JP3129723B2 - サポート結合オリゴヌクレオチド - Google Patents

サポート結合オリゴヌクレオチド

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JP3129723B2
JP3129723B2 JP01510012A JP51001289A JP3129723B2 JP 3129723 B2 JP3129723 B2 JP 3129723B2 JP 01510012 A JP01510012 A JP 01510012A JP 51001289 A JP51001289 A JP 51001289A JP 3129723 B2 JP3129723 B2 JP 3129723B2
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Description

【発明の詳細な説明】 固体サポート結合オリゴヌクレオチドには幾つかの可
能な用途がある。これらは複合DNA中の突然変異の存在
−例えばヒトにおける疾患遺伝子座の検出に用いること
ができる。これらを用いて、複合混合物から特定核酸を
選択することができ、例えば、全細胞群から特定mRNAを
選択することができる。これらは1989年５月２日出願の
国際出願第PCT/GB89/00460号に述べられている発明に有
用である。
幾つかの論文が核酸を固体マトリックスに付着させる
方法を述べている（１〜６）。これらの方法は二つの問
題を有している：これらは複雑で、しばしば非効率的工
程を必要とし；ヌクレオチドは塩基ならびに末端を介し
て結合する。塩基を介しての結合はハイブリッド形成反
応に結合ポリヌクレオチドを後に用いることを妨げる。
固体サポート付きオリゴヌクレオチドの合成方法は充
分に確立されている（７〜14）。オリゴヌクレオチドと
サポートとの間の結合は塩基中のブロッキング基を除去
するために用いられる最終試薬に対して不安定であるの
で、プロセスのこの工程も固体サポートからオリゴヌク
レオチド除去する。オリゴヌクレオチドは安定な結合を
用いた場合にサポートに結合して留まると考えられる。
スプロート（Sproat）とブラウン（Brown）（1985）
は、ウレタン結合が通常のスクシネート結合よりも安定
であるが、ウレタン結合が複雑な合成を必要とし、最終
の脱保護工程に対して完全には安定でないことを示し
た。
クレア（Crea）とホーン（Horn）（1980）は５′−ヒ
ドロキシル基を介してセルロースに結合したリボヌクレ
オチドを用いて、オリゴヌクレオチド合成を開始してい
る。生成した鎖の第１残基と第２残基との間の結合は最
終脱保護工程に対して不安定である。
アーノルド（Arnold）とベルグ（Berg）（1985）はオ
リゴヌクレオチド合成のプライマーが共有結合したポリ
マーサポートを述べている、この場合にプライマーは選
択的酸化によって開裂し、オリゴヌクレオチドの他の結
合は酸化されない。
合成が容易であり、標準的な解重合工程に対して完全
に安定である、新しい結合を提供することが、本発明の
目的である。
１態様では、本発明はオリゴヌクレオチド鎖から保護
基を除去するために用いる条件に安定である共有ホスフ
ォジエステル結合によってヒドロキシル基含有サポート
にヌクレオシド試薬を結合させることから成るオリゴヌ
クレオチド合成に適した誘導サポート（derivatized s
upport）の製造方法であって、ヒドロキシル基が脂肪族
部分が−（CnH2n）−（式中、ｎは少なくとも３であ
る）またはアルコキシまたはポリ（アルコキシ）である
脂肪族ヒドロキシル基であることを特徴とする方法を提
供する。
他の態様では、本発明次の工程： （ａ）サポートにヌクレオシドを結合させる工程； （ｂ）サポート付きヌクレオシド上で保護基含有オリゴ
ヌクレオチドを合成する工程； （ｃ）オリゴヌクレオチド鎖から保護基を除去する工程 から成り、サポートがヒドロキシル基を有し、それによ
って工程（ａ）ではヌクレオシドがサポートに工程
（ｃ）で用いる条件に安定な共有ホスフォジエステル結
合によって結合することから成るサポートに結合したオ
