JPH057490A - Ｄｎａ断片の分取法 - Google Patents
Ｄｎａ断片の分取法Info
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- JPH057490A JPH057490A JP14974891A JP14974891A JPH057490A JP H057490 A JPH057490 A JP H057490A JP 14974891 A JP14974891 A JP 14974891A JP 14974891 A JP14974891 A JP 14974891A JP H057490 A JPH057490 A JP H057490A
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- dna fragment
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 多種類の制限酵素によって切断されたＤＮＡ
断片混合物から、特定の切断末端を持つＤＮＡ断片を特
異的に分取する方法を提供すること。 【構成】 ＤＮＡの制限酵素による切断断片の末端の一
本鎖部分に特異的に結合するリガンドを固定化した支持
体を用いて、ＤＮＡの制限酵素による切断断片を特異的
に分離するＤＮＡ断片の分取法。
断片混合物から、特定の切断末端を持つＤＮＡ断片を特
異的に分取する方法を提供すること。 【構成】 ＤＮＡの制限酵素による切断断片の末端の一
本鎖部分に特異的に結合するリガンドを固定化した支持
体を用いて、ＤＮＡの制限酵素による切断断片を特異的
に分離するＤＮＡ断片の分取法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＤＮＡを制限酵素で切
断して得られるＤＮＡ断片を含む溶液から、特定の切断
末端を有するＤＮＡ断片を分取する方法に関する。
断して得られるＤＮＡ断片を含む溶液から、特定の切断
末端を有するＤＮＡ断片を分取する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸（二本鎖ＤＮＡ）を特定の場所で切
断するためには、制限酵素が用いられる。制限酵素はＤ
ＮＡを切断して５′リン酸と３′水酸基を新たに作る。
この切断は特異的であり、認識配列の内側に起こるが、
制限酵素の種類により切断場所が異なり、生ずる末端の
性質も異なる。制限酵素がＤＮＡの対称中心を切断すれ
ば平滑末端を生じ、対称中心以外で切断すれば５′また
は３′に突出した一本鎖部分の末端（粘着末端または付
着端）ができる。
断するためには、制限酵素が用いられる。制限酵素はＤ
ＮＡを切断して５′リン酸と３′水酸基を新たに作る。
この切断は特異的であり、認識配列の内側に起こるが、
制限酵素の種類により切断場所が異なり、生ずる末端の
性質も異なる。制限酵素がＤＮＡの対称中心を切断すれ
ば平滑末端を生じ、対称中心以外で切断すれば５′また
は３′に突出した一本鎖部分の末端（粘着末端または付
着端）ができる。
【０００３】ＤＮＡ断片を分離、精製することは、バイ
オテクノロジーの分野において基礎的な技術である。従
来、このＤＮＡ断片の分離、精製法としては、主として
電気泳動法が用いられてきた。
オテクノロジーの分野において基礎的な技術である。従
来、このＤＮＡ断片の分離、精製法としては、主として
電気泳動法が用いられてきた。
【０００４】ＤＮＡ分子は電荷を持っているため、電気
的な場に置かれるとプラス極へ移動する。電気泳動法
は、アガロース、ポリアクリロアミド、あるいはこれら
の混合物で作られたゲル中でＤＮＡ断片に電圧をかけて
泳動させると、ＤＮＡ分子が小さければ小さいほど、ゲ
ルを通ってより速く移動するため、ＤＮＡ断片が大きさ
（長さ）によって分離するという原理に基づき、ＤＮＡ
断片をゲル中で分離させる方法である。泳動ゲルから特
定のＤＮＡ断片を回収するには、目的とするバンド部分
を含むゲルを切り出して、ＤＮＡ断片を抽出する（例え
ば、「ラボマニュアル遺伝子工学 増補版」丸善株式会
社、平成２年６月３０日発行、第１９〜２８頁）。
的な場に置かれるとプラス極へ移動する。電気泳動法
は、アガロース、ポリアクリロアミド、あるいはこれら
