JPH05192196A - 一本鎖ｄｎａを末端で支持体に固定化する方法 - Google Patents
一本鎖ｄｎａを末端で支持体に固定化する方法Info
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- JPH05192196A JPH05192196A JP3272528A JP27252891A JPH05192196A JP H05192196 A JPH05192196 A JP H05192196A JP 3272528 A JP3272528 A JP 3272528A JP 27252891 A JP27252891 A JP 27252891A JP H05192196 A JPH05192196 A JP H05192196A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 一本鎖ＤＮＡを末端で支持体に固定化する方
法を提供する。 【構成】 一本鎖ＤＮＡと該一本鎖ＤＮＡの相補鎖とか
らなる二本鎖ＤＮＡを該一本鎖ＤＮＡの末端で支持体に
結合させ、次いで変性処理により相補鎖を脱離せしめ
る。
法を提供する。 【構成】 一本鎖ＤＮＡと該一本鎖ＤＮＡの相補鎖とか
らなる二本鎖ＤＮＡを該一本鎖ＤＮＡの末端で支持体に
結合させ、次いで変性処理により相補鎖を脱離せしめ
る。
Description
【０００１】本発明は分子生物学の分野に関し、詳しく
は、一本鎖ＤＮＡを末端で支持体に固定化する方法に関
する。一本鎖ＤＮＡを支持体に固定化したものは、ｍＲ
ＮＡを全ＲＮＡから精製する際に使用されるオリゴｄＴ
セルロース等のオリゴｄＴＤＮＡ結合粒子として、ある
いは、サザンハイブリダイゼーション等ハイブリダイゼ
ーション実験に用いるメンブレン上に非特異的に固定化
した一本鎖に変性したＤＮＡ等として使用されている。
かかる固定化一本鎖ＤＮＡは、従来、一本鎖ＤＮＡの末
端ヌクレオチド分子を、そのアミノ基や水酸基又は化学
的修飾により導入された官能基を介して支持体に結合さ
せることにより製造されてきた。しかしながら、この従
来法では、末端ヌクレオチド以外の分子に含まれるアミ
ノ基や水酸基、あるいは導入された官能基までが反応に
関与するため、末端ヌクレオチド分子のみを支持体に結
合させることは不可能であった。従って、得られた固定
化ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡが種々の部位で支持体に結合
したものであり、その本来の目的を十分に効率よく達成
し得ないものであった。
は、一本鎖ＤＮＡを末端で支持体に固定化する方法に関
する。一本鎖ＤＮＡを支持体に固定化したものは、ｍＲ
ＮＡを全ＲＮＡから精製する際に使用されるオリゴｄＴ
セルロース等のオリゴｄＴＤＮＡ結合粒子として、ある
いは、サザンハイブリダイゼーション等ハイブリダイゼ
ーション実験に用いるメンブレン上に非特異的に固定化
した一本鎖に変性したＤＮＡ等として使用されている。
かかる固定化一本鎖ＤＮＡは、従来、一本鎖ＤＮＡの末
端ヌクレオチド分子を、そのアミノ基や水酸基又は化学
的修飾により導入された官能基を介して支持体に結合さ
せることにより製造されてきた。しかしながら、この従
来法では、末端ヌクレオチド以外の分子に含まれるアミ
ノ基や水酸基、あるいは導入された官能基までが反応に
関与するため、末端ヌクレオチド分子のみを支持体に結
合させることは不可能であった。従って、得られた固定
化ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡが種々の部位で支持体に結合
したものであり、その本来の目的を十分に効率よく達成
し得ないものであった。
【０００２】本発明者らは、一本鎖ＤＮＡ分子に含まれ
るアミノ基や水酸基の反応性は、当該一本鎖ＤＮＡをそ
の相補鎖とアニーリングすることにより封じ得ることに
着目し、まず一本鎖ＤＮＡの末端ヌクレオチド分子を支
持体との結合が可能な様に化学的に修飾し、これをその
相補鎖とアニーリングした上で支持体に結合させるか、
あるいは二本鎖ＤＮＡの一方の鎖に１若しくはそれ以上
のヌクレオチド分子が付加した形の二本鎖ＤＮＡをその
まま、あるいは付加した部分を化学的に修飾した後、該
付加部分を介して支持体に結合させ、得られた固定化二
本鎖ＤＮＡを変性処理すると、相補鎖は支持体に共有結
合していないために固定化された一本鎖ＤＮＡから脱離
し、従ってこれを分離除去すれば、末端で支持体に結合
した固定化一本鎖ＤＮＡが得られることを見い出し、本
発明を完成したものである。
るアミノ基や水酸基の反応性は、当該一本鎖ＤＮＡをそ
の相補鎖とアニーリングすることにより封じ得ることに
着目し、まず一本鎖ＤＮＡの末端ヌクレオチド分子を支
持体との結合が可能な様に化学的に修飾し、これをその
相補鎖とアニーリングした上で支持体に結合させるか、
あるいは二本鎖ＤＮＡの一方の鎖に１若しくはそれ以上
のヌクレオチド分子が付加した形の二本鎖ＤＮＡをその
まま、あるいは付加した部分を化学的に修飾した後、該
付加部分を介して支持体に結合させ、得られた固定化二
本鎖ＤＮＡを変性処理すると、相補鎖は支持体に共有結
