SE466208B - Enkelstraengad aminoderivat av oligonukleotider och foerfarande foer framstaellning daerav - Google Patents
Enkelstraengad aminoderivat av oligonukleotider och foerfarande foer framstaellning daeravInfo
- Publication number
- SE466208B SE466208B SE8406484A SE8406484A SE466208B SE 466208 B SE466208 B SE 466208B SE 8406484 A SE8406484 A SE 8406484A SE 8406484 A SE8406484 A SE 8406484A SE 466208 B SE466208 B SE 466208B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- oligonucleotide
- deoxy
- amino group
- group
- phosphoramidite
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
466 208 2
Avsevärda ansträngningar har hittills gjorts för att utveckla
effektiva kemiska metoder för syntes av sådana oligonukleo-
tider. En kort sammanfattning av dessa metoder sâsom de har ut-
vecklats hittills finns i Crockett, G. C., Aldrichimica Acta
l6(3), 47-55 (1983). Den bästa metodologi som för närvarande
finns tillgänglig använder fosforamiditderivat av nukleosiderna
i kombination med ett syntetiskt fastfasförfarande, Matteucci
et al, J. Am. Chem. Soc., 103, 3185 (l98l); och Beaucage et al,
M. H. Tet. Lett., 22(20), 1858-1862 (1981). Oligonukleotiderna
med längder upp till 30 baser kan tillverkas rutinmässigt på
detta sätt och molekyler med så mycket som 50 baser har till-
verkats. Maskiner som använder denna teknologi finns nu kom-
mersiellt tillgängliga.
Det finns andra rapporter i litteraturen om derivatisering av
DNA. Ett modifierat nukleosidtrifosfat har utvecklats vari en
biotingrupp konjugerfiïstill en alifatisk aminogrupp vid
uracilens 5-position, Langer et al, Proc. Nat. Acad. Sci.,
ïSA¿¥78¿;&633-6631 (E9&l).fDeütæfinukledtïddéniwátrtnkdfiäfiflefiæwßw
effektivt i dubbelsträngad DNA. Inne i DNA kan det bindas
genom antibiotin-antikropp som därefter kan användas för
detektion genom fluorscens eller enzymatiska metoder. Det DNA
som har haft biotinkonjugerade nukleosider inkorporerade en-
ligt metoden av Langer et al, fragmenteras till mindra enkel-
eller dubbelsträngade bitar vilka är heterogena med avseende
på nukleosidsubenhetsekvensen och har variabel molekylvikt.
Draper och Gold, Biochemistry, 19, 1774-1781 (1980) rapporte-
rade introduktionen av alifatiska aminogrupper genom en bi-
sulfitkatalyserad transamineringsreaktion och deras efterföl-
jande reaktion med ett fluorescensmärke. I Draper och Gold
fästes aminogruppen direkt till en pyrimidinbas. Den så be-
lägna aminogruppen inhiberar vätebindning och av detta skäl
är dessa material inte användbara vid hybridisering och lik-
nande. Chu et al, Nucleic Acid Res. l1(l8), 6513-6529 (1983)
har rapporterat en metod att fästa en amin till den terminala
5'-fosfaten av oligonukleotider eller nukleinsyror.
3 466 208
Det finns många skäl att önska en metod för att kovalent fästa
andra kemiska arter till syntetiska oligonukleotider. Fluor-
escerande färgämnen fästa till oligonukleotiderna tillåter en
att eliminera radioisotoper från forsknings-, diagnos- och
kliniska förfaranden vari de användes och förbättra lagrings-
tiden och tillgängligheten. Såsom beskrivits i vår ansökan av-
seende en DNA-sekvenatormaskin (DNA sequencing machine)
tillåter syntesen av fluorescens-
märkta oligonukleotider automatisering av DNA-sekvenerings-
förfaranaet. Utvecklingen av ändamålsenliga tekniker ocn
instrumentering för detektion och användning av fluorescens-
märkta oligonukleotider möjliggör automatisering av andra hit-
tills mödosamma laboratorie- och kliniska tekniker. Fästandet
av DNA-spjälkningskemikalier såsom de som beskrivs av Schultz
et al, J. Am. Chem. Soc., 104, 6861 (l982); och Hertzberg
et al, J. Am. Chem. Soc., 104, 313 (1982) möjliggör konstruk-
tionen av syntetiska restriktionsenzymer, vars specificitet
styres av oligonukleotidsekvensen.
