se obtiene la proteína desnaturalizada a partir de separación por cromatografía de líquido de alto rendimiento de fase inversa, en cantidades de hasta 75 miligramos. Esta proteína desnaturalizada se puede utilizar para inmunizar ratones o conejos empleando protocolos convencionales; aproximadamente 100 microgramos son adecuados para la inmunización de un ratón, mientras que se podría utilizar hasta 1 miligramo para inmunizar a un conejo. Para identificar los hibridomas de ratón, la proteína desnaturalizada se puede radioyodar y se puede utilizar para rastrear los hibridomas de células B murinos potenciales por aquellos que produzcan anticuerpos . Este procedimiento requiere solamente de pequeñas cantidades de proteína, de tal manera que serían suficientes 20 miligramos para etiquetar y rastrear varios miles de clones . En el segundo enfoque, se analiza la secuencia de aminoácidos de PANEC-1 ó PANEC-2, como se dedujo a partir de la traslación del ADNc, para determinar las regiones de alta inmunogenicidad. Se sintetizan oligopéptidos que comprendan regiones hidrofílicas apropiadas, como se muestran en las Figuras 4 y 5, y se utilizan en protocolos de inmunización adecuados para criar anticuerpos. El análisis para seleccionar los epítopos apropiados es descrito por Ausubel FM y colaboradores (1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYC) . Las secuencias de aminoácidos óptimas para la inmunización están usualmente en el término C, el término N, y en las regiones hidrofílicas que intervengan del polipéptido, que tengan posibilidades de exponerse al medio ambiente externo cuando la proteína esté en su conformación natural . Típicamente, los péptidos seleccionados, de aproximadamente 15 residuos de longitud, se sintetizan utilizando el Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems Modelo 431A, empleando química de fmoc, y se acoplan con hemocianina de limpete de orificio (KLH, Sigma) mediante su reacción con éster de M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS cf . Ausubel FM y colaboradores, supra). Si es necesario, se puede introducir una cisteína en el término N del péptido para permitir el acoplamiento con la hemocianina de limpete de orificio. Se inmunizan conejos con el complejo de péptido-KLH en auxiliar completo de Freund. Los antisueros resultantes se prueban por su actividad anti-péptido mediante la fijación del péptido a plástico, el bloqueo con BSA al 1 por ciento, la reacción con el antisuero, lavado y reacción con IgG de cabra anti-conejo específica, etiquetada (radioactivamente o de una manera fluorescente) , y purificada por afinidad. También se pueden preparar hibridomas y se pueden rastrear empleando técnicas convencionales. Los hibridomas de interés se detectan mediante rastreo con PANEC-1 ó PANEC-2 etiquetado, para identificar las fusiones que produzcan el anticuerpo monoclonal con la especificidad deseada. En un protocolo típico, se recubren las cavidades de platos (FAST; Becton-Dickinson, Palo Alto, CA) con anticuerpos de conejo anti-ratón específicos, purificados por afinidad (o la Ig anti-especie adecuada), en 10 miligramos/mililitro. Las cavidades recubiertas se bloquean con BSA al 1 por ciento, se lavan y se exponen a los sobrenadantes de los hibridomas . Después de la incubación, las cavidades se exponen a PANEC-1 ó PANEC-2 etiquetada, 1 miligramo/mililitro. Los clones que produzcan anticuerpos fijarán una cantidad de PANEC-l ó PANEC-2 etiquetada que se pueda detectar arriba del fondo. Estos clones se expanden y se someten a 2 ciclos de clonación en una dilución limitante (1 célula/3 cavidades) . Los hibridomas clonados se inyectan en ratón prístino para producir ascitas, y el anticuerpo monoclonal se purifica a partir de fluido ascítico de ratón mediante cromatografía por afinidad sobre Proteína A. Los anticuerpos monoclonales con afinidades de cuando menos 108 M1, de preferencia 109 a 1010 ó más fuertes, típicamente se harán mediante procedimientos convencionales, como se describen en Harlow y Lañe (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; y en Goding (1986), Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, NYC, ambos incorporados a la presente como referencia.