の混合物で作られたゲル中でＤＮＡ断片に電圧をかけて
泳動させると、ＤＮＡ分子が小さければ小さいほど、ゲ
ルを通ってより速く移動するため、ＤＮＡ断片が大きさ
（長さ）によって分離するという原理に基づき、ＤＮＡ
断片をゲル中で分離させる方法である。泳動ゲルから特
定のＤＮＡ断片を回収するには、目的とするバンド部分
を含むゲルを切り出して、ＤＮＡ断片を抽出する（例え
ば、「ラボマニュアル遺伝子工学 増補版」丸善株式会
社、平成２年６月３０日発行、第１９〜２８頁）。
【０００５】電気泳動法では、ＤＮＡ断片をその大きさ
によって分離するため、ＤＮＡの塩基配列に特異的に分
離することはできない。しかも、切り出した電気泳動ゲ
ルから、目的とするＤＮＡ断片を抽出する作業が煩雑で
時間がかかり、かつ不純物が多いという欠点があった。
によって分離するため、ＤＮＡの塩基配列に特異的に分
離することはできない。しかも、切り出した電気泳動ゲ
ルから、目的とするＤＮＡ断片を抽出する作業が煩雑で
時間がかかり、かつ不純物が多いという欠点があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、多種
類の制限酵素によって切断されたＤＮＡ断片混合物か
ら、特定の切断末端を持つＤＮＡ断片を特異的に分取す
る方法を提供することにある。本発明者らは、鋭意研究
した結果、ある種の制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ 、Ｅｃ
ｏＲＩ等）によって切断されたＤＮＡ断片の末端が、一
本鎖部分を突出するような構造、すなわち粘着末端とな
ることに着目し、この一本鎖部分の塩基配列に相補的な
リガンド、例えば、相補的な塩基配列を持つオリゴヌク
レオチド（一本鎖ＤＮＡ）を固定化した支持体を用い
て、ＤＮＡ−ＤＮＡアフィニティーカラムクロマトグラ
フィーの原理によって、目的とする制限酵素切断末端を
持つＤＮＡ断片を分取できることを見出し、その知見に
基づいて本発明を完成するに至った。
類の制限酵素によって切断されたＤＮＡ断片混合物か
ら、特定の切断末端を持つＤＮＡ断片を特異的に分取す
る方法を提供することにある。本発明者らは、鋭意研究
した結果、ある種の制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ 、Ｅｃ
ｏＲＩ等）によって切断されたＤＮＡ断片の末端が、一
本鎖部分を突出するような構造、すなわち粘着末端とな
ることに着目し、この一本鎖部分の塩基配列に相補的な
リガンド、例えば、相補的な塩基配列を持つオリゴヌク
レオチド（一本鎖ＤＮＡ）を固定化した支持体を用い
て、ＤＮＡ−ＤＮＡアフィニティーカラムクロマトグラ
フィーの原理によって、目的とする制限酵素切断末端を
持つＤＮＡ断片を分取できることを見出し、その知見に
基づいて本発明を完成するに至った。
【０００７】
【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、ＤＮＡの制限酵素による切断断片の末端の一本鎖部
分に特異的に結合するリガンドを固定化した支持体を用
いて、ＤＮＡの制限酵素による切断断片を特異的に分離
することを特徴とするＤＮＡ断片の分取法が提供され
る。
ば、ＤＮＡの制限酵素による切断断片の末端の一本鎖部
分に特異的に結合するリガンドを固定化した支持体を用
いて、ＤＮＡの制限酵素による切断断片を特異的に分離
することを特徴とするＤＮＡ断片の分取法が提供され
る。
【０００８】以下、本発明について詳述する。本発明の
方法によれば、多種類の制限酵素によって切断されたＤ
ＮＡ断片混合物から、特定の切断末端を持つＤＮＡ断片
を特異的に分取することができる。
方法によれば、多種類の制限酵素によって切断されたＤ
ＮＡ断片混合物から、特定の切断末端を持つＤＮＡ断片
を特異的に分取することができる。
【０００９】ある種の制限酵素、例えば、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ 、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、Ｐｖｕ
Ｉ、ＨｉｎｆＩ、Ｓａｕ３Ａ、ＴａｑＩ、ＰｓｔＩ等に
よって切断されたＤＮＡ断片は、それぞれの末端に数塩