合していないために固定化された一本鎖ＤＮＡから脱離
し、従ってこれを分離除去すれば、末端で支持体に結合
した固定化一本鎖ＤＮＡが得られることを見い出し、本
発明を完成したものである。
【０００３】従って本発明の目的は、一本鎖ＤＮＡと該
一本鎖ＤＮＡの相補鎖とからなる二本鎖ＤＮＡを末端で
支持体に結合させ、次いで変性処理により相補鎖を脱離
せしめることからなる、一本鎖ＤＮＡを末端で支持体に
固定化する方法であって、該一本鎖ＤＮＡはその末端に
１若しくはそれ以上の余分のヌクレオチド分子を含んで
いるか、あるいは一本鎖ＤＮＡの末端にあるヌクレオチ
ド分子が化学的修飾を受けているものであり、該余分の
ヌクレオチドまたは化学的修飾を受けたヌクレオチドを
介して支持体への結合が行われることを特徴とする方法
を提供するものである。本発明の別の目的は、かかる方
法で得られる、末端で支持体に固定化された一本鎖ＤＮ
Ａを提供するものである。以下、本発明に係る固定化法
を順を追ってより詳細に説明する。
一本鎖ＤＮＡの相補鎖とからなる二本鎖ＤＮＡを末端で
支持体に結合させ、次いで変性処理により相補鎖を脱離
せしめることからなる、一本鎖ＤＮＡを末端で支持体に
固定化する方法であって、該一本鎖ＤＮＡはその末端に
１若しくはそれ以上の余分のヌクレオチド分子を含んで
いるか、あるいは一本鎖ＤＮＡの末端にあるヌクレオチ
ド分子が化学的修飾を受けているものであり、該余分の
ヌクレオチドまたは化学的修飾を受けたヌクレオチドを
介して支持体への結合が行われることを特徴とする方法
を提供するものである。本発明の別の目的は、かかる方
法で得られる、末端で支持体に固定化された一本鎖ＤＮ
Ａを提供するものである。以下、本発明に係る固定化法
を順を追ってより詳細に説明する。
【０００４】一本鎖ＤＮＡの末端を化学的に修飾する場
合 １）まず、末端に固定化に適した官能基(例えば−Ｎ
Ｈ2、−ＣＯＯＨなど)を導入した一本鎖ＤＮＡを調製す
る。ＤＮＡを合成する場合、その合成自体は、市販のＤ
ＮＡ合成装置(例えばＡＢＩ社製３９１型ＰＣＲ−ＭＡ
ＴＥなど)を使用し、常法によって行うことができる。
官能基の導入は、例えば次のような方法で行うことがで
きる。 （１） アミノリンク２（ＡＢＩ社製）の導入 以下の反応式に従い、ＤＮＡ合成装置を使って、ヘキシ
ルアミノ基をＤＮＡ末端に導入することができる（Appl
ied Biosystems Inc User Bulletin No. 49 August 198
8、 参照）。
合 １）まず、末端に固定化に適した官能基(例えば−Ｎ
Ｈ2、−ＣＯＯＨなど)を導入した一本鎖ＤＮＡを調製す
る。ＤＮＡを合成する場合、その合成自体は、市販のＤ
ＮＡ合成装置(例えばＡＢＩ社製３９１型ＰＣＲ−ＭＡ
ＴＥなど)を使用し、常法によって行うことができる。
官能基の導入は、例えば次のような方法で行うことがで
きる。 （１） アミノリンク２（ＡＢＩ社製）の導入 以下の反応式に従い、ＤＮＡ合成装置を使って、ヘキシ
ルアミノ基をＤＮＡ末端に導入することができる（Appl
ied Biosystems Inc User Bulletin No. 49 August 198
8、 参照）。
【化１】
【０００５】（２） 式：
【化２】 で示されるリンカーを、ＤＮＡ合成装置（ＡＢＩ社製、
Ａ−３９１ＥＰ ＰＣＲ−ＭＡＴＥなど）を用いてＤＮ
Ａ末端に導入し、これを適当に処理することにより、こ
のリンカー末端を反応性のあるアルデヒド基またはカル
ボキシル基に導くことができ、更にアルデヒド基の場合
は、ビオチンのヒドラシド化合物と反応させることによ
り、アビジンと複合体を形成し得るビオチンを導入する
ことができる(Jonathan N. Kremskyら、 Nucleic Acid
Research 1987 vol.15, p2891〜参照)。 （３） ＤＮＡ合成装置を用い、アミノ基をもつ塩基の
ヌクレオチド１〜数１０個を相補部分のＤＮＡ末端に付
加する。 （４） ターミナルトランスフェラーゼにより、支持体
との結合に適した塩基、またはその反応性誘導体をＤＮ
Ａ末端に導入する（Deug, G. and Wu, R. Methods in E
nzymology vol. 100 p96-116, 1983、参照）。 ２）次に、１)で得た一本鎖ＤＮＡの相補鎖を１)と同様
合成装置を用いて調製し、両者をアニーリングさせる。
Ａ−３９１ＥＰ ＰＣＲ−ＭＡＴＥなど）を用いてＤＮ
Ａ末端に導入し、これを適当に処理することにより、こ
のリンカー末端を反応性のあるアルデヒド基またはカル
ボキシル基に導くことができ、更にアルデヒド基の場合
は、ビオチンのヒドラシド化合物と反応させることによ
り、アビジンと複合体を形成し得るビオチンを導入する
ことができる(Jonathan N. Kremskyら、 Nucleic Acid
Research 1987 vol.15, p2891〜参照)。 （３） ＤＮＡ合成装置を用い、アミノ基をもつ塩基の
ヌクレオチド１〜数１０個を相補部分のＤＮＡ末端に付
加する。 （４） ターミナルトランスフェラーゼにより、支持体
との結合に適した塩基、またはその反応性誘導体をＤＮ
Ａ末端に導入する（Deug, G. and Wu, R. Methods in E
