BRPI0719923B1 - Métodos para sequenciamento de um ácido nucléico alvo, para conversão de um componente de ocorrência não natural em uma molécula de ácido nucléico em um componente de ocorrência natural, para terminar uma síntese de ácido nucléico, e para realizar o sequenciamento de sanger ou tipo sanger, e compostos - Google Patents

Abstract

nucleotídeos e nucleosídeos rotulados fotocliváveis e nucleotídeos e nucleosídeos rotulados e métodos para seu uso no sequenciamento de dna. são fornecidos novos nucleotídeos, nucleosídeo, e seus derivados aqui descritos, que podem ser usados na tecnologia de sequenciamento de dna e outros tipos de análise de dna. em outra modalidade, o nucleotídeo ou nucleosídeo com um grupo 3'-0h desprotegido é derivado na nucleobase para incluir um corante fluorescente ligado por meio de um ligante a um grupo terminador não-clivável. o grupo fluorescente não-clivável é designado para terminar a síntese de dna, a fim de que os oligômeros de dna possam ser sequenciados eficientemente em um formato paralelo. em outra modalidade, o nucleotídeo o nucleosídeo com um grupo 3'-0h desprotegido é derivado na nucleobase para incluir um corante fluorescente ligado por meio de um ligante a um grupo terminador fotoclivável. o grupo fluorescente fotoclivável é designado para terminar a síntese de dna, bem como ser clivado a fim de que os oligômeros de dna possam ser sequenciados eficientemente em um formato paralelo.

Description

CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente invenção geralmente se refere a compostos emétodos para sequenciamento de DNA e outros tipos de análise de DNA. Mais particularmente, a invenção se refere a nucleotídeos e nu- cleosídeos rotulados com grupos fotocliváveis, nucleotídeos e nucleo- sídeos rotulados com grupos não cliváveis e métodos para seu uso na análise e sequenciamento de DNA.

TÉCNICA ANTECEDENTE

[0002] Métodos para rapidamente sequenciar DNA foi tornado necessário para analisar doenças e mutações na população e terapias em desenvolvimento. A forma mais geralmente observada de variação de sequência humana é polimorfismos de nucleotídeo simples (SNPs), que ocorrem em aproximadamente 1- em -300 a 1- em -1000 pares de base de sequência genômica. Construindo na sequência completa do genoma humano, esforços estão em andamento para identificar a ligação genética subjacente às doenças comuns por mapeamento de SNP ou associação direta. Desenvolvimentos de tecnologia focalizados em alta produtividade, rápida e sequenciamento de DNA de custo inferior facilitariam a compreensão e uso de informação genética, tais como SNPs, em medicina aplicada.

[0003] Em geral, 10% a 15% de SNPs afetarão a função de proteína alterando-se resíduos de aminoácido específicos, afetarão o próprio processamento de genes mudando-se mecanismos de entrança- mento, ou afetarão o nível normal de expressão do gene ou proteína variando-se mecanismos reguladores. É pretendido que a identificação de SNPs informativos levarão a diagnósticos mais precisos de doença herdada, melhor prognóstico de suscetibilidades de risco, ou identidade de mutações esporádicas no tecido. Uma aplicação do perfil de SNP de um indivíduo seria demorar significativamente o começo ou progressão de doença com terapias de fármaco profilático. Além disso, um perfil de SNP de genes de metabolização de fármaco pode ser utilizado para prescrever um regime de fármaco específico para fornecer resultados seguros e mais eficazes. Para realizar estes objetivos ambiciosos, se- quenciamento de genoma deslocarão na fase de ressequenciamento com o potencial de sequenciamento parcial de uma grande maioria da população, que envolveria o sequenciamento de regiões específicas ou pares de base simples em paralelo, que são distribuídos ao longo do genoma humano para obter o perfil de SNP para uma determinada doença complexa.

[0004] Variações de sequência fundamentando doenças mais comuns são prováveis de envolver SNPs múltiplos, que são dispersados ao longo dos genes associados e existir na frequência inferior. Desse modo, tecnologias de sequenciamento de DNA que empregam estratégias para sequenciamento de novo são mais prováveis de detectar e/ou verificar estas variantes raras, amplamente dispersas do que tecnologias que alvejam apenas SNPs conhecidos.

[0005] Tradicionalmente, sequenciamento de DNA foi realizadopelo método de "Sanger" ou" didesóxi", que envolve a terminação de cadeia da síntese de DNA pela incorporação de 2',3'- didesoxinucleotídeos (ddNTPs) usando DNA polimerase (Sanger, F., Nicklen, S., e Coulson, A. R. (1977) DNA sequencing withnchain- terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467). A reação também inclui os 2'-desoxinucleotídeos (dNTPs) naturais, que prolongam a cadeia de DNA por síntese de DNA. Competição adequadamente equilibrada entre a extensão de cadeia e terminação de cadeia resulta na geração de um conjunto de fragmentos de DNA aninhados, que são distribuídos uniformemente em milhares de bases e difere no tamanho como incrementos de par de base. Eletroforese é usada para resolver os fragmentos de DNA aninhados por seu tamanho respectivo. A relação de dNTP/ddNTP na reação de sequencia- mento determina a frequência de terminação de cadeia, e consequentemente a distribuição de comprimentos de cadeias terminadas. Os fragmentos são em seguida detectados por meio da ligação anterior de quatro fluoroforos diferentes às quatro bases de DNA (isto é, A, C, G, e T), que fluorescem suas cores respectivas quando irradiadas com uma fonte de laser adequada. Atualmente, sequenciamento de Sanger foi o método mais amplamente usado para verificação de SNPs por se- quenciamento de PCR direto (Gibbs, R. A., Nguyen, P. -N., McBride, L. J., Koepf, S. M., e Caskey, C. T. (1989) Identification of mutations leading to the Lesch-Nyhan syndrome by automated direct DNA sequencing of in vitro amplified cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1919- 1923) or genomic sequencing (Hunkapiller, T., Kaiser, R. J., Koop, B. F. , and Hood, L. (1991) Large-scale and automated DNA sequencing Determination. Science 254, 59-67; International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome. (2001) Nature 409, 860-921).

[0006] Outro método de sequenciamento promissor é terminaçãoreversível cíclica (CRT) que é um método cíclico de detectar as adições de base simples, sincronísticas de múltiplos padrões. Este método se diferencia do método de Sanger (Metzker, M.L. (2005) Genoma Rex 15, 1767-1776) em que pode ser realizado sem a necessidade de eletroforese de gel, um gargalo de frasco principal avançando-se este campo. Como sequenciamento de Sanger, entretanto, tamanhos de leitura mais longos transladam em menos ensaios de sequenciamento necessários para abranger o genoma inteiro.

[0007] Permaneceu difícil realizar o objetivo de leituras de CRTlongas por que os terminadores reversíveis agem tipicamente como substratos inferiores com DNA polimerases comercialmente disponíveis. Terminadores reversíveis são estruturados com um grupo de bloqueio 3'-O e uma tintura fluorescente ligada à nucleobase por meio de um grupo ligante. Tanto o bloqueio quanto os grupos de tintura requerem a remoção antes das adições de base subsequentes. Estas modificações de nucleotídeo não são bem toleradas por DNA polimerases, que podem ser mutadas por numerosas estratégias para melhorar o desempenho enzimático. Na desproteção, o grupo ligante de nucleo- base é deixado para trás, acumulando sequencialmente no dúplex de DNA crescente com ciclos de CRT subsequentes. É acreditado que cinéticas de enzima inferiores e um dúplex de DNA sequencialmente modificado limitam tamanhos de leitura mais longos. A presente invenção descreve, em parte, estruturas de nucleotídeo reversíveis, novas que requerem uma única ligação de ambas as porções de tintura fluorescente e de terminação, melhorando as cinéticas de enzima bem como eficiências de desproteção. Estes terminadores reversíveis são eficazmente incorporados por várias DNA polimerases comercialmente disponíveis, com a etapa de desproteção que transforma o dúplex de DNA crescente em seu estado natural.

[0008] Tamanhos de leitura de sequenciamento de DNA de tecnologias de CRT são governados pela eficiência global de cada ciclo de adição de nucleotídeo. Por exemplo, se alguém considera o ponto final de 50% do material de partida original como tendo uma relação de si- nal-para-barulho aceitável, a equação seguinte pode ser aplicada para estimar o efeito da eficiência do ciclo sobre o tamanho de leitura: (RL)Ceff = 0,5, onde RL é o tamanho de leitura em bases e Ceff é a efi- ciência de ciclo global. Em outras palavras, o tamanho de leitura de 7 bases pode ser obtido com uma eficiência de ciclo global de 90%, 70 bases podem ser obtidas com uma eficiência de ciclo de 99% e 700 bases com uma eficiência de ciclo de 99,9%. Para alcançar o objetivo de extensões grandes de sequenciamento, o método tem que fornecer eficiência de ciclo muito alta ou a recuperação pode cair abaixo das relações de sinal para barulho aceitáveis. Terminadores reversíveis que exibem a incorporação mais alta e eficiências de desproteção alcançarão eficiências de ciclo mais altas, e assim tamanhos de leitura mais longos.

[0009] Para os terminadores de CRT funcionarem corretamente, ogrupo protetor deve ser eficazmente clivados sob condições moderadas. A remoção de um grupo protetor geralmente envolve qualquer tratamento com ácido forte ou base, redução catalítica ou química, ou uma combinação destes métodos. Estas condições podem ser reativas à DNA polimerase, nucleotídeos, padrão iniciado por oligonucleotídeo, ou o suporte sólido que cria resultados indesejáveis. O uso de grupos protetores fotoquímicos é uma alternativa atraente para o tratamento químico rigoroso e pode ser empregado de uma maneira não invasiva.

[00010] Vários grupos protetores fotorremovíveis incluindo 2- nitrobenzila, benziloxicarbonila, 3-nitrofenila, fenacila, 3,5- dimetoxibenzoinila, 2,4-dinitrobenzenossulfenila, e seus derivados foram usados para as sínteses de peptídeos, polissacarídeos, e nucleo- tídeos (Pillai, V. N. R. (1980) Photoremovable Protecting Grups in Or-ganic Synthesis. Synthesis, 1-26). Destes, o grupo protetor 2- nitrobenzila sensível à luz foi aplicado bem sucedidamente ao 2'-OH de ribonucleosídeos para síntese de dirribonucleosídeo (Ohtsuka, E., Tanaka, S., e Ikehara, M. (1974) Studies on transfer ribonucleic acids and related compounds. IX(1) Ribooligonucleotide synthesis using a photosensitive o-nitrobenzyla protection at the 2'-hydroxil group. Nu cleic Acids Res. 1, 1351-1357), as 2'-OH de ribofosforamiditas na síntese de ribozima automatizada (Chaulk, S. G., e MacMillan, A. M. (1998) Caged RNA: photo-control of a ribozyme. Nucleic Acids Res. 26, 3173-3178), o 3'-OH de fosforamiditas para síntese de oligonucleo- tídeo na química de Affymetrix (Pease, A. C., Solas, D., Sullivan, E. J., Cronin, M. T., Holmes, C. P., e Fodor, S. P. A. (1994) Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5022-5026), e ao grupo 3'-OH para aplicações de sequenciamento de DNA (Metzker, M. L., Raghavachari, R., Richards, S., Jacutin, S. E., Civitello, A., Burgess, K., e Gibbs, R. A. (1994) Termination of DNA synthesis by novel 3'-modified deoxyrribonucleosidr triphosphates. Nucleic Acids Res. 22, 4259-4267). Sob condições de desproteção (luz ultravioleta >300 nm), o grupo 2-nitrobenzila pode ser eficazmente clivado sem afetar as bases de pirimidina ou purina (Pease, A. C., Solas, D., Sullivan, E. J., Cronin, M. T., Holmes, C. P. e Fodor, S. P. A. (1994). Disposições de oligonucleotídeo para análise de sequência de DNA rápida. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 50225026) e (Bartholomew, D. G., e Broom, A. D. (1975) One-step Chemical Synthesis of Ribonucleosides bearing a Photolabile Ether Protecting Group. J. Chem. Soc. Chem. Commun., 38).

[00011] A necessidade em desenvolver novas tecnologias de se- quenciamento nunca foi maior que hoje com setores de pesquisa diversos de abrangência de aplicações que incluem genômicos comparativos e evolução, forênsicos, epidemiologia, e medicina aplicada para diagnósticos e terapêuticos. Tecnologias de sequenciamento atuais são muito caras, intensivas no trabalho, e demoradas para ampla aplicação em estudos de variação de sequência humana. Custo de centro de genoma é calculado com base em dólares por 1.000 Q20 bases e pode ser geralmente dividido nas categorias de instrumentação, pessoal, reagentes e materiais, e despesas gerais. Atualmente, estes cen- tros estão operando em menos que um dólar por 1.000 Q20 bases com pelo menos 50% do custo resultante apenas da instrumentação de se- quenciamento de DNA. Desenvolvimentos em novos métodos de detecção, miniaturização em instrumentação, tecnologias de separação microfluídica, e um aumento no número de ensaios por ciclo terá mais provavelmente o impacto maior na redução do custo.

[00012] É, portanto, um objetivo da invenção fornecer novos compostos que são úteis no sequenciamento eficiente de informação ge- nômica em reações de sequenciamento de alta produtividade.

[00013] É outro objetivo da invenção fornecer novos reagentes e combinações de reagentes que podem eficazmente e acessivelmente fornecer a informação genômica.

[00014] Ainda é outro objetivo da invenção fornecer bibliotecas e disposições de reagentes para métodos diagnósticos e para desenvolver terapêuticos alvejados para indivíduos.

DESCRIÇÃO DE INVENÇÃOSUMÁRIONUCLEOSÍDEOS E NUCLEOTÍDEOS ROTULADOS FOTOCLIVÁ- VEIS

[00015] Fornecidos são compostos de nucleosídeo bem como fos- fatos e sais dos mesmos, que podem ser utilizados na tecnologia de sequenciamento de DNA. Os compostos são opcionalmente na forma de compostos de trifosfato de ribonucleosídeo (NTP) e trifosfato de desoxirribonucleosídeo (dNTP). Os compostos de nucleotídeo e nu- cleosídeo incluem um grupo fotoclivável rotulado com um corante fluorescente. Os compostos de nucleotídeo e nucleosídeo contendo grupos protetores fotocliváveis são projetados para terminar a síntese de DNA e em seguida ser clivados eficazmente, de forma que os oligôme- ros de ácido nucleico possam ser sequenciados rapidamente em um formato paralelo. A presença de tais grupos cliváveis rotulados com tintu- ras fluorescentes nos compostos de nucleotídeo e nucleosídeo pode realçar a velocidade e precisão do sequenciamento de oligômeros grande de DNA em paralelo, para permitir, por exemplo, sequenciamento de ge- noma inteiro rápido, e a identificação de polimorfismos e outra valiosa informação genética.

[00016] Uma variedade de compostos de nucleotídeo e nucleosí- deo, contendo as nucleobases, adenina, citosina, guanina, timina, ura- cila, ou derivados de ocorrência natural, é fornecida a qual inclui grupos cliváveis e/ou que pode ser derivada para incluir um rótulo detec- tável tal como um corante.

[00017] Em uma modalidade, a base do nucleosídeo é covalente- mente ligada com um grupo 2-nitrobenzila, e a posição do carbono alfa do grupo 2-nitrobenzila é opcionalmente substituída por um grupo alquila ou arila como descrito aqui. O grupo 2-nitrobenzila pode ser fun- cionalizado para realçar as propriedades de terminação bem como a taxa de desproteção catalisada por luz. As propriedades de terminação do grupo 2-nitrobenzila, ou grupo 2-nitrobenzila substituído por carbono alfa, ligado à nucleobase ocorrem mesmo quando o grupo 3'-OH no açúcar de ribose é desbloqueado. Estes terminadores desbloqueados por 3'-OH são bem-tolerados por várias DNA polimerases comercialmente disponíveis, representando uma vantagem fundamental sobre os terminadores 3'-O-bloqueados. O grupo 2-nitrobenzila substituído por carbono alfa da mesma forma pode ser derivada para incluir uma tintura fluorescente selecionada.

[00018] Em uma modalidade, a base do nucleosídeo é covalente- mente ligada com um grupo 2-nitrobenzila, e o grupo 2-nitrobenzila é opcionalmente substituído com um ou mais de um grupo de retirada de elétron e doador de elétron como descrito aqui. O grupo 2-nitrobenzila pode ser funcionalizado para realçar a taxa de desproteção catalisada por luz. O grupo 2-nitrobenzila pode da mesma forma ser derivado pa- ra incluir uma tintura fluorescente detectável.

[00019] Em particular, métodos para sequenciamento de DNA são fornecidos usando combinações de quatro compostos de trifosfato de nu- cleosídeo, modificados com grupos 2-nitrobenzila, e derivados descritos aqui e rotulados com tinturas fluorescentes distintas, que podem ser utilizadas para identificar as bases incorporadas para revelar a sequência de DNA subjacente.