リゴヌクレオチドの製造方法であって、ヒドロキシル基
が脂肪族が−（CnH2n）−（式中、ｎは少なくとも３で
ある）またはアルコキシまたはポリ（アルコキシ）であ
る脂肪族ヒドロキシル基であることを特徴とする方法を
提供する。
さらに他の態様では、本発明は構造−Ｏ−PY−Ｏ−
（式中、Ｙは保護されたまたは保護されない酸素原子で
ある）で表される共有ホスフォジエステル結合によって
サポートに結合したヌクレオシドから成る、オリゴヌク
レオチド合成に適した誘導サポートであって、サポート
への結合が−（CnH2n）−（式中、ｎは少なくとも３で
ある）またはアルコキシまたはポリ（アルコキシ）であ
る脂肪族部分を介して行われることを特徴とする誘導サ
ポートを提供する。
さらに他の態様では、本発明はオリゴヌクレオチドが
末端ホスフェート基を介して共有ホスフォジエステル結
合によってサポートに結合したサポート結合オリゴヌク
レオチドであって、結合が構造式−Ｏ−PO2−Ｏ−Ｒ−
［Ｒは−（CnH2n）−（式中、ｎは少なくとも３であ
る）またはアルコキシまたはポリ（アルコキシ）である
脂肪族部分である］を有することを特徴とするサポート
結合オリゴヌクレオチドを提供する。
本発明にとってサポートの性質は決定的ではない。サ
ポートは塊状または粒状であり得、例えば誘導シリカゲ
ルまたはケイソウ土−ポリメチル−アクリルアミド、ま
たは制御孔質ガラス（controlled−pore glass）、ま
たは板ガラス表面であり得る。本質的なことは、サポー
トが脂肪族ヒドロキシル基を有することと、これらのヒ
ドロキシル基がヌクレオシド試薬との反応に利用され得
る形状であることである。これらのヒドロキシル基は、
例えば制御孔質ガラスまたは他のサポートを長鎖アルキ
ルアルコールによって誘導することによって形成される
ように、ヒドロキシアルキル基の一部を形成することが
できる。この代わりに、サポートを長鎖アルキルアミン
によって誘導し、アミン基を使用現場でヒドロキシル基
に転化することができる。または、ヒドロキシル基が、
固体サポートを成すかまたは固体サポート上に誘導され
るポリマー構造体の一部であることも可能である。
ヌクレオシド試薬の性質は本発明にとって決定的では
ない。オリゴヌクレオチド合成に通常用いられる試薬を
この場合にも用いることができる。試薬がホスフォール
アミジトであることが好ましい（７と８）。試薬と形成
される生成物とを次の反応図式に示す。
この図式では、Ｉはヌクレオシド３′−ホスフィット
試薬を表し、IIは誘導サポートを表し、IIIは両者の間
の反応によって最初に形成された共有結合を表し、IVは
最終生成物を表す。
Ｂは関係するヌクレオシドに適当な塩基を表す。
Ｘは例えばジメトキシトリチル基のようなブロッキン
グ基であり、その性質は本発明にとって決定的ではな
い、または（特にIVでは）オリゴヌクレオチド鎖を表
す。
Ｙは保護酸素原子であり、一般に、例えばメトキシま
たはβ−シアノエトキシのようなアルコキシ基である。
Ｚはジ−（C1〜C4アルキル）アミンまたはClまたはテ
トラゾリルである。
Ｒは脂肪族であり、アルキル基である。
Ｓは固体サポートを表す。
この代わりに、ヌクレオシド３′−試薬はホスフォネ
ートまたは水素ホスフォネート（hydrogen phosphonat
e）である（12）。試薬と形成された生成物を次の反応
図式に示す。
この図式では、Ｖはヌクレオシドホスフォネートまた
は水素ホスフォネートを表し、IIは誘導体化サポートを
表し、VIIは両者の間に最初に形成された共有結合を表
し、IVは最終生成物を表す。
Ｂ、Ｘ、ＲおよびＳは上記で定義した通りである。
Ｑは本発明の付着工程および合成工程に関係しない水
素又は有機基である。
この代わりに、ヌクレオシド３′−試薬は、Ａがアル
キルであり、Ｂ、ＸおよびＺが上記で定義した通りであ
る構造式VIIを有するホスフォーンアミジト（phosphona
midite）である。好ましい例では、Ａはメチルであり、
Ｚはジイソプロピルアミンである。
自動的なオリゴヌクレオチド合成装置は商業的に入手
可能である。先行技術では、提案オリゴヌクレオチド鎖