X Prueba de Diagnóstico Usando Anticuerpos Específicos de PANEC-1 y PANEC-2 Los anticuerpos de PANEC-1 ó PANEC-2 particulares son útiles para el diagnóstico de condiciones prepatológicas, y enfermedades crónicas o agudas que están caracterizadas por diferencias en la cantidad o en la distribución de PANEC-1 ó PANEC-2, respectivamente. Hasta la fecha, solamente se han encontrado PANEC-1 y PANEC-2 en la genoteca de páncreas humano, y por consiguiente, son específicos para anormalidades o patologías que afectan al páncreas . Las pruebas de diagnóstico para PANEC incluyen métodos que utilizan el anticuerpo y una etiqueta para detectar PANEC en fluidos corporales, tejidos o extractos de dichos tejidos humanos. Se pueden usar los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención con o sin modificación. Frecuentemente, se etiquetarán los polipéptidos y los anticuerpos por medio de unirlos, ya sea de manera covalente o no covalente, con una sustancia que proporcione una señal que se pueda detectar. Se conocen una amplia variedad de etiquetas y técnicas de conjugación y se han reportado extensamente en la literatura tanto científica como de patente. Las etiquetas apropiadas incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes que instruyen sobre el uso de dichas etiquetas incluyen las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; y 4,366,241.

Asimismo, se pueden producir las inmunoglobulinas recombinantes como se muestra en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,816,567, incorporada a la presente como referencia. En la técnica se conoce una variedad de protocolos para medir PANEC-1 ó PANEC-2 soluble o fijada a membrana, usando anticuerpos ya sea policlonales o monoclonales específicos para la proteína respectiva. Los ejemplos incluyen el ensayo inmunosorbente enlazado con enzima (ELISA) , el radioinmunoensayo (RÍA) y el rastreo de célula activada fluorescente (FACS) . Se prefiere un inmunoensayo de base monoclonal de dos sitios que utilice anticuerpos monoclonales reactivos a dos epítopos de no interferencia sobre PANEC-1 ó PANEC-2, pero se puede emplear un ensayo de fijación competitivo. Estos ensayos se describen, entre otros lugares, en Maddox, DE y colaboradores (1983, J Exp Med 158:1211).

XI Purificación de PANEC-1 y PANEC-2 Nativas Usando Anticuerpos Específicos Se puede purificar PANEC- 1 ó PANEC- 2 nativa o recombinante mediante cromatografía por inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para PANEC- 1 ó PANEC-2, respectivamente. En general, se construye una columna de inmunoafinidad mediante el acoplamiento covalente del anticuerpo anti-PANEC-1 ó PANEC-2 con una resina cromatográfica activada. Se preparan las inmunoglobulinas policlonales a partir de sueros inmunes, bien sea mediante precipitación con sulfato de amonio, o mediante purificación sobre Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) . De la misma manera, se preparan anticuerpos monoclonales a partir de fluido de ascitas de ratón mediante la precipitación de sulfato de amonio o cromatografía sobre Proteína A inmovilizada. Se une de manera covalente la inmunoglobulina parcialmente purificada a una resina cromatográfica tal como la Sefarosa activada de CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology) . Se acopla el anticuerpo a la resina, se bloquea la resina, y se lava la resina derivada de conformidad con las instrucciones del fabricante . Se utilizaron dichas columnas de inmunoafinidad en la purificación de PANEC-1 y PANEC-2 por medio de la preparación de una fracción a partir de las células que contenían PANEC-1 ó PANEC-2 en una forma soluble. Esta preparación se derivó por medio de la solubilización de la célula completa o una fracción subcelular obtenida vía la centrifugación diferencial mediante la adición de detergente o mediante otros métodos bien conocidos en la técnica. Alternativamente, se puede secretar PANEC-1 ó PANEC-2 soluble que contenga una secuencia de señal en una cantidad útil dentro del medio en el cual estén creciendo las células.

Se pasó una preparación que contenía PANEC-1 ó PANEC-2 soluble sobre la columna de inmunoafinidad, y se lavó la columna bajo condiciones que permitieran la absorbencia preferencial de quimiocinas (por ejemplo, reguladores de alta fuerza iónica en la presencia de un detergente) . Entonces, la columna se levigó bajo condiciones que rompieran el enlace de anticuerpo/quimiocina (por ejemplo, un regulador de un pH de 2-3 o una concentración elevada de un caótropo tal como la urea o el ion de tiocianato) ,y se recolectó PANEC-1 ó PANEC-2.