NUCLEOTÍDEOS E NUCLEOSÍDEOS ROTULADOS

[00020] São também fornecidos compostos de nucleosídeo, bem como fosfatos e sais dos mesmos, que podem ser utilizados na tecnologia de sequenciamento de DNA. Os compostos são opcionalmente na forma de compostos de trifosfato de ribonucleosídeo (NTP) e trifos- fato de desoxirribonucleosídeo (dNTP). Os compostos de nucleotídeo e nucleosídeo incluem um grupo não-clivável rotulado com uma tintura fluorescente. Os compostos de nucleotídeo e nucleosídeo são projetados para terminar a síntese de DNA, de forma que os oligômeros de ácido nucleico possam ser sequenciados rapidamente em um formato paralelo. Uma variedade de compostos de nucleotídeo e nucleosídeo, contendo as nucleobases, adenina, citosina, guanina, timina, uracila, ou derivados de ocorrência natural das mesmas, é fornecida a qual pode ser derivada para incluir um rótulo detectável tal como um corante.

[00021] Em uma modalidade, a base do nucleosídeo é covalente- mente ligada com um grupo benzila, e a posição de carbono alfa do grupo benzila é opcionalmente substituída com um grupo alquila ou arila como descrito aqui. O grupo benzila pode ser funcionalizado para realçar as propriedades de terminação. As propriedades de terminação do grupo benzila opcionalmente substituído por carbono alfa para a nucleobase ocorrem mesmo quando o grupo 3'-OH no açúcar de ribose é desbloqueado. Estes terminadores desbloqueados por 3'-OH são bem tolerados por várias DNA polimerases comercialmente disponíveis, representando uma vantagem fundamental sobre os terminado- res 3'-O-bloqueados. O grupo ligante da mesma forma pode ser derivado para incluir uma tintura fluorescente selecionada.

[00022] Em particular, métodos para sequenciamento de DNA são fornecidos usando combinações dos quatro compostos de trifosfato de nucleosídeo, modificados por um grupo de terminação não-clivável, e derivados descritos aqui e rotulados com tinturas fluorescentes distintas que podem ser utilizadas para identificar as bases incorporadas para revelar a sequência de DNA subjacente.

DESCRIÇÃO DETALHADANUCLEOTÍDEOS E NUCLEOSÍDEOS ROTULADOS FOTOCLIVÁ- VEIS

[00023] Fornecidos são compostos de nucleotídeo e nucleosídeo bem como sais, ésteres e fosfato dos mesmos, que podem ser utilizados na tecnologia de sequenciamento de DNA rápido. Os compostos são opcionalmente na forma de trifosfatos de ribonucleosídeo (NTPs) e trifosfatos de desoxirribonucleosídeo (dNTP). Os compostos de nu- cleotídeo e nucleosídeo em uma modalidade incluem um grupo fotocli- vável rotulado com uma tintura fluorescente. Os compostos de nucleo- tídeo e nucleosídeo incluem grupos protetores fotorremovíveis que são projetados para terminar a síntese de DNA bem como clivar rapidamente, de forma que estes monômeros possam ser utilizados para se- quenciamento rápido em um formato paralelo. A presença de tais grupos rapidamente cliváveis, rotulados com tinturas fluorescentes, nos compostos de nucleotídeo e nucleosídeo pode realçar a velocidade e precisão do sequenciamento de oligômeros grandes de DNA em paralelo, para permitir, por exemplo, o sequenciamento de genoma inteiro rápido, e a identificação de polimorfismos e outra valiosa informação genética.

[00024] Uma variedade de compostos de nucleotídeo e nucleosí- deo, contendo as nucleobases adenina, citosina, guanina, timina, ura- cila, ou derivados de ocorrência natural das mesmas, é fornecida a qual inclui grupos cliváveis e/ou que pode ser derivada para incluir um rótulo detectável tal como um corante.

[00025] Em uma modalidade, as nucleobases adenina, citosina, guanina, timina, uracila, ou derivados de ocorrência natural das mesmas, podem ser covalentemente ligadas a um grupo protetor fotorre- movível tal como um grupo 2-nitrobenzila. O grupo 2-nitrobenzila pode ser derivado para realçar sua terminação de síntese de DNA bem como a taxa de desproteção, desse modo aumentando sua utilidade no sequenciamento de DNA. O grupo protetor fotorremovível, tal como um grupo 2-nitrobenzila, pode da mesma forma ser derivado com uma tintura fluorescente por ligação covalente para o grupo protetor fotorre- movível.I. Vantagens de Compostos de Nucleotídeo e Nucleosídeo Rotulados Fotocliváveis para Sequenciamento

[00026] Compostos de nucleotídeo e nucleosídeo são fornecidos os quais são úteis na tecnologia de sequenciamento de DNA. Terminação reversível cíclica (CRT) é um método cíclico de detectar as adições de base simples, síncronas, de múltiplos padrões. Este método se diferencia do método de Sanger que pode ser realizado sem a necessidade de eletroforese de gel e formato altamente paralelo que são gargalos de frasco principais no avanço deste campo. Como o sequencia- mento de Sanger, entretanto, tamanhos de leitura mais longos transladam em menos ensaios de sequenciamento necessários para abranger o genoma inteiro. O ciclo de CRT compreende três etapas, incorporação, imageamento e desproteção. Para este procedimento, eficiência de ciclo, tempo de ciclo, e sensibilidade são fatores importantes. A eficiência de ciclo é o produto de desproteção e eficiências de incor- poração e determina o tamanho de leitura de CRT. O tempo de ciclo de CRT é a soma de incorporação, imageamento, e tempos de desproteção. Para CRT rápida para sequenciamento de genoma inteiro, os compostos de nucleotídeo e nucleosídeo como descritos aqui podem ser utilizados os quais podem exibir propriedades de desproteção eficientes e rápida. Estes compostos podem ser rotulados com tinturas fluorescentes, ligados diretamente a uma 2-nitrobenzila, fornecendo terminadores fluorescentes, reversíveis com propriedades de desproteção similares. O tamanho de leitura de tecnologias de CRT é gover-nado pela eficiência global de cada ciclo de adição de nucleotídeo, produto de desproteção e eficiências de incorporação. Por exemplo, se alguém considera o ponto final de 50% do material de partida original como tendo uma relação de sinal-para-barulho aceitável, a equação seguinte pode ser aplicada para estimar o efeito da eficiência do ciclo no tamanho de leitura:(RL)Ceff = 0,5onde RL é o tamanho de leitura em bases e Ceff é a eficiência de ciclo global. Em outras palavras, um tamanho de leitura de 7 bases pode ser obtido com uma eficiência de ciclo global de 90%, 70 bases podem ser obtidas com uma eficiência de ciclo de 99% e 700 bases com uma eficiência de ciclo de 99,9%. A eficiência de incorporação de compostos de acordo com a invenção pode variar de cerca de 70% a cerca de 100% da incorporação do nucleosídeo nativo análogo. Preferivelmente, a eficiência de incorporação variará de cerca de 85% a cerca de 100%. Eficiências de fotoclivagem variarão preferivelmente de cerca de 85% a cerca de 100%. Além disso, a terminação da extensão de ácido nucleico variará de cerca de 90% a cerca de 100% na incorporação de compostos de acordo com a invenção. Compostos de nucleotídeo e nucleosídeo em uma modalidade têm uma eficiência de ciclo de pelo menos 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, ou 99,9%. Quando aplicados ao DNA genômico, os compostos podem ser utilizados em CRT para ler diretamente do DNA genômico. DNA genômico fragmentado pode ser hibridizado para um chip de oligonucleotídeo de alta densidade contendo sítios de iniciação que abrangem os cromossomas selecionados. Cada sequência de iniciação é separada pelo tamanho de leitura estimado do método de CRT. Entre as adições de base, um imagea- dor fluorescente pode simultaneamente imagear o chip de alta densi-dade inteiro, marcando melhorias significantes na velocidade e sensibilidade. O fluoróforo que é ligado ao grupo 2-nitrobenzila ou seus derivado descritos aqui, é removido por irradiação uv que liberta o grupo 2-nitrobenzila ao próximo círculo de adição de base. Depois de aproximadamente 500 ciclos de CRT, as informações de sequência de genoma completa e contígua podem em seguida ser comparadas ao genoma humano de referência para determinar a extensão e tipo de variação de sequência na amostra de um indivíduo.II. Compostos de Nucleotídeo e Nucleosídeo Rotulado Fotoclivável

[00027] Uma variedade de compostos de nucleotídeos e nucleosí- deos bem como seus mono, di e trifosfatos é fornecida. Os compostos são úteis para tecnologia de sequenciamento de DNA. Em uma modalidade, os compostos de nucleotídeo e nucleosídeo incluem um grupo terminador fotoclivável rotulado com um corante fluorescente que pode ser detectado e eficazmente clivado em reações de CRT. Os compostos de nucleotídeo e nucleosídeo podem ser convertidos em seus mo- nofosfatos de nucleosídeo natural respectivos para ciclos subsequentes de reações de DNA polimerase. Em uma modalidade particular, compostos de nucleotídeo e nucleosídeo são fornecidos compreen-dendo um açúcar de ribose ou desoxirribose e uma base, em que a base é covalentemente ligada a um grupo 2-nitrobenzila, terminador fotoclivável. O grupo 2-nitrobenzila pode ser substituído com grupos que aumentam a terminação de síntese de DNA bem como a taxa de desproteção. Além disso, o grupo 2-nitrobenzila pode ser detectável ligando-se a um grupo repórter, tal como um corante. O corante pode ser opcionalmente ligada ao grupo 2-nitrobenzila por um ligante bifun- cional. Compostos de acordo com a invenção podem ser representados pela fórmula seguinte:

em que R1 é H, monofosfato, difosfato ou trifosfato, R2 é H ou OH, base é citosina, uracila, timina, adenina, ou guanina, ou derivados de ocorrência natural das mesmas, porção de terminação clivável é um grupo que dá propriedades de terminação de polimerase ao composto, ligante é um grupo bifuncional, e tintura é um fluoróforo. Compostos de acordo com a invenção podem ser projetados como terminadores reversíveis fotolábeis, fluorescentes úteis no sequenciamento de síntese de DNA. Os compostos podem ser terminadores reversíveis otimizados, modificados para ter comportamento de desproteção eficiente e rápida e boas propriedades fluorescentes em soluções aquosas. Em uma modalidade, um composto é fornecido tendo uma estrutura de fórmulas I-VII:

em que R1 = H, monofosfato, difosfato ou trifosfato, R2 = H ou OH, R3 e R4 são cada qual independentemente selecionado a partir do grupo H, uma alquila de cadeia linear ou ramificada de C1-C12, uma polienila ou alquenila de cadeia linear ou ramificada de C2-C12, uma polialquinila ou alquinila de cadeia linear ou ramificada de C2-C12, e um grupo aromático tal como um anel de fenila, naftila ou piridina, com a condição que pelo menos um dentre R3 e R4 é H; R5, R6, R7, e R8 seja cada qual in-dependentemente selecionado a partir do grupo H, OCH3, N02, CN, um haleto, uma alquila de cadeia linear ou ramificada de C1-C12, uma poli- enila ou alquenila de cadeia linear ou ramificada de C2-C12, uma polial- quinila ou alquinila de cadeia linear ou ramificada de C2-C12 um grupo aromático tal como um anel de fenila, naftila ou piridina, e/ou um grupo ligante da estrutura geral:

X = CH2, CHºCH, C.C, O, S, ou NH, Y = CH2, O, ou NH, n = um número inteiro de 0-12; m = um número inteiro de 0-12, e corante = um fluoróforo, ou sal farmaceuticamente aceitável ou éster do mesmo ouenantiômero, mistura racêmica, ou estereoisômero do mesmo. Emuma modalidade particular, nos compostos fornecidos aqui compreendendo um anel de 2-nitrofenila derivado, tal como os compostos defórmulas I-VII, a taxa de desproteção e remoção do grupo 2-nitrofeniladurante o sequenciamento de DNA pode ser realçada incluindo umgrupo doador de elétron na posição 4 ou um grupo de retirada de elé-tron na posição 5 do anel de 2-nitrofenila.

[00028] Em uma modalidade preferida, R3 e R4 são selecionados a partir do grupo que consiste em, porém não limitados a, -CH3, -CH2CH3, - CH2CH2CH3, isopropila, terc-butila, fenila, 2-nitrofenila, e 2,6 dinitrofe- nila. Alternativamente, R3 e R4 são selecionados a partir do grupo que consiste em, porém não limitados a, grupos alquila e aromáticos se opcionalmente contendo pelo menos um heteroátomo nos grupos alquila ou aromáticos, e também onde que o grupo aromático pode op-cionalmente ser uma arila tal como fenila ou policíclico tal como um grupo naftila. Em certas modalidades, R5, R6, R7, e R8 são selecionados a partir de um grupo aromático que consiste em grupos arila e po- licíclicos.

[00029] Alternativamente, porções de terminação fotocliváveis podem ter as seguintes estruturas gerais:

[00030] Por exemplo, compostos com tais porções de terminação fotocliváveis poderiam ter as seguintes estruturas:

em que a porção de terminação clivável é ligada à base através de uma ligação selecionada a partir do grupo que consiste em benzil amina, éter benzílico, carbamato, carbonato, carbamato de 2-(o-nitrofenil)etila, e car-bonato de 2-(o-nitrofenil)etila. Tais modalidades estão dentro do escopo da invenção atual.

[00031] Corantes fluorescentes não são particularmente limitadas. Por exemplo, o fluoróforo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em, porém não limitado a, BODIPY, fluoresceína, rodamina, cumarina, xanteno, cianina, pireno, ftalocianina, ficobiliproteína, alexa, corante de esquareno, combinações que resultam em corantes de transferência de energia, e derivados dos mesmos.

[00032] Modalidades preferidas incluem porém não são limitadas aos seguintes compostos:

III. Síntese de Compostos de Nucleotídeo e Nucleosídeo Fotocliváveis

[00033] Os compostos descritos aqui podem ser sintetizados geralmente como descrito aqui, e usando métodos disponíveis na técnica. Por exemplo, o esquema geral seguinte representa a síntese de um composto de adenosina:

[00034] Detalhes adicionais são fornecidos na seção de Exemplos. NUCLEOTÍDEOS E NUCLEOSÍDEOS ROTULADOS

[00035] Fornecidos são compostos de nucleotídeo e nucleosídeo bem como sais, ésteres e fosfatos dos mesmos, que podem ser utilizados na tecnologia de sequenciamento de DNA rápido. Os compostos são opcionalmente na forma de trifosfatos de ribonucleosídeo (NTPs) e trifosfatos de desoxirribonucleosídeo (dNTP). Os compostos de nucleotídeo e nucleosídeo em uma modalidade incluem um grupo não-clivável rotulado com um corante fluorescente. Os compostos de nucleotídeo e nucleosídeo são projetados para terminar a síntese de DNA, de forma que estes monômeros possam ser utilizados para se- quenciamento rápido em um formato paralelo. A presença de tal grupo rotulado com corantes fluorescentes nos compostos de nucleotídeo e nucleosídeo pode realçar a velocidade e precisão de sequenciamento de oligômeros grande de DNA em paralelo, para permitir, por exemplo, sequenciamento de genoma inteiro rápido, e a identificação de poli-morfismos e outra valiosa informação genética.

[00036] Uma variedade de compostos de nucleotídeo e nucleosí- deo, contendo as nucleobases adenina, citosina, guanina, timina, ura- cila, ou derivados de ocorrência natural das mesmas, é fornecida a qual inclui porções de terminação não cliváveis e/ou que pode ser derivada para incluir um rótulo detectável tal como um corante.

[00037] Em uma modalidade, as nucleobases adenina, citosina, guanina, timina, uracila, ou derivados de ocorrência natural das mesmas, podem ser covalentemente ligadas a um corante por meio de uma porção de terminação não-clivável. A porção de terminação não- clivável pode ser derivada para realçar sua terminação de síntese de DNA desse modo aumentando sua utilidade no sequenciamento de DNA.I. Vantagens de Compostos de Nucleotídeo E Nucleosídeo Rotulados para Sequenciamento

[00038] Compostos de nucleotídeo e nucleosídeo são fornecidos os quais são úteis na tecnologia de sequenciamento de DNA. A eficiência da incorporação de compostos de acordo com a invenção pode variar de cerca de 70% a cerca de 100% da incorporação do nucleosídeo nativo análogo. Preferivelmente, a eficiência de incorporação variará de cerca de 85% a cerca de 100%. Além disso, a terminação da extensão de ácido nucleico variará de cerca de 90% a cerca de 100% na incorporação de compostos de acordo com a invenção. Compostos de nucleotídeo e nucleosídeo em uma modalidade têm uma eficiência de terminação de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, ou 99,9%.II. Compostos de Nucleotídeo e Nucleosídeo Rotulados

[00039] Uma variedade de compostos de nucleosídeos bem como seus mono, di e trifosfatos é fornecida. Os compostos são úteis para tecnologia de sequenciamento. Em uma modalidade, o composto de nucleosídeo inclui um grupo fluorescente que pode ser detectado efi-cazmente. Os compostos de nucleosídeo podem ser convertidos em seus trifosfatos respectivos para reações de DNA polimerase. Com-postos de acordo com a invenção podem ser representados pela seguinte fórmula:

em que R1 é H, monofosfato, difosfato ou trifosfato, R2 é H ou OH, ba- se é citosina, uracila, timina, adenina, guanina, ou um derivado de ocorrência natural das mesmas, a porção de terminação não-clivável é um grupo que dá propriedades de terminação de polimerase ao com-posto, ligante é um grupo bifuncional, e o corante é um fluoróforo. Compostos de acordo com a invenção podem ser projetados como terminadores não reversíveis, não lábeis fluorescentes, úteis no se- quenciamento de síntese de DNA.