の第１ヌクレオチドによって予誘導体化された固体サポ
ートを合成装置に入れることが必要である。本発明は脂
肪族ヒドロキシル基（例えばヒドロキシルアルキル基）
を有する固体サポートを合成装置に入れることができ
る。次に、ヌクレオシド３′−試薬を合成装置内で提案
オリゴヌクレオチド鎖の第１ヌクレオチドとしてサポー
トに付着させる。
上記反応図式では、III〜IVの転化またはVI〜IVの転
化は酸化工程を含む。これは標準条件下で例えばヨウ素
または硫黄を用いて、オリゴヌクレオチド合成の前また
はより通常にはオリゴヌクレオチド合成の後に実施する
ことができる。
ヌクレオシド３′−試薬は固体状態オリゴヌクレオチ
ド合成のためにヌクレオシド５′−試薬よりも開発され
ている。それにも拘わらず、ヌクレオシド５′−試薬は
脂肪族ヒドロキシル（例えばヒドロキシアルキル）基を
有する共有５′−ホスフォジエステル結合を形成し、固
体状態オリゴヌクレオチド合成の基礎として、正確にそ
れらの３′−対応物と同様に、役立つと考えられる。本
発明はヌクレオシド３′−試薬の代替物としてヌクレオ
シド５′−試薬の使用を考える。
この方法の次の工程はサポート付きヌクレオシド上で
のオリゴヌクレオチド鎖の合成を含む。これの実施方法
は周知であり、実際に自動ミクロプロセッサー制御装置
を利用して、この仕事を実施することができる。これら
の方法は好ましくない副反応を避けるために保護基の供
給を必ず含み、オリゴヌクレオチド合成の最終工程は保
護基の除去を含む。オリゴヌクレオチドの可溶化を予め
生ずるのはこの工程である。この工程は典型的に、例え
ばチオフェノキシドを用いたホスフォジエステル基から
のメチル基の除去、例えば高温でのアンモニアを用いた
ヌクレオチド塩基のＮ原子からの保護基の除去、例えば
ジクロロ酢酸によるオリゴヌクレオチド鎖に加えた最後
のヌクレオチドの５′−位置からの保護基の除去を含
む。最初のヌクレオシドとサポートとの間の上記共有結
合は上記その他の通常の脱保護工程に対して安定であ
る。
次の例は本発明を説明する。
例１ バロチニ（Ballotini）ガラスビーズ［20g,90〜130μ
ｍ直径、ジェンコンス（Jencons）］をキシレン（40m
l）、グリシドキシプロピルトリメトキシシランおよび
痕跡量のジイソプロピルエチルアミンの混合物中に90℃
において一晩撹拌しながら懸濁させ、次にメタノール、
エーテルによって完全に洗浄し、風乾した。これらの誘
導ビーズ（6g）を窒素雰囲気下、80℃において触媒量の
濃硫酸を含むヘキサエチレングリコール中で撹拌しなが
ら、一晩加熱して、アルキルヒドロキシル誘導体化ビー
ズを得た。メタノールとエーテルで洗浄した後に、ビー
ズを真空下で乾燥し、アルゴン下、−20℃で貯蔵した。
少量のヒドロキシアルキル誘導ビーズを、バクテリオ
ファージ ラムダの左結合性端部の配列を合成するよう
にプログラムした自動オリゴヌクレオチド合成装置［ア
プライド バイオシステム（Applied Biosystem）］の
反応器に入れた。第１ヌクレオチドは、Ｙがβ−シアノ
エトキシであり、Ｚがジイソプロピルアミンである３′
−ホスフォールアミン（１）であった。これは誘導ビー
ズに共有結合した。
除去されたトリチル基量をスペクトロフォトメター
（spectrophotometer）中で測定することによって、合
成の各工程をモニターすることができる。この試験によ
って、段階的収率は96〜99％であった。このように、収
量と純度の両方は高く、我々の計算によると、ビーズ14
0mgはオリゴヌクレオチド4nmolより多くを保持する。
生成物は熱アンモニアによる標準処理によって脱保護
し、蒸留水によって完全に洗浄した。次にこれを32Pに
よって５′端部を標識した相補的オリゴヌクレオチドco
sLとのハイブリッド形成に用いた。
バクテリオファージλ（cosL）の左端部による誘導ビ
ーズ1mgに、放射能標識した（20μｌの100mM NaCl,1mM
EDTA中の13,000cpm32P）相補的オリゴヌクレオチドを
加えた。混合物を30℃において２時間インキュベート
し、放射性溶液を取り出し、ビーズを氷冷却バッファー