XII uimiotaxis Inducida por PANEC-1 y PANEC-2 o Activación Celular Se midieron las actividades quimiotácticas de PANEC-1 y PANEC-2 en cámaras de microquimiotaxis de 48 cavidades (Falk WR y colaboradores (1980) J Immunol Methods 33:239) . En cada cavidad, se separan dos compartimientos separados por un filtro que permite el paso de las células en respuesta al gradiente químico. El medio de cultivo celular tal como RPMI 1640 (Sigma, St. Louis MO) que contiene la quimiocina expresada, se coloca sobre el lado de un filtro, usualmente policarbonato, y las células suspendidas en el mismo medio se colocan en el lado opuesto del filtro. Se permite un tiempo suficiente de incubación para que las células recorran el filtro en respuesta al gradiente de concentración a través del filtro. Se recuperan los filtros de cada cavidad, y se determinan y cuantifican las células que están adheridas en el lado del filtro que está frente a la quimiocina. Se determina la especificidad de la quimioatracción por medio de realizar el ensayo de quimiotaxis 'sobre poblaciones específicas de células. Primero, se fraccionan las células sanguíneas obtenidas mediante venepuntura por medio de la centrifugación del gradiente de densidad y se prueba la actividad quimiotáctica de PANEC-1 ó PANEC-2 sobre poblaciones enriquecidas de neutrófilos, células mononucleares de sangre periférica, monocitos y linfocitos. Opcionalmente, dichas poblaciones de células enriquecidas son fraccionadas adicionalmente usando anticuerpos específicos CD8+ y CD4+ para la selección negativa de poblaciones de células T enriquecidas CD4+ y CD8+, respectivamente. Otro ensayo dilucida el efecto quimiotáctico de PANEC-1 ó PANEC-2 sobre células T activadas. Allí, se cultivan subconjuntos de células T sin fraccionar o células T fraccionadas durante 6 a 8 horas en recipientes de cultivo de tejido recubiertos con el anticuerpo CD-3. Después de esta activación del CD-3, se prueba la actividad quimiotáctica de PANEC-1 ó PANEC-2 como se describió anteriormente. En la técnica se conocen muchos otros métodos para obtener las poblaciones de células enriquecidas . Algunas quimiocinas también producen una activación celular no quimiotáctica de neutrófilos y monocitos. Esto se prueba vía medidas estándar de activación neutrófila tal como la polimerización de la actina, el aumento en la actividad del estallido respiratorio, la desgranulación del granulo azurofílico y la movilización del Ca++ como parte de la trayectoria de transducción de la señal . El ensayo para la movilización del Ca++ involucra cargar previamente los neutrófilos con una sonda fluorescente cuyas características de emisión se han alterado mediante la fijación del Ca++. Cuando se exponen las células a un estímulo de activación, se determina el flujo de Ca++ por medio de la observación de las células en un fluorómetro. Se ha descrito la medida de la movilización del Ca++ en Grynkievicz G y colaboradores (1985) J Biol Chem 260:3440, y en McColl S y colaboradores (1993) J Immunol 150:4550-4555, incorporadas a la presente como referencia. También se miden las respuestas de desgranulación y estallido respiratorio en los monocitos (Zachariae COC y colaboradores (1990) J Exp Med 171:2177-82) . Las medidas adicionales de la activación de monocito son la regulación de la expresión de la molécula de adhesión y la producción de citocina (Jiang Y y colaboradores (1992) J Immunol 148:2423-8) . La expresión de las moléculas de adhesión también varía con la activación del linfocito (Taub D y colaboradores (1993) Science 260:355-358) .

