JPH06504208A - 核酸の同時塩基配列決定 - Google Patents

核酸の同時塩基配列決定

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸の同時塩基配列決定 本発明は、核酸の同時塩基配列決定を行うための新規方法、およびすでに存在す る遺伝子バンクを核酸の同時塩基配列決定を行うことができる修飾遺伝子バンク に変換する方法に関するものである。
核酸の塩基配列は、通常、化学的なりＮＡ塩基配列決定法（マクサム・ギルバー ト法）または酵素的チェインターミネーション法（サンガー法）により決定され ている。マクサム・ギルバート法では、配列を決定しようとする核酸の塩基特異 的開裂がある種の化学物質を用いて行われる。サンが一法では、配列を決定しよ うとする核酸を鋳型として用い、さらにＤＮＡポリメラーゼ、例えば大腸菌ＤＮ Ａポリメラーゼのフレノウ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼまたはＴ７ＤＮＡポリ メラーゼを用いて、酵素的重合反応が行われる。通常のデオキシヌクレオシド三 リン酸（ｄＮＴＰ）のほかに、伸長反応停止分子としての２°、３′−ジデオキ シヌクレオシド−５°−三リン酸（ｄｄＮＴＰ）が酵素基質として用いられる。
新たに合成されたＤＮＡ鎖にこれらのジデオキシ化合物が取り込まれると、重合 反応は停止する。
本方法の個々の工程の順序は上記方法のいずれとも本質的に同じである。すなわ ち、最初に、配列決定を行おうとする高分子ＤＮＡを複数のより小さな断片（こ れらの配列がその後決定される）に分断する。この断片化は、例えば制限酵素を 用いる特異的開裂によって、またはＤＮａ　ｓ　ｅ　Ｉを用いる非特異的開裂に よって、あるいはＤＮＡの超音波処理によって達成することができる。
塩基配列の実際の決定はより小さな断片で行われ、両方の塩基配列決定法の原理 は、異なる長さの配列決定用産物（そのヌクレオチド配列は配列決定すべきＤＮ Ａから誘導される）の集団が化学的または酵素的反応によって生成されるという ことである。これら配列決定用産物の一方の末端は全集団で同一であり、他方の 末端はそれぞれの場合にＤＮＡの４種類の可能な塩基のうちの１つを有する可変 末端である。その後、異なる長さの配列決定用産物が、大きさに基づいた分離に より、一般的には非常に薄い、高分解能変性ポリアクリルアミドゲルでのゲル電 気泳動により、互いに分離される。
塩基配列の決定はこれらの配列決定用ゲルの直接分析により行うのが一般的であ る。その場合、配列決定用産物は、例えばｓ２ｐまたは３ｓＳのようなラジオア イソトープの取込み、ビオチニル化されたまたは蛍光標識されたヌクレオチドの 取込みにより、直接標識を有することが必要である。
配列決定用産物の直接標識化の欠点は、常に、それぞれの場合に、塩基特異的配 列決定反応においてただ１つのＤＮＡ断片が処理されるということである。この 欠点は、いわゆる多重法（例えばＥＰ−Ａ　０３０３４５９を参照）を用いる核 酸の同時塩基配列決定により解消できる。この技法は、それぞれの塩基特異的配 列決定反応において、複数の、一般には最高５０までの異なるＤＮＡ断片の同時 プロセシングを可能にする。そのためには、配列決定すべきＤＮＡ断片を異なる クローニングベクターに組み入れる。これらのベクターは、それぞれの場合に、 用いるベクターに特異的なオリゴヌクレオチド配列がクローニング部位の左と右 に存在するという点で相違する。ベクターはすべてこれらのオリゴヌクレオチド 配列の外側に同一の制限酵素切断部位を有し、クローン化されたＤＮＡ断片をベ クターに特異的な隣接領域と共にベクターから再び切断することができる。マク サム・ギルバート配列決定反応はこの断片混合物に対して実施される。配列決定 用産物のゲル電気泳動分離後、バンドを配列決定用ゲルからナイロン膜に移し、 そこに固定化する。それぞれの場合にただ１つのベクターに特異的なハイブリダ イゼーションプローブとこの膜とをハイブリダイズさせることにより、同一の膜 上で連続して複数のＤＮＡ断片の配列を可視化することが可能である。この方法 の利点は、４種の塩基特異的配列決定反応とこれにより得られる配列決定用産物 の分離を一度に行える点である。
しかしながら、この方法の欠点は、ＤＮＡ断片をクローン化するために、異なる 特異的オリゴヌクレオチド配列をそれぞれ有する多数のベクターを必要とする点 である。多重法の他の欠点は、個々のベクターへのＤＮＡのクローニングが平滑 末端連結反応によってのみ可能となる点である。このタイプのクローン化ではク ローニング効率が比較的低いばかりでなく、コロニーの何パーセントかは低い連 結反応効率のために純粋なベクターＤＮＡを含んでいる。この部分を配列決定前 に分離用ゲル電気泳動によって分離しなければならない。
上記欠点の結果として、多重塩基配列決定法は比較的限られた用途を有するにす ぎない。かくして、本発明の目的は、上記欠点（特に多数の基本ベクターの使用 および低いクローニング効率）を克服した核酸の同時塩基配列決定法を開発する ことであった。
本発明の目的は、 （ａ）配列決定すべき多数のＤＮＡ断片を用意すること：（ｂ）配列決定すべき ＤＮＡ断片の全体をいくつかのグループに分割すること； （ｃ）　（ｂ）からの分割したＤＮＡ断片の両末端に二本鎖ＤＮＡアダプターを 連結すること、その際該アダプターは５ヌクレオチド以上の長さの二本鎖領域を 有し、かつ該ＤＮＡ断片の末端に適合する第一端とベクターへのクローニングに 適する第二端を有し、そして異なるヌクレオチド配列を有する該アダプターを分 割したＤＮＡ断片のそれぞれのグループに連結させること； （ｄ）　（ｃ）からの両末端に該アダプターを有するＤＮＡ断片を、該アダプタ ーの第二端と対合する制限部位を有する基本ベクターにクローニングすること： （ｅ）　（ｄ）からの多数のクローンを選択すること（しかしながら、多くて１ つのクローンしか１つのグループから生じないことがある）、そして選択したク ローンに対して配列決定反応を行うこと：および （ｆ）多数の検出可能なハイブリダイゼーションプローブ（各プローブは（ｅ） からのただ１つのクローンに特異的である）を用いて配列決定反応の結果を解析 すること；を特徴とする、核酸の同時塩基配列決定法により達成される。
公知の多重法と比べた本発明方法の利点は、特に、公知の多重系とは対照的に、 単一の基本ベクターが必要であるにすぎない点である。その結果、最後の反応工 程でそれぞれの場合に用いられるハイブリダイゼーションプローブの固定化核酸 への結合を決定するアダプター配列は、ベクター外で、配列決定すべきＤＮＡ断 片にすでに連結させておくことができる。かくして、配列決定すべきＤＮＡ断片 の全体を希望する数のグループに分割することが可能である。なぜならば、これ らのグループの数が利用し得るベクターの数によって制限されないからである。
必要とされる異なるアダプターオリゴヌクレオチド（好ましくはｌＯ〜４０ヌク レオチドの鎖長）は簡便な方法で希望する配列へ化学合成することができる。Ｄ ＮＡ断片とアダプター分子との連結反応の効率は、過剰のアダプター分子を用い ることによってかなり向上させることができる。これはまた、公知の多重系と比 べて、用いるＤＮＡあたりの比較的高いコロニー形成率をもたらす。
本発明方法の工程（ａ）により得られるＤＮＡ断片は平滑末端をもっていても、 付着末端をもっていてもよい。平滑末端を有するＤＮＡ断片は、例えばＤＮＡを 開裂することにより、必要ならばその後任意の方法で末端を平滑化することによ り得られる。これらのＤＮＡ断片は、超音波および末端の酵素的処理（例えばＴ ４ＤＮＡポリメラーゼまたはフレノウ断片の使用）、平滑切断制限酵素による開 裂、ＤＮＡの機械的切断および／またはＤＮａｓｅ処理により、ＤＮＡを分断し て作製することが好ましい。付着末端を有するＤＮＡ断片は、適当な制限酵素お よび／または他の配列特異的切断酵素を用いてＤＮＡを開裂して作製することが 好ましい。