[00040] Em uma modalidade, um composto é fornecido tendo uma estrutura de fórmulas I-VII:

em que R1 = H, monofosfato, difosfato ou trifosfato, R2 = H ou OH, R3 e R4 são cada qual independentemente selecionado a partir do grupo H, uma alquila de cadeia linear ou ramificada de C1-C12, uma polienila ou alquenila de cadeia linear ou ramificada de C2-C12, uma polialquinila ou alquinila de cadeia linear ou ramificada de C2-C12, e um grupo aromático tal como um anel de fenila, naftila ou piridina; R5, R6, e R7, são cada qual independentemente selecionado a partir do grupo H, OCH3, NO2, CN, um haleto, uma alquila de cadeia linear ou ramificada de C1-C12, uma polienila ou alquenila de cadeia linear ou ramificada de C2-C12, uma polialquinila ou alquinila de cadeia linear ou ramificada de C2-C12, um grupo aromático tal como um anel de fenila, naftila, ou piridina, e/ou um grupo ligante da estrutura geral:

[00041] X = CH2, CH=CH, C.C, O, S, ou NH, Y = CH2, O, ou NH, n = um número inteiro de 0-12; m = um número inteiro de 0-12, e Corante = um fluoróforo; e R8 e R9 são como definidos acima para R5, R6, e R7, com a condição que R8 e R9 não sejam NO2; ou sal farmaceutica- mente aceitável ou éster do mesmo ou enantiômero, mistura racêmica, ou estereoisômero do mesmo.

[00042] Em uma modalidade preferida, R3 e R4 são selecionados a partir do grupo que consiste em, porém não limitados a, -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, isopropila, terc-butila, fenila, 2-nitrofenila, e 2,6- dinitrofenila. Alternativamente, R3 e R4 são selecionados a partir do grupo que consiste em, porém não limitados a, grupos alquila e aromáticos opcionalmente contendo pelo menos um heteroátomo nos grupos alquila ou aromáticos, e também onde o grupo aromático pode opcionalmente ser uma arila tal como fenila ou policíclico tal como um grupo naftila. Em certas modalidades, R5, R6, R7, e R8 são selecionados a partir de um grupo aromático que consiste em grupos arila e policícli- cos.

[00043] Alternativamente, ligantes podem ter as seguintes estruturas gerais:

[00044] Por exemplo, compostos com tais ligantes poderiam ter as seguintes estruturas:

em que a porção de terminação clivável pode ser ligada à base através de uma ligação tal como um benzil amina, éter benzílico, carbama- to, carbonato, carbamato de 2-(o-nitrofenil)etila, e/ou carbonato de 2- (o-nitrofenil)etila.

[00045] Corantes fluorescentes não são particularmente limitados. Por exemplo, o fluoróforo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em, porém não limitado a, BODIPY, fluoresceína, rodamina, cumarina, xanteno, cianina, pireno, ftalocianina, ficobiliproteína, alexa, corante de esquareno, combinações que resultam em corantes de transferência de energia, e derivados dos mesmos.

[00046] Modalidades preferidas incluem porém não são limitadas aos seguintes compostos:

III. Síntese de Compostos de Nucleotídeo E Nucleosídeo Rotulados

[00047] Os compostos descritos aqui podem ser sintetizados geralmente como descrito aqui, e usando métodos disponíveis na técnica. Por exemplo, o seguinte esquema geral representa a síntese de um composto de adenosina:Esquema geral para síntese de um composto modificado por N6 de Adenosina

Esquema geral para síntese de compostos modificados por 06 deGuanosina

Esquema geral para síntese de compostos modificados por 8-Oxo deGuanosina

Esquema geral para síntese de compostos modificados por 5-HOMe deUridina

Esquema geral para síntese de compostos modificados por 5-HOMe deCitidina

Esquema geral para síntese de compostos modificados por N4 de Citidina

IV. Métodos de Uso de Compostos de Acordo com a Invenção

[00048] Os compostos de nucleotídeo e nucleosídeo descritos aqui podem ser usados para uma variedade de propósitos na tecnologia de sequenciamento de DNA. Polimerases usadas junto com os compostos de acordo com a invenção podem ser polimerases nativas ou poli- merases modificadas. Polimerases incluem sem limitação Taq DNA polimerase, Klenow(exo-) DNA polimerase, Bst DNA polimerase, Vent(exo-) DNA polimerase, Pfu(exo-) DNA polimerase, e De- epVent(ex0-) DNA polimerase. Polimerases modificadas incluem sem limitação a TaqFS DNA polimerase, ThermoSequenase DNA polime- rase, TermoSequenase II DNA polimerase, Terminador DNA polimera- se, Terminator II DNA polimerase, e Vent(exo-) A488L DNA polimera- se. Preferivelmente, compostos de acordo com a invenção estão in-corporados em níveis igual a ou próximos aos níveis de incorporação de nucleotídeos de ocorrência natural, desse modo não resultando na tendência contra os compostos de acordo com a invenção. Ainda mais preferivelmente, compostos de acordo com a invenção são compatíveis com polimerases comercialmente disponíveis.NUCLEOTÍDEOS E NUCLEOSÍDEOS ROTULADOS FOTOCLIVÁ- VEIS

[00049] Em uma modalidade, os compostos podem ser utilizados na terminação reversível cíclica (CRT) que é um método cíclico de detectar as adições de base simples, síncronas de múltiplos padrões. Comprimentos de leitura mais longos transladam em menos ensaios de sequenciamento necessários para abranger o genoma inteiro. Um método de sintetizar um ácido nucleico compreende as seguintes etapas:a) ligar a extremidade 5' de um iniciador a uma superfície sólida;b) hibridizar um ácido nucleico alvo ao iniciador ligado à su-perfície sólida;c) adicionar um ou mais compostos de acordo com a fórmu- la:

em que R1 é H, monofosfato, difosfato ou trifosfato, R2 é H ou OH, base é citosina, uracila, timina, adenina, ou guanina, ou derivados de ocorrência natural das mesmas, porção de terminação clivável é um grupo que dá propriedades de terminação de polimerase ao composto, ligante é um grupo bifuncional, e corante é um fluoróforo;d) adicionar DNA polimerase ao complexo de ácido nuclei- co alvo/iniciador hibridizado para incorporar o composto da etapa anterior na fita de iniciador crescente, em que o composto incorporado termina a reação de polimerase em uma eficiência dentre cerca de 90% a cerca de 100%;e) opcionalmente lavar a superfície sólida para remover os componentes não incorporados;f) detectar o fluoróforo incorporado, em que o detector é opcionalmente um detector de excitação de múltiplas linhas pulsado para imagear os corantes fluorescentes;g) opcionalmente adicionar um ou mais compostos químicos para permanentemente tampar os iniciadores não prolongados;h) expor o suporte sólido a uma fonte de luz para remover a porção fotoclivável que resulta em um iniciador prolongado com de componentes de ocorrência natural; e i) lavar a superfície sólida para remover o grupo protetor clivado; e repetir as etapas anteriores de uma maneira cíclica.

[00050] Em outra modalidade, compostos de acordo com a invenção podem ser utilizados em um método de determinar a sequência de uma molécula de ácido nucleico que compreende as etapas de adicionar uma molécula de ácido nucleico alvo a um mecanismo de sequen- ciamento, adicionar um ou mais compostos de acordo com a invenção ao mecanismo de sequenciamento, adicionar uma enzima polimerase e opcionalmente componentes de ácido nucleico de ocorrência natural ao mecanismo de sequenciamento, realizar uma reação de polimerase para incorporar pelo menos um dos compostos da etapa anterior em uma fita de ácido nucleico crescente, e analisar o resultado da reação de polimerase para incorporação de pelo menos um composto de acordo com a invenção. As etapas podem ser realizadas em qualquer ordem e em qualquer número de repetições. Preferivelmente, a etapa de incorporação é seguida por terminação de crescimento de fita em uma taxa de cerca de 90% a cerca de 100%. Em outra modalidade, a incorporação do composto inventivo ocorre em cerca de 70% a cerca de 100% da taxa de incorporação de um substrato nativo da base análoga, tal que nenhuma tendência significante ocorre. Por exemplo, a taxa de incorporação pode ocorrer em cerca de 85% a cerca de 100% da taxa normal para a base de nucleotídeo correspondente. Uma modalidade importante inclui a etapa de expor a molécula de ácido nu- cleico resultante da incorporação de um nucleotídeo modificado em um uv ou outra fonte de luz para remover uma porção de terminação fotoclivável do ácido nucleico. Preferivelmente, a eficiência da etapa de fotoclivagem é cerca de 85% a cerca de 100% de exposição ao uv ou outra fonte de luz.

[00051] Métodos de acordo com a invenção podem ser praticados individualmente ou em combinação. Por exemplo, o método de se- quenciamento de uma molécula de ácido nucleico pode ser praticado em parte como um método de incorporar um componente de ocorrência não natural em uma molécula de ácido nucleico, ou um método separado de converter um componente de ocorrência não natural em uma molécula de ácido nucleico em um componente de ocorrência não natural depois da incorporação de um composto de acordo com a invenção.

[00052] Em uma modalidade, métodos de acordo com a invenção incluem o aspecto de terminar a síntese de ácido nucleico depois da incorporação de um nucleotídeo 3'-OH desprotegido. Vantajosamente, um nucleotídeo 3'-OH desprotegido pode ser incorporado por polime- rases em um nível mais alto, resultando em níveis inferiores do nucleo- tídeo modificado presente na reação de polimerase e tendências inferiores comparadas aos nucleotídeos naturais. Portanto, uma modalidade preferida inclui um método de terminar a síntese de ácido nuclei- co que compreende a etapa de colocar um nucleotídeo e nucleosídeo desprotegido 3'-OH no ambiente de uma polimerase e permitir a incorporação do nucleotídeo ou nucleosídeo desprotegido 3'-OH em uma molécula de ácido nucleico, em que o nucleotídeo ou nucleosídeo desprotegido 3'-OH é um composto de acordo com a seguinte fórmula:

em que R1 é H, monofosfato, difosfato ou trifosfato, R2 é H ou OH, base é citosina, uracila, timina, adenina, ou guanina, ou derivados de ocorrência natural das mesmas, porção de terminação clivável é um grupo que dá propriedades de terminação de polimerase ao composto, ligante é um grupo bifuncional, e corante é um fluoróforo. Preferivelmente, o método tem uma eficiência de terminação na incorporação do nucleotídeo ou nucleosídeo desprotegido 3'-OH que varia de cerca de 90% a cerca de 100%. Alternativamente, o método pode ter uma eficiência de incorporação das faixas de nucleotídeo ou nucleosídeo desprotegido 3'-OH de cerca de 70% a cerca de 100% comparada à eficiência de incorporação de um nucleotídeo ou nucleosídeo de ocorrência natural com a mesma base.

[00053] Os compostos de nucleotídeo e nucleosídeo podem ser usados na CRT para ler diretamente do DNA genômico. DNA genômi- co fragmentado pode ser hibridizado em um chip de oligonucleotídeo de alta densidade contendo sítios de iniciação que abrangem cromossomas selecionados. Cada sequência de iniciação é separada pelo tamanho de leitura estimado do método de CRT. Entre as adições de base, um imageador fluorescente, tal como um detector de Excitação de múltiplas linhas Pulsada (PME), pode simultaneamente imagear o chip de alta densidade inteira, marcando melhorias significantes na velocidade e sensibilidade. O fluoróforo, que é ligado ao grupo de terminação clivável na base é removido por uv ou outra irradiação de luz, desse modo transformando o nucleotídeo modificado em sua forma natural para o próximo ciclo de adição de base. Depois de aproximadamente 500 ciclos de CRT, a informação de sequência de genoma contígua e completa pode em seguida ser comparada ao genoma humano para determinar a extensão e tipo de variação de sequência na amostra de um indivíduo. Métodos para terminação reversível cíclica foram desenvolvidos na técnica e podem ser utilizados, como descrito, por exemplo, em WO 2003/021212, a descrição da qual está incorporada aqui por referência.

[00054] Em uma modalidade, um método para sequenciar um ácido nucleico detectando-se a identidade de um análogo de nucleotídeo depois que o análogo de nucleotídeo é incorporado em uma fita crescente de DNA em uma reação de polimerase é usado, o qual compreende as seguintes etapas:(a) ligar a extremidade 5' de um ácido nucleico a uma su-perfície sólida;(b) ligar um iniciador ao ácido nucleico ligado à superfície sólida;(c) adicionar uma polimerase e um ou mais compostos de trifosfato de nucleosídeo diferentes ao ácido nucleico em que o composto de trifosfato de nucleosídeo incorpora-se e em seguida termina a reação de polimerase, em que cada composto de trifosfato de nucleo- sídeo compreende uma base selecionada a partir do grupo que consiste em adenina, guanina, citosina, timina, e uracila, e seus análogos e um grupo de terminação fotoclivável ligado à base, o grupo fotoclivável compreendendo um rótulo detectável, e um açúcar de desoxirribose ou ribose,(d) opcionalmente lavar a superfície sólida para remover os análogos de nucleotídeo não incorporados;(e) detectar e desse modo identificar o rótulo detectável, tal como um corante fluorescente ou molécula repórter, ligado ao trifosfa- to de nucleosídeo terminado, por exemplo, com PME;(f) opcionalmente adicionar um ou mais compostos químicos para permanentemente tampar qualquer grupo -OH não reagido no iniciador ligado ao ácido nucleico ou em uma fita de extensão de iniciador formado adicionando-se um ou mais nucleotídeos ao iniciador; (g) expor a superfície sólida a uma fonte de luz para remover o grupo protetor fotoclivável que contém o rótulo sem igual ou molécula de repórter, em que a unidade de monofosfato de nucleosídeo incorporada restante se assemelha a uma molécula de ácido nucleico natural, nativa ou não modificada;(h) lavar a superfície sólida para remover o grupo protetor clivável; e(i) repetir as etapas (c) a (h) para determinar a sequência de análogos de nucleotídeo incorporados identificados na fita de iniciador crescente.NUCLEOTÍDEOS E NUCLEOSÍDEOS ROTULADOS

[00055] Em uma modalidade preferida, métodos de acordo com a invenção incluem um método de determinar a sequência de um ácido nucleico alvo que compreende (i) adicionar um ácido nucleico alvo a um ou mecanismo de sequenciamento de Sanger ou tipo Sanger, (ii) adicionar um ou mais compostos de acordo com a invenção ao meca-nismo de sequenciamento, com a condição que onde mais de um tipo de base estiver presente, cada base seja ligada a um fluoróforo diferente; (iii) adicionar um iniciador complementar e uma enzima polime- rase, (iv) realizar uma reação de polimerase para incorporar pelo menos um dos compostos da etapa (ii) em uma fita de ácido nucleico crescente, e (v) analisar o resultado da reação de sequenciamento de Sanger com instrumentação de sequenciamento de fluorescência ou por fluorescência de excitação de múltiplas linhas pulsada, em que as etapas (i)-(iii) podem ser realizadas em qualquer ordem.

[00056] Em uma modalidade preferida, a incorporação de pelo menos um compostos de acordo com etapa (iv) é seguida por terminação de crescimento de fita em uma eficiência de cerca de 90% a cerca de 100%. Alternativamente, a incorporação de pelo menos um composto de acordo com a etapa (iv) ocorre em cerca de 70% a cerca de 100% da eficiência de incorporação de um substrato nativo com a mesma base na reação de polimerase, ou mais preferivelmente em cerca de 85% a cerca de 100%.

[00057] Métodos de acordo com a invenção da mesma forma incluem um método de incorporar um componente de ocorrência não natural em um ácido nucleico compreendendo: (i) adicionar um ácido nu- cleico alvo em um mecanismo de sequenciamento; (ii) adicionar um ou mais compostos de acordo com a invenção ao mecanismo de sequen- ciamento, com a condição que onde mais de um tipo de base estiver presente, cada base seja ligada a um fluoróforo diferente; (iii) adicionar uma enzima polimerase; e (iv) realizar uma reação de polimerase para incorporar pelo menos um dos compostos de etapa (ii) em uma fita de ácido nucleico crescente, em que as etapas (i)-(iii) podem ser realizadas em qualquer ordem. O método pode também compreender (v) analisar o resultado da reação de cadeia de polimerase para incorporação de pelo menos um composto de etapa (ii).

[00058] Uma modalidade alternativa da invenção é um método de terminar a síntese de ácido nucleico que compreende a etapa de colocar um nucleotídeo ou nucleosídeo desprotegido 3'-OH de acordo com a invenção no ambiente de uma polimerase e permitir a incorporação do nucleotídeo ou nucleosídeo desprotegido 3'-OH em um ácido nu- cleico. Modalidades preferidas do método têm uma eficiência de terminação na incorporação do nucleotídeo ou nucleosídeo desprotegido 3'- OH que variam de cerca de 90% a cerca de 100%; com a eficiência de incorporação do nucleotídeo ou nucleosídeo desprotegido 3'-OH que varia de cerca de 70% a cerca de 100% comparada à eficiência de in-corporação de um nucleotídeo ou nucleosídeo de ocorrência natural com a mesma base.

[00059] Métodos de realizar o sequenciamento de Sanger ou tipo Sanger que compreende a adição de um composto de acordo com a invenção a um método de sequenciamento de Sanger ou tipo Sanger são da mesma forma abrangidos. Um método de realizar o minisse- quenciamento ou sequenciamento tipo minissequenciamento que compreende a adição de um composto de acordo com a invenção a um método de minissequenciamento ou sequenciamento tipo minisse- quenciamento dentro do escopo da invenção.