Föreliggande uppfinning ger en allmän metod för införandet
av en fri alifatiska aminogrupp (fria alifatiska aminogrupper)
i syntetiska oligonukleotider. Denna aminogrupp reagerar lätt
och specifikt med en mångfald amino-reaktiva funktioner och
möjliggör därigenom kovalent bindning av en mångfald kemiska
arter.
I korthet innefattar föreliggande uppfinning nya alifatiska
aminoderivatiserade (aliphatic aminoderivitized) enkelsträngade
oligonukleotider konjugerade till endetekterbar grupp som är
en kromofor, ett fluorescerande medel, protien, enzym eller ett
annat "märke" ("tag").
Föreliggande uppfinning innefattar ytterligare de nya oligo-
nukleotiderna med åtminstone en aminoderivatiserad nukleosid
infogad via fosforamiditprekursorer.
Enligt en annan aspekt innefattar föreliggande uppfinning syn-
466 208 4
tesen av oligonukleotider på en fastfasbärare, vari oligo-
nukleotiden får reagera med en skyddad aminoderivatiserad
nukleosidfosforamidit.
Föreliggande uppfinning utgör enligt en specifik aspekt, den
syntetiserade molekylen 5'-trifluoracetamido 5'-deoxi-3'-N,N-
diisopropyl fosforamidotymidin (figur 2) och dess addition
till 5' terminus som den sista additionen i fastfasoligo-
nukleotidsyntesen. Under spjälkning och deprotektion av oligo-
nukleotiden hydrolyseras trifluoracetylgruppen och lämnar en
fri alifatiska aminogrupp på 5' terminus av oligonukleotiden.
Denna aminoderivatiserade oligonukleotid kan därefter reageras
med vilken som helst av en mångfald amino-reaktiva molekyler
för att ge motsvarande oligonukleotid-derivat. Detta är ett
specialfall av den mer allmänna tillämpningen med användning
av en modifierad nukleosid som har en skyddad alifatiska amino-
grupp på basgruppen i stället för på 5'-kolet. En sådan mole-
kyl möjliggör att flera fria aminogrupper kan placeras i oligo-
nukleotideniochwvid.vilken:somthehstfönskadwgusitianaifigïigøfirL»
nukleotidsekvensen.
Ett ändamål med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla
nya reagens och tekniker tillämpliga på DNA-sekvenering.
Ett annat ändamål med uppfinningen är att ge förbättringar
inom DNA-hybridisering för detektion av genetiska sjukdomar
och för andra ändamål.
Dessa och andra ändamål och fördelar med föreliggande upp-
finning framgår för en fackman på området av de mera specifika
uppgifter som följer.
Den strategi som användes för att införa alifatiska amino-
grupper i en oligonukleotid är att syntetisera 3'-fosforamidit-
derivatet av en nukleosidanalog innehållande en skyddad alifa-
tisk aminogrupp. Denna fosforamidit kan därefter omsättas med
oligonukleotiden som syntetiseras på en fast bärare på ett
5 466 208
sätt som är analogt till reaktionen av icke derivatiserade
nukleosidfosforamiditer. Spjälkning från den fasta fasen och
deprotektion av basgrupperna och den alifatiska aminogruppen
ger den amino-derivatiserade oligonukleotiden.
Exempel I
Syntes av VI. I figur 3 visas syntesen av föreningen VI från
den kommersiellt tillgängliga föreningen I (tymidin). Synte-
sen av föreningarna II-IV beskrivs i Horowit et al, J. Org.
Chem., 27, 3045-3048 (l962); och Gibbs och Orgel, J. Carbo-
hydrates-Nucleosides and Nucleotides, 3(5 och 6), 315-334
(1976). Syntesen av föreningar V och VI är enligt följande.
Exempel II
5'-trifluoracetamido-5'-deoxitymidin(V): 1,25 g (5 mmol) 5'-
amino-5'-deoxitymidin upplöstes i 25 ml torr dimetylformamid.
Till detta sattes 1,3 ml (10.mmoll^S-etyI-trifluortioacetatfi
(Aldrich). Reaktionsblandningen omrördes försiktigt vid rus-
temperatur. TLC av reaktionsblandningen på kiselgel F-254-
plattor körda i MeOH:aceton 1:1 visar en enkel fläck av produkt
spårad genom kortvâgs-UV. Produkten har hög mobilitet i detta
lösningsmedelssystem i motsats till utgångsföreningen VI som
är praktiskt taget orörlig.