nzymology vol. 100 p96-116, 1983、参照）。 ２）次に、１)で得た一本鎖ＤＮＡの相補鎖を１)と同様
合成装置を用いて調製し、両者をアニーリングさせる。
【０００６】３）上で得た二本鎖ＤＮＡに固定化用支持
体を加え、適当な手段で両者を結合させる。支持体とし
ては、例えば、ナイロンメンブラン、ニトロセルロース
メンブラン、ポリテトラフルオロエチレンメンブラン、
ポリエチレンメンブラン等、天然または合成有機高分子
メンブラン（膜状体）を挙げることができる。ニトロセ
ルロースのように有機高分子（例；セルロース）を化学
的に処理し、改質して得たメンブランも含む。また、そ
の他の支持体としては、グラファイト、多孔質ガラス、
シリカ等の無機高分子メンブラン；アルミニウム、アパ
タイト等の金属メンブラン；アルミナ、窒化珪素等のセ
ラミックスメンブラン；食塩等の結晶を挙げることがで
きる。さらに、これらの表面を化学的、物理的に表面処
理することで改質されたものも使用できる。
体を加え、適当な手段で両者を結合させる。支持体とし
ては、例えば、ナイロンメンブラン、ニトロセルロース
メンブラン、ポリテトラフルオロエチレンメンブラン、
ポリエチレンメンブラン等、天然または合成有機高分子
メンブラン（膜状体）を挙げることができる。ニトロセ
ルロースのように有機高分子（例；セルロース）を化学
的に処理し、改質して得たメンブランも含む。また、そ
の他の支持体としては、グラファイト、多孔質ガラス、
シリカ等の無機高分子メンブラン；アルミニウム、アパ
タイト等の金属メンブラン；アルミナ、窒化珪素等のセ
ラミックスメンブラン；食塩等の結晶を挙げることがで
きる。さらに、これらの表面を化学的、物理的に表面処
理することで改質されたものも使用できる。
【０００７】さらに、ナイロン、ニトロセルロース、セ
ルロース、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン
等の有機高分子の粒子；グラファイト、多孔質ガラス、
シリカ等の無機高分子の粒子；アルミニウム、アパタイ
ト等の金属粒子；アルミナ等のセラミック粒子；等も使
用することができ、また、これら有機高分子を、例えば
酸化、還元、加水分解などの化学的処理、例えばプラズ
マ照射などの物理的処理で改質したもの、無機高分子粒
子、金属粒子、セラミック粒子を、例えばイオンプレー
ティングなどの物理的、化学的に表面処理を行うことで
改質されたものも使用できる。この表面処理の仕方は、
ポリメチルメタクリレート重合膜に強アルカリ溶液(４
Ｎ ＮａＯＨ)をかけ、数時間反応させて表面にカルボキ
シル基を導入する；ポリスチレン膜に紫外線照射を行い
過酸化物を表面に生じさせ酸処理により水酸基を導入す
る；テフロンシートにナフタレニドナトリウム塩を作用
させ、さらに過酸化水素を作用させて水酸基を導入する
(Ind. Eng. Chem. Res 1989 Vol.28 No.7)；ポリウレタ
ン膜に、アンモニアガス中でグロー放電することにより
その表面にアミノ基を導入する、等がある。ＤＮＡと支
持体との結合法は、ＤＮＡおよび支持体の両者の化学的
修飾の種類によって異なり、次のいずれかの方法を用い
ることができる。
ルロース、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン
等の有機高分子の粒子；グラファイト、多孔質ガラス、
シリカ等の無機高分子の粒子；アルミニウム、アパタイ
ト等の金属粒子；アルミナ等のセラミック粒子；等も使
用することができ、また、これら有機高分子を、例えば
酸化、還元、加水分解などの化学的処理、例えばプラズ
マ照射などの物理的処理で改質したもの、無機高分子粒
子、金属粒子、セラミック粒子を、例えばイオンプレー
ティングなどの物理的、化学的に表面処理を行うことで
改質されたものも使用できる。この表面処理の仕方は、
ポリメチルメタクリレート重合膜に強アルカリ溶液(４
Ｎ ＮａＯＨ)をかけ、数時間反応させて表面にカルボキ
シル基を導入する；ポリスチレン膜に紫外線照射を行い
過酸化物を表面に生じさせ酸処理により水酸基を導入す
る；テフロンシートにナフタレニドナトリウム塩を作用
させ、さらに過酸化水素を作用させて水酸基を導入する
(Ind. Eng. Chem. Res 1989 Vol.28 No.7)；ポリウレタ
ン膜に、アンモニアガス中でグロー放電することにより
その表面にアミノ基を導入する、等がある。ＤＮＡと支
持体との結合法は、ＤＮＡおよび支持体の両者の化学的
修飾の種類によって異なり、次のいずれかの方法を用い
ることができる。
【０００８】i） ＤＮＡ又は担体上の水酸基（主とし
てジオール基）をトリフルオロエタンスルフォニルクロ
ライド（トレシルクロライド）(K.Nillson and K. Mosb
ach:Biochem. Biophys. Res. Commun., 102, 449, 198
1)、ＣＮＢｒ(R. Axen, et al: Nature, 214, 1302, 19
67)、トリクロロトリアジン(T. H. Finlay, et al: Ana
l. Biochem., 87, 77, 1978)、エピクロロヒドリン(I.