本発明方法の工程（ｂ）は配列決定すべきＤＮＡ断片の全体をいくつかのグルー プに分割することから成っている。これらのグループの数は希望する数であって よく、例えばそれは配列決定すべき全ＤＮＡの大きさによる。配列決定すべきＤ ＮＡ断片は、例えばｌＯ〜１ｏｏｏ、好ましくは５０〜５００のグループまたは フラクションに分割することができる。
これら個々のグループのＤＮＡ断片は、本発明方法の工程（Ｃ）に従って、該Ｄ ＮＡ断片に適合する第一端を一方の側に有する二本鎖ＤＮＡアダプターと連結さ せる。この第一端は上述したように平滑末端でも付着末端でもよい。アダプター は他方の側にベクターへのクローニングに適する第二端を有する。この第二端は 平滑末端でもよいが、好ましくは付着末端である。なぜならば、この場合、配列 決定すべきＤＮＡ断片の基本ベクターへのクローニングが、平滑末端連結を介し てではなく、付着末端を有するＤＮＡ断片同士の連結を介して行われると、実質 的に改善されたクローニング効率が達成されるからである。　−アダプターの二 本鎖領域の長さはＤＮＡ断片へのアダプターの連結を可能にするに足る長さであ ることが好ましい。それ故に、二本鎖領域は一般には５ヌクレオチド以上でなけ ればならず、好ましくは６ヌクレオチド以上の長さである。
分割したＤＮＡ断片の各グループには、異なるヌクレオチド配列のアダプターを 連結させる。この方法では、１つのグループ内で、単一のアダプターを使うこと も、ヌクレオチド配列および／または第二端（ベクターへのクローニングに使用 ）が異なる２種類のアダプターの混合物を使うこともできる。これに関して、「 異なるヌクレオチド配列」という用語は、異なるグループからのアダプターのヌ クレオチド配列が、本発明方法の工程（ｆ）で異なる標識ハイブリダイゼーショ ンプローブを用いて配列決定反応を解析する際に、交差ハイブリダイゼーション を起こさない程度に異なっていることを意味する。アダプター配列を選択すると きに観察されることが好ましい他の基準は、できる限り高い方がよい融解温度（ ＧＣ含量）、内部ヘアピン構造の非存在、そして配列決定すべきＤＮＡ断片中に 低い頻度でしか存在しない「まれな」配列の存在（例えば真核生物ＤＮＡ中の５ ’−ＣＧ−３°）である。さらに、用いるアダプターの配列は、配列決定を自動 化しやすいように、できるだけ均一な融解温度をもつことが好ましい。
各グループ内の連結反応においては、単一のアダプターあるいは異なるヌクレオ チド配列および／または異なる第二端を有する２種類のアダプターを使用するこ とができ、後者の方が好ましい。
異なる第二端を有する異なるアダプターを用いる場合は、従って、アダプターを 有するＤＮＡ断片のクローニングのために、アダプターのそれぞれの末端と対合 する２つの異なる制限部位で開環された、すなわち非対称的に加水分解された基 本ベクターを使うことが必要である。ＤＮＡ断片のクローニングのための制限部 位は、それぞれの酵素で開裂するときにそれらが対合する（好ましくは非適合性 の）末端を生ずるという条件で、任意に選択できる。この例はＥｃｏＲＩＳＰｓ ｔ　Ｌ　Ｈｉｎｄｎ１部位などである。さらに、クローニングに用いる制限部位 は基本ベクター上の特異な部位であることがもちろん好ましい。
基本ベクターは、好ましくは、挿入部位の両側に、少なくとも１つの、いわゆる 「まれにしか存在しない」酵素開裂部位を有する。まれにしか存在しない開裂部 位とは、その固有の性質のために、配列決定すべきＤＮＡ中にきわめて低い頻度 でしか存在しないことが期待される開裂部位として理解される。このような開裂 部位の例は、例えば少なくとも７ヌクレオチドの認識配列を有する制限部位（例 えば、ＮｏｔＩ、５ｆｉＬＲｓｒＩＩ、ＳｇｒＡＩＳＳｗａＩ、ＰａｃＩ、Ａｓ ｃｌ、、ＰｍｅＩ、５ｓｅ８３８７■、Ｓｒｓ　Ｉまたはｌ−３ｃｅ１部位）お よび／または真核生物ＤＮＡ中にきわめてまれにしか存在しないヌクレオチド配 列５゛−ＣＧ−３’　を認識配列内に少なくとも１度含んでいる制限部位である 。このまれにしか存在しない開裂部位は、ＤＮＡの内部を開裂することなく、ベ クターからクローン化ＤＮＡを切り出すために用いることができる。
さらに、アダプターを有するＤＮＡ断片のクローニングのために、ＤＮＡ断片の 挿入に用いる制限部位の近（に転写ターミネータ−を有する基本ベクターを使用 して（しかし、必要というわけではない）、クローン化ＤＮＡ配列の可能な転写 によるベクターと宿主細胞とのネガティブな相互作用が起こらないようにするこ とが好ましい。適当な基本ベクターの好ましい例は、例えばクローニングのため の対応する適当な特異的制限部位と共に「多重クローニング部位」を有するもの である。その例は、特にＡｕ５ｕｂｅｌら、　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏ ｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、補遺１６（７，１，３章） の表７．１．１に示される市販のジデオキシ塩基配列決定用ベクターである。こ れらの記載から、本発明方法のベクターの使用可能性についての必要条件は、公 知の多重法でのベクターの使用可能性についての必要条件よりもかなり少ないこ とが明らかである。
本発明方法の工程（ｅ）は、（ｄ）からの多数の異なるクローンを選択しくしか しながら、多くて１つのクローンしか１つのグループから生じないかもしれない ）、そして選択したクローンにおいて配列決定反応を行うことから成っている。
これらのクローンの作製は、例えば（ｄ）のクローニング工程後に適当な宿主細 胞（好ましくはＥ、ｃｏｌｉ細胞）を連結ＤＮＡで形質転換し、このようにして 得られた遺伝子バンクを増幅し、そして公知方法（例えば、分離用ゲル電気泳動 およびプラスミドＤＮＡの単離）を用いて挿入されたＤＮＡベクターの存在につ いてこの遺伝子パンクからの個々のクローンを検査することにより達成できる。
選択したクローンに対する塩基配列決定反応は、原理的には、すでに知られてい る多重塩基配列決定法において化学的方法または酵素的チェインターミネーショ ン法のいずれかにより行うことができる。本方法では、個々の塩基特異的反応（ サンガー法またはマクサム・ギルバート法による）を異なるＤＮＡ断片の混合物 に対して直接、すなわち同時に行うことが好ましい。
マクサム・ギルバート法による化学的方法では、最初に、アダプターを含む配列 決定すべきＤＮＡ断片をベクターから切り出す必要がある。これは例えばベクタ ーへのクローニングが行われた制限部位で達成できる。このやり方では、工程（ ｄ）でクローン化されたＤＮＡ断片が再放出される。しかしながら、クローニン グ部位の近くに、好ましくは１００ヌクレオチド未満の距離で存在する「まれに しか存在しない」開裂部位をこのために使うことが好ましい。この方法を用いる と、配列決定すべきＤＮＡの内部で開裂する可能性が極端に低くなる。その後、 切り出された断片をベクターＤＮＡから精製する。これは好ましくは分離用アガ ロースゲル電気泳動により達成される。この方法ではＤＮＡ断片の混合物が得ら れ、それぞれのＤＮＡ断片はその両末端の領域に他のＤＮＡ断片のアダプター分 子とは異なるアダプター分子を有している。続いて、この混合物を公知のマクサ ム・ギルバート法により処理する。これは一般に混合物を４つのアリコートに分 割することを伴い、各アリコートを異なる塩基特異的化学試薬（最終的にそれぞ れの塩基でのＤＮＡ断片の統計学的開裂へ導く）で処理する。その結果、配列決 定用産物の集団が得られ、その配列を次の工程で決定することができる。