XIII Rastreo de Fármacos Esta invención es particularmente útil para rastrear compuestos mediante la utilización del polipéptido PANEC-1 ó PANEC-2 o fragmentos de fijación del mismo, en cualquiera de una variedad de técnicas de rastreo de fármacos. El polipéptido de quimiocina o un fragmento que se emplea en dicha prueba puede estar ya sea libre en la solución, adherido a un soporte sólido, sostenido sobre una superficie celular o localizado intracelularmente. Un método para el rastreo de fármacos utiliza células huéspedes eucarióticas ' o procarióticas las cuales se transforman de manera estable con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido o un fragmento. Los fármacos se rastrean en comparación con dichas células transformadas en ensayos de fijación competitivos. Dichas células, ya sea en forma viable o fija, se usan para ensayos de fijación convencionales. Se puede medir, por ejemplo, la formación de complejos entre el PANEC-1 ó PANEC-2 y el agente que se está probando. De una manera alternativa, se puede examinar la disminución en la formación del complejo entre el PANEC-1 ó PANEC-2 y su célula objetivo, monocito, etc., causado por el agente que se está probando. De esta manera, la presente invención proporciona métodos de rastreo de fármacos u otros agentes los cuales pueden producir inflamación y enfermedad. Estos métodos comprenden poner en contacto este agente, con un polipéptido PANEC-1 ó PANEC-2 ó fragmento del mismo y hacer ensayos para (i) buscar la presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido PANEC-1 ó PANEC-2 o el fragmento, o (ii) buscar la presencia de un complejo entre el polipéptido PANEC-1 ó PANEC-2 o el fragmento y la célula, mediante métodos bien conocidos en la técnica. En dichos ensayos de fijación competitivos, el polipéptido de quimiocina o el fragmento están típicamente etiquetados. Después de una incubación adecuada, se separa el polipéptido PANEC-1 ó PANEC-2 ó el fragmento de aquel que está presente en la forma fijada, y la cantidad de la etiqueta libre o sin complejar es una medida de la capacidad del agente particular para fijarse al PANEC-1 ó PANEC-2 ó para interferir con el complejo de PANEC-1 ó PANEC-2 y el agente. Otra técnica para el rastreo de fármacos proporciona un rastreo de rendimiento elevado para los compuestos que tienen una afinidad de fijación adecuada a los polipéptidos PANEC-l ó PANEC-2 y se describe con detalle en la Solicitud de Patente Europea Número 84/03564, publicada el 13 de septiembre de 1984, incorporada a la presente como referencia. Brevemente expresado, se sintetizan grandes números de diferentes compuestos de prueba de péptido pequeños sobre un sustrato sólido, tal como espigas de plástico o alguna otra superficie. Se hacen reaccionar los compuestos de prueba con el polipéptido PANEC-l ó PANEC-2 y se lavan. Entonces se detecta el polipéptido PANEC-l ó PANEC-2 mediante métodos bien conocidos en la técnica. El PANEC-l ó PANEC-2 purificado también se puede recubrir directamente encima de placas para usarse en las técnicas de rastreo de fármacos mencionadas anteriormente. En adición, se pueden usar anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre el soporte sólido. Esta invención también contempla el uso de ensayos de rastreo de fármacos competitivos en los cuales los anticuerpos neutralizantes capaces de fijar el PANEC-l ó PANEC-2 compiten específicamente con un compuesto de prueba para fijarse a los polipéptidos de quimiocina o a los fragmentos de los mismos. En esta forma, se pueden usar los anticuerpos para detectar la presencia de cualquier péptido que comparta uno o más determinantes antigénicos con el PANEC-1 Ó PANEC-2.

XIV Diseño Racional del Fármaco El objetivo del diseño racional del fármaco es producir análogos estructurales de polipéptidos biológicamente activos de interés o de moléculas pequeñas con las cuales aquellos interactúan, por ejemplo, agonistas, antagonistas, o inhibidores. Se puede usar cualquiera de estos ejemplos para formar fármacos que son formas más activas o estables del polipéptido o los cuales intensifican o interfieren con la función de un polipéptido in vivo (cf. Hodgson J (1991) Bio/Technology 9:19-21, incorporada a la presente como referencia) . En un planteamiento, se determina la estructura tridimensional de una proteína de interés, o de un complejo inhibidor de proteína, mediante cristalografía de rayos X, mediante modelación de computadora o, más típicamente, mediante una combinación de dos planteamientos . Se debe averiguar tanto la forma como las cargas del polipéptido para dilucidar la estructura y para determinar el (los) sitio (s) activo (s) de la molécula. Con menos frecuencia, se puede obtener información útil con respecto a la estructura del polipéptido por medio de la modelación basada en la estructura de las proteínas homologas. En ambos casos, la información estructural relevante se usa para designar moléculas parecidas a quimiocina o para identificar inhibidores eficientes. Los ejemplos útiles del diseño racional de fármacos pueden incluir moléculas las cuales han mejorado la actividad o la estabilidad como se muestra en Braxton S y Wells JA (1992 Biochemistry 3:7796-7801) o los cuales actúan como inhibidores, agonistas, o antagonistas de péptidos nativos, como se muestra en Athauda SB y colaboradores (1993 J Biochem 113:742-746), incorporada a la presente como referencia. También es posible aislar un anticuerpo específico objetivo, seleccionado mediante ensayo funcional, como se describió anteriormente, y después disolver su estructura de cristal. Este planteamiento, en principio, rinde un farmanúcleo sobre el cual se puede basar el drseño del fármaco. Es posible desviar la cristalografía de proteína en su totalidad por medio de generar anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ids) a un anticuerpo funcional, farmacológicamente activo. Al igual que la imagen de espejo de una imagen de espejo, se esperaría que el sitio de fijación de los anti-idiotípicos fuera un análogo del receptor original. Entonces se pueden usar los anti-idiotípicos para identificar cualesquier péptidos aislados de bancos de péptidos química o biológicamente producidos. Los péptidos aislados actuarían entonces como el farmanúcleo. En virtud de la presente invención, se puede poner a disposición una cantidad suficiente de polipéptido para realizar estudios analíticos como la cristalografía de rayos X. En adición, el conocimiento de la secuencia de aminoácidos del PANEC proporcionada en la presente, dará una guía a aquellos que emplean las técnicas de modelación por computadora, en lugar de o además de la cristalografía de rayos X.