基の一本鎖部分を突出するような構造（粘着末端）を形
成する。本発明においては、この一本鎖部分を有するＤ
ＮＡ断片の該一本鎖部分に相補的なリガンドを固定化し
た支持体を用いて、ＤＮＡ−ＤＮＡアフィニティーカラ
ムクロマトグラフィーによって、目的とする制限酵素切
断末端を持つＤＮＡ断片を分取する。
Ｉ 、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、Ｐｖｕ
Ｉ、ＨｉｎｆＩ、Ｓａｕ３Ａ、ＴａｑＩ、ＰｓｔＩ等に
よって切断されたＤＮＡ断片は、それぞれの末端に数塩
基の一本鎖部分を突出するような構造（粘着末端）を形
成する。本発明においては、この一本鎖部分を有するＤ
ＮＡ断片の該一本鎖部分に相補的なリガンドを固定化し
た支持体を用いて、ＤＮＡ−ＤＮＡアフィニティーカラ
ムクロマトグラフィーによって、目的とする制限酵素切
断末端を持つＤＮＡ断片を分取する。
【００１０】リガンドとしては、通常、ＤＮＡ断片の末
端に突出した一本鎖部分と相補的な塩基配列を有するオ
リゴヌクレオチド（数個から十数個のヌクレオチドがリ
ン酸ジエステル結合で重合したもので、以下、一本鎖Ｄ
ＮＡまたは単にＤＮＡともいう。）を用いる。
端に突出した一本鎖部分と相補的な塩基配列を有するオ
リゴヌクレオチド（数個から十数個のヌクレオチドがリ
ン酸ジエステル結合で重合したもので、以下、一本鎖Ｄ
ＮＡまたは単にＤＮＡともいう。）を用いる。
【００１１】分離方法としては、リガンドを固定化した
支持体（担体）をカラムに詰めるアフィニティーカラム
クロマトグラフィーを使用する。迅速な分離を行うため
に、好ましくは高速液体クロマトグラフィーを使用す
る。本発明におけるアフィニティーカラムクロマトグラ
フィーにおいては、例えば、オリゴヌクレオチドを不溶
性の支持体に結合（固定化）させたものをカラムに詰
め、該オリゴヌクレオチドと相補的な一本鎖部分を末端
に持つＤＮＡ断片を含む試料溶液を注入すると、固定化
オリゴヌクレオチドと該特定のＤＮＡ断片が特異的かつ
可逆的に結合し、他のＤＮＡ断片は素通りする。そし
て、特異的に結合した固定化オリゴヌクレオチドと特定
のＤＮＡ断片の結合力を適当な方法で弱めてやれば、目
的とする特定のＤＮＡ断片を分取することができる。
支持体（担体）をカラムに詰めるアフィニティーカラム
クロマトグラフィーを使用する。迅速な分離を行うため
に、好ましくは高速液体クロマトグラフィーを使用す
る。本発明におけるアフィニティーカラムクロマトグラ
フィーにおいては、例えば、オリゴヌクレオチドを不溶
性の支持体に結合（固定化）させたものをカラムに詰
め、該オリゴヌクレオチドと相補的な一本鎖部分を末端
に持つＤＮＡ断片を含む試料溶液を注入すると、固定化
オリゴヌクレオチドと該特定のＤＮＡ断片が特異的かつ
可逆的に結合し、他のＤＮＡ断片は素通りする。そし
て、特異的に結合した固定化オリゴヌクレオチドと特定
のＤＮＡ断片の結合力を適当な方法で弱めてやれば、目
的とする特定のＤＮＡ断片を分取することができる。
【００１２】この場合、用いる制限酵素とアフィニティ
ーカラムの組み合わせを選択することによって、唯一種
類のＤＮＡ断片を分離することも可能である。すなわ
ち、ＤＮＡ断片の一方の末端の一本鎖部分が特異的とな
るアフィニティーカラムと、他方の末端の一本鎖部分が
特異的となるアフィニティーカラムを順次組み合わせて
用いることにより、両端の構造が分かったＤＮＡ断片を
得ることができる。
ーカラムの組み合わせを選択することによって、唯一種
類のＤＮＡ断片を分離することも可能である。すなわ
ち、ＤＮＡ断片の一方の末端の一本鎖部分が特異的とな
るアフィニティーカラムと、他方の末端の一本鎖部分が
特異的となるアフィニティーカラムを順次組み合わせて
用いることにより、両端の構造が分かったＤＮＡ断片を
得ることができる。
【００１３】本発明で使用する支持体としては、高速液
体クロマトグラフィー用のゲル（シリカゲル等）、有機
高分子ビーズ（ポリスチレン系、ポリメタクリル酸メチ
ル系、ポリビニル系、ポリアクリルアミド系など）、ア
ガロース、セルロース等の高分子化合物、または各種メ
ンブラン（ニトロセルロース、ナイロンメンブラン、ポ
リテトラフルオロエチレンシート等）を挙げることがで