Detector de PME

[00060] Em uma modalidade que usa quaisquer dos nucleotídeos e nucleosídeos fotocliváveis e/ou rotulados anteriores, uma excitação múltiplas linhas pulsada ("PME") para detecção de fluorescência cega para cores pode ser usada como descrito em US 2003/0058440 publicada em 27 de março de 2003, ou WO 2003/021212, publicada em 13 de março de 2003. Esta tecnologia fornece a detecção de fluorescência com aplicação para identificação de alta produtividade de SNPs informativos, para diagnóstico mais preciso de doença herdada, melhor prognóstico de suscetibilidades de risco, ou identificação de mutações esporádicas. A tecnologia de PME tem duas vantagens principais que significativamente aumentam a sensibilidade de fluorescência: (1) excitação ideal de todos os fluoroforos no ensaio genômico e (2) detecção “cega para cores", que coleta consideravelmente mais luz que a detecção resolvida de comprimento de onda padrão. Esta tecnologia difere-se significativamente da instrumentação de sequenciamento de DNA que caracteriza a excitação de fonte simples e dispersão de cor para identificação de sequência de DNA. A tecnologia pode ser usada em diagnósticos clínicos, forênsicos, e metodologias de sequencia- mento gerais e terá a capacidade, flexibilidade, e portabilidade de variação de ensaios de variação de sequência alvejados para uma grande maioria da população.

[00061] Em uma modalidade, um aparelho e método para uso na identificação de sequência de DNA de alta produtividade é usado. Um aparelho de excitação de múltiplas linhas de pulso para analisar uma amostra contendo uma ou mais espécies fluorescentes é usado, com-preendendo: um ou mais lasers configurados para emitir duas ou mais linhas de excitação, cada linha de excitação tendo um comprimento de onda diferente; um circuito de cronometragem acoplado à um ou mais lasers e configurados para gerar as duas ou mais linhas de excitação sequencialmente de acordo com um programa de cronometragem para produzir os sinais de emissão de fluorescência correlacionados com tempo da amostra; um detector não dispersivo posicionado para coletar os sinais de emissão de fluorescência correlacionados com o tempo emanando da amostra; e um analisador acoplado ao detector e configurado para associar os sinais de emissão de fluorescência corre-lacionados com o tempo com o programa de cronometragem para identificar os componentes da amostra.

[00062] O detector e o analisador podem ser integrais. Em uma modalidade, as duas ou mais linhas de excitação cruzam-se na amostra, ou as duas ou mais linhas de excitação podem ser configuradas de forma que elas não cruzem-se na amostra. As duas ou mais linhas de excitação podem ser coaxiais. Em uma modalidade, o aparelho pode também compreender uma reunião de um ou mais prismas em relação operativa com o um ou mais lasers e configurado para tornar a radiação das duas ou mais linhas de excitação substancialmente colinear e/ou coaxial. O mecanismo pode ter uma pluralidade de linhas de excitação, por exemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou mais linhas de excitação tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou mais comprimentos de onda de excitação, respectivamente. A amostra pode ser compreendida de uma pluralidade de vasos tais como capilares, por exemplo em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, até 20, até 24, até 28, até 36, até 48, até 64, até 96, até 384 ou mais vasos capilares. Uma cubeta de fluxo de bainha pode ser usada.

[00063] O programa de cronometragem pode compreender um atraso entre o fogo de cada laser dentre cerca de 10 fs e cerca de 5 s,entre cerca de 1 ms e cerca de 100 ms, ou entre cerca de 50 ps e cerca de 500 ps. Uma ou mais das linhas de excitação é pulsada. A linhade excitação pulsada pode ser controlada por lógica de TTL ou pormeios mecânicos ou eletrônicos. Em uma modalidade, o mecanismo pode gerar uma sequência de linhas de excitação discretas que são correlacionados com tempo com os sinais de emissão de fluorescência da amostra. Os lasers podem independentemente compreender um laser de diodo, um laser semicondutor, um laser de gás, tal como um íon de argônio, criptônio, ou laser de hélio-neon, um laser de diodo, um laser em estado sólido tal como um laser de Neodímio que incluirá um meio de ganho de íon, tal como YAG e vanadato de ítrio (YV04), ou um laser em estado sólido bombeado por diodo. Outros dispositivos, que produzem luz em um ou mais comprimentos de onda de excitação discretos, podem da mesma forma ser utilizados no lugar do laser. O laser pode compreender um deslocador de Raman em relação operável com pelo menos um feixe de laser. Em uma modalidade da invenção, o comprimento de onda de excitação fornecido para cada laser é oticamente emparelhado ao comprimento de onda de absorção de cada fluoróforo.

[00064] O detector pode compreender um dispositivo de par carregado, um tubo fotomultiplicador, um fotodiodo de avalanche de silício ou um detector de PIN de silício. A pegada do dispositivo é preferivelmente pequena, tal como menor que 4 ft x 4 ft x 2ft, menor que 1 ft x ft x 2ft, e pode ser tornada tão pequena quanto 2,54 cm x 7,62 cm x 15,24. Outro aspecto compreende um método de identificar componentes de amostra compreendendo: (a) preparar uma amostra que compreende componentes de amostra, um primeiro corante e um se gundo corante; (b) colocar a amostra no caminho do feixe de uma pri-meira linha de excitação e uma segunda linha de excitação; (c) excitar sequencialmente a primeira linha de excitação e a segunda linha de excitação; (d) coletar os sinais de fluorescência das amostras como uma função de tempo; e (e) classificar a fluorescência por cada janela em tempo da linha de excitação, em que os componentes de amostra são identificados. É um aspecto da invenção que os sinais de fluorescência são coletados de períodos de tempo discretos em que nenhuma linha de excitação é incidente na amostra, os períodos de tempo ocorrendo entre a excitação das duas linhas de excitação. Esta técnica é conhecida como "olhando no escuro". Ainda outro aspecto é que o máximo de absorção do primeiro corante corresponde substancialmente ao comprimento de onda de excitação da primeira linha de excitação. O máximo de absorção da segundo corante pode da mesma forma substancialmente corresponder ao comprimento de onda de excitação da segunda linha de excitação. Em ainda outro aspecto há um terceiro e quarto corantes e uma terceira e quarta linhas de excitação, em que os máximos de absorção do terceiro e quarto corantes correspondem substancialmente aos comprimentos de onda de excitação da terceira e quatro linha de excitação, respectivamente. Similarmente, pode haver 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou mais corantes em que os máximos de absorção dos corantes correspondem substancialmente aos comprimentos de onda de excitação de uma 5a, 6a, 7 a, 8 a, 9 a, 10 a, 11 a, 12 a, 13 a, 14 a, ou mais linhas de excitação, respectivamente. Os corantes podem ser uma tintura de zanteno, fluoresceína, rodamina, BODIPY, cianina, cumarina, pireno, ftalocianina, ficobilipro- teína, Alexa, de esquareno, ou algum outro corante adequado.

[00065] Em uma modalidade, componentes de amostra permitem a determinação dos SNPs. O método pode ser para a identificação de alta produtividade de SNPs informativo. Os SNPs podem ser obtidos diretamente do material de DNA genômico, do material amplificado por PCR, ou do material de DNA clonado e podem ser analisados usando um método de extensão de iniciador de nucleotídeo simples. O método de extensão de iniciador de nucleotídeo simples pode compreender usar os dNTPs não rotulados simples, dNTPs rotulados simples, dNTPs 3'-modificado simples, 3'-dNTPs modificados por base simples, alfa-tiodNTS simples ou 2',3'-didesoxinucleotídeos rotulados simples. O método de mini-sequenciamento pode compreender usar os dNTPs não rotulados simples, dNTPs rotulados simples, dNTPs 3'- modificados simples, 3'-dNTPs modificados por base simples, alfa-tio- dNTPs simples ou 2',3'-didesoxinucleotídeos rotulados. Os SNPs podem ser obtidos diretamente do material de DNA genômico, do material amplificado de PCR ou dos materiais de DNA clonados. Da mesma forma considerados são os métodos para detectar ácidos nucleico. Os ácidos nucleicos podem ser detectados in situ ou em vários géis, manchas, e métodos similares para detectar ácidos nucleicos, tais como, descritos na Patente US 7.125.660, que está aqui incorporada por referência.EXEMPLOSNUCLEOTÍDEOS E NUCLEOSÍDEOS ROTULADOS FOTOCLIVÁ- VEISExemplo 1: compostos dASíntese de trifosfato de 3'-O-(2-nitrobenzil)-2'-desoxiadenosina (WW1p108)Esquema. Síntese de 3'-O-(2-nitrobenzil)-2'-desoxiadenosina-5'- trifosfato. (i) TBSCl, imidazol, DMF, temperatura ambiente, durante a noite; Boc2O, DMAP, DMF, temperatura ambiente, durante a noite, 83%; (ii) n-Bu4NF, THF, 0°C, em seguida gradualmente aquecidos em temperatura ambiente, 96%; (iii) TBSCl, imidazol, DMF, 83%; (iv) n- Bu4NOH, NaI, NaOH, CH2Cl2/H2O, brometo de 2-nitrobenzila, tempera- tura ambiente, 91%; (v) SiO2, alto vácuo, 70-80°C, 24 horas, 91%; (vi) n-Bu4NF, THF, 0°C, em seguida gradualmente aquecidos em temperatura ambiente, 23%; (vii) POCl3, (MeO)3PO, menos 20°C; (n- Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; 1 M de HNEt3HCO3, 31%.N6,N6-bis-terc-butiloxicarbonil-3 '.5'-O-bis-terc-butlldimetllsllll-2 - desoxiadenosina (dA.01)

[00066] O composto dA.01 foi sintetizado de acordo com o procedimento descrito por Furrer e Giese1. Uma solução de 2'- desoxiadenosina dA (2,5 g, 10 mmols), imidazol (4,5 g, 66 mmols) e TBSCl (4,82 g, 32 mmols) em DMF anidra (25 mL) foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. Metanol (20 mL) foi adicionado, e a mistura foi agitada durante 20 minutos e em seguida concentrada em vácuo. O resíduo foi dissolvido em DMF anidra (15 mL) seguido pela adição de DMAP (3,66 g, 30 mmols) e Boc2O (6,55 g, 30 mmols). A reação foi agitada em temperatura ambiente durante a noite e em seguida concentrada em vácuo. O resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 (100 mL) e lavado duas vezes com solução de NH4Cl saturada (50 mL cada). A camada aquosa combinada foi extraída com CH2Cl2 (50 mL). A camada orgânica combinada foi em seguida secada em Na2SO4, concentrada em vácuo, e purificada por cromatografia de coluna em sílica- gel para produzir N6,N6-bis-terc-butiloxicarbonil-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiadenosina dA.01 (5,66 g, 83%) como uma es-puma branca.N6.N6-bis-terc-butiloxicarbonil-2'-desoxiadenosina (dA.02)

[00067] Uma solução de Bu4NF (7,85 g, 30 mmols) em THF (30 mL) foi adicionada a uma solução de composto dA.01 (6,78 g, 10 mmols) em THF (30 mL) a 0°C. A mistura reacional foi gradualmente aquecida em temperatura ambiente, agitada durante duas horas, e em seguida concentrada em vácuo. O resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 (100 mL) e lavado duas vezes com solução de NH4Cl saturada (100 mL cada). A camada orgânica foi em seguida secada em Na2SO4, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel, para pro-duzir N6,N6-bis-terc-butiloxicarbonil-2'-desoxiadenosina dA.02 (4,34 g, 96%) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,84 (s, 1 H, H-8), 8,20 (s, 1 H, H-2), 6,41 (dd, 1 H, J = 5,6 Hz e 9,2 Hz, H-1), 4,77 (d, 1 H, H-4), 4,21 (s, 1 H, H- 3), 3,98 (dd, 1 H, H-5'a), 3,80 (m, 1 H, H-5'b), 3,00 (m, 1 H, H-2'a), 2,36 (m, 1 H, H-2'b), 1,47 (s, 18 H, (CH3)3CO).N6,N6-Bis-terc-butiloxicarbonil-5'-O-terc-butil-dimetilsilil-2'-desoxiadenosina (dA.03)

[00068] Uma solução de TBSCl (1,88 g, 12,5 mmols) em DMF anidra (5 mL) foi adicionada a uma solução de composto dA.02 (4,34 g, 9,6 mmols) e imidazol (1,3 g, 19,2 mmols) em DMF anidra (20 mL) a 0°C. A mistura foi gradualmente aquecida em temperatura ambiente e agitada durante dois dias. Água (50 mL) foi adicionada, e a mistura foi extraída três vezes com acetato de etila (40 mL cada). A camada orgânica combinada foi lavada com solução de NH4Cl saturada (50 mL), secada em Na2SO4 e purificada por cromatografia de coluna em sílica- gel, para produzir N6,N6-bis-terc-butiloxicarbonil-5'-O-terc-butil-dimetilsilil-2'-desoxiadenosina dA.03 (4,68 g, 83%) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,84 (s, 1 H, H-8), 8,42 (s, 1 H, H-2), 6,57 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 4,69 (m, 1 H, H-4), 4,10 (m, 1 H, H-3), 3,89 (m, 2 H, H-5'a e H-5'b), 2,70 (m, 1 H, H-2'a), 2,58 (m, 1 H, H-2'b), 1,44 (s, 18 H, (CH3)3CO), 0,91 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,10 (s, 6 H, (CH3)2Si).N6,N6-bis-terc-butiloxicarbonil-5'-O-terc-butildimetilsilil-3'-O-(2- nitrobenzil)-2' -desoxiadenosina (dA. 04)

[00069] Uma solução de composto dA.03 (1,13 g, 2 mmols) em CH2Cl2 (3 mL) foi misturada com uma solução de n-Bu4NOH (0,94 mL, 4 mmols, solução aquosa a 55%) e NaI (20 mg, quantidade catalítica) em NaOH (1 M; 3 mL). À mistura, uma solução de brometo de 2- nitrobenzila (1,3 g, 6 mmols) em CH2Cl2 (2 mL) foi adicionada gota a gota, e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante duas horas no escuro. A camada orgânica foi separada, e a camada aquosa foi extraída duas vezes com CH2Cl2 (10 mL cada). A camada orgânica combinada foi secada em Na2SO4, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel, para produzir N6,N6-bis-terc-butiloxicarbonil-5'-O-terc-butildimetilsilil-3'-O-(2- nitrobenzil)-2'-desoxiadenosina dA.04 (1,28 g, 91%) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,85 (s, 1 H, H-8), 8,43 (s, 1 H, H-2), 8,10 (dd, 1 H, Ph-H), 7,81 (d, 1 H, Ph-H), 7,70 (t, 1 H, Ph-H), 7,51 (t, 1 H, Ph-H), 6,57 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1), 4,98 (dd, 2 H, PhCH2), 4,45 (m, 1 H, H-4), 4,33 (m, 1 H, H-3), 3,90 (m, 2 H, H-5'a e H-5'b), 2,73 (m, 2 H, H-2'a e H-2'b), 1,46 (s, 18 H, (CH3)3CO), 0,91 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,11 (s, 6 H, (CH3)2Si);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C33H49N6O9Si [M+H]+, a massa calculada foi 701.3330, e a massa observada foi 701.3317.5'-O-terc-butildimetilsilil-3'-O-(2-nitrobenzil)-2'-desoxiadenosina (dA.05)

[00070] Sílica-gel 60 (10 g, malha 100-200, ativada por aquecimento a 70-80°C sob pressão reduzida durante 24 horas) foi adicionada a uma solução de composto dA.04 (1,28 g, 1,8 mmol) em CH2Cl2 (50 mL), e a mistura foi evaporada em vácuo até a secura. O resíduo obtido foi aquecido a 70-80°C durante dois dias sob pressão reduzida, lavado três vezes com metanol (50 mL cada) e filtrado usando um funil de buchi. O filtrado combinado foi concentrado em vácuo e purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel para produzir 5'-O-terc- butildimetilsilil-3'-O-(2 -nitrobenzil)-2'-desoxiadenosina dA.05 (0,83 g, 91%) como uma espuma branca. 1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,34 (s, 1 H, H-8), 8,15 (s, 1 H, H-2), 8,09 (d, 1 H, Ph - H), 7,81 (d, 1 H, Ph-H), 7,67 (t, 1 H, Ph-H), 7,47 (t, 1 H, Ph-H), 6,50 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1), 6,03 (bs, 2 H, 6-NH2), 4,96 (dd, 2 H, PhCH2), 4,43 (m, 1 H, H-4), 4,30 (m, 1 H, H-3), 3,88 (m, 2 H, H-5'a e H-5'b), 2,71 (m, 2 H, H-2'a e H-2'b), 0,91 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,10 (s, 6 H, (CH3)2Si);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C23H33N6O5Si [M+H]+, a massa calculada foi 501.2282. e a massa observada foi 501.1702.3'-O-(2-Nitrobenzil)-2'-desoxiadenosina (dA.06)