サンが−による酵素的チェインターミネーション法では、ＤＮＡ断片をベクター から切り出す必要がない。初めに、異なるクローン化ＤＮＡ断片を含むベクター の混合物を変性する。得られた一本鎖ＤＮＡに、多ローン化ＤＮＡ断片の近くの ベクター領域および／またはアダプターと相補的で、それ故変性ＤＮＡに結合す るブライマーオリゴヌクレオチドを加える。ＤＮＡ断片の配列決定を両側から行 うつもりならば、各調製物に２つの異なるプライマー分子を加えることができる 。このようにして得られた混合物を４つのアリコートに分割した後、公知のサン ガー法に従って、ＤＮＡポリメラーゼを用いた重合反応をそれぞれの場合に異な る伸長反応停止分子の存在下で行う。その後、この方法で作られた配列決定用産 物の集団を以下に記載するようにしてさらに処理する。
本発明方法の工程（ｆ）、つまりそれぞれの場合に全クローンからただ１つのク ローンにのみ特異的で、検出可能なハイブリダイゼーションプローブを用いた配 列決定反応の解析は一般に次の工程： （ｆｌ）　（ｅ）からの配列決定反応により得られた配列決定用産物を大きさに より分離すること、その際いくつかのクローンからの特定の反応の対応する配列 決定用産物を一緒に分離すること； （ｆ２）分離した配列決定用産物を核酸結合用の適当な担体に移行させ、所望に より、移行した配列決定用産物を該担体に固定化すること； （ｆ３）該担体と（ｉ）第一の検出可能なハイブリダイゼーションプローブまた は（ｉｉ）　２つまたは複数の選択的に検出可能なハイブリダイゼーションプロ ーブとを可逆的にハイブリダイズさせること、その際各プローブはそれぞれの場 合に（ｅ）からの単一クローンに対してのみ特異的であり、各プローブの特異性 が特定のアダプターおよび所望により隣接ベクター配列から形成される特定の標 的配列への、反応条件下で実施されたハイブリダイゼーションにより規定される こと：（ｆ４）　（ｆ３）からの結果を解析し、結合したハイブリダイゼーショ ンプローブを担体から除去すること；そして（ｆ５）所望により、他の標的配列 に結合するという点で他のプローブと相違する別の検出可能なハイブリダイゼー ションプローブを用いて工程（ｆ３）および（ｆ４）を繰り返すこと；から成っ ている。
配列決定用産物の分離（ｆｌ）は、好ましくはゲル電気泳動により、特に好まし くは特殊な配列決定用ゲルでの変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により行わ れる。ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデンまたは化学的に活性 化されたセルロース（例えばジアゾセルロース）から製造された膜を担体として 用いることが好ましく、この担体上に分離した配列決定用産物を移行させる（ｆ ２）。担体へのＤＮＡ断片の移行およびそれらの固定化は公知のプロッティング 法を用いて行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８９参照）。
続いて、それぞれの場合に単一のクローンにのみ特異的な第一の検出可能なハイ ブリダイゼーションプローブを用いて担体との可逆的ハイブリダイゼーションを 行う。しかしながら、異なる標識のために同時に選択的に検出し得るという条件 で、２以上のハイブリダイゼーションプローブを同時に使用することも可能であ る。この場合、プローブの特異性は単にグループ特異的またはクローン特異的ア ダプターによって決定される。比較的短いアダプターを使う場合、プローブのハ イブリダイゼーションはアダプターで起こるだけでなく、さらに隣接ベクター配 列でも起こり得る。
プローブと標的配列との間のハイブリダイゼーション領域の長さは１０〜５０ヌ クレオチドが好ましく、１５〜４０ヌクレオチドが特に好ましい。この方法にお いて、核酸の配列決定を可能にするハイブリダイゼーションが達成される。
相補的標的配列に可逆的にハイブリダイズするプローブの担体からの除去は公知 方法に従って、例えばＳＤＳの存在下で該ハイブリッドの融解温度以上に加熱す ることによって行われる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲を参照）。
本発明方法の場合には、放射性標識または非放射性標識を有するハイブリダイゼ ーションプローブを使うことができる。ビオチン、蛍光体、発光体、ジゴキシゲ ニンおよび／または酵素（例えばペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファタ ーゼ）で標識されたプローブのような非放射性標識プローブを用いることが好ま しい。特に、ジゴキシゲニンまたはその誘導体で標識されたプローブを用いるこ とが好適である。本発明によるプローブは、合成中に標識ヌクレオチドを組み入 れる化学合成により簡単な方法で作製することができる。一方、例えば５°−リ ン酸化によって、プローブを放射性標識することもできる。
本発明の同時塩基配列決定法の特に好ましい態様を添付した図面に模式的に示し である。出発物質として必要とされる成分はベクター（Ａ）と、二本鎖ＤＮＡか ら構成され、それぞれが一方の側に平滑末端を、他方の側に突出末端を有する２ 種類のアダプター分子（Ｂ）および（Ｃ）である。
図１は出発物質を示す。
ベクターを２つの異なる制限酵素（それぞれが突出する非適合性の末端をもたら す）で加水分解する。
図２はこの加水分解を示す。
平滑末端を有する配列決定用Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｄ）をアダプター分子に連結し、開 環したベクターにクローン化する。そのために、得られた配列決定用ＤＮＡをア ガロースゲル電気泳動により分離し、希望の大きさの領域（好ましくは８００〜 ｔｚ００ｂｐ）をゲルから切り出して溶出することが好ましい。
図３はこれを模式的に示しである。
このようにして得られた挿入ＤＮＡを含むベクターは適当な細胞（一般にはＥ、 ｃｏｌｉ細胞）への形質転換により増幅させ、その後単離することができる。
本発明は、さらに、すでに存在する遺伝子バンクを、（上記のように）核酸の同 時塩基配列決定を行うことができる修飾遺伝子バンクに変換する方法に関するも のである。この場合、「遺伝子バンク」とは、基本ベクター中に多数の異なる（ 配列決定すべき）ＤＮＡフラグメントが挿入体として存在することを意味する。
遺伝子バンクの修飾方法は二本鎖ＤＮＡアダプター分子を決定すべき挿入体の近 くでベクター中に導入することに基づいており、この方法により、複数の異なる アダプター分子を用いる場合、遺伝子バンクを同時塩基配列決定を行うことがで きる多くのグループに分割することが可能となる。
この方法は次の工程： （ａ）基本ベクターにクローン化された多数の異なるＤＮＡ断片から成る目的の 遺伝子バンクを用意すること、その際基本ベクターは少なくとも１つのまれにし か存在しない酵素開裂部位をクローン化ＤＮＡ断片の近くに含むこと；（ｂ）　 （ａ）に記載のまれにしか存在しない開裂部位で開裂することにより該遺伝子バ ンクを線状化すること；（Ｃ）該遺伝子バンクをいくつかのグループに分割する こと；（ｄ）分割した線状化遺伝子バンクを二本鎖ＤＮＡアダプターと連結させ ること、その際該アダプターの二本鎖領域は５ヌクレオチド以上の鎖長を有しか つ基本ベクターの開裂部位と対合する末端を両側に有し、これにより異なる配列 を有するアダプターを遺伝子バンクの各グループに連結させること；そして （ｅ）所望により、目的の連結産物を副産物から分離すること：を含んでいる。
この方法では、アダプターの導入によりベクター中の開裂部位が除かれるように 、アダプター分子のヌクレオチド配列を選択することが好ましい。こうすると、 遺伝子バンクを線状化する工程（ｂ）において用いる制限酵素で再開裂すること により、目的とする連結産物を副産物から分離することが可能となる。この方法 では、（アダプター分子が挿入されていない）再連結ベクターを再度開環して、 唯一の形質転換可能な産物としてクローン化ＤＮＡを有するベクターが得られる ようにする。この方法での「まれにしか存在しない開裂部位」は上記のように定 義され、すなわちそれは少な（とも８ヌクレオチド長の認識配列を有しかつ／ま たヌクレオチド配列５′−ＣＧ−３’　を少なくとも１度含んでおり、例えばＮ ｏｔＩ、５ｆｉｌ、ＲｓｒＩＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｗａＩ、Ｐａｃ　Ｉ、　Ａｓ　 ｃ　Ｉ、　Ｐｍｅ　Ｉ、５ｓｅ８３８７１，５ｒｓＩまたはｌ−３ｃｅＩ認識部 位を有する。