XV Identificación de Receptores de PANEC-l y PANEC-2 Los PANEC-l y PANEC-2 purificados son útiles para la caracterización y purificación de receptores superficiales de célula específicos y otras moléculas de fijación. Es muy probable que las células que responden a PANEC-l y PANEC-2 mediante la quimiotaxis u otras respuestas específicas expresen un receptor para PANEC-l y PANEC-2, respectivamente. Las etiquetas radioactivas se pueden incorporar dentro de los PANEC-l y PANEC-2, mediante diferentes métodos conocidos en la técnica. Una modalidad preferida es la etiquetación de grupos amino primarios en PANEC-l y PANEC-2 con reactivo de Bolton-Hunter 125I (Bolton, AE y Hunter, WM (1973) Biochem J 133:529) , el cual se ha usado para etiquetar otras quimiocinas sin una pérdida concomitante de la actividad biológica (Hebert CA y colaboradores (1991) J Biol Chem 266:18989; McColl S y colaboradores (1993) J Immunol 150:4550-4555) . Se incuban las células portadoras del receptor con la molécula de quimiocina etiquetada. Después se lavan las células para remover la quimiocina no fijada, y se cuantifica la molécula etiquetada fijada al receptor. Se usan los datos obtenidos usando diferentes concentraciones de PANEC-l ó PANEC-2 para calcular los valores para el número y afinidad de receptores. El PANEC-l ó PANEC-2 etiquetado también es útil como un reactivo para la purificación de su receptor específico. En una modalidad de purificación por afinidad, la quimiocina se acopla de manera covalente a una columna de cromatografía. Se extraen las células portadoras del receptor, y se pasa el extracto sobre la columna. El receptor se fija a la columna en virtud de su afinidad biológica por el PANEC-l ó el PANEC-2.

Se recupera el receptor de la columna y se somete al secuenciamiento de la proteína con terminal N. Después se usa esta secuencia de aminoácidos para designar las sondas de oligonucleótido degenerado para la clonación del gen receptor. En un método alternativo, se obtiene el ARNm de las células portadoras del receptor y se convierte en una genoteca de ADNc. La genoteca se transfecta dentro de una población de células, y se seleccionan aquellas células que expresen el receptor usando PANEC-l ó PANEC-2 etiquetado de manera fluorescente. Se identifica el receptor específico de PANEC-l ó PANEC-2, mediante la recuperación y secuenciamiento del ADN recombinante a partir de células altamente etiquetadas. En otro método alternativo, se ponen los anticuerpos, contra la superficie de las células portadoras del receptor, específicamente los anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se rastrean para identificar aquellos que inhiban la fijación de PANEC-l ó PANEC-2 etiquetado. Después se usan estos anticuerpos monoclonales en la purificación por afinidad o en la clonación de expresión del receptor. Se identifican de manera similar los receptores solubles u otras moléculas de fijación solubles. Se incuba el PANEC-l ó PANEC-2 etiquetado con extractos u otros materiales apropiados derivados del páncreas. Después de la incubación, se identifican los complejos de PANEC-l ó PANEC-2 (los que sean más grandes que el tamaño de la molécula de quimiocina purificada) mediante una técnica de clasificación según el tamaño, tal como, por ejemplo, la cromatografía por exclusión de tamaños o la centrifugación de gradiente de densidad y se purifican mediante métodos conocidos en la técnica. Se somete a los receptores solubles o a la(s) proteína (s) de fijación a un secuenciamiento con terminal N para obtener información suficiente para la identificación de la base de datos, si se conoce la proteína soluble, o para la clonación, si se desconoce la proteína soluble.