によって完全に洗浄した。ビーズに付着して残留したオ
リゴヌクレオチド（約3,000cpm,23％）蒸留水による溶
出によって定量的に除去することができる。
非相補的オリゴヌクレオチドによる同じ条件下での対
照「ハイブリッド形成」はビーズに対して0.02％の非特
異的結合を示した。
これらの実験は合成が直接的であること、およびビー
ズがハイブリッド形成に上首尾に用いられることを示
す。
ガラスビーズはカラムに充填して、多くの望ましい性
質を有するアフィニティマトリックスを形成するために
理想的である。
下記第１表は例１に述べた一般的方法によって誘導さ
れたビーズの物理的パラメーターを要約する。
例２ ２枚のガラスシートをそれらの間に狭い間隙を保持し
て一緒にクランプした。例１と同じ試薬を狭い間隙に注
入して、同じ条件下で誘導を実施した。
固体サポートとして誘導ガラスプレートを用いて標準
条件下でオリゴヌクレオチド合成を手動で実施した。第
１ヌクレオチドはトリエチルアンモニウム塩として用い
た３′−水素ホスフェートであった。オリゴヌクレオチ
ド合成の第１工程とその後の工程の両方の収率と純度は
高かった。
次の例は標識DNAフラグメントとオリゴヌクレオチド
との誘導ビーズへのハイブリッド形成の幾つかの方法を
示す。
例３ スティックに付着したガラスビーズへのハイブリッド形
成 プラスッチックスティック2cm長さを溶融ポリプロピ
レン中に浸漬してから、誘導体化ガラスビーズのパイル
に接触させて、冷却した。約100〜200ビーズがスティッ
クに接着した。多くの実験が示すように、このビーズ保
持方法はハイブリッド形成を非常に促進する。配列３′
AGGTCGCCGCCC5′によって誘導体化したガラスビーズ約1
00個が付着したスティックを0.1M NaClと、５′端部に
おいて30,000cpmの活性までに標識した相補的オリゴヌ
クレオチド80fmolとを含む溶液30μｌ中に浸漬した。
30℃における30分後に、スティックを管から取り出
し、すすぎ洗いし、スティックを50℃の0.1M NaCl中に
浸漬することによって結合物質を溶離した。次に、ハイ
ブリッド化したオリゴヌクレオチド量を測定した。供給
オリゴヌクレオチドの典型的に４％がこのやり方でピッ
クアップされることができた;0.1％は非特異的に結合
し、除去されなかった。従って、単一ビーズの結合容量
は約0.03fmolオリゴヌクレオチドである。
温度を低下させ、ハイブリッド形成の長さを高めるこ
とによって、初期オリゴヌクレオチドのより大きな割合
をピックアップすることができた。このようにして、同
様な実験では、30℃での55分後に5.3％がハイブリッド
化され、0.05％の非特異的に結合し、30℃での16時間後
に13％がハイブリッド化され、0.2％は非特異的に結合
した。
対照として、非相補的オリゴヌクレオチド５′GGGCGG
CGACCT3′は14時間後に0.2％の結合を示したにすぎなか
った。
要約すると、プラスチックスティックに付着した誘導
ガラスビーズによる実験は非常に容易であり、ビーズに
対するハイブリッド形成の高度な特異性を示すことが実
証された。
例４ バッチ式ハイブリッド形成 0.5ml遠心管内で典型的に1mgのビーズによってハイブ
リッド化を実施することによって、ビーズにハイブリッ
ド化する放射性物質量をさらに高め、非特異的結合を減
ずることができた。ハイブリッド形成後に、管を回転さ
せ、上澄みを除去し、ビーズを洗浄した。Tmより高温で
の洗浄はハイブリッドの完全な溶融を生ずるので、結合
物質をセレンコフ（Cerenkov）計測によって測定するこ
とができた。このようにして、我々はハイブリッド形成
速度と溶離速度の塩濃度と温度への依存性を次の用に測
定することができた： ５管の各々に、ほぼ同数のビーズと50μｌの0.1M Na
Cl中の相補的オリゴヌクレオチド（30,000cpm）を加え
た。ハイブリッド形成を30℃において一晩実施し、ハイ
ブリッド量を最大にした。溶液を除去し、ビーズを氷冷
0.1M NaClで２回洗浄した。各管に対して異なる温度に
おいて徐々に時間を長くして溶離を実施した。各期間後