Matsumoto, et al: J.Biochem., 85, 1091, 1979)、ビ
スオキシラン(L. Sundberg and J. Porath: J.Chromato
gr., 90, 87, 1974)、ジビニルスルホン酸(J. Porath: M
eth. Enzymol.,34, 27, 1974)、ベンゾキノン(J. Brand
t, et al: Biochem. Biophys. Acta, 386, 196, 197
5)、カルボニルジイミダゾール(G. S. Bethell, et al:
J. Biol.Chem., 254, 2572, 1979)などで活性化し、担
体上、又はＤＮＡの主としてアミノ基と結合させる。
てジオール基）をトリフルオロエタンスルフォニルクロ
ライド（トレシルクロライド）(K.Nillson and K. Mosb
ach:Biochem. Biophys. Res. Commun., 102, 449, 198
1)、ＣＮＢｒ(R. Axen, et al: Nature, 214, 1302, 19
67)、トリクロロトリアジン(T. H. Finlay, et al: Ana
l. Biochem., 87, 77, 1978)、エピクロロヒドリン(I.
Matsumoto, et al: J.Biochem., 85, 1091, 1979)、ビ
スオキシラン(L. Sundberg and J. Porath: J.Chromato
gr., 90, 87, 1974)、ジビニルスルホン酸(J. Porath: M
eth. Enzymol.,34, 27, 1974)、ベンゾキノン(J. Brand
t, et al: Biochem. Biophys. Acta, 386, 196, 197
5)、カルボニルジイミダゾール(G. S. Bethell, et al:
J. Biol.Chem., 254, 2572, 1979)などで活性化し、担
体上、又はＤＮＡの主としてアミノ基と結合させる。
【０００９】ii） ＤＮＡ又は担体上の主としてカルボ
キシル基（−ＣＯＯＨ基）を水溶性カルボジイミド等の
カルボジイミド(A. Tengblad: Biochem, J., 199, 297,
1981、 M. Funabashi, et al: Anal. Biochem., 126, 4
14, 1982)又は２−エトキシ−１−エトキシカルボニル
−１，２−ジヒドロキノリン(ＥＥＤＱ)(G. Saccomani,
et al: J. Biochem., 256, 12405, 1981、B. Belleau a
nd G. Malek: J. Am.Chem. Soc., 90, 1651, 1968)で活
性化し、担体上又はＤＮＡの主としてアミノ基（−ＮＨ
2）と縮合結合させる。 iii） 従来の非特異的又は末端とは限らない状態で支
持体に結合したＤＮＡに、所望のＤＮＡをＤＮＡリガー
ゼ（連結酵素）を用いて結合させる。 iv） 担体上及びＤＮＡのヒドラジド基とアルデヒド基
またはヒドラジド基とカルボキシル基を用いて結合させ
る。ヒドラジド基とアルデヒド基の場合は、混合すると
ヒドラゾン結合を形成する。これを還元操作を行うこと
で共有結合化する(Jonathan N. Kremsky：上掲)。ヒド
ラジドとカルボキシル基の場合は、ii)のようにカルボ
ジイミド等を用いる。
キシル基（−ＣＯＯＨ基）を水溶性カルボジイミド等の
カルボジイミド(A. Tengblad: Biochem, J., 199, 297,
1981、 M. Funabashi, et al: Anal. Biochem., 126, 4
14, 1982)又は２−エトキシ−１−エトキシカルボニル
−１，２−ジヒドロキノリン(ＥＥＤＱ)(G. Saccomani,
et al: J. Biochem., 256, 12405, 1981、B. Belleau a
nd G. Malek: J. Am.Chem. Soc., 90, 1651, 1968)で活
性化し、担体上又はＤＮＡの主としてアミノ基（−ＮＨ
2）と縮合結合させる。 iii） 従来の非特異的又は末端とは限らない状態で支
持体に結合したＤＮＡに、所望のＤＮＡをＤＮＡリガー
ゼ（連結酵素）を用いて結合させる。 iv） 担体上及びＤＮＡのヒドラジド基とアルデヒド基
またはヒドラジド基とカルボキシル基を用いて結合させ
る。ヒドラジド基とアルデヒド基の場合は、混合すると
ヒドラゾン結合を形成する。これを還元操作を行うこと
で共有結合化する(Jonathan N. Kremsky：上掲)。ヒド
ラジドとカルボキシル基の場合は、ii)のようにカルボ
ジイミド等を用いる。
【００１０】v） ＤＮＡ及び担体上に互いに親和力の
あるものを導入し（例えばビオチンとアビジン等）、そ
の親和力に基づいた固定化を行う(Jonathan N. Kremsk
y; 上掲）。 vi） ＤＮＡと担体上のチオール基同志を活性化、固定
化する。(K. Brocklehurst, et al: Biochem, J., 133,