XVI Uso y Administración de PANEC-l y PANEC-2 Los anticuerpos, inhibidores, receptores, o antagonistas de PANEC-l y PANEC-2 (u otros tratamientos para una producción excesiva de quimiocina, abreviado posteriormente en la presente como TEC) , pueden proporcionar diferentes efectos cuando se administran de una manera terapéutica. Los tratamientos para la producción excesiva de quimiocina se formularán en un medio portador acuoso no tóxico, inerte, y farmacéuticamente aceptable, de preferencia a un pH de aproximadamente 5 a 8, más preferiblemente de 6 a 8, aunque el pH puede variar de acuerdo con las características del anticuerpo, inhibidor, receptor, o antagonista que se esté formulando y la condición que se vaya a tratar. Las características del tratamiento para la producción excesiva de quimiocina incluyen solubilidad de la molécula, vida media y antigenicidad/inmunogenicidad; estas y otras características pueden ayudar a definir un portador efectivo. Se prefieren las proteínas humanas nativas, como tratamientos para la producción excesiva de quimiocina, pero las moléculas orgánicas o sintéticas que resultan de rastreos de fármacos pueden ser igualmente efectivas en situaciones particulares . Los tratamientos para la producción excesiva de quimiocina se pueden aplicar mediante rutas de administración conocidas, incluyendo pero no limitándose a cremas y geles locales; rocío y aerosol transmucosal , parche y venda transdérmico; formulaciones inyectables, intravenosas y lavados; y líquidos y pildoras administrados oralmente, particularmente formulados para resistir el ácido y las enzimas del estómago. La formulación particular, dosis exacta, y ruta de administración las determinará el médico que atiende y variarán de conformidad a cada situación específica. Tales determinaciones se hacen mediante la consideración de múltiples variables tales como la condición que se va a tratar, el tratamiento para la producción excesiva de quimiocina que se va a administrar, y el perfil farmacocinético del tratamiento para la producción excesiva de quimiocina particular. Factores adicionales que se pueden tomar en cuenta incluyen el estado de enfermedad (por ejemplo, la severidad) del paciente, la edad, el peso, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la combinación de fármacos, las sensibilidades a la reacción, y la tolerancia/respuesta a la terapia. Las formulaciones de tratamiento para la producción excesiva de quimiocina de acción prolongada se pueden administrar cada 3 o 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas, dependiendo de la vida media y del índice de evacuación del tratamiento para la producción excesiva de quimiocina particular. Las cantidades de dosis normales pueden variar desde 0.1 a 100,000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 1 gramo, dependiendo de la ruta de administración. En la literatura se proporciona guía en cuanto a las dosis particulares y los métodos de aplicación,- ver las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,657,760; 5,206,344; ó 5,225,212. Se anticipa que diferentes formulaciones serán efectivas para diferentes tratamientos para la producción excesiva de quimiocina, y que la administración que se dirige al páncreas puede necesitar la aplicación de una manera diferente de aquella para la aplicación dirigida a otro órgano o tejido. Se contempla que las condiciones o enfermedades del páncreas que activan los monocitos, macrófagos, basófilos, eosinófilos, u otros leucocitos, pueden precipitar un daño que puede ser tratable con los tratamientos para la producción excesiva de quimiocina. Estas condiciones o enfermedades se pueden diagnosticar específicamente mediante las pruebas de diagnóstico discutidas anteriormente, y estas pruebas se deben realizar en casos de los que se sospeche inflamación o infecciones virales o bacterianas,- lesión mecánica asociada con trauma; enfermedades hereditarias que provocan pancreatitis; enfermedad biliar,- enfermedades de infiltración tales como leucemias y linfornas ; u otros problemas fisiológicos y patológicos que afecten la función del órgano. Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la especificación anterior están incorporadas a la presente como referencia. Se considera que la especificación por escrito precedente es suficiente para permitirle a alguien experto en la técnica practicar la invención. De hecho, se pretende que estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones diferentes modificaciones de las maneras descritas anteriormente para llevar a cabo la invención las cuales son obvias para aquellos expertos en el campo de la biología molecular o campos relacionados.