に、上澄みを除去し、ビーズを氷冷NaCl溶液（100μ
ｌ、0.1M）で２回洗浄し、予熱したNaCl（100μｌ、0.1
M）で溶離した。
第２表は結合オリゴヌクレオチドの溶離％を経時的に
詳述する。溶離速度は温度に明確に依存する。例えば、
65℃では30℃における３倍量が５分間内に溶離した。Tm
より充分に低い30℃においても、無視できない速度であ
ることは意外ではない。
他の実験では、供給オリゴヌクレオチドの濃度を50倍
に変化させた。1.5ml遠心管内での0.1M NaCl、1mM ED
TA中の30℃、２時間のハイブリッド化の後に、上澄みを
除去し、０℃、0.1M NaClにより３回洗浄し、ビーズに
結合した放射能量をセレンコフ計測によって測定した。
濃度とハイブリッド量（すなわち、ハイブリッド形成速
度、第３表）との間には直線的関係があり、このことは
ハイブリッド形成が疑似１次反応（pseudo first ord
er reaction）であることを示す。
オリゴヌクレオチドの最高濃度は20μｌ中の160fmol
（13,000cmpに相当）であった。0.03％のみは非特異的
に結合し、溶離しなかった。
さらに、0.02％のみの非相補的オリゴヌクレオチドが
同様な実験においてビーズに結合し（65,000cpm中の12c
pm）、このことはこのDNAフラグメント単離方法が非常
に特異的であり、明確であることを示唆している。 第２表 溶離速度に対する温度の効果 溶離温度 ５′ 20′ 50′ 110′ 330′ 残留
％ 温度 溶離％ 30℃ 23 38 54 71 85 0
36℃ 34 61 78 90 96 3
44℃ 42 54 67 87 97 2
65℃ 74 89 96 98 98 1.4
第３表 ハイブリッド形成速度に対するオリゴヌクレオチド濃度の効果 相対濃度 50 20 10 2 1 ハイブリッド化％ 23 14 5.5 0.8 0.6 相対速度 38 23 9 1.5 1 例５ 長いDNAフラグメントの単離 長いDNAフラグメントの単離を次の実験で実施した： 総λDNA（制限酵素バッファー135μｌ中に５μｇ）を制
限エンドヌクレアーゼHinf １の15単位によって消化さ
せ、生成した143制限フラグメントをウシ腸ホスファタ
ーゼ（１単位）によって脱ホスフォリル化した。37℃で
の１時間後に、EGTA4μｌを加え、混合物を65℃でさら
に45分間インキュベートし、フェノール抽出し、エタノ
ール沈降させた。
混合物をキナーゼ標識バッファー（10xPNKバッファー
８μl,0.1MDDT1μｌ、PNK酵素４μｌ、蒸留水30μｌ、1
5μlCi−32P.ATP）50μｌ中に溶解し、37℃において１
時間インキュベートし、100μｌまで補充し、セファデ
ックス（Sephadex）G25カラムを降下させ、非結合ヌク
レオチドを除去した。
バロチニガラスビーズ（100μｍ、ジェンコンス）の
アリコートをバクテリオファージλの右結合性端部の配
列、すなわち３′−CCCGCCGCTGGA5′によって誘導し、
アンモニア中で脱保護し、洗浄し、少量をＵ形毛細管の
底部に入れた。この底部を制御可能な温度ブロック中で
40℃に保持し、毛細管の上部左アームと右アームにプラ
スチック注射器のジャケットをかぶせ、それに熱水を供
給することによって、これらのアームを67℃に維持し
た。ハイブリッド形成溶液を加えた（0.1M NaCl 75μ
ｌ、５′端部 10pmol、ビーズ上のオリゴヌクレオチド
に相補的な左λ結合性端部 33fmolを含む、総放射能約
700,000cpm）。
ポンプを毛細管のアームの一つに取り付け、それぞれ
40℃と67℃とに維持した毛細管の部分の間にハイブリッ
ド形成溶液を前後に循環させた。ビーズに対する左端部
のハイブリッド化は40℃で生じ、溶液中に再アニールし
た二つの粘着性λ端部が67℃において変性した。
４時間後に、ハイブリッド形成溶液を除去し、ビーズ
を徹底的に洗浄してから、熱TE中に溶離させた。溶液の
アリコートをポリアクリルアミドゲル上に入れた。オー
トラジオグラフィーは洗液（wash）中に正確なサイズの