通常の遺伝子バンクを、同時ＤＮＡ塩基配列決定が可能な遺伝子バンクに変換す るための特に好ましい態様は、以下に模式的に記載される。この方法では、挿入 体の近くにまれにしか存在しない制限部位（例えばＮｏｔＩ）を有する基本ベク ター（Ａ）中の遺伝子バンクから出発する。現代の高性能ベクター（例えばｐＢ ｓＳＫベクター）を基本ベクターとして用いることが好ましい。さらに、制限部 位に適合する末端を有する１組の特殊なアダプターオリゴヌクレオチド（Ｂ）を 出発物質として必要とする。アダプター分子は好ましくは脱リン酸化され、そし て末端の突出領域の近隣の配列がＮｏｔＩ認識配列と一致しないようにすべきで ある。
アダプター分子の二本鎖領域は同時ＤＮＡ塩基配列決定に必要な標的配列（これ にハイブリダイゼーションプローブがあとで結合される）を含む。従って、これ に対応して非常に多くの「異なるヌクレオチド配列」　（上記定義参照）を有す るアダプター分子が必要となる。特に、個々のアダプター分子間で配列決定を妨 げる交差ハイブリダイゼーションが起こらないようにすべきである。
最初の工程では、ベクターをＤＮＡ挿入体の近く（好ましくは１００ヌクレオチ ド以下の距離）のまれにしか存在しない制限部位（この場合はＮｏｔＩ）におい て加水分解し、いくつかのグループに分割する。次いで、各グループの加水分解 ベクターを異なる二本鎖アダプター分子と連結させる。
この方法では、目的産物（１）のほかに、希望しない副産物（２）および（３） が形成される。副産物（３）は形質転換可能でなく（それ故、特別な分離を必要 としない）、そして副産物（２）は（アダプター分子のヌクレオチド配列がＮｏ ｔＩ部位を除くよう−に選択されるとき）ＮｏｔＩでの再開裂により再線状化さ れ、かくして形質転換が可能でない。これについては図４に模式的に示しである 。
このような遺伝子バンクに対する塩基配列決定反応は、すでに上述した原理に従 って行われる。
本発明による遺伝子バンクの修飾において、一方では対称的な配列を有しかつ２ つの同一の自己相補的オリゴヌクレオチドから成る二本鎖アダプター分子を用い ることができ、他方では非対称的な配列を有するアダプター分子を用いることも できる。非対称アダプター分子の使用が好ましい。この場合、塩基配列決定反応 の解析のために２つのハイブリダイゼーションプローブ（それぞれがアダプター 分子の一本の鎖に相補的であるが、自己相補的ではない）の混合物を用いなけれ ばならない。
本発明方法の出発物質として、配列決定すべきクローン化ＤＮＡ断片の近くでそ の各側に少なくとも１つのまれにしか存在しない制限部位を含む基本ベクター中 の遺伝子バンクを使用する場合は、本発明方法の工程（ｂ）〜（ｅ）を２回行う ことができる。この方法では、クローン化ＤＮＡ断片の両側に特定のアダプター 分子が存在し、各アダプター分子が上記のような同時塩基配列決定法において特 定のハイブリダイゼーションプローブと結合し、かくしてクローン化ＤＮＡ断片 の両末端から出発する該ＤＮＡ断片の配列決定が可能である。
さらに、以下の配列表および実施例により本発明の詳細な説明することにする。
配列番号：ｌ　アダプター（１） 配列番号：２　アダプター（２）　配列表には、用いるアダプターの５′−３° 方向の相補鎖を示しである。
配列番号：３　アダプター（３） 配列番号＝４　アダプター（４）　配列表には、用いるアダプターの５’−３’ 方向の相補鎖を示しである。
配列番号＝９　アダプターＧＢＩ、このアダプターＤＮＡは５゜−３′方向で塩 基１−２３および３′−５′方向で５−２７に相補的な塩基から成る。
配列番号：１０　アダプター〇Ｂ２、このアダプターＤＮＡは５゛−３゛方向で 塩基１−２２および３゛−５°方向で５−２６に相補的な塩基から成る。
配列番号：１１　オリゴヌクレオチドＢＣＩＡ配列番号：１２　オリゴヌクレオ チドＢＧＩＢ配列番号：１３　オリゴヌクレオチドＢＧ２Ａ配列番号：１４　オ リゴヌクレオチドＢＧ２Ｂ配列番号：１５Ｔ３配列決定用プライマー（本頁以下 余白） 実施例 １０μｇの染色体酵母−ＤＮＡ（５０μｌの５０ｍｍｏｌ／１トリスＨＣＩ、１ ０ｍｍｏｌ／Ｉ　ＭｇＣＬ、１０ｍｍｏｌ／Ｉ　ＤＴＴ　ｐＨ７，８に溶解した もの）を超音波浴（ソルックスＲＫ２５５Ｈ，ＢＡＮＤＥＬＩＮ、周波数：３５ ｋＨｚ；出カニ　ｌ　６０／３２０Ｗ）中で、得られた断片がアガロースゲル電 気泳動で分析して５ｋｂｐより小さくなるまで音波処理した。
末端の平滑化および大きさによる分離：末端を平滑化するために、ＤＮＡ断片を ４０μｌの容量で３０分間ｄＮＴＰ　（０，０２５ｍｍｏ　ｌ／ｌ）の存在下に クレノウボリメラーゼ（０，２５Ｕ／μｍ）およびＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（０ ，１５Ｕ／μｌ）と反応させた。これらの酵素の不活性化（７０℃で１０分加熱 ）後、このＤＮＡの一部をアガロースゲル（０，８％低融点アガロース、ＩＸＴ ＢＥ）にかけ、電気泳動により分離した。
約１　ｋｂｐの鎖長を有する断片の単離：鎖長が０，５〜１．１ｋｂｐの断片を 含むゲルの領域をゲルから切り出した。アガロースの凍結とその後の遠心により ＤＮＡ断片を溶出し、１／ｌＯ容量の酢酸ナトリウム（３ｍｏｌ／１　ｐＨ７） と０．８容量のインプロパツールを加えてＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡ を７０％Ｅ　ｔ　ＯＨ（ｖ／ｖ）で洗い、乾燥し、ＴＥ（１０ｍｍｏｌ／１　ト リス−ＨＣｌ、Ｏ，１ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８）中に取り上げた。
多重ベクターｌＯまたは１９への断片のクローニング約２０ｎＨの得られた断片 を、２０μｌ　（５０ｍｍｏｌ／１トリスーＨＣｌ、ｌＯｍｍｏｌ／Ｉ　ＭｇＣ ｌ＊、ｌＯｍｍｏｌ／ｌ　ＤＴＴ、　ｐＨ７，８，０，５ｍｍｏｌ／１　ｒＡＴ Ｐ）の容量でＴ４ＤＮＡリガーゼ（０，３ワイス単位／μｌ）を用いて２０ｎＨ の多重ベクターＩＯまたは１９（ミリポア社からの多重キットのベクター１また は３に相当）と連結させた（１６℃で２２時間）。多重ベクターは予め標準条件 下にＳｍａ　Ｉで加水分解し、次いで脱リン酸化しておいた。
ＤＨ５α細胞の形質転換および培養 購入したコンピテントＤＨ５α細胞をＢＲＬ社の指示に従って１０分の１の連結 混合物で形質転換し、テトラサイクリンに対して選別しながら培養した。用いた ベクターに関してｌμｇのＤＮＡにつき５Ｘ１０’の独立クローンが得られた。
得られた約１０００のコロニーを有するＬＢプレートを、コロニーが約１〜２ｍ ｍの直径に達するまで３７℃で培養する。次いで、ガラス製のへらを使ってＬＢ 培地中にコロニーを懸濁し、プレートから取り出し、そしてテトラサイクリンに 対して選別しながら３ｍｌの容量でさらに２時間培養する。その後、遠心により 細菌を沈殿させる。標準条件下で細胞をアルカリ溶解することによりプラスミド ＤＮＡを単離し、カラムクロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ、ミニ調製）により 精製する。このＤＮＡの一部（約２μｇ）をアガロースゲル（０，８％低融点ア ガロース、ｌ　ＸＴＢＥ、０．５ｍｇ／ｍｌエチジウムプロミド）にかけ、電気 泳動（４Ｖ／　ｃ　ｍで１時間）により分離する。多重ベクターＩＯまたは１９ の「超コイル形態」と「弛緩形態」の間のゲル領域がクローン化酵母ＤＮＡを有 するプラスミドＤＮＡを含んでいる。このゲル領域を切り出す。そこに含まれる ＤＮＡをアガロースの凍結とその後の遠心により溶出し、１／Ｉ　Ｏ容量の酢酸 ナトリウム（３ｍ。