573, 1973)。 vii） ＤＮＡと担体上のアミノ基同志をブリモアセタ
ミド法にて結合させる(P. Cuatrecasas: J. Biol. Che
m., 245, 3059, 1970 )。
あるものを導入し（例えばビオチンとアビジン等）、そ
の親和力に基づいた固定化を行う(Jonathan N. Kremsk
y; 上掲）。 vi） ＤＮＡと担体上のチオール基同志を活性化、固定
化する。(K. Brocklehurst, et al: Biochem, J., 133,
573, 1973)。 vii） ＤＮＡと担体上のアミノ基同志をブリモアセタ
ミド法にて結合させる(P. Cuatrecasas: J. Biol. Che
m., 245, 3059, 1970 )。
【００１１】４）上で得た固定化二本鎖ＤＮＡを２.４
Ｍテトラエチルアンモニウムクロライド水溶液、適宜希
釈した１０×ＳＳＣ(１.５ＭのＮａＣｌおよび ０.１５
Ｍクエン酸ナトリウム；ｐＨ７.０)、０.１〜２ＭＮａ
Ｃｌ水溶液等の塩溶液中、熱(約４０℃以上)またはアル
カリを加えることにより変性させ、遠心して固相と液相
を分離することにより、固定化一本鎖ＤＮＡを得る。
Ｍテトラエチルアンモニウムクロライド水溶液、適宜希
釈した１０×ＳＳＣ(１.５ＭのＮａＣｌおよび ０.１５
Ｍクエン酸ナトリウム；ｐＨ７.０)、０.１〜２ＭＮａ
Ｃｌ水溶液等の塩溶液中、熱(約４０℃以上)またはアル
カリを加えることにより変性させ、遠心して固相と液相
を分離することにより、固定化一本鎖ＤＮＡを得る。
【００１２】二本鎖ＤＮＡをそのまま、あるいは末端を
化学的に修飾して用いる場合 既述した様に、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖に１若しくはそ
れ以上のヌクレオチド分子が付加した形の二本鎖ＤＮＡ
は、そのままあるいは化学的な修飾を施した後支持体に
末端で結合させることができるので、上記の工程３)以
降の操作を施せば、上と同様の目的を達成することがで
きる。この様な二本鎖ＤＮＡは、次の様にして調整する
ことができる。
化学的に修飾して用いる場合 既述した様に、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖に１若しくはそ
れ以上のヌクレオチド分子が付加した形の二本鎖ＤＮＡ
は、そのままあるいは化学的な修飾を施した後支持体に
末端で結合させることができるので、上記の工程３)以
降の操作を施せば、上と同様の目的を達成することがで
きる。この様な二本鎖ＤＮＡは、次の様にして調整する
ことができる。
【００１３】i） 一本鎖ＤＮＡの化学的修飾(４)で述
べた様に、ターミナルトランスフェラーゼを使用して、
片方のＤＮＡ鎖の末端にのみ、支持体との結合に適した
塩基またはその反応性誘導体を導入することができる。 ii） 末端に一本鎖部分ができる様に制限酵素で切断す
る。 iii） 官能基を持つＤＮＡ分子と、二本鎖ＤＮＡをＤ
ＮＡリガーゼにより結合させる。例えば、二本鎖ＤＮＡ
の両端の切断端が異なる配列を持つように２種の制限酵
素で処理する。そこで一方の切断端に特異的に結合でき
る配列を有する官能基を有するＤＮＡを加え、そこにＤ
ＮＡリガーゼを作用させることにより目的ＤＮＡ断片の
末端に官能基を導入できる。(この場合、除去したい方
の鎖の５'末端を脱リン酸化しておいてもよい。即ち目
的とする二本鎖ＤＮＡの一端だけが出た長い二本鎖ＤＮ
Ａを調製し、この状態で脱リン酸化酵素により５’末端
を脱リン酸化し、その後二本鎖ＤＮＡを切断して目的断
片をつくると一方の５’末端は脱リン酸化されたものが
できる)。
べた様に、ターミナルトランスフェラーゼを使用して、
片方のＤＮＡ鎖の末端にのみ、支持体との結合に適した
塩基またはその反応性誘導体を導入することができる。 ii） 末端に一本鎖部分ができる様に制限酵素で切断す
る。 iii） 官能基を持つＤＮＡ分子と、二本鎖ＤＮＡをＤ
ＮＡリガーゼにより結合させる。例えば、二本鎖ＤＮＡ
の両端の切断端が異なる配列を持つように２種の制限酵
素で処理する。そこで一方の切断端に特異的に結合でき
る配列を有する官能基を有するＤＮＡを加え、そこにＤ
ＮＡリガーゼを作用させることにより目的ＤＮＡ断片の
末端に官能基を導入できる。(この場合、除去したい方
の鎖の５'末端を脱リン酸化しておいてもよい。即ち目
的とする二本鎖ＤＮＡの一端だけが出た長い二本鎖ＤＮ
Ａを調製し、この状態で脱リン酸化酵素により５’末端
を脱リン酸化し、その後二本鎖ＤＮＡを切断して目的断
片をつくると一方の５’末端は脱リン酸化されたものが
できる)。
【００１４】iv） 二本鎖ＤＮＡの３’末端−ＯＨ基に
トリクロロトリアジン基を導入することでＯＨ基を活性
化する(５’末端−ＯＨ基にはiii)で述べた脱リン酸化
を行い−ＯＨ基を露出させトリクロロトリアジンを反応
させて活性化する。３’末端の−ＯＨ基と５’末端の−
ＯＨ基では反応性が全く５’末端の方が良いため５’末
端−ＯＨ基を特異的に活性化できる)。この場合、一方