１帯のみと溶離レーン（elution lane）とを明らかに
した。左端部の全体で1000cpmが理論量の５％に相当す
るビーズによって結合された。
要約すると、この実験は長いDNAフラグメントの複合
混合物からの高度に特異的な単離を実証する。
例６ カラムクロマトグラフィー オリゴヌクレオチドを単離し、新規なサポートのハイ
ブリッド形成挙動を調べるためのもう一つの容易で便利
な方法は、カラムクロマトグラフィーによる方法であ
る。
ガラス毛細管（直径1.0mm）の１端を引き伸ばして、
非常に狭い先細の開口を形成した。次にこの開口を他端
からの粉砕ガラス粒子の充填とそれらをガラスに粘着さ
せるためのブンゼンバーナーの火炎中での焼結とによっ
て塞いだ。トリクロロエタン中のジクロロジメチル−シ
ランの溶液に通し、エタノールで洗浄することによっ
て、毛細管の内側をシラン化した（silanised）。ガラ
スビーズ約40mgをガラスフリット上に置き、カラムの頂
部を注入ポンプによって駆動可能な注射器に結合サせ
た。このようにして、放射性ハイブリッド形成溶液と洗
浄溶液とを異なる速度で、典型的には３〜10μl/分の範
囲内の速度でカラムに供給することができた。
典型的な実験では、TE中0.1M NaCl、0.1％SDSの溶液
（pH7.5）1ml中の標識オリゴヌクレオチド0.2pmol（34,
000cpm）をカラムに３μl/分の速度で供給した。ジャケ
ット付きカラムを35℃に維持した。90μｌ分画をミクロ
遠心管に回収して、放射能量をセレンコフ計測によって
測定した。0.1M NaCl洗浄溶液を同様にして供給して、
回収した。ジャケット内の温度を高めることによってオ
リゴヌクレオチドを回収することができた。
このようにして、オリゴヌクレオチドの70％がガラス
ビーズに結合し、高温において溶離され、0.1％のみの
物質がサポートに残留することが判明した。
非相補的オリゴヌクレオチド（位置７において不適
合）を用いた対照実験は、35℃での洗浄後に、供給した
80,000cpm中の400cpmが残留することを示した。40℃で
は、140cpm＝0.2％のみが残留した。
サポート上の接近可能なオリゴヌクレオチドの％を測
定した。0.13pmolキナーゼ標識オリゴヌクレオチドと5p
mol非標識オリゴヌクレオチドをビーズ40mgに供給し
た。全体で約3nmolのオリゴヌクレオチドを含む、サポ
ートにハイブリッド化した物質の10％（約500fmol）が
合成中の脱トリイル化（detriylation）から測定され
た。
この結果から、サポート上のオリゴヌクレオチドの1/
6000が使用条件（35℃、低塩）下でハイブリッド化し、
不適合オリゴヌクレオチドの無視できる結合が生ずるこ
とが算出される。溶融はこの場合にも非常に急激であ
り、オリゴヌクレオチドの大部分は48℃における二つの
90μｌ分画中に溶離した。
これらの実験は誘導ビーズが核酸のクロマトグラフィ
ー分離に有用であることを示唆する。
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ルグ アール ピー（Berg Ｒ Ｐ）、モレキュラー
バイオシステム社（Molecular Biosystems Inc.）、P
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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マスコス，ウーヴェ イギリス国オーエックス１・２ジェイエ ッチ，オックスフォード，ウェリント ン・スクエア 25 (56)参考文献 特開 昭59−163564（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−27900（ＪＰ，Ａ) 特表 昭60−502155（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07H 21/04 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】構造式II: の誘導化サポートに共有結合したヌクレオシドを含む、