１／１ｐＨ７）と０．８容量のイソプロパツールを加えてＤＮＡを沈殿させる。
沈殿したＤＮＡを７０％ＥｔＯＨ（ｖ／ｖ）で洗い、乾燥し、ＴＥ（１０ｍｍｏ ｌ／１　トリス−ＨＣｌ、０゜１ｍｍｏｌ／Ｉ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８）中に取り上 げる。得られたＤＮＡの一部を用いてコンピテントＤＨ５α細胞を形質転換し、 テトラサイクリンに対して選別しなからＬＢプレートで培養する。
酵母の染色体ＤＮＡを、実施例１に記載したように超音波で処理して５ｋｂｐよ り小さい断片に分断した。これらのＤＮＡの末端をクレノウボリメラーゼおよび Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑化した。これらの酵素の不活性化（７０ ℃で１０分）後、このＤＮＡの２８ｇを２０μｍ　（５０ｍｍｏｌ／１　トリス −ＨＣＬ　ｌＯｍｍｏｌ／Ｉ　ＭｇＣ１ｔ、ｌＯｍｍｏｌ／Ｉ　ＤＴＴ、ｐＨ７ ，８，１ｍｍｏｌ／ｌ　ｒＡＴＰ）の容量で７４ＤＮＡリガーゼ（５０ワイス単 位／ｍ１）および２μｇずつの次のアダプター分子と反応させたニ アダブタ− （１）　：　５　’　−ＡＡＴＴＣＣＡＴＡＡＣＴＧＴＡＡＣＣ’１ＴＴＡＡＣ −：ｌ　’　ＥｃｏＮ　（２４−ｍａｒ　）　配列番号：１（２）：　コＩ−Ｇ ＧＴＡ’Ｉ’ｒＧＡＣＡＴＴＧＧＡＡＡＴＴＧ−５１ＥｃｏＨ（２０−ｍａｒ） 　配列番号：２（））：　５’−ＣＴＡＴＴＴＧＴＡＡＴＴＣＣＧＣＴＧＣＡ− ３’ＰｓｔＨ（２０−ｍａｒ）　配列番号＝３（４）：　３’−ＧＡＴＡＡＡＣ ＡＴＴＡＡＧＧＣＧ−５’　ＰｓｔＮ（１６−ｍａｒ）　配列番号：４このよう にして得られたＤＮＡ断片のプロセシングを実施例１に記載したように行う。連 結後、ＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲルにかけて分離した。０．５〜１．１ ｋｂｐの長さの断片を溶出し、精製した。その後、それらを、実施例１とは対照 的にＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで予め処理して相互に非適合性の付着末端を有する多 重ベクター１０または１９にクローン化した。コンピテントＤＨ５α細胞を連結 混合物で形質転換し、テトラサイクリンに対して選別しながらＬＢプレートで培 養した。
用いたベクターに関して１μｇのＤＮＡにつき３Ｘ１０’の独立クローンが得ら れ、かくして実施例１のときよりも約６倍以上のコロニーが得られた。
クローン化酵母ＤＮＡを有するプラスミドを独占的に含む遺伝子バンクは実施例 １に記載するように構築した。
実施例　３ 多重法または新規な方法を用いて構築した遺伝子バンクの同時塩基配列決定 実施例１および実施例２により得られた遺伝子バンクをストリ−りして単一コロ ニーを分離した。２つの遺伝子バンクのそれぞれからの１コロニーをｌ　Ｏｍｌ のＬＢ培地中で合わせ、懸濁した。
懸濁体が６００　ｎｍの波長で２の光学密度となるまで培地を３７℃で振とうし た。標準条件下で細胞をアルカリ溶解することによりプラスミドＤＮＡを単離し 、カラムクロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ、ミニ調製）により精製した。
２つのプラスミドＤＮＡの混合物（８μｇ）は、改良Ｔ７ボリメラーゼ（シーク エナーゼ）およびＵＳＢ社のプロトコールを用いて配列決定を行った。オリゴヌ クレオチドＰ１ｅｘＥおよびＰｌｅｘＰ（それぞれの場合に、混合物あたり４０ ｎｇ）の混合物を配列決定用プライマーとして用い、これを多重法による配列決 定のための標準として使用した。得られた配列決定用産物を配列決定用ゲル（長 さ４０ｃｍ、厚さ０．４ｍｍ、６％ポリアクリルアミド、７ｍｏｌ／１尿素；緩 衡液：１ＸＴＢＥ）で分離し、毛管プロットにより中性ナイロン膜へ移行させ、 そして２５６ｎｍのＵＶ光線を照射して膜上に固定化した。配列決定用産物は、 非修飾オリゴヌクレオチドをターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラ ーゼおよびジゴキシゲニン処理ｄＵＴＰ　（ベーリンガーマンハイム社）と反応 させて得られたジゴキシゲニン処理オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーシ ョンにより検出した。
対応する配列梯子はベーリンガーマンハイム社のジゴキシゲニン検出系（抗ジゴ キシゲニン抗体のＦａｂ断片）とその後の化学発光を用いて可視化した。配列決 定反応の検出後、膜を標準条件下で加熱して、ハイブリダイズしたオリゴヌクレ オチドを除いた。
膜はそれぞれの場合に次のジゴキシゲニン処理オリゴヌクレオチドの１つと一度 反応させた： 多重ベクター１０ Ｌ諜しヨ江（５’　−ＴＡＴＡＴＡＴＡＧＧＧＴＡ’ｌ’ｒＡＧＧＴＧ　３　’ 　）　配列番号：５已１Ｌよ圧（５’　−ＴＧＡＧＴＡＴＡＴＴＧＡＴＧＡ’Ｉ ’ｒＡＧＧ　３　’　）　配列番号：６多重ベクター１９ Ｊ　（５１−ＡＧＡＡＧＴＴＡＡＴＧＴＡＧＧＧＴＴＧＧ：ｌ　’　）　配列番 号ニアＬｌＬ記よ（５’　−ＧＴＧＡＴＡＡＧＴＡＧＡＧ’ｎ’ＧＧＴＴＧ−３ ’　）　、　配列番号＝８Ｐｓ　ｔＨ，ＥｃｏＨ（実施例２参照）。
結果： 実施したハイブリダイゼーションのそれぞれにおいて、独立した明確な配列を決 定することができた。
ファージベクターラムダＺＡＰＩＩのＥｃｏＲＩ開裂部位に構築されかつストラ タジーン社（米国サンジエゴ）から市販されているヒト心臓からのｃＤＮＡバン クを、初めに、製造者の指示に従って二本鎖ファージミド形態に変換した。
ファージミドバンクから単離した全ＤＮＡＩμｇを標準条件下で酵素ＮｏｔＩで 開裂した。２つの別個の反応において、それぞれの場合、５００ｎｇの開裂ＤＮ Ａに３００ｎＨのアダプターＤＮＡ（混合物１ニアダブター〇Ｂ１．混合物２ニ アダブター〇Ｂ２）を加えた。２０μｍ（５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣ１２、Ｌ　ＯｍＭ　ＤＴＴ、ｐＨ７，８，１ｍＭ　ＡＴＰ）の容量でＴ４ ＤＮＡリガーゼ（５０ワイス単位／ｍ１）と反応させてアダプターをＤＮＡに連 結させた（１２℃で１０時間）。用いたアダプターは次の配列を有する： ＧＢＩ： ５’　−ＧＧＣＣＡＣＡＴＡＡＣｒＣＡＡＡＴＣＴＣＡＡＡ　−３’　配列番号 ：９３’−ＴＧＴＡ？ｒＧＡＧＴＴＴＡＧＡＧＴＴＴＣＣＧＧ−５’ＧＢ２： ５１−ＧＧＣＣＡＧＣＴＡＴＣＴＣＧＴＡＡＴｒＧＣＴ　−３’　配列番号　： １０３’−ＴＣＧＡＴＡＧＡＧＣＡＴＴＡＡＣＧＡＣＣＧＧ−５’過剰のアダプ ターの分離： 連結後、反応混合物を６５℃で１０分間加熱し、続いて氷上で冷やす。この反応 混合物をアガロースゲル（０，８％低融点アガロース、ＩＸＴＢＥ、０．５ｍｇ ／ｍｌエチジウムプロミド）にかけ、電気泳動（４Ｖ／ｃｍで１時間）で分離す る。プラスミドＤＮＡ　（線状ｐＢｓＳＫＩＩ　ＤＮＡより大きい）を含むゲル の領域を切り出す。そこに含まれるＤＮＡをアガロースの凍結とその後の遠心に より溶出し、１／１０容量の酢酸ナトリウム（３ｍｏ１／１、ｐＨ７）と０．　 ８容量のイソプロパツールを加えてＤＮＡを沈殿させる。沈殿したＤＮＡを７０ ％ＥｔＯＨ（ｖ／ｖ）で洗い、乾燥し、ＴＥ　（１０ｍｍｏ　１／ｌ　トリス− ＨＣｌ、０゜１ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８）中に取り上げる。
付着末端をアニーリングすることによる両末端でのアダプター含有プラスミドＤ ＮＡの環状化： 約５０ｎｇの単離ＤＮＡを、初めに６５℃で２０分間、次に３７℃でさらに２時 間、２０μｍ（５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＣ１２，１０ｍＭ　 ＤＴＴ、ｐＨ７，８）の容量中に貯蔵する。