[00071] Uma solução de n-Bu4NF (314 mg, 1,2 mmol) em THF (1,2 mL) foi adicionada a uma solução de composto dA.05 (400 mg, 0,8 mmol) em THF (3 mL) a 0°C. A mistura reacional foi gradualmente aquecida em temperatura ambiente e agitada durante quatro horas. Metanol (10 mL) foi adicionado para dissolver o precipitado formado durante a reação, seguido pela adição de sílica-gel 60 (1,5 g). A mistura foi evaporada em vácuo até a secura, e o resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel para produzir 3'-O-(2- nitrobenzil)-2'-desoxiadenosina dA.06 (72 mg, 23%) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,35 (s, 1 H, H-8), 8,13 (s, 1 H, H-2), 8,06 (d, 1 H, Ph-H), 7,79 (m, 2 H, Ph-H), 7,60 (m, 1 H, Ph-H), 7,34 (bs, 2 H, 6-NH2, D2O permutável), 6,33 (dd, 1 H, J = 4,8 e 6,8 Hz, H-1), 5,40 (t, 1 H, D2O permutável, 5'-OH)), 4,92 (s, 2 H, PhCH2), 4,36 (m, 1 H, H-4), 4,12 (m, 1 H, H-3), 3,59 (m, 2 H, H-5'a e H-5'b), 2,85 (m, 1 H, H-2'a), 2,54 (m, 1 H, H-2'b);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C17H19N6O5 [M+H]+, a massa calculada foi 387.1417, e a massa observada foi 387.1350. 3'-O-(2-Nitrobenzil)-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato (WWipl08)POCl3 (26 μL, 0,24 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dA.06 (72 mg, 0,18 mmol) em trimetilfosfato (1 mL) e manti- do a menos 20-30°C durante 2,5 horas. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n-butilamônio (427 mg, 0,9 mmol) e tri-n-butilamina (0,2 mL) em DMF anidra (2 mL) foi adicionada. Depois de cinco minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora e em seguida liofilizada até a secura. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado e purificado por cromatografia de permuta de ânion usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de NH4HCO3 (50 mM a 500 mM em 300 minutos) a uma taxa de fluxo de 4,5 mL/minuto. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas para produzir 3'-O-(2-nitrobenzil)-2'- desoxiadenosina-5'-trifosfato WW1pl08 (38 mg, 31%) como um sólido macio branco.1H RMN (400 MHz, D2O): δ 8,50 (s, 1 H, H-8), 8,24 (s, 1 H, H-2), 8,10 (d, 1 H, Ph-H), 7,78 (d, 1 H, Ph-H), 7,62 (m, 1 H, Ph-H), 6,50 (dd, 1 H, J = 6,8 e 8 Hz, H-1), 5,03 (dd, 2 H, Ph-CH2), 4,65 (m, 1 H, H-4), 4,53 (m, 1 H, H-3), 4,22 (m, 2 H, H-5'a e H-5'b), 2,80 (m, 2 H, H-2'a e H-2'b); 31P RMN (162 MHz, D2O): δ -5,54 (d, J = 19,4 Hz), -10,85 (d, J = 19,4 Hz), -21,31 (t, J = 19,4 Hz);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C17H21N6O14P3Na [M+Na]+, a massa calculada foi 649.0226, e a massa observada foi 649.0212.

[00072] O trifosfato também foi purificado usando HPLC preparativa sem detecção por UV para produzir a amostra livre de contaminação do nucleotídeo natural (por exemplo, dATP). A determinação da con-centração da solução de trifosfato foi realizada por medida de UV/VIS usando o coeficiente de extinção de ε260 = 20.800.Síntese de trifosfato de N 6-(2-nitrobenzil)-2'-desoxiadenosina(WW1p129)

Esquema. Síntese de N6-(2-nitrobenzil)-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato. (i) Mg(ClO4)2, THF, 50°C, 68%; (ii) NaH, DMF, brometo de 2- nitrobenzila, 0°C, em seguida gradualmente aquecidos em temperatura ambiente, 49%; (iii) SÍO2, vácuo, 70-80°C, 87%; (iv) n-BU4NF, THF, 43%; (v) POCl3, (MeO)aPO, menos 20-30°C; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; 1 M de HNEt3HCO3; 60%.N6-terc-Butiloxicarbonil-3 \5'- O-bis-terc-butildimetilsilil-2 -desoxiadenosina (dA.07)

[00073] Mg(ClO4)2 (155 mg, 0,7 mmol) foi adicionado a uma soluçãode composto dA.01 (2,36 g, 3,5 mmols) em THF anidroso (35 mL) e agitada durante a noite a 50°C. O solvente foi removido em vácuo, e o produto cru foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel, para produzir N6-terc-butiloxicarbonil-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'- desoxiadenosina dA.07 (1,39 g, 68%) como uma espuma amarela.1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,74 (s, 1 H, H-8), 8,29 (s, 1 H, H-2), 8,24 (s, 1 H, 6-NHBoc), 6,49 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 4,60 (m, 1 H, H- 4), 4,02 (m, 1 H, H-3), 3,86 (dd, 1 H, H-5'a), 3,77 (dd, 1 H, H-5'b), 2,62 (m, 1 H, H-2'a), 2,47 (m, 1 H, H-2'b), 1,54 (s, 9 H, (CH3)3CO), 0,90 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,08 (2 s, 12 H, (CH3)2Si).N6-terc-Butiloxicarbonil-N6-(2-nitrobenzil)-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil- 2-desoxiadenosina (dA.08)

[00074] NaH (5,3 mg, 0,22 mmol, seco) foi adicionado a uma solução de composto dA.07 (116 mg, 0,2 mmol) em DMF anidra (2 mL) a 0°C e agitada durante 30 minutos. Uma solução de brometo de 2- nitrobenzila (43 mg, 0,2 mmol) em DMF anidra (0,5 mL) foi adicionada gota a gota. A mistura foi gradualmente aquecida em temperatura ambiente e agitada durante duas horas. DMF foi removido em vácuo, e o resíduo foi dissolvido em acetato de etila (20 mL), lavado duas vezes com solução de NH4Cl saturada (10 mL cada) e uma vez com água (10 mL). A camada aquosa combinada foi extraída com acetato de eti- la (10 mL), e a camada orgânica combinada foi secada em Na2SO4, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel, para produzir N6-terc-butiloxicarbonil-N6-(2-nitrobenzil)-3',5'- O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiadenosina dA.08 (70 mg, 49%) como um óleo viscoso.1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,69 (s, 1 H, H-8), 8,38 (s, 1H, H-2), 8,05 (dd, 1 H, Ph - H), 7,77 (d, 1 H, Ph-H), 7,56 (m, 1 H, Ph-H), 7,40 (m, 1 H, Ph-H), 6,51 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 5,63 (s, 2 H, Ph-CH2), 4,63 (m, 1 H, H-4), 4,03 (m, 1 H, H-3), 3,87 (m, 1 H, H-5'a), 3,78 (m, 1 H, H-5'b), 2,63 (m, 1 H, H-2'a), 2,46 (m, 1 H, H-2'b), 1,40 (s, 9 H, (CH3)3CO), 0,92 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,10 (2 S, 12 H, (CH3)2Si-);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C34H55N6O7Si2 [M+H]+, a massa calculada foi 715.3671, e a massa observada foi 715.3661. N6-(2-Nitrobenzil)-3',5-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiadenosina (dA.09)

[00075] Sílica-gel 60 (3,5 g, 100-200 mesh, ativada por aquecimento a 70-80°C sob pressão reduzida durante 24 horas) foi adicionada a uma solução de composto dA.08 (325 mg, 0,45 mmol) em CH2Cl2 (20 mL), e a mistura foi evaporada em vácuo até a secura. O resíduo foi aquecido a 70-80°C sob pressão reduzida durante dois dias, lavado três vezes com metanol (20 mL cada) e filtrado usando um funil de bu- chi. O filtrado combinado foi concentrado em vácuo e purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel, para produzir N6-(2-nitrobenzil)- 3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiadenosina dA.09 (238 mg,86%) como uma espuma amarela.1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,37 (s, 1 H, H-8), 8,09 (s, 1 H, H-2), 8,07 (d, 1 H, Ph - H), 7,74 (d, 1 H, Ph-H), 7,56 (m, 1 H, Ph-H), 7,42 (m, 1 H, Ph-H), 6,57 (t, 1 H, 6-NH), 6,44 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 5,19 (bs, 2 H, Ph-CH2), 4,61 (m, 1 H, H-4), 4,00 (m, 1, H, H-3), 3,86 (dd, 1 H, H- 5'a), 3,76 (dd, 1 H, H-5'b), 2,63 (m, 1 H, H-2'a), 2,43 (m, 1 H, H-2'b), 0,91 (s, 18 H, (CH3)3Csi), 0,09 (2 s, 12 H, (CH3)2Si-);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C29H47N6O5Si2 [M+H]+, a massa calculada foi 615.3147, e a massa observada foi 615.2288. N6-(2-Nitrobenzil)-2'-desoxiadenosina (dA. 10)

[00076] Uma solução de n-Bu4NF (216 mg, 0,83 mmol) em THF (1 mL) foi adicionada a uma solução de composto dA.09 (202 mg, 0,33 mmol) em THF (5 mL) a 0°C. A mistura reacional foi gradualmente aquecida em temperatura ambiente e agitada durante duas horas. Sílica-gel 60 (1 g) foi adicionada, e a mistura foi evaporada em vácuo até a secura. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel para produzir N6-(2-nitrobenzil)-2'-desoxiadenosina dA.10 (55 mg, 43%) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,48 (br s, 1 H, D2O permutável, 6- NH), 8,41 (s, 1 H, H-8), 8,16 (s, 1 H, H-2), 8,04 (dd, 1 H, Ph-H), 7,66 (d, 1 H, Ph-H), 7,51 (m, 2 H, Ph-H), 6,35 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 5,32 (d, 1 H, D2O permutável, 3'-OH), 5,17 (t, 1 H, D2O permutável, 5'-OH), 4,97 (bs, 2 H, Ph-CH2), 4,41 (m, 1 H, H-4), 3,87 (m, 1 H, H-3), 3,60 (m, 1 H, H-5'a), 3,52 (m, 1 H, H-5'b), 2,71 (m, 1 H, H-2'a), 2,28 (m, 1 H, H- 2'b);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C17H19N6O5 [M+H]+, a massa calculada foi 387.1417, e a massa observada foi 387.1186.N6-(2-Nitrobenzil)-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato (WW1p129)

[00077] POCl3 (19 μL, 0,2 mmol) foi adicionado a uma solução decomposto dA.10 (52 mg, 0,13 mmol) em trimetilfosfato (0,5 mL) e man-tida a menos 20-30°C durante 2,5 horas. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n-butilamônio (308 mg, 0,65 mmol) e tri-n-butilamina (130 μL) em DMF anidra (1,3 mL) foi adicionada. Depois de cinco minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora e em seguida liofilizada até a secura. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado e purificado por cromatografia de permuta de ânion usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de NH4HCO3 (50 mM a 500 mM em 300 minutos) a uma taxa de fluxo de 4,5 mL/minuto. As frações contendo trifos- fato foram combinadas e liofilizadas para produzir N6-(2-nitrobenzil)-2'- desoxiadenosina-5'-trifosfato WW1p129 (53 mg, 60%) como um sólido macio branco.1H RMN (400 MHz, D2O): δ 8,42 (s, 1 H, H-8), 8,13 (s, 1 H, H-2), 8,09 (d, 1 H, Ph-H), 7,55 (m, 2 H, Ph-H), 7,45 (m, 1 H, Ph-H), 6,46 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 5,05 (bs, 2 H, Ph-CH2), 4,29 (s, 1 H, H-3), 4,21 (m, 2 H, H-5'a e H-5'b), 2,78 (m, 1 H, H-2'a), 2,59 (m, 1 H, H-2'b);31P RMN (162 MHz, D2O): δ -5,86 (d, J = 16,2 Hz), -10,78 (d, J = 16,2 Hz), -19,22 (t, J = 16,2 Hz);

[00078] ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C17H22N6O14P3 [M-H]-,a massa calculada foi 625.0250, e a massa observada foi 625.0231.

[00079] O trifosfato também foi purificado usando HPLC preparativa sem detecção por UV para produzir amostra livre de contaminação do nucleotídeo natural. A determinação da concentração da solução de trifosfato foi realizada por medida de UV/VIS que usa o coeficiente de extinção de ε260 = 20.800.Síntese de trifosfato de N6-(4-metóxi-2-nitrobenzil)-2'-desoxiadenosina(WW2p005)

Esquema. Síntese de N6-(4-metóxi-2-nitrobenzil)-2'-desoxiadenosina- 5'-trifosfato.(i) NaH, DMF, brometo de 4-metóxi-2-nitrobenzila, 0°C, em seguida gradualmente aquecidos em temperatura ambiente, 64%; (ii) SiO2, alto vácuo, 70-80°C, 24 horas, 84%; (iii) n-Bu4NF, THF, 99%; (iv) POCl3, (MeO)3PO, menos 20-30°C; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; 1 M de HNEt3 HCO3; 40%.N6-terc-Butiloxicarbonil-N6-(4-metóxi-2-nitrobenzil)-3',5'-O- bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiadenosina (dA.11)

[00080] NaH (26 mg, 1,1 mmol, seco) foi adicionado a uma solução de composto dA.07 (580 mg, 1,0 mmol) em DMF anidra (5 mL) a 0°C e agitada durante 45 minutos. Uma solução de brometo de 4-metóxi-2- nitrobenzila (260 mg, 1,05 mmol) em DMF anidra (1,0 mL) foi adicionada gota a gota. A mistura foi gradualmente aquecida em temperatura ambiente e agitada durante a noite. DMF foi removida em vácuo, e o resíduo foi dissolvido em acetato de etila (50 mL) e lavado duas vezes com solução de NH4Cl saturada (30 mL cada). A camada aquosa combinada foi extraída com acetato de etila (20 mL), e a camada orgâni-ca combinada foi secada em Na2SO4, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel, para produzir N6-terc- butiloxicarbonil-N6-(4-metóxi-2-nitrobenzil)-3',5'-O-bis-terc-butil-dimetilsilil-2'-desoxiadenosina dA.11 (480 mg, 64%) como um óleo vis-coso.1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,68 (s, 1 H, H-8), 8,37 (s, 1 H, H-2), 7,66 (d, 1 H, J = 8,7 Hz, Ph-H), 7,55 (d, 1 H, J = 2,7 Hz, Ph-H), 7,10 (dd, 1 H, J = 2,7 e 8,7 Hz, Ph - H), 6,51 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 5,55 (s, 2 H, Ph-CH2), 4,63 (m, 1 H, H-4), 4,03 (m, 1 H, H-3), 3,87 (m, 1 H, H-5'a), 3,84 (s, 3 H, OCH3), 3,78 (m, 1 H, H-5'b), 2,63 (m, 1 H, H-2'a), 2,44 (m, 1 H, H-2'b), 1,41 (s, 9 H, (CH3)3CO), 0,92 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,10 (2 s, 12 H, (CH3)2Si-);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C35H57N6O8Si2 [M+H]+, a massa calculada foi 745.3776, e a massa observada foi 745.3782. N6-(4-Metóxi-2-nitrobenzil)-3 '.5'-O-bis-terc-butlldimetllsllll-2 - desoxiadenosina (dA.12)

[00081] Sílica-gel 60 (5 g, 100-200 mesh, ativada por aquecimento a 70-80°C sob pressão reduzida durante 24 horas) foi adicionada a uma solução de composto dA.11 (530 mg, 0,71 mmol) em CH2Cl2 (30 mL), e a mistura foi evaporada em vácuo até a secura. O resíduo foi aquecido a 70-80°C sob pressão reduzida durante dois dias, lavado três vezes com metanol (20 mL cada) e filtrado usando um funil de bu- chi. O filtrado combinado foi concentrado em vácuo e purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel, para produzir N6-(4-metóxi-2- nitrobenzil)-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiadenosina dA.12(385 mg, 84%) como uma espuma amarela.1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,37 (s, 1 H, H-8), 8,08 (s, 1 H, H-2), 7,66 (d, 1 H, J = 8,5 Hz, Ph-H), 7,57 (m, 1 H, J = 2,7 Hz Ph-H), 7,09 (dd, 1 H, J = 2,7 e 8,7 Hz Ph - H), 6,52 (t, 1 H, 6-NH), 6,43 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 5,07 (bs, 2 H, Ph-CH2), 4,60 (m, 1 H, H-4), 4,00 (m, 1 H, H-3), 3,87 (m, 1 H, H-5'a), 3,85 (s, 3 H, OCH3), 3,76 (dd, 1 H, H-5'b), 2,62 (m, 1 H, H-2'a), 2,43 (m, 1 H, H-2'b), 0,91 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,09 (2 s, 12 H, (CH3)2Si-);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C30H48N6O6Si2 [M+H]+, a massa calculada foi 645.3252, e a massa observada foi 645.3248. N6-(4-Metóxi-2-nitrobenzil)-2'-desoxiadenosina (dA.13)