Reaktionsblandningen rotationsindunstades till torrhet under
reducerat tryck, överfördes till en Erlenmeyer-kolv i 30 ml
isopropanol och omkristalliserades ur kokande isopropanol:
Me0H. Utbyte = 1,315 g (3,9 mmol, 80% utbyte), smältpunkt
2610-2620 (sönderdelning), analys, beräknat C 42,7%; H 4,18%;
N l2,5%, funnet C 42,7%; H 4,16%; N l2,4%. Strukturen V bekräf-
tades ytterligare genom 'H NMR.
466 208 6
Exempel III p .
Detta exempel åskådliggör framställningen av en skyddad amino-
derivatiserad nukleosidfosforamidit.
5'-trifluoracetamido-5'-deoxi-3'-N,N-diisoprpylfosforamido-
tymidin (VI): Allt glasmaterial, sprutor och kapillärrör som
användes vid denna reaktion upphettades över natten i en tork-
ugn. Dimetylformamid (DMF) lagrades över 4 Å molekylsiktar
(Linde). Diisopropyletylamin (DIPEA) destillerades från kalium-
hydroxid, därefter från kalciumhydrid och lagrades över 4 Å
molekylsiktar.
Till en torr 3-halsad 50 ml rundbottnad kolv med omröringsan-
ordning sattes 63 mg (0,l9 mmol) V. De tre halsarna förseddes
med gummiserumproppar och nålar instuckos i propparna. Kolven
vakuumpumpades i flera timmar i en exsickator över torr CaCl2.
Kolven hölls under en sakta ström av torr kvävgas och 2 ml
torr.DME tillsattes genom;imiekfiiønssprwtantg60%ul DIEEAh»
(0,34 mmol) tillsattes i ett torrt 100 ul kapillärrör; 40 ul
klor-N,N-diisopropylaminometoxifosfin (American Bionuclear,
Emeryville, CA) tillsattes (i ett torrt 100 ul kapillärrör).
Reaktionsblandningen omrördes sakta tills allt utgångsmaterial
upplösts och fick därefter sedimentera vid rumstemperatur
(alltid under N2). TLC efter l timme på kiselgel F-254-plattor
i HCCL3:EtOH:Et3N 88:l0:2 visade en enkel produktfläck med
mycket högre mobilitet än utgångsmaterialet V. Försök att
rena denna produkt på ett sätt liknande det som beskrivits för
nukleosidfosforamiditerna (4) misslyckades beroende på produkt-
nedbrytning. Därför användes den orena reaktionsblandningen
direkt för kopplingen till den syntetiska oligonukleotiden på
fastfasbäraren. Strukturen av VI bestämmes av reaktiviteten
av denna produkt med tillsats av oligonukleotiden och från den
väntade produkten av reaktionen på basis av litteraturresultat.
'x
7 466 208
Exempel IV
Detta exempel åskådliggör framställningen av en oligonukleo-
tid kopplad vid 5' terminus via en fosfodiester-bindning till
3'-hydroxylen av 5'-amino-5'-deoxitymidin.
Addition av VI till 5'terminus av en oligonukleotid: En bas-
skyddad syntetisk oligonukleotid med sekvensen 5'OH-AGC ACT
TTT AGA GT 3' kopplad till den fasta fasen vid 3"terminus
framställdes genom metoder som i detalj beskrivs i protokollet
benämnd "A Procedure for the Manual Synthesis of Deoxyoligo-
nucleotides using dimethoxytrityl nucleoside phosphoramidites
on a Solid Support", utgiven av Applied Biosystems, Inc.,
Foster City, Californien. Skillnaderna i reaktion av oligo-
nukleotiden med vi är a) 1 stället för stegen 4.22 och 4.23
kombineras l ml nyframställd reaktionsblandning innehållande
VI med l ml 0,5M tetrazol i acetonitril och sättes till reak-
tionskärlet; b) efter steg 4.33 sker två 30 sekunders tvätt-
ningar med.acetonitril;¿och;c),tillslutningsreaktionenlâsute-~“
slutes (för att följas av analys av icke reagerade hydroxyl-“
grupper i en efterföljande addition).