きる。これらの支持体は、そのままで、あるいはこれら
の表面にカルボキシル基、アミノ基、水酸基などの官能
基を導入した後に使用する。
体クロマトグラフィー用のゲル（シリカゲル等）、有機
高分子ビーズ（ポリスチレン系、ポリメタクリル酸メチ
ル系、ポリビニル系、ポリアクリルアミド系など）、ア
ガロース、セルロース等の高分子化合物、または各種メ
ンブラン（ニトロセルロース、ナイロンメンブラン、ポ
リテトラフルオロエチレンシート等）を挙げることがで
きる。これらの支持体は、そのままで、あるいはこれら
の表面にカルボキシル基、アミノ基、水酸基などの官能
基を導入した後に使用する。
【００１４】支持体に固定化するリガンドは、前記した
とおり分離、分取の目的物質である特定の制限酵素切断
ＤＮＡ断片の末端と特異的に結合するもの、例えば、末
端の一本鎖部分に相補的なオリゴヌクレオチドを選択し
て使用する。このようなオリゴヌクレオチドは、通常、
市販のＤＮＡ合成装置を用いて化学的に合成することが
できる。
とおり分離、分取の目的物質である特定の制限酵素切断
ＤＮＡ断片の末端と特異的に結合するもの、例えば、末
端の一本鎖部分に相補的なオリゴヌクレオチドを選択し
て使用する。このようなオリゴヌクレオチドは、通常、
市販のＤＮＡ合成装置を用いて化学的に合成することが
できる。
【００１５】リガンドと支持体の結合方法としては、支
持体に導入された各種の官能基（−ＣＯＯＨ基、−ＮＨ
2基、−ＯＨ基等）をそのまま、あるいは縮合剤や活性
化剤で活性化処理（トレシルクロライド、水溶性カルボ
ジイミド等での処理）をしてから官能基（−ＮＨ2、−
ＣＯＯＨ等）を持つオリゴヌクレオチドと反応させる方
法を用いる。
持体に導入された各種の官能基（−ＣＯＯＨ基、−ＮＨ
2基、−ＯＨ基等）をそのまま、あるいは縮合剤や活性
化剤で活性化処理（トレシルクロライド、水溶性カルボ
ジイミド等での処理）をしてから官能基（−ＮＨ2、−
ＣＯＯＨ等）を持つオリゴヌクレオチドと反応させる方
法を用いる。
【００１６】
【実施例】以下、本発明について、実施例を挙げて具体
的に説明するが、本発明は、これらの実施例のみに限定
されるものではない。
的に説明するが、本発明は、これらの実施例のみに限定
されるものではない。
【００１７】［実施例１］ ＜ｐＢＲ３２２からＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ切断断片の分
取＞ＤＮＡとして大腸菌由来のプラスミドｐＢＲ３２２
を用い、目的のＤＮＡ断片がｐＢＲ３２２の一部である
ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ切断断片（以下、「断片Ａ」と略
記）を抽出して分取する例を示す。
取＞ＤＮＡとして大腸菌由来のプラスミドｐＢＲ３２２
を用い、目的のＤＮＡ断片がｐＢＲ３２２の一部である
ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ切断断片（以下、「断片Ａ」と略
記）を抽出して分取する例を示す。
【００１８】ｉ）ｐＢＲ３２２の制限酵素による切断と
制限酵素切断部位の決定 図１に示すように、ｐＢＲ３２２の制限酵素地図（遺伝
生理学的地図）は公知である。図１中、各記号およびそ
の位置は、制限酵素とそれによる切断部位を示す。ただ
し、Ａｐ′はアンピシリン耐性遺伝子、Ｔｃ′はテトラ
サイクリン耐性遺伝子、Ｏｎ′は複製開始点を、それぞ
れ示している。
制限酵素切断部位の決定 図１に示すように、ｐＢＲ３２２の制限酵素地図（遺伝
生理学的地図）は公知である。図１中、各記号およびそ
の位置は、制限酵素とそれによる切断部位を示す。ただ
し、Ａｐ′はアンピシリン耐性遺伝子、Ｔｃ′はテトラ
サイクリン耐性遺伝子、Ｏｎ′は複製開始点を、それぞ
れ示している。
【００１９】図１において、斜線を施した部分が目的と
する切断断片Ａであるが、断片Ａの両端を制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断できること、断片Ａには制
限酵素ＳａｌＩおよびＰｖｕＩＩによる切断部位が存在
しないことが分かる。そこで、以下に述べる操作によ