[00082] Uma solução de n-Bu4NF (353 mg, 1,35 mmol) em THF (2 mL) foi adicionada a uma solução de composto dA.12 (350 mg, 0,54 mmol) em THF (5 mL) a 0°C. A mistura reacional foi gradualmente aquecida em temperatura ambiente e agitada durante quatro horas. Sílica-gel 60 (1,5 g) foi adicionada, e a mistura foi evaporada em vácuo até a secura. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel para produzir N6-(4-metóxi-2-nitrobenzil)-2'-desoxiadenosina dA.13 (225 mg, 99%) como uma espuma amarela.1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,40 (bs, 1 H, D2O permutável, 6- NH), 8,39 (s, 1, H, H-8), 8,15 (s, 1 H, H-2), 7,54 (d, 1 H, J = 2,7 Hz, Ph- H), 7,44 (d, 1 H, J = 8,2 Hz, Ph-H), 7,24 (d, 1 H, J = 2,7 e 8,7 Hz, Ph- H), 6,33 (t, 1 H, J = 6,7 Hz, H-1), 5,32 (d, 1 H, D2O permutável, 3'-OH), 5,17 (t, 1 H, D2O permutável, 5'-OH), 4,88 (bs, 2 H, Ph-CH2), 4,40 (m, 1 H, H-4), 3,87 (m, 1 H, H-3), 3,81 (s, 3 H, OCH3), 3,60 (m, 1 H, H-5'a), 3,52 (m, 1 H, H-5'b), 2,70 (m, 1 H, H-2'a), 2,26 (m, 1 H, H-2'b);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C18H21N6O6 [M+H]+, a massa calculada foi 417.1523, e a massa observada foi 417.1458.N6-(4-Metóxi-2-nitrobenzil)-2'-desoxiadenosina-5'-trífosfato (WW2p005)

[00083] POCl3 (19 μL, 0,2 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dA.13 (42 mg, 0,1 mmol) em trimetilfosfato (0,5 mL) e mantida a menos 20-30°C durante três horas. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n-butilamônio (237 mg, 0,5 mmol) e tri-n-butilamina (100 μL) em DMF anidra (1 mL) foi adicionada. Depois de cinco minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora e em seguida liofilizada até a secura. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado e purificado por cromatografia de permuta de ânion usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de NH4HCO3 (50 mM a 500 mM em 300 minutos) a uma taxa de fluxo de 4,5 mL/minuto. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas para produzir N6-(4-metóxi-2-nitrobenzil)- 2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato WW2p005 (28 mg, 40%) como um sólido macio branco.1H RMN (400 MHz, D2O): δ 8,41 (s, 1 H, H-8), 8,17 (s, 1 H, H-2), 7,64(d, 1 H, J = 2,7 Hz, Ph-H), 7,47 (d, 1 H, J = 8,7 Hz, Ph-H), 7,15 (d, 1 H,J = 2,7 e 8,7 Hz, Ph-H), 6,46 (t, 1 H, J = 6,7 Hz, H-1), 4,97 (bs, 2 H,Ph-CH2), 4,29 (s, 1 H, H-3), 4,20 (m, 2 H, H-5'a e H-5'b), 3,84 (s, 3 H,OCH3), 2,80 (m, 1 H, H-2'a), 2,60 (m, 1 H, H-2'b);31P RMN (162 MHz, D2O): δ -5,97 (d, J = 19,9 Hz), -11,07 (d, J = 19,3 Hz), -21,76 (t, J = 19,3 Hz);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C18H21N6O15P3Na [M- 2H+ Na]-, a massa calculada foi 677.0175, e a massa observada foi 677.0197.

[00084] O trifosfato também foi purificado usando HPLC preparativa sem detecção por UV para produzir amostra livre de contaminação do nucleotídeo natural. A determinação da concentração da solução de tri- fosfato foi realizada por medida de UV/VIS usando o coeficiente de extin-ção de £260 = 20.800. Síntese de trifosfato de N6-[4-(3-amino-1-propil)-2-nitrobenzil]-2‘-desoxiadenosina rotulado por 6-FAM (WW2p055)

Esquema. Síntese de trifosfato N6-[4-(3-amino-1-propil)-2-nitrobenzil]- 2'-desoxiadenosina rotulado por 6-FAM. (i) NaH, DMF, brometo de 4- iodo-2-nitrobenzila, 0°C, em seguida gradualmente aquecidos em temperatura ambiente, 61%; (ii) PdCl2(PPh3)2, CuI, Et3N, THF, refluxo, 94%; (iii) SiO2, vácuo, 70-80°C, 82%; (iv) n-Bu4NF, THF, 0°C, em se- guida gradualmente aquecidos em temperatura ambiente, 33%; (v) POCl3, esponja de próton, (MeO)3PO, menos 20-30°C, duas horas; (n- Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF, dois minutos; 1 M de HNEt3HCO3, uma hora; NH4OH, uma hora; 72%; (vi) 6-FAM-SE, 0,1 M de NaHCO3/NaCO3, pH 9,2.N6-terc-Butiloxicarbonil-N6-(4-iodo-2-nitrobenzil)-3',5'-O-bis-terc- butildimetilsilil-2'desoxiadenosina (dA.14)

[00085] NaH (40 mg, 1,66 mmol, seco) foi adicionado a uma solução de composto dA.07 (875 mg, 1,51 mmol) em DMF anidra (10 mL) a 0°C e agitada durante 45 minutos. Uma solução de brometo de 4- iodo-2-nitrobenzila (516 mg, 1,51 mmol) em DMF anidra (2 mL) foi adicionada gota a gota. A mistura foi gradualmente aquecida em temperatura ambiente e agitada durante quatro horas. DMF foi removida em vácuo, e o resíduo foi dissolvido em acetato de etila (50 mL), lavado com solução de NH4Cl saturada (30 mL) e lavado duas vezes com água (30 mL cada). A camada aquosa combinada foi extraída com acetato de etila (20 mL), e a camada orgânica combinada foi secada em Na2SO4, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel, para produzir N6-terc-butiloxicarbonil-N6-(4-iodo- 2-nitrobenzil)-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'desoxiadenosina dA.14 (777 mg, 61%) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,66 (s, 1 H, H-8), 8,38 (s, 1 H, H-2), 8,34 (d, 1 H, J = 1,1 Hz, Ph-H), 7,85 (dd, 1 H, J = 1,1 e 8,3 Hz, Ph-H), 7,50 (d, 1 H, J = 8,3 Hz, Ph-H), 6,50 (t, 1 H, J = 6,3 Hz, H-1), 5,54 (s, 2 H, Ph-CH2), 4,63 (m, 1 H, H-3), 4,03 (m, 1 H, H-4), 3,87 (m, 1 H, H-5'a), 3,78 (m, 1 H, H-5'b), 2,62 (m, 1 H, H-2'a), 2,46 (m, 1 H, H-2'b), 1,41 (s, 9 H, (CH3)3CO), 0,92 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,10 (2 s, 12 H, (CH3)2Si).N6-terc-Butiloxicarbonil-N6-[4-(3-trifluoroacetamido-1-propinil)-2- nitrobenzil]-3', 5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiadenosina (dA.15)

[00086] Sob uma atmosfera de N2, uma mistura de composto dA.14 (730 mg, 0,87 mmol), N-propargiltrifluoroacetamida (183 mg, 1,2mmol), CuI (33 mg, 0,17 mmol), cloreto de bis(trifenilfosfina)paládio(II) (61 mg, 0,087 mmol) e Et3N (1,6 mL, 11,57 mmols) em THF anidroso (7,5 mL) foi refluxada durante seis horas no escuro. A mistura foi concentrada em vácuo, e o resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel, para produzir N6-terc-butiloxicarbonil-N6-[4-(3- trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrobenzil]-3',5'-O-bis-terc- butildimetilsilil-2'-desoxiadenosina dA.15 (706 mg, 94%) como uma espuma amarela.1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,67 (s, 1 H, H-8), 8,39 (s, 1 H, H-2), 8,06 (d, 1 H, J = 1,5 Hz, Ph-H), 7,73 (d, 1 H, J = 8,2 Hz, Ph-H), 7,56 (dd, 1 H, J = 1,5 e 8,2 Hz, Ph - H), 7,28 (br s, 1 H, NH), 6,51 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 5,59 (s, 2 H, Ph-CH2), 4,63 (m, 1 H, H-3), 4,37 (m, 2 H, CH2), 4,03 (m, 1 H, H-4), 3,87 (m, 1 H, H-5'a), 3,78 (m, 1 H, H-5'b), 2,63 (m, 1 H, H-2'a), 2,48 (m, 1 H, H-2'b), 1,40 (s, 9 H, (CH3)3CO), 0,92 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,10 (2 s, 12 H, ((CH3)2Si-).N6-[4-(3-Trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrobenzil]-3',5'-O-bis-terc- butildimetilsilil-2'-desoxiadenosina (dA.16)

[00087] Sílica-gel 60 (3,5 g, malha 100-200, ativada por aquecimentoa 70-80°C sob pressão reduzida durante 24 horas) foi adicionada a uma solução de composto dA.15 (507 mg, 0,59 mmol) em CH2Cl2 (30 mL), e a mistura foi evaporada em vácuo até a secura. O resíduo foi aquecido a 70-80°C sob pressão reduzida durante 42 horas, lavado três vezes com metanol (20 mL cada) e filtrado usando um funil de buchi. O filtrado com-binado foi concentrado em vácuo e purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel, para produzir N6-[4-(3-trifluoroacetamido-1-propinil)-2- nitrobenzil]-3',5'-O-bis-terc-butildimetil-silil-2'-desoxiadenosina dA.16 (366 mg, 82%) como uma espuma amarela.1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,35 (s, 1 H, H-8), 8,12 (s, 1 H, H-2), 8,05 (d, 1 H, J = 1,3 Hz, Ph-H), 7,66 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, Ph-H), 7,48 (dd, 1 H, J = 1,3 e 8,0 Hz, Ph - H), 7,20 (bs, 1 H, NH), 6,54 (t, 1 H, NH), 6,44 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 5,16 (bs, 2 H, Ph-CH2), 4,61 (m, 1 H, H- 4), 4,39 (d, 2 H, CH2), 4,00 (m, 1 H, H-3), 3,87 (m, 1 H, H-5'a), 3,78 (m, 1 H, H-5'b), 2,62 (m, 1 H, H-2'a), 2,44 (m, 1 H, H-2'b), 1,40 (s, 9 H, (CH3)3CO), 0,91 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,09 (2 S, 12 H, (CH3)2Si-).N6-[4-(3-Trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrobenzil]-2'-desoxiadenosina (dA.17)

[00088] Uma solução de n-Bu4NF (282 mg, 1,08 mmol) em THF (2 mL) foi adicionada a uma solução de composto dA.16 (330 mg, 0,43 mmol) em THF (5 mL) a 0°C. A mistura reacional foi gradualmente aquecida em temperatura ambiente e agitada durante duas horas. Metanol (5 mL) e sílica-gel 60 (2 g) foram adicionados, e a mistura foi evaporada em vácuo até a secura. O resíduo foi purificado por croma- tografia de coluna em sílica-gel para produzir N6-[4-(3-trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrobenzil]-2'-desoxiadenosina dA.17 (75 mg, 33%) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 10,08 (t, 1 H, D2O permutável, NH), 8,50 (br s, 1, H, D2O permutável, NH), 8,42 (s, 1 H, H-8), 8,16 (s, 1 H, H-2), 8,06 (d, 1 H, J = 1,6 Hz, Ph-H), 7,71 (dd, 1 H, J = 1,6 e 8,1 Hz, Ph-H), 7,51 (m, 1 H, Ph-H), 6,35 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 5,30 (d, 1 H, D2O permutável, 3'-OH), 5,13 (br s, 1 H, D2O permutável, 5'-OH), 4,96 (br s, 2 H, Ph-CH2), 4,41 (m, 1 H, H-4), 4,29 (d, 2 H, CH2), 3,87 (m, 1 H, H-3), 3,60 (m, 1 H, H-5'a), 3,51 (m, 1 H, H-5'b), 2,72 (m, 1 H, H - 2'a), 2,27 (m, 1 H, H-2'b).N6-[4-{3-Amino-1-propil)-2-nitrobenzil]-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato(dA.18)

[00089] POCl3 (8,5 μL, 0,09 mmol) foi adicionado a uma solução decomposto dA.17 (32 mg, 0,06 mmol) e esponja de próton (19 mg, 0,09 mmol) em trimetilfosfato (0,5 mL) e mantida a menos 20-30°C durante duas horas. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n-butilamônio (142 mg, 0,3 mmol) e tri-n-butilamina (60 μL) em DMF anidra (0,6 mL) foi adicionado. Depois de dois minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH 7,5; 5 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente, seguida pela adição gota a gota de hidróxido de amônio concentrado (10 mL, 27%) a 0°C. A mistura foi agitada durante uma hora adicional em temperatura ambiente, e em seguida liofilizada até a secura. O resíduo obtido foi dissolvido em água (10 mL), filtrado e purificado por cromatografia de permuta de ânion usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de NH4HCO3 (50 mM a 500 mM em 300 minutos) a uma taxa de fluxo de 4,5 mL/minuto. As frações contendo trifos- fato foram combinadas e liofilizadas para produzir trifosfato dA.18 (31 mg, 72%) como um sólido macio branco.1H RMN (400 MHz, D2O): δ 8,47 (s, 1 H, H-8), 8,23 (s, 1 H, Ph-H), 8,20 (s, 1 H, H-2), 7,65 (d, 1 H, J = 8,2 Hz, Ph-H), 7,57 (d, 1 H, J = 8,2 Hz, Ph-H), 6,52 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1), 5,14 (br s, 2 H, Ph-CH2), 4,31 (s, 1 H, H-4), 4,21 (m, 2 H, H-5'a e H-5'b), 3,60 (s, 2 H, CH2), 2,82 (m, 1 H, H-2'a), 2,62 (m, 1 H, H-2'b);31P RMN (162 MHz, D2O): δ -5,43 (d, J = 15,4 Hz), -10,46 (d, J = 15,6 Hz), -18,85 (t, J = 15,6 Hz);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C20H23N7O14P3 [M-H]-, a massa calculada foi 678.0516. e a massa observada foi 678.0857. N6-[4-(3-Amino-1-propil)-2-nitrobenzil]-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato rotulado por 6-FAM (WW2p055)

[00090] Uma solução de 6-FAM-SE (6,7 mg, 0,014 mmol) em DMSO anidroso (70 μL) foi adicionado uma solução de trifosfato dA.18 (4,4 μmol) em tampão de Na2CO3/NaHCO3 (0,1 M, pH 9,2; 3 mL) e incubada em temperatura ambiente durante uma hora. A reação foi purificada por HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD- 300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir o trifosfato rotulado por 6-FAM WW2p055 (2,6 mg, 49%). Fase móvel: A, 100 mM de acetato de trieti- lamônio (TEAA) em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). A eluição foi realizada com um gradiente linear de 5-20% de B durante 20 minutos, e em seguida 20-90% de B durante 20 minutos. A concentração de WW2p055 foi estimada por espec- troscopia de adsorção usando o coeficiente de extinção do corante de 6-FAM (isto é, 68.000 a 494 nm).31P RMN (162 MHz, D2O): δ -5,87 (d, J = 19,8 Hz), -11,01 (d, J = 19,1 Hz), -21,76 (t, J = 19,8 Hz);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C41H35N7O20P3 [M+H]+, a massa calculada foi 1038.1150, e a massa observada foi 1138.1281. Síntese de trifosfato de N6 -[4-(3-amino-1-propil)-2-nitrobenzil]-2'deóxi- adenosina rotulado por 5(6)-SFX (WW2p052)

Esquema. Síntese de trifosfato de N6-[4-(3-amino-1-propil)-2- nitrobenzil]-2'-desoxiadenosina rotulado por 5(6)-SFX. (i) 5(6)-SFX, 0,1 M de NaHCO3/NaCO3, pH 9,2.N6-[4-(3-Amino-1-propil)-2-nitrobenzil]-2'desoxiadenosina-5'-trifosfato rotulado por 5(6)-SFX (WW2p052)

[00091] Uma solução de 5(6)-SFX (1,5 mg, 2,55 μmol) em DMSO anidro (30 μL) foi adicionada a uma solução de trifosfato dA.18 (0,54 μmol) em tampão de Na2CO3/NaHCO3 (0,1 M, pH 9,2; 0,8 mL) e incubada em temperatura ambiente durante uma hora. A reação foi purificada por HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD- 300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir o trifosfato rotulado por 5(6)-SFX WW2p052. Fase móvel: A, 100 mM de acetato de trietilamônio (TEAA) em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). A eluição foi realizada com um gradiente linear de 5-20% de B durante 20 minutos e em seguida 20-90% de B durante 20 minutos. A concentração de WW2p052 foi estimada por espectroscopia de adsorção usando o coeficiente de extinção do corante de 6-FAM (isto é, 68.000 a 494 nm).Síntese de trifosfato de N6 -[1-(2-nitrofenil)etil]-2'-desoxiadenosina(WW3p006)

Esquema. Síntese de trifosfato de N6-[1-(2-nitrofenil)etil]-2'-desoxiadenosina(i) 1-(2-nitrofenil)etilamina, BOP, DIPEA, DMF, temperatura ambiente, durante a noite, 42%; (ii) POCl3, esponja de próton, (MeO)3PO, 0°C, duas horas; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF, cinco minutos; 1 M de HNEt3HCO3, uma hora.N6-[1-(2-Nitrofenil)etil]-2'-desoxiadenosina (dA.19)