の鎖に１もしくはそれ以上のヌクレオチドが存在する必
要はない。
トリクロロトリアジン基を導入することでＯＨ基を活性
化する(５’末端−ＯＨ基にはiii)で述べた脱リン酸化
を行い−ＯＨ基を露出させトリクロロトリアジンを反応
させて活性化する。３’末端の−ＯＨ基と５’末端の−
ＯＨ基では反応性が全く５’末端の方が良いため５’末
端−ＯＨ基を特異的に活性化できる)。この場合、一方
の鎖に１もしくはそれ以上のヌクレオチドが存在する必
要はない。
【００１５】本発明方法により製造された固定化ＤＮＡ
は、一本鎖ＤＮＡ分子が全て末端で支持体に結合したも
のであり、従って固定化によるＤＮＡの塩基の破壊がな
いため液相中でのＤＮＡの挙動とほぼ同じ挙動が期待で
き、非常に精度の高いＤＮＡのハイブリッド形成ができ
る。又具体的には、本発明の方法で固定化したＤＮＡと
従来法(一本鎖ＤＮＡのまま)の固定化したＤＮＡでは、
ハイブリッド量が単位ＤＮＡ当たり１０倍以上違った。
又、固定化したＤＮＡは従来法ではＤＮＡ中の塩基がつ
ぶれるためこの固定化ＤＮＡではＤＮＡ中に変異が生じ
たものと同じ結果となりＤＮＡ中の１塩基の変異を見分
けるハイブリッド形成はできない。しかし本発明の方法
では、ハイブリッドさせるＤＮＡ中の１塩基の変異も認
別が可能であった。これは、固定化したＤＮＡの塩基が
途中で壊れていないことを示している。以下に実施例を
挙げるが本発明はこれに限定されるものではない。
は、一本鎖ＤＮＡ分子が全て末端で支持体に結合したも
のであり、従って固定化によるＤＮＡの塩基の破壊がな
いため液相中でのＤＮＡの挙動とほぼ同じ挙動が期待で
き、非常に精度の高いＤＮＡのハイブリッド形成ができ
る。又具体的には、本発明の方法で固定化したＤＮＡと
従来法(一本鎖ＤＮＡのまま)の固定化したＤＮＡでは、
ハイブリッド量が単位ＤＮＡ当たり１０倍以上違った。
又、固定化したＤＮＡは従来法ではＤＮＡ中の塩基がつ
ぶれるためこの固定化ＤＮＡではＤＮＡ中に変異が生じ
たものと同じ結果となりＤＮＡ中の１塩基の変異を見分
けるハイブリッド形成はできない。しかし本発明の方法
では、ハイブリッドさせるＤＮＡ中の１塩基の変異も認
別が可能であった。これは、固定化したＤＮＡの塩基が
途中で壊れていないことを示している。以下に実施例を
挙げるが本発明はこれに限定されるものではない。
【００１６】実施例１ ＡＢＩ社製ＤＮＡ合成装置にて下記の配列のＤＮＡを合
成した。１μＭスケールで合成し、下記(１)の配列は
１.８mg、(２)の配列は１.３mg精製後回収された。 （１） 5’X GTC TGG GAA AAA CCC CCT TTG AGT 3' （２） 5’ACT CAA AGG GGG TTT TTC CCA GAC 3’ X：アミノリンク２(ＡＢＩ社製) 得られたＤＮＡをそれぞれ業者指示の方法により精製し
た。(１)および(２)のＤＮＡそれぞれ１００μg分をと
って減圧下で乾固する。(１)のＤＮＡ１００μgを１Ｍ
ＮaＣl(１００μl)に溶かし、乾固した(２)のＤＮＡ(１
００μg)と混合した。次いで０.４Ｍ ＮaＨＣＯ3(pＨ
７.５)を１００μl加えた。この溶液を９５℃の水浴上
で２分間あたため、２０分かけて５５℃に冷却した。こ
れに、後に説明する方法で調製したトレシル活性化シリ
カゲル２０mgを加え、室温で２４時間反応させた。反応
終了後、シリカゲルを１Ｍ ＮaＣlで３回洗浄し、最後
に、１Ｍ ＮaＣl １mlに懸濁した。これを９５℃で５分
間加温し、直ちに遠心し(１２０００ rpm)、上清を除去
し、残渣として固定化ＤＮＡを得た。
成した。１μＭスケールで合成し、下記(１)の配列は
１.８mg、(２)の配列は１.３mg精製後回収された。 （１） 5’X GTC TGG GAA AAA CCC CCT TTG AGT 3' （２） 5’ACT CAA AGG GGG TTT TTC CCA GAC 3’ X：アミノリンク２(ＡＢＩ社製) 得られたＤＮＡをそれぞれ業者指示の方法により精製し
た。(１)および(２)のＤＮＡそれぞれ１００μg分をと
って減圧下で乾固する。(１)のＤＮＡ１００μgを１Ｍ
ＮaＣl(１００μl)に溶かし、乾固した(２)のＤＮＡ(１
００μg)と混合した。次いで０.４Ｍ ＮaＨＣＯ3(pＨ
７.５)を１００μl加えた。この溶液を９５℃の水浴上
で２分間あたため、２０分かけて５５℃に冷却した。こ
れに、後に説明する方法で調製したトレシル活性化シリ
カゲル２０mgを加え、室温で２４時間反応させた。反応
終了後、シリカゲルを１Ｍ ＮaＣlで３回洗浄し、最後
に、１Ｍ ＮaＣl １mlに懸濁した。これを９５℃で５分
間加温し、直ちに遠心し(１２０００ rpm)、上清を除去
し、残渣として固定化ＤＮＡを得た。
【００１７】この様にして得た固定化ＤＮＡの固定化量
を分光光度計により、以下の要領で測定した。即ち、固
定化量測定溶媒として飽和ショ糖溶液を用い、シリカゲ
ル溶液の屈折率をあわせた上でスペクトルをとるとゲル
による散乱光の影響を極めて押えた上で正確な測定がで
きる。スペクトルのとり方は、分光光度計としてシマズ