り、ｐＢＲ３２２を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、Ｓ
ａｌＩ、およびＰｖｕＩＩで処理して、断片Ａを含むＤ
ＮＡ断片の混合物（ＤＮＡ断片サンプル）を得た。使用
した制限酵素は、全て宝酒造社供給のものである。
する切断断片Ａであるが、断片Ａの両端を制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断できること、断片Ａには制
限酵素ＳａｌＩおよびＰｖｕＩＩによる切断部位が存在
しないことが分かる。そこで、以下に述べる操作によ
り、ｐＢＲ３２２を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、Ｓ
ａｌＩ、およびＰｖｕＩＩで処理して、断片Ａを含むＤ
ＮＡ断片の混合物（ＤＮＡ断片サンプル）を得た。使用
した制限酵素は、全て宝酒造社供給のものである。
【００２０】（１）以下の組成の反応液（反応液１）を
３７℃で１時間反応させた後、６０℃で５分間処理し
て、反応を停止させる。 （反応液１） ｐＢＲ３２２ ２μｌ（０．５μｇ／μｌ） ＥｃｏＲＩ ２μｌ（５Ｕ／μｌ） ＰｓｔＩ ２μｌ（５Ｕ／μｌ） ＳａｌＩ ２μｌ（５Ｕ／μｌ） 高温ｂｕｆｆｅｒ ３μｌ（×１０濃度） 水 １９μｌ 合計 ３０μｌ
３７℃で１時間反応させた後、６０℃で５分間処理し
て、反応を停止させる。 （反応液１） ｐＢＲ３２２ ２μｌ（０．５μｇ／μｌ） ＥｃｏＲＩ ２μｌ（５Ｕ／μｌ） ＰｓｔＩ ２μｌ（５Ｕ／μｌ） ＳａｌＩ ２μｌ（５Ｕ／μｌ） 高温ｂｕｆｆｅｒ ３μｌ（×１０濃度） 水 １９μｌ 合計 ３０μｌ
【００２１】（２）フェノール抽出し、エタノール沈殿
に付した後、沈殿物を分離し、乾燥させる。
に付した後、沈殿物を分離し、乾燥させる。
【００２２】（３）得られた乾燥ＤＮＡを水１６μｌに
溶かし、下記の組成の反応液（反応液２）中で３７℃に
おいて１時間反応させた後、６０℃で５分間処理して、
反応を停止する。 （反応液２） ＤＮＡ水溶液 １６μｌ 中塩ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ（×１０濃度） ＰｖｕＩＩ ２μｌ（５Ｕ／μｌ） 合計 ２０μｌ
溶かし、下記の組成の反応液（反応液２）中で３７℃に
おいて１時間反応させた後、６０℃で５分間処理して、
反応を停止する。 （反応液２） ＤＮＡ水溶液 １６μｌ 中塩ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ（×１０濃度） ＰｖｕＩＩ ２μｌ（５Ｕ／μｌ） 合計 ２０μｌ
【００２３】（４）フェノール抽出し、エタノール沈殿
に付した後、沈殿物を分離し、乾燥させる。
に付した後、沈殿物を分離し、乾燥させる。
【００２４】ｉｉ）ＤＮＡ結合アフィニティーカラムの
作製 以下の塩基配列で示される２種のＤＮＡ（オリゴヌクレ
オチド）をＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍ社製、３９１ ＰＣＲ−ＭＡＴＥＥＰ型）を
用いて合成した。
作製 以下の塩基配列で示される２種のＤＮＡ（オリゴヌクレ
オチド）をＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍ社製、３９１ ＰＣＲ−ＭＡＴＥＥＰ型）を
用いて合成した。
【００２５】各ＤＮＡの５′末端には、支持体に連結す
るためのアミノリンクＩＩ（ＤＮＡリンカ−）を組み込
んだ。 ５′ ＸＡＡＴＴ ３′ ５′ ＸＴＧＣＡ ３′ （ただし、ＸはアミノリンクＩＩを示す） ＤＮＡはＥｃｏＲＩ切断末端の一本鎖部分に相補的な
配列であり、ＤＮＡはＰｓｔＩ切断末端の一本鎖部分
に相補的な配列である。およびのＤＮＡをそれぞれ
別個に支持体に固定化した。固定化は以下の操作により
行なった。
るためのアミノリンクＩＩ（ＤＮＡリンカ−）を組み込
んだ。 ５′ ＸＡＡＴＴ ３′ ５′ ＸＴＧＣＡ ３′ （ただし、ＸはアミノリンクＩＩを示す） ＤＮＡはＥｃｏＲＩ切断末端の一本鎖部分に相補的な
配列であり、ＤＮＡはＰｓｔＩ切断末端の一本鎖部分
に相補的な配列である。およびのＤＮＡをそれぞれ
別個に支持体に固定化した。固定化は以下の操作により
行なった。