[00092] Em uma suspensão de 2'-desoxiinosina (100 mg, 0,4 mmol) e hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)fosfônio (BOP, 210 mg, 0,48 mmol) em DMF anidra (1 mL), N,N-di-isopropiletilamina (100 μL, 0,6 mmol) foi adicionada seguida pela adição de uma solução de 1-(2-nitrofenil)etilamina (250 mg, 1,51 mmol) em DMF (1 mL). A rea-ção foi agitada em temperatura ambiente durante 64 horas. Sílica-gel 60 (1 g, malha 60-200) foi adicionada, e a mistura foi evaporada em vácuo até a secura. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em sí-lica-gel para produzir N6-[1-(2-nitrofenil)etil]-2'-desoxiadenosina dA.19 (67 mg, 42%, mistura 1:1 de diastereômeros) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para diastereômeros: δ 8,68 (br s, 1 H, D2O permutável, NH), 8,42 (br s, 1 H, H-8), 8,16 e 8,06 (2 s, 1 H, H-2), 7,88 (m, 2 H, Ph-H), 7,69 (m, 1 H, Ph-H), 7,46 (m, 1 H, Ph-H), 6,34 (m, 1 H, H-1), 5,79 (m, 1 H, Ph-CH), 5,32 (br s, 1 H, D2O permutável, 3'- OH), 5,16 (br s, 1 H, D2O permutável, 5'-OH), 4,42 (m, 1 H, H-3), 3,88 (m, 1 H, H-4), 3,61 (m, 1 H, H-5'a), 3,53 (m, 1 H, H-5'b), 2,71 (m, 2 H, H-2'a), 2,25 (m, 1 H, H-2'b), 1,68 (d, 3 H, J = 6,8 Hz, CH3)N6-[1-(2-Nitrofenil)etil]-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato (WW3p006)

[00093] Composto dA.19 (30 mg, 0,075 mmol) e esponja de próton (32 mg, 0,15 mmol) foram evaporados três vezes a partir de piridina anidra (2 mL) e dissolvidos em trimetilfosfato (0,5 mL). POCl3 (10,5 μL, 0,11 mmol) foi adicionado, e a mistura foi agitada durante duas horas a 0°C. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n-butilamônio (178 mg, 0,38 mmol) e tri-n-butilamina (75 μL) em DMF anidra (0,75 mL) foi adicionada. Depois de cinco minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente, e em seguida liofilizada até a secura. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado, e parte da solução foi purificada com HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD-300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir N6-[1-(2- nitrofenil)etil]-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato WW3p006 (mistura 1:1 de diastereômeros). Fase móvel: A, 100 mM de acetato de trietilamô- nio (TEAA) em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). A eluição foi realizada com um gradiente linear de 5-50% de B durante 40 minutos e em seguida 50-90% de B durante 10 minutos.1H RMN (400 MHz, D2O) para diastereômeros: δ 8,47 (s, 1 H, H-8), 8,1 2 (2 s, 1 H, H-2), 8,02 (d, 1 H, J = 8,2 Hz, Ph-H), 7,78 (d, 1 H, J = 7,8 Hz, Ph-H), 7,67 (t, 1 H, J = 7,6 Hz, Ph-H), 7,49 (t, 1 H, J = 8,1 Hz, Ph- H), 6,49 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 5,89 (bs, 1 H, Ph-CH), 4,29 (m, 1 H, H-4), 4,23 - 4,15 (m, 2 H, H-5'a e H-5'b), 2,81 (m, 1 H, H-2'a), 2,58 (m, 1 H, H-2'b), 1,74 (d, 3 H, J = 6,8 Hz, CH3);31P RMN (162 MHz, D2O) para diastereômeros: δ -5,65 (m), -10,52 (d, J = 19,6 Hz), -21,32 (m);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C18H21N6O14P3Na [M- 2H+Na]-, a massa calculada foi 661.0226, e a massa observada foi 661.0492.Síntese de trifosfato de N6-(1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]etil}-2- desoxiadenosina rotulado por 6-FAM (WW3p015)

Esquema. Síntese de trifosfato de N6-{1-[4-(3-amino-1-propinil)-2- nitrofenil ]etil}-2'-desoxiadenosina rotulado por 6-FAM. (i) 1-(4-Iodo-2- nitrofenil) etilamina, BOP, DIPEA, DMF, temperatura ambiente, 65%; (ii) N-propargiltrifluoroacetamida, Pd(PPh3)4(0), CuI, Et3N, DMF anidra, 4,5 horas, 94%; (iii) POCl3, esponja de próton, (MeO)3PO, 0°C, duas horas; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF, cinco minutos; 1 M de HNEt3HCO3, uma hora; NH4OH, uma hora; (iv) 6-FAM-SE, 0,1 M de NaHCO3/Na2CO3, pH 9,2, uma hora.N6-[1-(4-Iodo-2-nitrofenil)etil]-2'-desoxiadenosina (dA.20)

[00094] Em uma suspensão de 2'-desoxiinosina (150 mg, 0,6 mmol) e hexafluorofosfonato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)fosfônio (BOP, 379 mg, 0,86 mmol) em DMF anidra (1,5 mL), N,N-di- isopropiletilamina (186 μL, 1,1 mmol) foi adicionada seguida pela adição de uma solução de 1-(4-iodo-2-nitrofenil)etilamina (460 mg, 1,57 mmol) em DMF anidra (0,5 mL). A mistura foi agitada sob atmosfera de nitrogênio durante 48 horas. DMF foi removida em vácuo, e o produto cru foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel para produzir N6- [1-(4-iodo-2-nitrofenil)etil]-2'-desoxiadenosina dA.20 (204 mg, 65%, mis-tura 1:1 de diastereômeros) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para diastereômeros: δ 8,72 (br m, 1 H, D2O permutável, NH), 8,42 (br s, 1 H, H-8), 8,20 (s, 1 H, H-2), 8,06 (m, 2 H, Ph-H), 7,65 (m, 1 H, Ph-H), 6,34 (m, 1 H, H-1), 5,70 (br s, 1 H, PhCH), 5,32 (br s, 1 H, D2O, trocável, 3'-OH), 5,15 (br m, 1 H, D2O permutável, 5'-OH), 4,42 (m, 1 H, H - 4'), 3,88 (m, 1 H, H-3), 3,61 (m, 1 H, H-5'a), 3,53 (m, 1 H, H-5'b), 2,71 (m, 1 H, H-2'a), 2,25 (m, 1 H, H- 2'b), 1,65 (d, 3 H, J = 6,9 Hz, CH3);13C RMN (100 MHz, MeOH-d4) para diastereômeros: δ 153,39 (CH), 151,94 (C), 150,65 (C), 143,44 (CH), 141,82 (C), 141,40 (C),133,77/133,69 (CH), 130,55/130,52 (CH), 121,37 (C), 92,09 (C), 91,87 (C), 89,97 (CH), 87,21 (CH), 73,18/73,15 (CH), 65,78/65,76 (CH2), 47,12 (CH), 41,62 (CH2), 37,14/37,10 (CH3);ES-MS (ESI): m/e 525 [M-H]-.N6-{1-[4-(3- Trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrofenil]etil}-2 - desoxiadenosina (dA.21)

[00095] Uma solução de composto dA.20 (108 mg, 0,21 mmol), N- propargiltrifluoroacetamida (127 mg, 0,84 mmol), CuI (11 mg, 0,06 mmol), tetracis(trifenilfosfina)-paládio(0) (33 mg, 0,03 mmol) e Et3N (80 μL, 0,56 mmol) em DMF anidra (1,5 mL) foi agitada em temperatura ambiente durante quatro horas e meia. A mistura foi concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel para produzir N6-{1-[4-(3-trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrofenil]etil(-2'-desoxiadenosina dA.21 (106 mg, 94%, mistura 1:1 de diastereômeros) como um sólido ceroso.1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para diastereômeros: δ 10,10 (br m, 1 H, D2O permutável, NH), 8,71 (br m, 1 H, D2O permutável, NH), 8,43 (br s, 1 H, H-8), 8,15 e 8,06 (2 s, 1 H, H-2), 7,93 (s, 1 H, Ph-H), 7,86 (m, 1 H, Ph-H), 7,75 (m, 1 H, Ph-H), 6,35 (br m, 1 H, H-1), 5,73 (br m, 1 H, Ph-CH), 5,31 (br s, 1 H, D2O permutável, 3'-OH), 5,15 (br m, 1 H, D2O permutável, 5'-OH), 4,40 (m, 1 H, H-4), 4,31 (d, 2 H, J = 5,3 Hz, CH2), 3,88 (m, 1 H, H-3), 3,62 (m, 1 H, H-5'a), 3,51 (m, 1 H, H-5'b), 2,71 (m, 1 H, H-2'a), 2,25 (m, 1 H, H-2'b), 1,67 (d, 3 H, J = 6,8 Hz, CH3);13C RMN (100 MHz, MeOH-d4) para diastereômeros: δ 157,85/157,48 (C), 152,26 (CH), 149,50 (C), 140,27 (C), 136,04 (CH), 128,02 (CH), 127,07 (CH), 122,56 (C), 120,25 (C), 117,81 (C), 114,96 (C), 88,85 (CH), 86,08 (CH), 85,81 (C), 80,67 (C), 72,07/72,04 (CH), 62,66/62,63 (CH2), 48,30 (CH), 40,47 (CH2), 29,46 (CH2), 24,26 (CH3);N6-{1 -[4-(3-A mino-1 -propinil) -2-nitrofenil]etil}-2 '-desoxiadenosina-5 - trifosfato (dA.22)

[00096] Composto dA.21 (44 mg, 0,08 mmol) e esponja de próton (34 mg, 0,16 mmol) foram evaporados três vezes a partir de piridina anidrosa (2 mL) e dissolvidos em trimetilfosfato (0,5 mL). POCl3 (11 μL, 0,12 mmol) foi adicionado, e a mistura foi agitada durante duas horas a 0°C. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n-butilamônio (190 mg, 0,4 mmol) e tri-n- butilamina (80 μL) em DMF anidra (0,8 mL) foi adicionada. Depois de cinco minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente, e em seguida liofilizada até a secura. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado, e parte da solução foi purificada com HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD- 300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir N6-{1-[4-(3-trifluoroacetamido-1- propinil)-2-nitrofenil]etil}-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato. Fase móvel: A, 100 mM de acetato de trietilamônio (TEAA) em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). A purificação por HPLC foi obtida usando um gradiente linear de 5-50% de B durante 20 minutos, e em seguida 50-90% de B durante 10 minutos. N6-{1-[4-(3-trifluoro- acetamido-1-propinil)-2-nitrofenil]etil}-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato foi em seguida tratado com hidróxido de amônio concentrado (1 mL, 27%) em temperatura ambiente durante uma hora para produzir N6-{1- [4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]etil}-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato dA.22 (mistura 1:1 de diastereômeros).1H RMN (400 MHz, D2O): δ 8,45 (s, 1 H, H-8), 8,08 (2 s, 1 H, H-2), 7,95 (s, 1 H, Ph-H), 7,65 (m, 1 H, Ph-H), 7,53 (m, 1 H, Ph-H), 6,45 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 5,80 (br s, 1 H, Ph-CH), 4,28 (s, 1 H, H-4), 4,18 (m, 2 H, H-5'a e H-5'b), 3,64 (s, 2 H, CH2), 2,78 (m, 1 H, H-2'a), 2,57 (m, 1 H, H- 2'b), 1,69 (d, 3 H, J = 6,8 Hz, CH3);31P RMN (162 MHz, D2O): δ -5,29 (d, J = 20,1 Hz), -10,45 (d, J = 19,1 Hz), -21,08 (t, J = 19,6 Hz);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C21H25N7O14P3 [M-H]-, a massa calculada foi 692.0672 e a massa observada foi 692.0757. N6-{1 -[4-(3-A mino-1 -propinil) -2-nitrofenil]etil}-2 '-desoxiadenosina-5 - trifosfato rotulado por 6-FAM (WW3p015)

[00097] Uma solução de 6-FAM-SE (1,5 mg, 3,15 μmol) em DMSO anidroso (30 μL) foi adicionada a uma solução de trifosfato dA.22 (0,34 μmol) em tampão de Na2CO3/NaHCO3 (0,1 M, pH 9,2; 100 μL) e incubada em temperatura ambiente durante uma hora. A reação foi purificada por HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD- 300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir o trifosfato rotulado por 6-FAM WW3p015. Fase móvel: A, 100 mM de acetato de trietilamônio (TEAA) em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). A purificação por HPLC foi obtida usando um gradiente linear de 5-50% de B durante 40 minutos, e em seguida 50-90% de B durante 10 minutos. A concentração de WW3p015 foi estimada por espectroscopia de adsorção usando o coeficiente de extinção do corante de 6-FAM (isto é, 68.000 a 494 nm).Separação de diastereoisômeros N6 -{1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-etil}-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato (dA.22 dS1 e dA.22 ds2)

[00098] A separação do dois diastereoisômeros de dA.22 foi realizada por HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD- 300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir trifosfato de N6-{(R ou S)-1-[4-(3- amino-1-propinil)-2-nitrofenil]etil}-2'-desoxiadenosina dA.22 dS1 (dias- tereoisômero simples, configuração absoluta não determinada) e trifos- fato de N6-{(S ou R)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]etil}-2'-desoxiadenosina dA.22 dS2 (diastereoisômero simples, configuração absoluta não determinada). Fase móvel: A, 100 mM de acetato de trie- tilamônio (TEAA) em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). A purificação por HPLC foi obtida usando um gradiente linear de 5-25% de B durante 50 minutos, e em seguida 2550% de B durante 30 minutos.

Síntese de diastereoisômero simples rotulado por 6-FAM N6-{(R ou S)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]etil}-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato (WW3p021)

Esquema. Síntese de diastereoisômero simples rotulado por 6-FAMN6-{(R ou S)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]etil}-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato. (i) 6-FAM-SE, 0,1 M, NaHCO3/Na2CO3,pH 9,2, uma hora.Diastereoisômero simples rotulado por 6-FAM N6-{(R ou S)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]etil}-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato(WW3p021)

[00099] Uma solução de 6-FAM-SE (0,75 mg, 1,57 μmol) em DMSO anidroso (15 μL) foi adicionada a uma solução de trifosfato dA.22 ds1 (0,26 μmol, diastereoisômero simples, configuração absoluta não determinada) em tampão de Na2CO3/NaHCO3 (0,1 M, pH 9,2; 150 μL) e incubada em temperatura ambiente durante uma hora. A reação foi purificada por HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD-300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir o diastereoi- sômero simples rotulado por 6-FAM trifosfato WW3p02l. Fase móvel: A, 100 mM de acetato de trietilamônio (TEAA) em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). A purificação por HPLC foi obtida usando um gradiente linear de 5-50% de B durante 40 minutos, e em seguida 50-90% de B durante 10 minutos. A concentração de WW3p021 foi estimada por espectroscopia de adsorção usando o coeficiente de extinção do corante de 6-FAM (isto é, 68.000 a 494 nm).Síntese de diastereoisômero simples rotulado por 6-FAM N6-{(R ou S)- 1 -(4-[3 - (6-aminocaproil)amino-1-propinil]-2-nitrofenil}etil}-2‘-desoxiadenosina-5'-trifosfato (WW3p032)

Esquema. Síntese de diastereoisômero simples rotulado por 6-FAM N6-{(R ou trifosfato de S)-1-{4-[3-(6-aminocaproil)amino-1-propinil]-2- nitrofenil}etil}-2'-desoxiadenosina. (i) éster de N-sucinimidila de ácido 6-N-(trifluoroacetil) aminocaproico, 0,1 M de NaHCO3/Na2CO3, pH 9,2, uma hora; NH4OH, uma hora; (ii) 6-FAM-SE, 0,1 M de NaHCO3/Na2CO3, pH 9,2, uma hora.N6-{(R ou S)-1-{4-[3-(6-Aminocaproil)amino-1-propinil]-2-nitrofenil)etil}-2'- desoxiadenosina-5'-trifosfato (diastereoisômero simples dA.23 ds1)

[000100] Uma solução de éster de N-sucinimidila de ácido 6-N- (trifluoroacetil)aminocaproico (0,5 mg, 1,54 μmol) em DMSO anidro (10 μL) foi adicionada a uma solução de trifosfato dA.22 ds1 (0,25 μmol, diastereoisômero simples, configuração absoluta não determinada) em tampão de Na2CO3/ NaHCO3 (0,1 M, pH 9,2; 200 μL) e incubada em temperatura ambiente durante uma hora. NH4OH (500 uL, 25% aq) foi adicionado, e a mistura foi incubada em temperatura ambiente durante outra hora. A reação foi purificada por HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD-300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir trifosfato dA.23 ds1 (diastereoisômero simples, configuração absoluta não determinada). Fase móvel: A, 100 mM de acetato de trietilamônio (TEAA) em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). A purificação por HPLC foi obtida usando um gradiente linear de 5-50% de B durante 20 minutos, e em seguida 50-90% de B durante 10 minutos.Síntese de diastereoisômero simples rotulado por 6-FAM N6-{(R ou S)- 1-{4-[3-(6-aminocaproil)amino- 1-propinil]-2-nitrofenil}etil}-2 desoxiadenosina-5'-trifosfato (WW3p032)

[000101] Uma solução de 6-FAM-SE (0,5 mg, 1,05 μmol) em DMSO anidroso (10 μL) foi adicionada uma solução de trifosfato dA.23 ds1 (0,196 μmol, diastereoisômero simples, configuração absoluta não de-terminada) em tampão de Na2CO3/NaHCO3 (0,1 M, pH 9,2; 200 μL) e incubada em temperatura ambiente durante uma hora. A reação foi purificada por HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD-300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir o diastereoisômero simples rotulado por 6-FAM trifosfato WW3p032. Fase móvel: A, 100 mM de acetato de trietilamônio (TEAA) em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). A purificação por HPLC foi obtida usando um gradiente linear de 5-50% de B durante 40 minutos, e em seguida 5090% de B durante 10 minutos. A concentração de WW3p032 foi estimada por espectroscopia de adsorção usando o coeficiente de extinção do corante de 6-FAM (isto é, 68.000 a 494 nm).Exemplo 2: compostos dTSÍNTESE DE N -(2-NITROBENZIL)-TIMIDINA-5'-TRIFOSFATO(WW1P050)