Kopplingsreaktflxens effektivitet monitoreras lätt genom efter-
följande koppling med en "normal" fosforamídit och spjälkning
av dimetoxitritylgruppen för att ge färganalys. Om 5'-hydro-
xylgrupperna i oligonukleotiden i den första kopplingen rea-
gerar med VI finns de inte längre tillgängliga för reaktion
vid den efterföljande kopplingen och lite färg frigöres vid
DCA-behandlingen efter den andra kopplingen. I detta exempel
är OD450=l,l2 (efter utspädning) för DMT-gruppen frigjord
45O=O,026
(efter utspädning) för DMT frigjord från en G-rest tillsatt
från oligonukleotiden innan reaktionen med VI. OD
efter reaktionen med VI. Därför blockerades 98% av 5' OH-
grupperna genom reaktion med VI. Oligonukleotiden deprotekte-
rades och spjälkades från den fasta fasen genom behandling med
tiofenol och koncentrerad NH OH på vanligt sätt och NH OH av-
4 4
lägsnades under reducerat tryck. Oligonukleotiden upplöstes i
466 2Û8
l ml destillerad H20. 0D260 var 128 av denna lösning vilket
indikerade koncentrationen av DNA att vara 4,5 mg/ml. 50 ul
av denna lösning späddes till 1 ml med H20 och blandades i 15
minuter med några hundra mg AG50W-X4 (natriumform) jonbytar-
harts för att överföra DNA från ammoniumsaltet till natrium-
saltet (ammoniumjonen interfererar med den efterföljande nin-
hydrinanalysen). Hartset avlägsnades genom centrifugering och
den överstående vätskan torkades i en Savant rotationskon-
centrator. Kvantitativ ninhydrinanalys (Sarin, V. K., et al,
Anal. Biochem. 117, 147 - 157 (1981)) gav ungefär 1 mol amino-
grupp per mol oligonukleotid (molkoncentrationen av oligo-
nukleotiden bestämdes ur en beräknad extinktionskoefficient
E260 = 1,55 x 105, beräknat på nukleotidkompositionen). Nin-
hydrinanalys av samma molmängd av en kontroll-oligonukleotid
till vilken inget VI hade konjugerats gav ingen amino-
positiv reaktion.
Exempel V
Konjugation med färgämne: Till 100 ul av ovannämnda Iöšníng av "
amino-oligonukleotider sattes 200 ul H20, 50 ul 1 M karbonat/
bikarbonatbuffert pH 9,0 och 25 ul nyframställd 10 mg/ml
fluorescein isotiocyanat (FITC) (Molecular Probes, Inc.,
Junction City, Oregon) i dimetylsulfoxid. Blandningen lämnades
vid rumstemperatur i flera timmar och renades genom kromatogra-
fi på en kolonn (1 cm x 9 cm) av Sephadex G-25 medium i H20.
Den gula produkten eluerades i den undantagna volymen och be-
friades från oreagerat färgämne. En kontrollreaktion med oligo-
nukleotider vartill inget VI omsatts gav mycket lite eller
ingen färg i den från kolonnen undantagna volymen vilket indi-
kerade att färgen verkligen reagerat med den tillsatta amino-
gruppen. Färg-oligonukleotidkonjugatet hade eU:0D260 = 2,3,
OD495 = 0,54. Beräknat på E495 7 x 104 för FITC, gav dešta en
7,7 uM lösning av färgämne. Baserat på E260 = 1,55 x 10 är
DNA 12,8 UM. Därför märktes 4'60% av DNA-molekylerna med färg-
ämne. Detta är en grov bedömning som inte tillåter förändrin-
gar i den bundna fluoresceinadsorbtionen i förhållande till
9 466 208
obunden eller för kontaminerande kortare och icke reaktiva
oligonukleotider. Ett prov av detta färgade DNA elektroforera-
des på en 20% polyakrylamidgel och blev klart synlig som ett
enkelt färgat (och fluorescerande) band med en mobilitet ända-
målsenlig för en oligonukleotid av denna längd.
Den färgkonjugerade oligonukleotiden renades bekvämt genom
högutlösningsvätskekromatografi (HPLC) på en omvänd fas C18-
kolonn (Waters) med användning av acetonitril:O,l M trietyl-
ammoniumacetat pH 7,0 gradient för eluering.