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Incyte Pharmaceuticals, Inc. (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: QUIMIOCINAS NOVEDOSAS EXPRESADAS EN PÁNCREAS (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 4 (iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: INCYTE PHARMACEUTICALS , INC. (B) CALLE: 3174 PORTER DRIVE (C) CIUDAD: PALO ALTO (D) ESTADO: CA (E) PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE NORTEAMÉRICA (F) CÓDIGO POSTAL: 94304 (v) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: PC compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD DEL TCP: Para Ser Asignado (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 16 de febrero de 1996 (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SERIE DE SOLICITUD: US 08/390,740 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 17 de febrero de 1995 (viii) INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE : (A) NOMBRE: Luther, Barbara J. (B) NUMERO DE REGISTRO: 33,954 (C) NUMERO DE REFERENCIA/CASO: PF-0027 PCT (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO: 415-855-0555 (B) TELEFAX: 415-852-0195 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 289 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: 223187 (B) CLON: PÁNCREAS HUMANO (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:l: ATGAAGGTCT CCGCAGCACT TCTGTGGCTG CTGCTCATAG C?GCTGCCTT CAGCCCCCAG 60 GGGCTCACTG GGCCAGCTTC TGTCCCAACC ACCTGCTGCT TTAACCTGGC CAATAGGAAG 120 ATACCCCTTC AGCGACTAGA GAGCTACAGG AGAATCACCA GTGGCAA.\7G TCCCCAGAAA 1,0 GCTGTGATCT TCAAGACCAA ACTGGCCAAG GATATCTGTG CCGACCCCAA GAAGAAGTGG 240 GTGCAGGATT CCATGAAGTA TCTGGACCAA AAATCTCCAA CTCCAAAGC 28* (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 2 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 97 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: PÁNCREAS HUMANO (B) CLON: 223187 (Xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 2 Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Trp Leu Leu Leu lie Ala Ala Ala 1 5 ?o 15 Phe Ser Pro Gln Gly Leu Thr Gly Pro Ala Ser Val Pro Thr Thr Cys 20 25 30 Cys Phe Asn Leu Ala Asn Arg Lys He Pro Leu Gln Arg Leu Glu Ser 35 40 45 Tyr Arg Arg He Thr Ser Gly Lys Cys Pro Gln Lys Ala Val He Phe 50 55 60 Lys Thr Lys Leu Ala Lys Asp He Cys Ala Asp Pro Lys Lys Lys Trp 65 70 75 60 Val Gln Asp Ser Met Lys Tyr Leu Asp Gln Lys Ser Pro Thr Pro Lys 85 90 95 Pro (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 3 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD.- 402 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: PÁNCREAS HUMANO (B) CLON: 226152 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA : SEQ ID NO : 3 : ATGGCTCAGT CACTGGCTCT GAGCCTCCTT ATCCTGGTTC TGGCCTTTGG CATCCCCAGG 60 ACCCAAGGCA GTGATGGAGG GGCTCAGGAC TGTTGCCTCA AGTACAGCCA AAGGAAGATT 120 CCCGCCAAGG TTGTCCGCAG CTACCGGAAG CAGGAACCAA GCTTAGGCTG CTCCATCCCA 180 GCTATCCTGT TCTTGCCCCG CAAGCGCTCT CAGGCAGAGC TATGTGCAGA CCCAAAGGAG 240 CTCTGGGTGC AGCAGCTGAT GCAGCATCTG GACAAGACAC CATCCCCACA GAAACCAGCC 3 00 CAGGGCTGCA GGAAGGACAG GGGGGCCTCC AAGACTGGCA AGAAAGGAAA GGGCTCCAAA 3 50 GGCTGCAAGA GGACTGAGCG GTCACAGACC CCTAAAGGsC CA 402 (2 ) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA : (A) LONGITUD : 134 aminoácidos (B) TIPO : aminoácido (C) TIPO DE CADENA : sencilla (D) TOPOLOGÍA : lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) GENOTECA: PÁNCREAS HUMANO (B) CLON: 226152 (xi ) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA : SEQ ID NO : 4 Met Ala Gln Ser Leu Ala Leu Ser Leu Leu He Leu Val Leu Ala Phe 1 5 1 0 15 Gly He Pro Arg Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys 20 25 30 Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys He Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr 35 40 45 Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu Gly Cys Ser He Pro Ala He Leu Phe 50 55 60 Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu 65 70 75 80 Leu Trp Val Gln Gln Leu Met Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro 85 90 95 Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr 100 105 110 Cly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser 115 120 125 Gln Thr Pro Lys Gly Pro 130