【００２６】＜ゲルの活性化＞トレシルクロライド（Ｋ
＆Ｋ社製）は、ｐＨ３以上では水により分解されるの
で、以下の操作はドライボックスまたは乾燥窒素を満た
した無菌パック等を用いて、水の混入を避けて行なっ
た。アセトンおよびピリジンは、あらかじめモレキュラ
ーシーブで３日間以上脱水してから使用した。
＆Ｋ社製）は、ｐＨ３以上では水により分解されるの
で、以下の操作はドライボックスまたは乾燥窒素を満た
した無菌パック等を用いて、水の混入を避けて行なっ
た。アセトンおよびピリジンは、あらかじめモレキュラ
ーシーブで３日間以上脱水してから使用した。
【００２７】（１）１０ｍｌの蓋付き丸底フラスコに、
アセトン１．５ｍｌ、ピリジン１００ｍｌ、およびスタ
ーラーチップを入れる。
アセトン１．５ｍｌ、ピリジン１００ｍｌ、およびスタ
ーラーチップを入れる。
【００２８】（２）他方、ゲル（島津製作所製、Ｓｈｉ
ｍｐａｃｋ ｄｉｏｌ ３００）１ｇを、＃５ガラスフ
ィルター上で吸引しながら、アセトン５０ｍｌで素早く
洗浄し、すぐに上記丸底フラスコに入れる。
ｍｐａｃｋ ｄｉｏｌ ３００）１ｇを、＃５ガラスフ
ィルター上で吸引しながら、アセトン５０ｍｌで素早く
洗浄し、すぐに上記丸底フラスコに入れる。
【００２９】（３）次いで、丸底フラスコを氷浴で冷却
し（約０℃）、乾燥窒素を送り込みながら、激しい攪拌
下にトレシルクロライド（ゲル１ｇ当り２００μｌ）を
ほぼ１分間で滴下する。
し（約０℃）、乾燥窒素を送り込みながら、激しい攪拌
下にトレシルクロライド（ゲル１ｇ当り２００μｌ）を
ほぼ１分間で滴下する。
【００３０】（４）滴下終了後、丸底フラスコに蓋を
し、スターラーの速度を落としてゲルの破砕を避けつ
つ、約０℃で２０分間反応を継続する。
し、スターラーの速度を落としてゲルの破砕を避けつ
つ、約０℃で２０分間反応を継続する。
【００３１】（５）反応後、ゲルをガラスフィルター上
に移し、アセトン、アセトン＋５ｍＭ ＨＣｌ（１：
１）、および５ｍＭ ＨＣｌで順次洗浄する。さらに、
乾燥アセトン３０ｍｌで洗浄した後、乾燥窒素を満たし
たビニール袋をフィルターの口に当て、ほぼ１時間吸引
してゲルを完全に乾燥させる。
に移し、アセトン、アセトン＋５ｍＭ ＨＣｌ（１：
１）、および５ｍＭ ＨＣｌで順次洗浄する。さらに、
乾燥アセトン３０ｍｌで洗浄した後、乾燥窒素を満たし
たビニール袋をフィルターの口に当て、ほぼ１時間吸引
してゲルを完全に乾燥させる。
【００３２】＜ゲルへのリガンドの固定化＞リガンドと
して前記で合成したＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）お
よびを用い、それぞれ別個に以下の操作を行なった。
して前記で合成したＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）お
よびを用い、それぞれ別個に以下の操作を行なった。
【００３３】（１）合成したＤＮＡを濃アンモニア水で
切り出し、５５℃で１０時間保持した後、合成の際に官
能基保護のために用いた保護基を脱保護する。
切り出し、５５℃で１０時間保持した後、合成の際に官
能基保護のために用いた保護基を脱保護する。
【００３４】（２）減圧下に濃縮乾固し、１０ｍＭ Ｔ
ＥＡＡ（酢酸トリエチルアミン）バッファー２００μｌ
に溶かす。
ＥＡＡ（酢酸トリエチルアミン）バッファー２００μｌ
に溶かす。
【００３５】（３）エーテル抽出により保護基を除去し
た後、再度濃縮乾固する。これを、カップリングバッフ
ァー（０．２Ｍ ＮａＨＣＯ3、０．５Ｍ ＮａＣｌ、
ｐＨ７．５）１８０μｌに溶かす。
た後、再度濃縮乾固する。これを、カップリングバッフ
ァー（０．２Ｍ ＮａＨＣＯ3、０．５Ｍ ＮａＣｌ、
ｐＨ７．５）１８０μｌに溶かす。
【００３６】（４）前記で調製した活性化ゲル１００ｍ
ｇを、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに取り、上記
プローブＤＮＡと混合する。穏やかに攪拌しながら２５
℃で２４時間保持すると、プローブＤＮＡはゲルに固定
化される。
ｇを、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに取り、上記