Det finns en mångfald tillämpningsområden för de nya amino-
derivatiserade oligonukleotiderna som beskrivits ovan. Den
alifatiska aminogruppen reageras lätt och specifikt med en
mångfald funktionella grupper. Detta innebär att praktiskt ta-
get vilken som helst önskad molekyl kan fästas till en på ovan
beskrivet sätt preparerad oligonukleotid. Detta inkluderar en-
zymer, andra proteiner, fluorescensmärkningar, bioluminescens-
märkningar, kromoforer och så vidaret Oligonukleotiderdhanflif
vid omfattning använts inom många områden, ofta i samband med
radiomärkning. Det kommer att bli möjligt att ersätta de radio-
aktiva märkningarna med icke-radioaktiva probemolekyler. Detta
innebär att förfaranden vari oligonukleotider användes blir
billigare och lättare att använda och förenliga med klinisk
hantering (setting). Även om radiomärkning är mindre före-
dragen kan de nya amino-derivatiserade oligonukleotiderna även
125
radiomärkas såsom exempelvis med I . Följande tre särskilda
exempel på användningar av de nya amino-derivatiserade oligo-
nukleotiderna utgör endast exempel:
1. Automatiserad DNA-sekvenering.
2. Detektion av genetiska sjukdomar genom DNA-hybridisering.
3. Allmän användning av fluorescens för detektion av hybridi-
sation.
466 208
10
Detektion av genetiska abnormaliteter: Oligonukleotider kan
användas för att bestämma individerna genotyp. Detta görs på
DNA-prov erhållna från fetus genom aminiocentesis. Denna in-
formation är ovärderlig för genetisk bedömning av par med risk
för en mångfald genetiska sjukdomar. Vuxnas genotyp kan även
bestämmas och tillåter effektiv diagnos och behandling på ett
tidigt stadium. Ett slående exempel på denna teknologi är
detektion av sickelcellanemi, Connor et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 80, 278 (1983). Nitton-bas-par-långa syntetiska oligo-
nukleotider syntetiserades, en komplementär till den normala
lummn B-globingenen (BA) och en komplementär till sickelcell-
B-globingenen (BS). Dessa molekyler märktes radioaktivt och
användes som prov vid DNA-hybridisation. Under lämpliga hybri-
disationsbetingelser kan dessa prov användas för att skilja
BA-genen från BS-allelen. Detta möjliggör diagnos av sickel-
cellsjukdomen. Mera allmänt, såsom påpekas i Connor et al,'
“this allele-specific hybridization behavior of oligonucleo-
tides~pravides@a:general;method for the_diagnpsis of any
genetic disease which'invoIves"a~porntßmuiatiønæflnmthëïüfiäïg¿
sequence of a single-copy gene". Föreliggande uppfinning är f
direkt applicerbar på denna teknik. Oligonukleotidproben pre-
pareras med en aminogrupp och märkes med ett fluorescensmärke.
Fluorescensprobemolekylen är obegränsat stabil i motsats till
den korta livstiden för radioaktiva probe och erfordrar inte
några speciella försiktighetsåtgärder vid användning eller
hantering. Detta gör att ett sådant tillvägagångssätt i hög
grad föredrages för användning vid klinisk användning, som är
det huvudsakliga område vari teknologin kommer att användas.
Oligonukleotidprober användes i stor utsträckning vid forsknings-
arbete liksom vid kliniskt arbete. De användes i allmänhet för
att spåra en bit DNA och en önskad sekvens i ett “bibliotek“,
en DNA-fragmentkollektion klonad i en plasmid eller fagvektor,
-som innehåller sekvenser som omfattar hela genomet (eller ut-
tryckt RNA) av en organism. De användes aven för att hybridi-
sera till DNA i en given sekvens i en "blot“ av en restrik-
tionssmälta (restriction digest) av en speciell bit av DNA. I
ll 466 208
alla dessa exempel liksom i andra märkes oligonukleotiden med
32p, vanligtvis vid 5' terminus och molekylen detekteras genom
autoradiografi. Föreliggande uppfinning beskriver märkningen
av oligonukleotider med fluorescensfärgämnen. Därför kan
fluorescens användas för detektion av molekylerna i vilken
som helst av de tekniker vari radioaktivitet konventionellt
har använts. Detta ger en mångfald fördelar i förhållande till
radioaktivitet såsom probestabilitet, kostnader och lätt vid
användning och avfallshantering.
Claims (16)
- 466 208 /i PATENTKRAV l. Enkelsträngad oligonukleotid, k ä n n e t e c k n a d av att den innehåller en alifatisk aminogrupp fäst till deoxiri- bosringen av den 5'-terminala nukleosiden och har en detekter- bar grupp fäst till den alifatiska aminogruppen.
- 2. Oligonukleotid n a d av att den medel.