のＵＶ−２００／型を用い、コントロールに５mg／２０
０μlシリカゲル（shim pack diol）をとり、５mg／４
００μlシリカゲル（shim pack diol）によりベースラ
イン補正後、同じく５mg／２００μlのＤＮＡ固定化ゲ
ルをサンプルとして測定したのが第１図であり、２６０
nmにＤＮＡに特異的な吸収があるのがわかる。この固定
化量は２６０nmの吸収１に対して３０μg／ml一本鎖Ｄ
ＮＡが対応するとして計算した。 △Ａ260＝０.４５より１３.５μg／ml(０.４５×３０よ
り) ゲルは５mg／２００μlより１２.５mg／mlである。故に
１３.５÷１２.５×１０００＝１.０８mg／g乾燥ゲルと
なり、よって１gのゲルに１.０８mgの一本鎖ＤＮＡが末
端固定されたことがわかった。
を分光光度計により、以下の要領で測定した。即ち、固
定化量測定溶媒として飽和ショ糖溶液を用い、シリカゲ
ル溶液の屈折率をあわせた上でスペクトルをとるとゲル
による散乱光の影響を極めて押えた上で正確な測定がで
きる。スペクトルのとり方は、分光光度計としてシマズ
のＵＶ−２００／型を用い、コントロールに５mg／２０
０μlシリカゲル（shim pack diol）をとり、５mg／４
００μlシリカゲル（shim pack diol）によりベースラ
イン補正後、同じく５mg／２００μlのＤＮＡ固定化ゲ
ルをサンプルとして測定したのが第１図であり、２６０
nmにＤＮＡに特異的な吸収があるのがわかる。この固定
化量は２６０nmの吸収１に対して３０μg／ml一本鎖Ｄ
ＮＡが対応するとして計算した。 △Ａ260＝０.４５より１３.５μg／ml(０.４５×３０よ
り) ゲルは５mg／２００μlより１２.５mg／mlである。故に
１３.５÷１２.５×１０００＝１.０８mg／g乾燥ゲルと
なり、よって１gのゲルに１.０８mgの一本鎖ＤＮＡが末
端固定されたことがわかった。
【００１８】トレシル活性化シリカゲルの調製 以下の操作は、水分を嫌うので、ドライボックスもしく
は乾燥窒素を満たした無菌パックなどを適宜利用し、な
るべく水分の混入を防ぐことを念頭において行う。 １）アセトン、ピリジンをあらかじめモレキュラーシー
ブで脱水しておく。 ２）１mlの脱水アセトン、１００μlのピリジン、およ
び小さなスターラーチップを１０mlのメスフラスコに入
れておく。 ３）１gのゲルをガラスフィルター(＃５メシュ)上でア
スピレーターで吸収しながら、アセトン、脱水アセトン
で素早く洗浄し、直ちに２)で用意したメスフラスコに
入れる。
は乾燥窒素を満たした無菌パックなどを適宜利用し、な
るべく水分の混入を防ぐことを念頭において行う。 １）アセトン、ピリジンをあらかじめモレキュラーシー
ブで脱水しておく。 ２）１mlの脱水アセトン、１００μlのピリジン、およ
び小さなスターラーチップを１０mlのメスフラスコに入
れておく。 ３）１gのゲルをガラスフィルター(＃５メシュ)上でア
スピレーターで吸収しながら、アセトン、脱水アセトン
で素早く洗浄し、直ちに２)で用意したメスフラスコに
入れる。
【００１９】４）乾燥窒素で外気が混入しないようにし
ながら、スターラーでゲルを激しく撹拌しつつ、１００
〜２００μlのトリフルオロエタンスルフォニルクロラ
イド(Ｆluka製)を１分ほどかけて滴下する。この際、氷
を詰めたビニール袋などでフラスコを０℃付近に保って
おく。 ５）メスフラスコにふたをし、ゲルを破砕させないよう
にスターラーの速度を落し２０分間反応させる。やはり
０℃付近に保つ。 ６）反応後、ガラスフィルター上に移し、アセトン、ア
セトン＋５mＭ ＨＣl(１：１)、５mＭ ＨＣｌで洗浄す
る。 ７）さらにアセトンで洗浄し、フィルター上で十分アセ
トンをとばす。 ８）ナスフラスコに移し、減圧下にアセトンをとばす。
トレシルは高温では不安定なので、５）で用いた氷入り
ビニールなどで低温に保ちつつ乾燥させると、トレシル
化シリカゲルが得られる。
ながら、スターラーでゲルを激しく撹拌しつつ、１００
〜２００μlのトリフルオロエタンスルフォニルクロラ
イド(Ｆluka製)を１分ほどかけて滴下する。この際、氷
を詰めたビニール袋などでフラスコを０℃付近に保って
おく。 ５）メスフラスコにふたをし、ゲルを破砕させないよう
にスターラーの速度を落し２０分間反応させる。やはり
０℃付近に保つ。 ６）反応後、ガラスフィルター上に移し、アセトン、ア
セトン＋５mＭ ＨＣl(１：１)、５mＭ ＨＣｌで洗浄す
る。 ７）さらにアセトンで洗浄し、フィルター上で十分アセ
トンをとばす。 ８）ナスフラスコに移し、減圧下にアセトンをとばす。
トレシルは高温では不安定なので、５）で用いた氷入り
ビニールなどで低温に保ちつつ乾燥させると、トレシル
化シリカゲルが得られる。
【００２０】実施例２ ＡＢＩ社製ＤＮＡ合成装置にて下記の配列のＤＮＡを合
成した。１μＭスケールで合成し、下記(１)の配列は