遺伝子バンクの構築： 購入したコンピテントＤＨ５α細胞をＢＲＬ社の指示に従って１０分の１の連結 混合物で形質転換した。細菌をＬＢ培地にストリークし、アンピシリンに対して 選別しながら培養する。この方法で構築された遺伝子バンクは、用いたベクター に関して、ｌμｇのＤＮＡにつき１〜６Ｘ１０’の独立クローンを含んでいた。
それぞれの場合に、２つの遺伝子バンクの各々から１つのコロニーを取り出し、 １０ｍ１のＬＢ培地で一緒に培養した。実施例３に記載したようにプラスミドＤ ＮＡを単離し、２つのプラスミドＤＮＡの混合物（８μｇ）について改良Ｔ７ポ リメラーゼ（シークエナーゼ）およびＵＳＢ社のプロトコールを用いて配列決定 を行った。配列決定用プライマーとしてＴ３配列決定用プライマー　（５’−Ａ ＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ−３°（配列番号：１５）、それぞれの場合 に混合物あたり４０ｎｇ）を用いた。得られた配列決定用産物を配列決定用ゲル （長さ４０ｃｍ、厚さ０．４ｍｍ、６％ポリアクリルアミド、７ｍｏｌ／Ｉ尿素 ；緩衝液：ＩＸＴＢＥ）て分離し、毛管プロットにより中性ナイロン膜へ移行さ せ、そして２５６ｎｍのＵＶ光線を照射して膜上に固定化した。配列決定用産物 は、非修飾オリゴヌクレオチドをターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフ エラーゼおよびジゴキシゲニン処理ｄＵＴＰ　（ベーリンガーマンハイム社）と 反応させて得られたジゴキシゲニン処理オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼ ーションにより検出した。
対応する配列梯子はベーリンガーマンハイム社のジゴキシゲニン検出系（抗ジゴ キシゲニン抗体のＦａｂ断片）とその後の化学発光を用いて可視化した。配列決 定反応の検出後、膜を標準条件下で加熱して、ハイブリダイズしたオリゴヌクレ オチドを除いた。
膜はそれぞれの場合にオリゴヌクレオチドＢＣＩＡおよびＢＧＩＢの混合物と、 次にオリゴヌクレオチドＢＧ２ＡおよびＢＧ２Ｂの混合物と１度反応させる： ＢＧＩＡ：　５’−ＧＡＧＴＴＡＴＧＴＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣ−３’　（配列番 号；１１）ＢＧＩＢ：　５嘗−ＡＧＡＣＧＧＣＣＡＣＡＴＡＡＣＴＣＡＡＡ−１ （配列番号＝１２）ＢＧ２Ａ：　５’−ＣＧＡＧＡＴＡＧＣＴＧＧＣＣＧＣＣＡ −３’　（配列番号：１コ）ＢＧ２Ｂ＝　５’−ＡＧＡＧＣＧＧＣＣＡＧＣＴＡ ＴＣＴＣ−３’　（配列番号：１４）結果： 実施したハイブリダイゼーションのそれぞれにおいて、独立した明確な配列を決 定することができた。
配列表 （ｉｉ）配列の数：１５ （２）配列番号：ｌの情報： （ｉ）配列の特徴。
（Ａ）配列の長さ＝２４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載６配列番号、１： 入ＡＴｒＣＣＡＴＡＡ　ＣＴＧＴＭＣＣＴＩ’　ＴＡＡＣ２４（２）配列番号： ２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝２０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （Ｘり配列の記載：配列番号：２： ＣＣＡＴＡＡＣＴＧＴ　ＡＡＣＣＴＴＴＭＣ２０（２）配列番号：３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝３＝ ＣＴＡＴＩＴＧＴＡＡ　ＴＴＣＣＧＣＴＧＣＡ　２０（２）配列番号：４の情報 ： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝１６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：４： ＣＴＡＴＴｒＧＴＭ　ＴＴＣＣＧＣ１６（２）配列番号＝５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝２０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：５： τＡＴＡＴＡＴＡＧＧ　ＧＴＡＴｒＡＧＧＴＧ　２０（２）配列番号二６の情報 ： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝２０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝６二 ＴＧＡＧＴＡＴＡＴＴ　ＧＡＴＧＡＴＴＡＧＧ　２０（２）配列番号＝７の情報 ： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝２０塩基対 （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号ニア： ＡＧＡＡＧＴｒＡＡＴ　ＧＴＡＧＧＧＴＴＧＧ　２０（２）配列番号：８の情報 ： （ｉ）配列の特徴。
（Ａ）配列の長さ＝２０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載　配列番号＝８： ＧＴＧＡＴＡＡＧＴＡ　ＧＡＧＴｒＧＧＴＴＧ　２０（２）配列番号＝９の情報 ： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：両形態 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号ニア二 ＧＧＣＣＡＣＡＴＡＡ　ＣＴＣＡＡＡＴＣＴＣＡＡＡＧＧＣＣ２７（２）配列番 号：１０の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：両形態 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１０：ＧＧＣＣＡＧＣＴＡＴ　ＣＴＣＧＴＡＡ ＴＴＧ　ＣＴＧＧＣＣ２ｇ（２）配列番号：１１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１１：ＧＡＧ’ｌ’ｌ”ＡＴＧＴＧ　ＧＣＣＧ ＣＣＡＣＣ１９（２）配列番号：１２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１２：入ＧｋＣＧＧＣＣｋＣＡＴＡＡＣＴＣＡ ＡＡ　２０（２）配列番号＝１３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝１８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１３：ＣＧＡＧＡＴＡＧＣＴ　ＧＧＣＣＧＣＣ Ａ　１８（２）配列番号：１４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１４：ＡＧＡＧＣＧＧＣＣＡ　ＧＣＴＡＴＣＴ Ｃ１８（２）配列番号：１５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ二１７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝１５：ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＭＡＧ　１ ７Ｆｉｇｕｒａ　１ 記号の意味 士 Ｆｉｇｕｒｅ　３ １１ゴ　Ｄ＝＝＝＝＝う＝ミ１エエエエエエエエ。（ミ９２０３８８．ｄＦｉｇ ｕｒ＠４ 副産物： フロントページの続き （７２）発明者　ブルム、ヘルムート ドイツ連邦共和国　８１４７５　ミュンヘンケニクスヴイーセルシュトラーセ　 ８６（７２）発明者　トムディ、ホルスト ドイツ連邦共和国　８２０６１　ノーリードファサネンヴエーク　６