- 3. Oligonukleotid n a d av att den
- 4. Oligonukleotid n a d av att den
- 5. Oligonukleotid n a d av att den
- 5. Oligonukleotid n a d av att den
- 7. Oligonukleotid n a d av att den enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k - detekterbara gruppen är ett fluorescerande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k detekterbara gruppen är en kromofor. enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k detekterbara gruppen är ett protein. enligt patentkravet 4, k ä n n e t e c k detekterbara gruppen är ett enzym. enii-gltfl-l/fl-pateawfkraveff L detekterbara gruppen är radioaktivt I125. enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k - alifatiska aminogruppen fästes till 5'-kol- atom 2 av den 5'-terminala nukleosiden.
- 8. Oligonukleotid enligt patentkravet 7, k ä n n e t e c k - n a d av att oligonukleotiden innehåller en 5'-terminal 5'- amino-5'-deoxitymidinnukleosid.
- 9. 5'-deoxi-5'-(skyddad amino)-nukleosidfosforamidit.
- 10. Förening enligt patentkravet 9, k ä n n e t e c k n a d av att den skyddade aminogruppen är en trifluoracetamidogrupp.
- A? 466 208 ll. 5'-trifluoracetamido-5'-deoxi-3'-N,N-diisopropylfosfor- amidotymidin.
- 12. Förfarande för framställning av ett 5'-deoxi-5'-trifluor- acetamido-tymidinfosforamidit, k ä n n e t e c k n a t av att 5'-deoxi-5'-trifluoracetattymidin omsättes med en fosfin.
- 13. Sätt för framställning av en oligonukleotid enligt patent- kravet 8, k ä n n e t e c k n a t av att man omsätter 5'- amino-5'-deoxitymidin till 5'-trifluoracetamido-5'-deoxitymi- din, omsätter denna produkt med klor-N,N-diisopropylaminome- toxifosfin till motsvarande fosforamidit, och omsätter denna med en basskyddad oligonukleotid fäst till en fastfasbärare.
- 14. Sätt för framställning av en oligonukleotid innehållande en alifatisk aminogrupp vid 5'-terminus, k ä n n e t e c k -_ n a t av att man inför den alifatiska aminogruppen i oligo- nukleotiden med användning av ett aminonukleosidfosforamidit i det sista kopplingssteget av oligonukleotidsyntesen på en fastfasbärare.
- I5;VSätt*för«framstäIIningøav~enmoligonukleotídfenligm*paraÜ* kravet 13, k ä n n e t e c k n a t av att aminonukleosidfos- foramiditet är en skyddad 5'-amino-5'-deoxi-3'-fosforamiditty- midin.
- 16. Sätt för framställning av en oligonukleotid enligt patent- kravet 13, vari aminonukleosidfosforamiditet är 5'-trifluor- acetamido-5'-deoxi-3'-fosforamido-tymidin.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US56501083A | 1983-12-20 | 1983-12-20 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SE8406484D0 SE8406484D0 (sv) | 1984-12-19 |
SE8406484L SE8406484L (sv) | 1985-06-21 |
SE466208B true SE466208B (sv) | 1992-01-13 |
Family
ID=24256835
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SE8406484A SE466208B (sv) | 1983-12-20 | 1984-12-19 | Enkelstraengad aminoderivat av oligonukleotider och foerfarande foer framstaellning daerav |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
JP (3) | JPS60197698A (sv) |
CA (1) | CA1244786A (sv) |
DE (1) | DE3446635C2 (sv) |
FR (1) | FR2556726B1 (sv) |
GB (1) | GB2153356B (sv) |
SE (1) | SE466208B (sv) |
Families Citing this family (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1223831A (en) | 1982-06-23 | 1987-07-07 | Dean Engelhardt | Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same |
US5015733A (en) * | 1983-12-20 | 1991-05-14 | California Institute Of Technology | Nucleosides possessing blocked aliphatic amino groups |
US5118800A (en) * | 1983-12-20 | 1992-06-02 | California Institute Of Technology | Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide |
US4849513A (en) * | 1983-12-20 | 1989-07-18 | California Institute Of Technology | Deoxyribonucleoside phosphoramidites in which an aliphatic amino group is attached to the sugar ring and their use for the preparation of oligonucleotides containing aliphatic amino groups |