    オリゴヌクレオチド合成に適したサポートであって、 構造式IIIまたは構造式VI: を有する、オリゴヌクレオチド合成に適したサポート
    （式中、Ｘはブロッキング基であり、Ｂはヌクレオシド
    に適当な塩基であり、Ｙは保護された酸素原子であり、
    Ｒは脂肪族であり、そして、は固体サポートを表
    す）。
  2. 【請求項２】サポートに共有結合しており、そして、 構造式IV: （式中、Ｌはオリゴヌクレオチド鎖であり、Ｂはヌクレ
    オシドに適当な塩基であり、Ｒは脂肪族であり、そし
    て、は固体サポートを表す）を有する、オリゴヌクレ
    オチド。
  3. 【請求項３】請求項２記載のサポートに結合したオリゴ
    ヌクレオチドを製造するための、以下の工程： ａ）構造式I: （式中、Ｘはブロッキング基であり、Ｂはヌクレオシド
    に適当な塩基であり、Ｙは保護された酸素原子であり、
    そして、Ｚはジ−（C1〜C4アルキル）アミンまたはC1ま
    たはテトラゾリルである）を有するヌクレオシド試薬
    を、共有結合により、脂肪族ヒドロキシル基を有するサ
    ポートに結合させ、 ｂ）サポートに結合させたヌクレオシド上で保護基含有
    オリゴヌクレオチド鎖を合成し、そして ｃ）オリゴヌクレオチドから保護基を除去すること からなる方法。
  4. 【請求項４】請求項２記載のサポートに結合したオリゴ
    ヌクレオチドを製造するための、以下の工程： ａ）構造式V: （式中、Ｘはブロッキング基であり、そして、Ｂはヌク
    レオシドに適当な塩基である）を有するヌクレオシド試
    薬を、共有結合により、脂肪族ヒドロキシル基を有する
    サポートに結合させ、 ｂ）サポートに結合させたヌクレオシド上で保護基含有
    オリゴヌクレオチド鎖を合成し、そして ｃ）オリゴヌクレオチドから保護基を除去すること からなる方法。
  5. 【請求項５】構造式II a: の誘導化サポートに共有結合したヌクレオシドを含む、
    オリゴヌクレオチド合成に適したサポートであって、 構造式III aまたは構造式VI a: を有する、オリゴヌクレオチド合成に適したサポート
    （式中、Ｘはブロッキング基であり、Ｂはヌクレオシド
    に適当な塩基であり、Ｙは保護された酸素原子であり、
    Ｒは脂肪族であり、そして、は固体サポートを表
    す）。
  6. 【請求項６】サポートに共有結合しており、そして、 構造式IV a: （式中、Ｌはオリゴヌクレオチド鎖であり、Ｂはヌクレ
    オシドに適当な塩基であり、Ｒは脂肪族であり、そし
    て、は固体サポートを表す）を有する、オリゴヌクレ
    オチド。
  7. 【請求項７】請求項６記載のサポートに結合したオリゴ
    ヌクレオチドを製造するための、以下の工程： ａ）構造式I a: （式中、Ｘはブロッキング基であり、Ｂはヌクレオシド
    に適当な塩基であり、Ｙは保護された酸素原子であり、
    そして、Ｚはジ−（C1〜C4アルキル）アミンまたはC1ま
    たはテトラゾリルである）を有するヌクレオシド試薬
    を、共有結合により、脂肪族ヒドロキシル基を有するサ
    ポートに結合させ、 ｂ）サポートに結合させたヌクレオシド上で保護基含有
    オリゴヌクレオチド鎖を合成し、そして ｃ）オリゴヌクレオチドから保護基を除去すること からなる方法。
  8. 【請求項８】請求項６記載のサポートに結合したオリゴ
    ヌクレオチドを製造するための、以下の工程： ａ）構造式Va: （式中、Ｘはブロッキング基であり、そして、Ｂはヌク
    レオシドに適当な塩基である）を有するヌクレオシド試
    薬を、共有結合により、脂肪族ヒドロキシル基を有する
    サポートに結合させ、 ｂ）サポートに結合させたヌクレオシド上で保護基含有
    オリゴヌクレオチド鎖を合成し、そして ｃ）オリゴヌクレオチドから保護基を除去すること からなる方法。
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