１.２mg、(２)の配列は１.２mg精製後回収された。 （１） 5’X GTC TGG GAA AAA CCC CCT TTG AGT 3' （２） 5’ACT CAA AGG GGG TTT TTC CCA GAC 3’ X：アミノリンク２(ＡＢＩ社製) 得られたＤＮＡをそれぞれ業者指示の方法により精製し
た。(１)および(２)のＤＮＡそれぞれ５００μg分をと
って減圧下で乾固する。(１)のＤＮＡ５００μgを１Ｍ
ＮaＣl(１００μl)に溶かし、乾固した(２)のＤＮＡ(５
００μg)と混合した。この溶液を９５℃の水浴上で２分
間あたため、６０分かけて３５℃に冷却した。これに、
０.４Ｍ ＮaＨＣＯ3（pＨ７.５）１００μlを加え、さ
らにＴＯＳＯＨ製トレシル５ＰＷゲル２０mgを加え、室
温で２４時間反応させた。反応終了後、ゲルを１Ｍ Ｎa
Ｃlで３回洗浄し、最後に、０.５Ｍ ＮaＣl １mlに懸濁
した。これを９５℃で５分間加温し、直ちに遠心し(１
２０００ rpm)、上清を除去し、残渣として固定化ＤＮＡ
を得た。この除去した上清のＤＮＡより固定化されたＤ
ＮＡ量を算出したところ８０μg／g・dry・gelのＤＮＡ
が固定できた（上清のＡ260＝０.０５３、Ａ260＝１が
３０μg／ml ＤＮＡとして計算した）。
成した。１μＭスケールで合成し、下記(１)の配列は
１.２mg、(２)の配列は１.２mg精製後回収された。 （１） 5’X GTC TGG GAA AAA CCC CCT TTG AGT 3' （２） 5’ACT CAA AGG GGG TTT TTC CCA GAC 3’ X：アミノリンク２(ＡＢＩ社製) 得られたＤＮＡをそれぞれ業者指示の方法により精製し
た。(１)および(２)のＤＮＡそれぞれ５００μg分をと
って減圧下で乾固する。(１)のＤＮＡ５００μgを１Ｍ
ＮaＣl(１００μl)に溶かし、乾固した(２)のＤＮＡ(５
００μg)と混合した。この溶液を９５℃の水浴上で２分
間あたため、６０分かけて３５℃に冷却した。これに、
０.４Ｍ ＮaＨＣＯ3（pＨ７.５）１００μlを加え、さ
らにＴＯＳＯＨ製トレシル５ＰＷゲル２０mgを加え、室
温で２４時間反応させた。反応終了後、ゲルを１Ｍ Ｎa
Ｃlで３回洗浄し、最後に、０.５Ｍ ＮaＣl １mlに懸濁
した。これを９５℃で５分間加温し、直ちに遠心し(１
２０００ rpm)、上清を除去し、残渣として固定化ＤＮＡ
を得た。この除去した上清のＤＮＡより固定化されたＤ
ＮＡ量を算出したところ８０μg／g・dry・gelのＤＮＡ
が固定できた（上清のＡ260＝０.０５３、Ａ260＝１が
３０μg／ml ＤＮＡとして計算した）。
【図１】 固定化一本鎖ＤＮＡのＵＶスペクトルを示す
グラフである。
グラフである。
Claims (2)
- 【請求項１】 一本鎖ＤＮＡと該一本鎖ＤＮＡの相補鎖
とからなる二本鎖ＤＮＡを該一本鎖ＤＮＡの末端で支持
体に結合させ、次いで変性処理により相補鎖を脱離せし
めることからなる、一本鎖ＤＮＡを末端で支持体に固定
化する方法であって、固定化される一本鎖ＤＮＡは相補
鎖に比べその末端に１若しくはそれ以上の余分のヌクレ
オチド分子を含んでいるか、あるいは固定化される一本
鎖ＤＮＡの末端にあるヌクレオチド分子が化学的修飾を
受けているものであり、該余分のヌクレオチドまたは化
学的修飾を受けたヌクレオチドを介して支持体への結合
が行われることを特徴とする方法。 - 【請求項２】 請求項１に記載の方法で得られる、末端
で支持体に固定化された一本鎖ＤＮＡ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3272528A JPH05192196A (ja) | 1990-11-22 | 1991-10-21 | 一本鎖ｄｎａを末端で支持体に固定化する方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-319169 | 1990-11-22 | ||
| JP31916990 | 1990-11-22 | ||
| JP3272528A JPH05192196A (ja) | 1990-11-22 | 1991-10-21 | 一本鎖ｄｎａを末端で支持体に固定化する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05192196A true JPH05192196A (ja) | 1993-08-03 |
Family
ID=26550249
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3272528A Pending JPH05192196A (ja) | 1990-11-22 | 1991-10-21 | 一本鎖ｄｎａを末端で支持体に固定化する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05192196A (ja) |
-
1991
- 1991-10-21 JP JP3272528A patent/JPH05192196A/ja active Pending
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