US5821058A (en) | 1984-01-16 | 1998-10-13 | California Institute Of Technology | Automated DNA sequencing technique |
USRE43096E1 (en) | 1984-01-16 | 2012-01-10 | California Institute Of Technology | Tagged extendable primers and extension products |
GB8509880D0 (en) * | 1985-04-17 | 1985-05-22 | Ici Plc | Testing device |
US4762779A (en) * | 1985-06-13 | 1988-08-09 | Amgen Inc. | Compositions and methods for functionalizing nucleic acids |
US4757141A (en) * | 1985-08-26 | 1988-07-12 | Applied Biosystems, Incorporated | Amino-derivatized phosphite and phosphate linking agents, phosphoramidite precursors, and useful conjugates thereof |
US4959463A (en) * | 1985-10-15 | 1990-09-25 | Genentech, Inc. | Intermediates |
US4855225A (en) * | 1986-02-07 | 1989-08-08 | Applied Biosystems, Inc. | Method of detecting electrophoretically separated oligonucleotides |
DE3642939A1 (de) * | 1986-06-03 | 1987-12-10 | Europ Lab Molekularbiolog | Verfahren zur dna-markierung |
US5242796A (en) * | 1986-07-02 | 1993-09-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method, system and reagents for DNA sequencing |
CA1340806C (en) * | 1986-07-02 | 1999-11-02 | James Merrill Prober | Method, system and reagents for dna sequencing |
US4904582A (en) * | 1987-06-11 | 1990-02-27 | Synthetic Genetics | Novel amphiphilic nucleic acid conjugates |
US4833332A (en) * | 1987-06-12 | 1989-05-23 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Scanning fluorescent detection system |
US4965349A (en) * | 1987-12-24 | 1990-10-23 | Applied Biosystems, Inc. | Method of synthesizing oligonucleotides labeled with ammonia-labile groups on solid phase supports |
US5262536A (en) * | 1988-09-15 | 1993-11-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides |
US4997928A (en) * | 1988-09-15 | 1991-03-05 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Fluorescent reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides |
GB8822228D0 (en) * | 1988-09-21 | 1988-10-26 | Southern E M | Support-bound oligonucleotides |
CA2098187A1 (en) * | 1990-12-11 | 1992-06-11 | Clifford M. Chan | Methods for labelling oligonucleotides |
US5643722A (en) * | 1994-05-11 | 1997-07-01 | Trustees Of Boston University | Methods for the detection and isolation of proteins |
US6020481A (en) * | 1996-04-01 | 2000-02-01 | The Perkin-Elmer Corporation | Asymmetric benzoxanthene dyes |
SE522077C2 (sv) | 1997-09-05 | 2004-01-13 | Lightup Technologies Ab | Förfarande att välja sekvens hos sond för nukleinsyrahybridisering |
DE19815864A1 (de) * | 1998-04-08 | 1999-10-14 | Europ Lab Molekularbiolog | 5'-modifizierte Nukleotide und ihre Anwendung in der Molekularbiologie und Medizin |
EP1163251A1 (en) | 1999-03-24 | 2001-12-19 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | N-acylphosphoramidites and their use in oligonucleotide synthesis |
WO2003048179A2 (en) | 2001-12-03 | 2003-06-12 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Thermolabile hydroxyl protecting groups and methods of use |
US9809824B2 (en) | 2004-12-13 | 2017-11-07 | The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | CpG oligonucleotide prodrugs, compositions thereof and associated therapeutic methods |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3284440A (en) * | 1964-06-12 | 1966-11-08 | Merck & Co Inc | Phosphate esters of cytosine arabinoide and process for preparing same |
US3847898A (en) * | 1969-05-27 | 1974-11-12 | Upjohn Co | N4-trihaloethoxy carbonyl arabino-furanosyl cytosine 5'-esters |
IL57570A (en) * | 1978-06-22 | 1982-07-30 | Miles Lab | Method and reagent for specific binding assay with a prosthetic group as a label component |
IL57571A (en) * | 1978-06-22 | 1983-03-31 | Miles Lab | Flavin adenine dinucleotide-labeled conjugates and their use in a homogeneous immunoassay method for determining haptens |
US4415732A (en) * | 1981-03-27 | 1983-11-15 | University Patents, Inc. | Phosphoramidite compounds and processes |