プローブＤＮＡと混合する。穏やかに攪拌しながら２５
℃で２４時間保持すると、プローブＤＮＡはゲルに固定
化される。
【００３７】（５）反応終了後、２０００ｒｐｍで５分
間遠心した後、ゲルを上清から分離し、１Ｍ ＮａＣｌ
で３回洗浄し、ＤＮＡ固定化ゲルを得る。
間遠心した後、ゲルを上清から分離し、１Ｍ ＮａＣｌ
で３回洗浄し、ＤＮＡ固定化ゲルを得る。
【００３８】（６）ＤＮＡ固定化ゲルを緩衝液Ａ（０．
５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に懸濁
し、パッカーに入れ、緩衝液Ｂ（１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１０ｍＭ リン酸）で送液し、カラム（２．１ｍｍ
φ×１０ｃｍ）に充填する。
５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に懸濁
し、パッカーに入れ、緩衝液Ｂ（１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１０ｍＭ リン酸）で送液し、カラム（２．１ｍｍ
φ×１０ｃｍ）に充填する。
【００３９】（７）緩衝液Ｃ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ７．５、０．２Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ）を送液してカラムを洗浄し、Ｄ
ＮＡアフィニティーカラムを得る。
Ｃｌ、ｐＨ７．５、０．２Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ）を送液してカラムを洗浄し、Ｄ
ＮＡアフィニティーカラムを得る。
【００４０】ｉｉｉ）ＥｃｏＲＩ切断末端を持つＤＮＡ
断片の分取 以下の手順により、制限酵素ＥｃｏＲＩによる切断末端
を持つＤＮＡ断片を分取した。
断片の分取 以下の手順により、制限酵素ＥｃｏＲＩによる切断末端
を持つＤＮＡ断片を分取した。
【００４１】（１）前記ｉｉ）で調製したＤＮＡ（Ｅ
ｃｏＲＩ切断末端に相補的な配列）が固定化されたアフ
ィニティーカラムを高速液体クロマトグラフィー（ＴＯ
ＳＯＨ社製）につなぐ。
ｃｏＲＩ切断末端に相補的な配列）が固定化されたアフ
ィニティーカラムを高速液体クロマトグラフィー（ＴＯ
ＳＯＨ社製）につなぐ。
【００４２】（２）ｉ）で得られたＤＮＡ断片サンプル
を、１００μｌの緩衝液Ａに溶解し、インジェクション
し、緩衝液Ａで溶出した（流速０．３ｍｌ／分）。
を、１００μｌの緩衝液Ａに溶解し、インジェクション
し、緩衝液Ａで溶出した（流速０．３ｍｌ／分）。
【００４３】（３）ＤＮＡ断片サンプルは２つのピーク
となって溶出されたため、それぞれのピークを分取し、
エタノール沈殿させた後、沈殿物を乾燥させた。
となって溶出されたため、それぞれのピークを分取し、
エタノール沈殿させた後、沈殿物を乾燥させた。
【００４４】（４）１．５％アガロースゲル電気泳動に
よって、後ピークが、ＥｃｏＲＩ切断末端を持つ断片で
あることを確認した。
よって、後ピークが、ＥｃｏＲＩ切断末端を持つ断片で
あることを確認した。
【００４５】ｉｖ）目的ＤＮＡ断片の分取 （１）前記ｉｉ）で調製したＤＮＡ（ＰｓｔＩ切断末
端に相補的な配列）を固定化したアフィニティーカラム
を高速液体クロマトグラフィーにつなぎ、ｉｉｉ）で得
られた後ピーク部分のサンプルを１００μｌの緩衝液Ａ
に溶かし、インジェクションした。ｉｉｉ）と同様に、
溶出すると２つのピークに分かれて溶出したので、これ
らをそれぞれ分取し、エタノール沈殿させた後、沈殿物
を乾燥した。
端に相補的な配列）を固定化したアフィニティーカラム
を高速液体クロマトグラフィーにつなぎ、ｉｉｉ）で得
られた後ピーク部分のサンプルを１００μｌの緩衝液Ａ
に溶かし、インジェクションした。ｉｉｉ）と同様に、
溶出すると２つのピークに分かれて溶出したので、これ
らをそれぞれ分取し、エタノール沈殿させた後、沈殿物
を乾燥した。
【００４６】（２）１．５％アガロースゲル電気泳動に
付すと、前ピーク、後ピークともに一本のＤＮＡバンド
となり、断片の大きさはそれぞれ約６５０ｂｐ、７５０