Claims (24)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ADN recombinante, la cual comprende un gen de quimiocina expresado en páncreas (panec- 1) , cuya secuencia de nucleótido se muestra en la SEQ ID N0:1.

2. Una prueba de diagnóstico para condiciones activadas o inflamatorias del páncreas, la cual comprende los pasos de: a) proporcionar una muestra biológica; y b) combinar la muestra biológica con la molécula de ADN de la reivindicación 1 ó un fragmento de la misma.

3. La prueba de diagnóstico de la reivindicación 2, en donde la condición activada comprende pancreatitis.

4. El ADN anti-sentido de la molécula de ADN de la reivindicación 1.

5. Un vector de expresión que comprende la molécula de ADN de la reivindicación 1.

6. Una célula huésped transformada con el vector de expresión de la reivindicación 5.

7. Un método para producir el polipéptido de quimiocina expresada en páncreas (PANEC-l) , comprendiendo este método los pasos de: a) cultivar las células huésped de la reivindicación 6, bajo condiciones adecuadas para la expresión de PANEC-l; y b) recuperar el PANEC-l a partir del cultivo celular.

8. Un polipéptido de PANEC-l purificado' cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 2.

9. Un anticuerpo específico para el polipéptido de la reivindicación 8.

10. Una prueba de diagnóstico para condiciones activadas o inflamadas del páncreas, la cual comprende los pasos de: a) proporcionar una muestra biológica,- y b) combinar la muestra biológica con el anticuerpo de la reivindicación 9.

11. Una composición farmacéutica que comprende al anticuerpo de la reivindicación 9, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

12. Un método para el tratamiento de la condición activada o inflamada del páncreas, el cual comprende administrar a un individuo que sufra de la misma, la composición farmacéutica de la reivindicación 11 en una dosificación efectiva.

13. Una molécula de ADN recombinante, la cual comprende al gen de quimiocina expresada en páncreas (panec-2) , cuya secuencia de nucleótidos se muestra en la SEQ ID NO: 3.

14. Una prueba de diagnóstico para condiciones activadas o inflamatorias del páncreas, la cual comprende los pasos de: a) proporcionar una muestra biológica; y b) combinar la muestra biológica con la molécula de ADN de la reivindicación 13, o un fragmento de la misma.

15. La prueba de diagnóstico de la reivindicación 14, en donde la condición activada comprende pancreatitis.

16. El ADN anti-sentido de la molécula de ADN de la reivindicación 13.

17. Un vector de expresión que comprende a la molécula de ADN de la reivindicación 13.

18. Una célula huésped transformada con el vector de expresión de la reivindicación 17.

19. Un método para la producción del polipéptido de quimiocina expresada"en páncreas (PANEC-2) , comprendiendo este método los pasos de: a) cultivar las células huésped de la reivindicación 18, bajo condiciones adecuadas para la expresión de PANEC-2; y b) recuperar el PANEC-2 a partir del cultivo celular.

20. Un polipéptido de PANEC-2 purificado cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 4.

21. Un anticuerpo específico para el polipéptido de la reivindicación 20.

22. Una prueba de diagnóstico para condiciones activadas o inflamadas del páncreas, la cual comprende los pasos de: a) proporcionar una muestra biológica,- y b) combinar la muestra biológica con el anticuerpo de la reivindicación 21.

23. Una composición farmacéutica que comprende al anticuerpo de la reivindicación 21 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

24. Un método para el tratamiento de una condición activada o inflamada del páncreas, el cual comprende administrar a un individuo que sufra de la misma, la composición farmacéutica de la reivindicación 23, en una dosificación efectiva.