FR2519005B1 (fr) * | 1981-12-29 | 1985-10-25 | Pasteur Institut | Fragments d'adn marques a l'une au moins de leurs extremites par des ribonucleotides modifies reconnaissables par des molecules affines et procede pour realiser une analyse de tels fragments d'adn |
-
1984
- 1984-12-19 FR FR8419462A patent/FR2556726B1/fr not_active Expired
- 1984-12-19 CA CA000470476A patent/CA1244786A/en not_active Expired
- 1984-12-19 JP JP59266525A patent/JPS60197698A/ja active Granted
- 1984-12-19 SE SE8406484A patent/SE466208B/sv not_active IP Right Cessation
- 1984-12-20 DE DE19843446635 patent/DE3446635C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-12-20 GB GB08432205A patent/GB2153356B/en not_active Expired
-
1988
- 1988-10-06 JP JP25102888A patent/JPH01250393A/ja active Granted
-
1992
- 1992-04-14 JP JP11959792A patent/JPH0678353B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB2153356A (en) | 1985-08-21 |
GB8432205D0 (en) | 1985-01-30 |
CA1244786A (en) | 1988-11-15 |
JPH0157119B2 (sv) | 1989-12-04 |
DE3446635C2 (de) | 1997-08-07 |
JPH06145192A (ja) | 1994-05-24 |
FR2556726B1 (fr) | 1987-02-20 |
GB2153356B (en) | 1987-07-22 |
JPS60197698A (ja) | 1985-10-07 |
JPH0460600B2 (sv) | 1992-09-28 |
FR2556726A1 (fr) | 1985-06-21 |
SE8406484D0 (sv) | 1984-12-19 |
SE8406484L (sv) | 1985-06-21 |
JPH0678353B2 (ja) | 1994-10-05 |
JPH01250393A (ja) | 1989-10-05 |
DE3446635A1 (de) | 1985-06-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
SE466208B (sv) | Enkelstraengad aminoderivat av oligonukleotider och foerfarande foer framstaellning daerav | |
JP3140127B2 (ja) | 3′−(2′)−アミノ−またはチオール−修飾された螢光色素結合ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド、並びにその製造法および使用 | |
US5118800A (en) | Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide | |
US4849513A (en) | Deoxyribonucleoside phosphoramidites in which an aliphatic amino group is attached to the sugar ring and their use for the preparation of oligonucleotides containing aliphatic amino groups | |
JP2683336B2 (ja) | 択一的ヌクレオチド配列の識別手段 | |
US20050106610A1 (en) | Kits containing modified amplification oligonucleotides | |
JPWO2005085269A1 (ja) | ヌクレオチド誘導体とdnaマイクロアレイ | |
BRPI0719923B1 (pt) | Métodos para sequenciamento de um ácido nucléico alvo, para conversão de um componente de ocorrência não natural em uma molécula de ácido nucléico em um componente de ocorrência natural, para terminar uma síntese de ácido nucléico, e para realizar o sequenciamento de sanger ou tipo sanger, e compostos | |
IE912662A1 (en) | Large comb-type branched polynucleotides | |
US6063571A (en) | Process for amplifying nucleic acids using DNA/PNA primers | |
JP3167138B2 (ja) | 単純ヘルペスウイルスの型特異的検出方法 | |
WO1990008838A1 (en) | Labeling of nucleic acids with fluorescent markers | |
US6831072B2 (en) | Compositions and methods of synthesis and use of novel nucleic acid structures | |
JP4189929B2 (ja) | ジップコード方式を用いたpnaチップ及びその製作方法 | |
KR20050122196A (ko) | 뉴클레오티드 유도체와 dna 마이크로어레이 | |
EP2170924B1 (en) | 5-bromo-2'-deoxy-uridine labeled nucleotide triphosphates and nucleic acid probes and methods of making and using the same | |
JP3650797B2 (ja) | ヒトアデノウイルス5型e1aおよびe1b遺伝子検出用オリゴヌクレオチド | |
WO1989002933A1 (en) | Non-nucleotide reagents for substituting termini of oligonucleotides | |
JP4467930B2 (ja) | ヌクレオチド標識試薬およびそれが導入されたオリゴヌクレオチド誘導体 | |
JPH01500003A (ja) | 光不安定結合による固形支持体上のポリヌクレオチド・プローブ | |
EP1228243A1 (en) | Compositions and methods of synthesis and use of novel nucleic acid structures | |
JPH064670B2 (ja) | 酵素標識化されたポリヌクレオチドおよびその製法 | |
McGuire | Synthesis and studies of modified nucleotides and oligonucleotides | |
JPH11113571A (ja) | オリゴヌクレオチド及びその利用 | |
Kumar | Nucleic Acids |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
NAL | Patent in force |
Ref document number: 8406484-9 Format of ref document f/p: F |
|
NUG | Patent has lapsed | ||
NUG | Patent has lapsed |