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. １．核酸の同時塩基配列決定法であって、（ａ）配列決定すべき多数のＤＮＡ断 片を調製すること；（ｂ）配列決定すべきＤＮＡ断片の全体をいくつかのグルー プに分割すること； （ｃ）（ｂ）からの分割したＤＮＡ断片の両末端に二本鎖ＤＮＡアダプターを連 結すること、その際該アダプターは５ヌクレオチド以上の長さの二本鎖領域を有 し、かつ該ＤＮＡ断片の末端に適合する第一端とベクターへのクローニングに適 する第二端を有し、そして異なるヌクレオチド配列を有する該アダプターを分割 したＤＮＡ断片のそれぞれのグループに連結させること； （ｄ）（ｃ）からの両末端に該アダプターを有するＤＮＡ断片を、該アダプター の第二端と対合する制限部位を有する基本ベクターにクローニングすること； （ｅ）（ｄ）からの多数のクローンを選択すること（しかしながら、多くて１つ のクローンしか１つのグループから生じないことがある）、そして選択したクロ ーンに対して配列決定反応を行うこと；および （ｆ）多数の検出可能なハイブリダイゼーションプローブを用いて配列決定反応 の結果を解析すること、その際各プローブは（ｅ）からのただ１つのクローンに 特異的であること；から成る上記方法。
  2. ２．ＤＮＡ断片が平滑末端を有する、請求項１記載の方法。
  3. ３．ＤＮＡ断片が付着末端を有する、請求項１記載の方法。
  4. ４．第二端が付着末端であるアダプターを用いる、請求項１〜３のいずれか１つ に記載の方法。
  5. ５．二本鎖ＤＮＡアダプターの長さが１０〜４０ヌクレオチドである、請求項１ 〜４のいずれか１つに記載の方法。
  6. ６．それぞれのグループ内で単一のアダプターを用いる、請求項１〜５のいずれ か１つに記載の方法。
  7. ７．それぞれのグループ内で２種類のアダプターを用いる、請求項１〜５のいず れか１つに記載の方法。
  8. ８．それぞれのグループ内の連結反応のために、異なるヌクレオチド配列および 付着第二端を有する２種類のアダプターを使用し、そしてアダプターを有するＤ ＮＡ断片をクローン化するために、アダプターのそれぞれの第二端に適合しうる ２つの制限部位を有する基本ベクターを使用する、請求項１〜５または７のいず れか１つに記載の方法。
  9. ９．２種類のアダプター分子の付着第二端が互いに適合性でない、請求項８記載 の方法。
  10. １０．ＤＮＡ断片をクローン化するために用いる基本ベクターがさらに少なくと も１つのまれにしか存在しない酵素開裂部位を挿入部位の両側に有する、請求項 １〜９のいずれか１つに記載の方法。
  11. １１．まれにしか存在しない酸素開裂部位が少なくとも７ヌクレオチドの認識配 列を有し、そして／またはヌクレオチド配列５′−ＣＧ−３′を少なくとも１度 含んでいる、請求項１０記載の方法。
  12. １２．開裂部位がＮｏｔＩ、ＳｆｉＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｗａＩ、Ｐ ａｃＩ、ＡｓｃＩ、ＰｍｅＩ、Ｓｓｅ８３８７Ｉ、ＳｒｓＩまたは１−ＳｃｅＩ 開裂部位である、請求項１１記載の方法。
  13. １３．アダプターを有するＤＮＡ断片をクローン化するために、ＤＮＡ断片挿入 用の制限部位の近くに転写ターミネーターを有する基本ベクターを使用する、請 求項１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
  14. １４．塩基配列決定反応を分析するために非放射性標識ハイブリダイゼーシヨン プローブを用いる、請求項１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
  15. １５．ビオチン、蛍光体、発光体、ジゴキシゲニンおよび／または酵素で標識さ れたハイブリダイゼーションプローブを用いる、請求項１４記載の方法。
  16. １６．（ｆ）が次の工程： （ｆ１）（ｅ）からの配列決定反応により得られた配列決定用産物をそれらの大 きさにより分離すること、その際いくつかのクローンからの特定の反応の対応す る配列決定用産物を一緒に分離すること； （ｆ２）分離した配列決定用産物を核酸結合用の適当な担体に移行させ、所望に より、移行した配列決定用産物を該担体に固定化すること； （ｆ３）該担体と（ｉ）第一の検出可能なハイブリダイゼーションプローブまた は（ｉｉ）２つまたは複数の選択的に検出可能なハイブリダイゼーションプロー ブとを可逆的にハイブリダイズさせること、その際各プローブはそれぞれの場合 に（ｅ）からの単一クローンに対してのみ特異的であり、各プローブの特異性が 特定のアダプターおよび所望により隣接ベクター配列から形成される特定の標的 配列への、反応条件下で実施されたハイブリダイゼーションにより規定されるこ と；（ｆ４）（ｆ３）からの結果を解析し、結合したハイブリダイゼーションプ ローブを担体から除去すること；そして（ｆ５）所望により、別の検出可能なハ イブリダイゼーションプローブ（それらは他の標的配列に結合するという点で他 のプローブと相違する）を用いて工程（ｆ３）および（ｆ４）を繰り返すこと； から成る、請求項１記載の方法。
  17. １７．すでに存在する遺伝子バンクを、核酸の同時塩基配列決定を行うことがで きる修飾遺伝子バンクに変換する方法であって、（ａ）基本ベクターにクローン 化された多数の異なるＤＮＡ断片から成る目的の遺伝子バンクを作製すること、 その際基本ベクターは少なくとも１つのまれにしか存在しない酵素開裂部位をク ローン化ＤＮＡ断片の近くに含むこと；（ｂ）（ａ）に記載のまれにしか存在し ない開裂部位で開製することにより該遺伝子バンクを線状化すること；（ｃ）該 遺伝子バンクをいくつかのグループに分割すること；（ｄ）分割した線状化遺伝 子バンクを二本鎖ＤＮＡアダプターと連結させること、その際該アダプターの二 本鎖領域は５ヌクレオチド以上の鎖長を有しかつ基本ベクターの開裂部位と対合 する末端を両側に有し、これにより異なる配列を有するアダプターを遺伝子バン クの各グループに連結させること；そして （ｅ）所望により、目的の連結産物を副産物から分離すること；から成る上記方 法。
  18. １８．アダプターの導入により開裂部位が除かれるように、アダプターのヌクレ オチド配列を選択する、請求項１７記載の方法。
  19. １９．工程（ｅ）が遺伝子バンクの線状化に用いた酵素を使って（ｄ）からの連 結産物を再開製することを含む、請求項１８記載の方法。
  20. ２０．ＮｏｔＩ、ＳｆｉＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｗａＩ、ＰａｃＩ、Ａ ｓｃＩ、ＰｍｅＩ、Ｓｓｅ８３８７Ｉ、ＳｒｓＩまたはＩ−ＳｃｅＩを用いて開 裂を行う、請求項１７〜１９のいずれか１つに記載の方法。
  21. ２１．対称配列を有するアダプター分子を用いる、請求項１７〜２０のいずれか １つに記載の方法。
  22. ２２．非対称配列を有するアダプター分子を用いる、請求項１７〜２０のいずれ か１つに記載の方法。
  23. ２３．クローン化ＤＮＡ断片の近くでその各側に少なくとも１つのまれにしか存 在しない酵素開裂部位を含む基本ベクター中の遺伝子バンクを使用して、請求項 １７記載の工程（ｂ）〜（ｅ）を２度行うことができるようにする、請求項１７ 記載の方法。
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Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100267023A1 (en) * 1992-09-24 2010-10-21 Keygene N.V. Selective restriction fragment amplification: fingerprinting
GB9214873D0 (en) * 1992-07-13 1992-08-26 Medical Res Council Process for categorising nucleotide sequence populations