ｂｐとなった。これにより、後ピーク部分は、目的とす
るＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ切断末端を両端に持つＤＮ
Ａ断片（断片Ａ）であることを確認した。
付すと、前ピーク、後ピークともに一本のＤＮＡバンド
となり、断片の大きさはそれぞれ約６５０ｂｐ、７５０
ｂｐとなった。これにより、後ピーク部分は、目的とす
るＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ切断末端を両端に持つＤＮ
Ａ断片（断片Ａ）であることを確認した。
【００４７】
【発明の効果】本発明によれば、末端の構造が特異的な
ＤＮＡ断片を分取することができる。また、本発明によ
れば、複数の制限酵素とアフィニティーカラムの組み合
わせによって、一種類のＤＮＡ断片を分取することがで
きる。
ＤＮＡ断片を分取することができる。また、本発明によ
れば、複数の制限酵素とアフィニティーカラムの組み合
わせによって、一種類のＤＮＡ断片を分取することがで
きる。
【００４８】したがって、本発明の方法は、分子生物
学、ゲノム解析などの分野で、制限酵素地図の分かって
いるＤＮＡから目的のＤＮＡ断片のみを抽出するのに好
適である。また、未知のＤＮＡ断片混合物をその末端の
構造により分類することも可能である。
学、ゲノム解析などの分野で、制限酵素地図の分かって
いるＤＮＡから目的のＤＮＡ断片のみを抽出するのに好
適である。また、未知のＤＮＡ断片混合物をその末端の
構造により分類することも可能である。
【００４９】さらにまた、本発明の方法によれば、電気
泳動等の煩雑で時間のかかる手段を用いずに、容易にＤ
ＮＡ断片を抽出することができる。
泳動等の煩雑で時間のかかる手段を用いずに、容易にＤ
ＮＡ断片を抽出することができる。
【図１】ｐＢＲ３２２の完全な制限酵素地図を示す説明
図である。
図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 ＤＮＡの制限酵素による切断断片の末端
の一本鎖部分に特異的に結合するリガンドを固定化した
支持体を用いて、ＤＮＡの制限酵素による切断断片を特
異的に分離することを特徴とするＤＮＡ断片の分取法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14974891A JPH057490A (ja) | 1991-05-25 | 1991-05-25 | Ｄｎａ断片の分取法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14974891A JPH057490A (ja) | 1991-05-25 | 1991-05-25 | Ｄｎａ断片の分取法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH057490A true JPH057490A (ja) | 1993-01-19 |
Family
ID=15481907
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14974891A Pending JPH057490A (ja) | 1991-05-25 | 1991-05-25 | Ｄｎａ断片の分取法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH057490A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008301806A (ja) * | 1994-10-13 | 2008-12-18 | Solexa Inc | 分子タグ化システム |
-
1991
- 1991-05-25 JP JP14974891A patent/JPH057490A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008301806A (ja) * | 1994-10-13 | 2008-12-18 | Solexa Inc | 分子タグ化システム |
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