GB9401200D0 (en) * 1994-01-21 1994-03-16 Medical Res Council Sequencing of nucleic acids
WO1997043449A1 (en) * 1996-05-15 1997-11-20 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods for sequencing large nucleic acid segments and compositions for large sequencing projects
US6124092A (en) 1996-10-04 2000-09-26 The Perkin-Elmer Corporation Multiplex polynucleotide capture methods and compositions
US6117634A (en) * 1997-03-05 2000-09-12 The Reagents Of The University Of Michigan Nucleic acid sequencing and mapping
US6197557B1 (en) 1997-03-05 2001-03-06 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for analysis of nucleic acids
US7270958B2 (en) 1998-09-10 2007-09-18 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for analysis of nucleic acids
US7687039B2 (en) * 1998-10-28 2010-03-30 Covaris, Inc. Methods and systems for modulating acoustic energy delivery
US6828098B2 (en) 2000-05-20 2004-12-07 The Regents Of The University Of Michigan Method of producing a DNA library using positional amplification based on the use of adaptors and nick translation
US20020086310A1 (en) * 2000-09-01 2002-07-04 Frank Fan Identification of targets of antimicrobial compounds
US20040197791A1 (en) * 2001-06-29 2004-10-07 Makarov Vladimir L. Methods of using nick translate libraries for snp analysis
JP2005535283A (ja) * 2001-11-13 2005-11-24 ルビコン ゲノミクス インコーポレイテッド ランダムフラグメント化により生成されたｄｎａ分子を用いたｄｎａ増幅および配列決定
EP1606417A2 (en) * 2003-03-07 2005-12-21 Rubicon Genomics Inc. In vitro dna immortalization and whole genome amplification using libraries generated from randomly fragmented dna
US8206913B1 (en) 2003-03-07 2012-06-26 Rubicon Genomics, Inc. Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a DNA polymerization process
CA2902980A1 (en) 2004-03-08 2005-09-29 Rubicon Genomics, Inc. Methods and compositions for generating and amplifying dna libraries for sensitive detection and analysis of dna methylation
DK1924704T3 (da) 2005-08-02 2011-09-05 Rubicon Genomics Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til bearbejdning og mangfoldiggørelse af DNA, herunder ved anvendelse af flere enzymer i en enkelt reaktion
EP1924705A1 (en) * 2005-08-02 2008-05-28 Rubicon Genomics, Inc. Isolation of cpg islands by thermal segregation and enzymatic selection-amplification method
US8702836B2 (en) 2006-11-22 2014-04-22 Covaris, Inc. Methods and apparatus for treating samples with acoustic energy to form particles and particulates
WO2009117031A2 (en) * 2007-12-18 2009-09-24 Advanced Analytical Technologies, Inc. System and method for nucleotide sequence profiling for sample identification
US9528107B2 (en) 2012-01-31 2016-12-27 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for selection of nucleic acids

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0093948B1 (de) * 1982-05-07 1986-12-03 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF) Doppelstrangiger Vektor und ihn verwendendes Verfahren
EP0224126A3 (en) * 1985-11-25 1989-02-01 The University of Calgary Covalently linked complementary oligodeoxynucleotides as universal nucleic acid sequencing primer linkers
US4942124A (en) * 1987-08-11 1990-07-17 President And Fellows Of Harvard College Multiplex sequencing
JP2901004B2 (ja) * 1989-04-12 1999-06-02 株式会社日立製作所 Ｄｎａの塩基配列決定法
WO1992022650A1 (en) * 1991-06-17 1992-12-23 Life Technologies, Inc. Recombination-facilitated multiplex analysis of dna fragments

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