Esquema. Síntese de N3-(2-nitrobenzil)-timidina-5'-trifosfato. (i) TBSCl, imidazol, CH2Cl2 anidroso, temperatura ambiente, durante a noite, 58%; (ii) brometo de 2-nitrobenzila, n-Bu4NOH,NaI,NaOH (1 M), CHCl3, temperatura ambiente, durante a noite, 37%; (iii) n-Bu4NF, THF, 25°C, 45 minutos, 80%; (iv) POCl3, esponja de próton, (MeO)3PO, 0°C, seis horas; (n-Bu3NH)2 H2P2O7, n-Bu3N, DMF, cinco minutos; 1 M de HNEt3HCO3, uma hora, 56%.5'-O-terc-butildimetilsilil-timidina (dT.01)

[000102] Uma solução de timidina dT (2,85 g, 11,76 mmols), imidi- azol (2,44 g, 35,80 mmols) e TBSCl (1,77 g, 11,76 mmols) em CH2Cl2 anidroso (20 mL) foi agitada em temperatura ambiente durante a noite sob uma atmosfera de N2. A mistura reacional foi em seguida concentrada em vácuo até um óleo viscoso, seguida pela adição de éter etílico (60 mL) e água (60 mL). A camada orgânica foi separada e lavada duas vezes com água (20 mL cada), e a camada aquosa combinada foi extraída com éter etílico (20 mL). A camada orgânica combinada foi secada em Na2SO4, concentrada em vácuo e purificada por cromato- grafia de coluna em sílica-gel, para produzir 5'-O-terc-butildimetilsilil- timidina dT.01 (3,44 g, 82%) como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 9,35 (br s, 1 H, H-3), 7,53 (d, 1 H, J = 1,2 Hz, H-6), 6,39 (dd, 1 H, J = 8,3, 5,6 Hz, H-1), 4,45 (m, 1 H, H-4), 4,07 (m, 1 H, H-3), 3,87 (m, 2 H, H-5'a e H-5'b), 2,99 (br. s, 1 H, 3'-OH), 2,38 (m, 1 H, H-2'b), 2,09 (m, 1 H, H-2'b), 1,91 (d, 3 H, J = 1,2 Hz, 5- Me), 0,92 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,11 (s, 6 H, (CH3)2Si).N3-(2-Nitrobenzil)-5'-O-terc-butildimetilsilil-timidina (dT.02)

[000103] Em uma mistura vigorosamente agitada de composto dT.01 (660 mg, 1,85 mmol), hidróxido de tetrabutilamônio (0,5 mL), iodeto de sódio (55 mg) em CHCl3 (5 mL) e NaOH (1 M; 5 mL), uma solução de brometo de 2-nitrobenzila (400 mg, 1,85 mmol) em CHCl3 (5 mL) foi adicionada gota a gota e agitada em temperatura ambiente durante a noite. A camada orgânica foi separada, e a camada aquosa foi extraída duas vezes com clorofórmio (5 mL cada). A camada orgânica combinada foi lavada com água (5 mL), salmoura (5 mL) e secada em Na2SO4. O solvente foi evaporado em vácuo, e o resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel para produzir N3-(2- nitrobenzil)-5'-O-terc-butildimetilsilil-timidina dT.02 (562 mg, 58%) como uma espuma branca.1H RMN (CDCl3): δ 7,98 (dd, 1 H, J = 7,2, 1,2 Hz, Ph-H), 7,60 (d, 1 H, J = 1,2 Hz, H - 6), 7,49 (dt, 1 H, J = 7,6, 1,2 Hz, Ph-H), 7,36 (dt, 1 H, J = 8,1, 1,4 Hz, Ph-H), 7,16 (dd, 1 H, J =7,8, 1,1 Hz, Ph-H), 6,31 (dd, 1 H, J = 8,2, 5,7 Hz,H-1), 5,50 (d, 1 H, J = 16,2 Hz, PhCH2), 5,44 (d, 1 H, J = 16,2 Hz, PhCH2), 4,40 (m, 1 H, H-4), 3,97 (q, 1 H, J = 2,4 Hz, H-3), 3,82 (dq, 2 H, J = 11,4, 2,4 Hz, H-5'a e H-5'b), 2,98 (s, 1 H, 3'-OH), 2,29 (m, 1 H, H-2'a), 2,05 (m, 1 H, H-2'b), 1,93 (d, 3 H, J = 1,2 Hz, 5- Me), 0,90 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,09 (s, 3 H, (CH3)Si), 0,08 (s, 3 H, (CH3)Si).N3-(2-Nitrobenzil)-timidina (dT.03)

[000104] Uma solução de n-Bu4NF (1,0 M em THF, 1,125 mL, 1,125 mmol) foi adicionada gota a gota a uma solução de composto dT.02 (369 mg, 0,75 mmol) em THF (3,75 mL). A mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 45 minutos, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel para produzir N3-(2-nitrobenzil)-timidina dT.03 (225 mg, 80%) como uma espuma branca.1H RMN (CDCl3): δ 8,01 (dd, 1 H, J = 8,2, 1,3 Hz, Ph-H), 7,51 (m, 2 H, H-6 e Ph-H), 7,40 (m, 1 H, Ph-H), 7,21 (dd, 1 H, J = 7,8, 0,9 Hz, Ph-H), 6,21 (t, 1 H, J = 6,7 Hz, H-1), 5,49 (dd, 2 H, PhCH2), 4,53 (m, 1 H, H-4), 3,97 (m, 1 H, H-3), 3,78 (m, 2 H, H-5'a e H-5'b), 2,30 (m, 2 H, H-2'a e H-2'b), 1,94 (s, 3 H, 5-CH3).N3-(2-Nitrobenzil)-timidina-5'-trífosfato (WW1p050)

[000105] POCl3 (30 μL, 0,33 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dT.03 (38 mg, 0,11 mmol) e esponja de próton (32 mg, 0,15 mmol) em trimetilfosfato (0,5 mL) a 0°C e agitado durante seis horas. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n-butilamônio (237 mg, 0,5 mmol) e tri-n-butilamina (100 μL) em DMF anidra (1 mL) foi adicionada. Depois de cinco minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trieti- lamônio (1 M, pH 7,5; 10 mL) foi adicionado à solução. A reação foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora e em seguida liofi- lizada até a secura. O resíduo obtido foi dissolvido em água (10 mL), filtrado e purificado por cromatografia de permuta de ânion usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de NH4HCO3 (50 mM a 500 mM em 240 minutos) a uma taxa de fluxo de 4,5 mL/minuto. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofiliza- das para produzir trifosfato N3-(2-nitrobenzil)-timidina-5'-trifosfato WW1p050 (38 mg, 56%) como um sólido macio branco.1H RMN (400 MHz, D2O): δ 8,15 (d, 1 H, J = 8,2 Hz, Ph-H), 7,82 (s, 1 H, H-6), 7,64 (t, 1 H, J = 7,6 Hz, Ph-H), 7,54 (t, 1 H, J = 7,6 Hz, Ph-H), 7,24 (d, 1 H, J = 7,8 Hz, Ph-H), 6,35 (t, 1 H, J = 6,7 Hz, H-1), 5,47 (s, 2 H, Ph-CH2), 4,64 (m, 1 H, H-4), 4,25 (m, 3 H, H-3, H-5'a e H-5'b), 2,40 (m, 2 H, H-2'a e H-2'b), 1,98 (s, 3 H, 5-CH3);31P RMN (162 MHz, D2O): δ -6,12 (d, J = 15,6 Hz), -11,21 (d, J = 15,4 Hz), -19,565 (d, J = 15,6 Hz);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C17H20N3O16P3Na [M- 2H+Na]-, a massa calculada foi 637.9954, e a massa observada foi 637.9802.Síntese de 5-(2-nitrobenziloximetil)-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato(VL3p03085)

Esquema. Síntese de 5-(2-nitrobenziloximetil)-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato. (i) TBSCl, imidazol, DMF anidra, temperatura ambiente, durante a noite, 90%; (ii) NBS, peróxido de benzoíla, CCl4, refluxo, uma hora, 44%; (iii) álcool 2-nitrobenzílico, 110-115°C, 10 minutos, 35%; (iv) POCl3, esponja de próton, (MeO)3PO, 0°C, duas horas; (n- Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; 1 M de HNEt3HCO3, uma hora, 22%. 3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-timidina (dT.04)

[000106] Em uma solução de timidina (5,00 g, 20,64 mmols) e imidi- azol (9,0 g, 132,1 mmols) em DMF anidra (11 mL), uma solução de TBSCl (9,96 g, 66,05 mmols) em DMF (11 mL) foi adicionada gota a gota, e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante a noite sob uma atmosfera de N2. Depois que a mistura foi diluída com água (100 mL), o precipitado formado foi filtrado e dissolvido em éter etílico (125 mL). A solução de éter foi lavada duas vezes com água (25 mL cada) e uma vez com salmoura (25 mL), secada em Na2SO4, e concentrada sob pressão reduzida até um sólido ceroso, que foi recristali- zado a partir de hexano/etila, (10:1) para produzir 3',5'-O-bis-terc- butildimetilsilil-timina dT.04 (10,64 g, 90%).1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,51 (br s, 1 H, H-3), 7,48 (d, 1 H, J = 1,2 Hz, H-6), 6,34 (dd, 1 H, J = 5,8 e 8,0 Hz, H-1), 4,41 (m, 1 H, H-3), 3,93 (m, 2 H, H-4), 3,87 (dd, 1 H, J = 2,6 e 11,4 Hz, H-5'a), 3,76 (dd, 1 H, J = 2,6 e 11,4 Hz, H-5'b), 2,17 (m, 1 H, H-2'a), 2,01 (m, 1 H, H-2'b), 1,92 (d, 3 H, J = 1,2 Hz, CH3), 0,93 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,88 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,11 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0,08 (s, 6 H, (CH3)2Si).5-Bromometil-3',5‘-O -bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiuridina (dT.05)

[000107] Uma solução de composto dT.04 (4,63 g, 9,83 mmols), N- bromossucinimida (3,68 g, 20,68 mmols) e peróxido de benzoíla (0,10 g, solução aquosa a 75%) em CCl4 (100 mL) foi refluxada durante uma hora. A mistura foi filtrada, e o filtrado foi concentrado em vácuo e purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel, para produzir 5- bromometil-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiuridina dT.05 (2,40 g, 44%).1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 9,16 (br s, 1 H, H-3), 7,89 (s, 1 H, H-6), 6,30 (dd, 1 H, J = 5,8 e 7,7 Hz, H-1), 4,41 (m, 1 H, H-3), 4,29 (d, 1 H, J = 10,6 Hz, CH2Br), 4,23 (d, 1 H, J = 10,6 Hz, CH2Br), 3,98 (m, 2 H, H- 4), 3,89 (dd, 1 H, J = 2,6 e 11,4 Hz, H-5'b), 3,78 (dd, 1 H, J = 2,6 e 11,4, Hz, H-5'a), 2,30 (m, 1 H, H-2'a), 2,01 (m, 1 H, H-2'b), 0,95(s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,91 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,15 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0,09 (s, 6 H, (CH3)2Si).5-(2-Nitrobenziloximetil)-2'-desoxiuridina (dT.06)

[000108] O composto dT.05 (238 mg, 0,43 mmol) e álcool 2- nitrobenzílico (331 mg, 2,17 mmols) foram aquecidos líquidos a 110-115°C durante 10 minutos sob uma atmosfera de N2. A mistura foi ar-refecida em temperatura ambiente, dissolvida em acetato de etila, e purificada por cromatografia em sílica-gel para produzir 5-(2- nitrobenziloximetil)-2'-desoxiuridina dT.06 (60 mg, 35%).1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 11,41 (br s, 1 H, D2O permutável, NH), 8,05 (d, J = 8,0 Hz, 1 H, Ph-H), 7,96 (s, 1 H, H-6), 7,78 (m, 2 H,Ph-H), 7,56 (m, 1 H, Ph-H), 6,17 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1), 5,25 (d, 1 H,D2O permutável, 3'-OH), 5,00 (t, 1 H, J = 5,0 Hz, D2O permutável, 5'- OH), 4,48 (s, 2 H, CH2), 4,24 (m, 1 H, H-3), 4,23 (s, 2 H, CH2), 3,79 (m,1 H, H-4), 3,57 (m, 2 H, H-5), 2,11 (m, 2 H, H-2);13C RMN (100 MHz, MeOH-d4): δ 163,38 (C), 147,18 (C), 139,53 (CH), 134,80 (C), 133,81 (C), 132,87 (CH), 128,53 (CH), 127,63 (CH), 123,75 (CH), 110,24 (C), 87,16 (CH), 82,83 (CH), 70,41 (CH), 68,26 (CH2), 64,73 (CH2), 61,05 (CH2), 39,58 (CH2);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C17H20N3O8 [M+H]-, a massa calculada foi 394.1250, e a massa observada foi 394.1286.5-(2-Nitrobenziloximetil)-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato (VL3p03085)

[000109] POCl3 (22 μL, 0,24 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dT.06 (48 mg, 0,12 mmol) e esponja de próton (39 mg, 0,18 mmol) em trimetilfosfato (0,5 mL) a 0°C e agitada durante duas horas. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n-butilamônio (285 mg, 0,6 mmol) e tri-n-butilamina (120 μL) em DMF anidra (1,2 mL) foi adicionada. Depois de dois minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trietila- mônio (1 M, pH 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora, e em seguida liofilizada até a secura. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado e purificado por cromatografia de permuta de ânion usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de NH4HCO3 (50 mM a 500 mM em 300 minutos) a uma taxa de fluxo de 4,5 mL/minuto. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas para produzir 5-(2-nitrobenziloximetil)-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato VL3p03085 (16 mg, 22%) como um sólido macio branco.1H RMN (400 MHz, D2O): δ 8,01 (d, J = 8,0 Hz, 1 H, Ph-H), 7,78 (s, 1 H, H-6), 7,65 (m, 2 H, Ph-H), 7,52 (m, 1 H, Ph-H), 6,26 (t, J = 6,8 Hz, 1 H, H-1), 4,93 (m, 2 H, CH2), 4,57 (m, 1 H, H-3), 4,41 (s, 2 H, CH2), 4,21 (m, 3 H, H-4 e H-5), 2,34 (m, 2 H, H-2);31P RMN (162 Hz, D2O): δ -5,58 (d, J = 18,5 Hz), -10,91 (d, J = 18,5 Hz), -20,80 (br);TOF-MS (ESI): Para o íon molecular C17H21N3O17P3 [M-H]-, a massa calculada foi 632.0084, e a massa observada foi 631.9779.Síntese de 5-[1 -(2-nitrofenil)etiloximetil]-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato (WW2p043)

Esquema. Síntese de 5-[1-(2-nitrofenil)etiloximetil]-2'-desoxiuridina-5'- trifosfato. (i) 1-(2-nitrofenil)etanol (1,25 g, 7,50 mmols), 110-115°C, 10 minutos, 8%; (ii) POCl3, esponja de próton, (MeO)3PO, 0°C, três horas; (n-Bu3NH)2H2 P2O7, n-Bu3N, DMF; 1 M de HNEt3HCO3, uma hora, 55%.5-[1-(2-Nitrofenil)etiloximetil]-2'-desoxiuridina (dT.07)

[000110] O composto dT.05 (0,81 g, 1,5 mmol) e 1-(2-nitrofenil)etanol (1,25 g, 7,50 mmols) foi aquecido líquido a 110-115°C durante 10 minutos sob uma atmosfera de N2. A mistura foi arrefecida em temperatura ambiente, dissolvida em acetato de etila, e purificada por cromatografia em sílica-gel para produzir 5-[1-(2-nitrofenil)etiloximetil]-2'-desoxiuridina dT.07 (48 mg, 8%, mistura 1:1 de diastereômeros).1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para diastereômeros: δ 11,36 e 11,35 (2 br s, 1 H, D2O permutável, NH), 7,95 (m, 1 H, Ph-H), 7,87 (m, 1 H, Ph- H), 7,76 (m, 2 H, H-6 e Ph-H), 7,54 (m, 1 H, Ph-H), 6,14 (m, 1 H, H-1), 5,25 (d, 1 H, D2O permutável, 3'-OH), 5,00 (m, 2 H, entre eles 1 H D2O permutável, 5'-OH e CH), 4,24 (m, 1 H, H-3), 3,96 (m, 2 H, CH2), 3,78 (m, 1 H, H-4), 3,57 (m, 2 H, H-5), 2,08 (m, 2 H, H-2), 1,43 (d, J = 6,3 Hz, 3 H, CH3);

[000111] ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C18H22N3O8 [M+H]+, amassa calculada foi 408.1407, e a massa observada foi 408.1446.5-[1-(2-Nitrofenil)etiloximetil]-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato (WW2p043)

[000112] POCl3 (15 μL, 0,17 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dT.07 (34 mg, 0,08 mmol) e esponja de próton (27 mg, 0,12 mmol) em trimetilfosfato (0,5 mL) a 0°C e agitada durante três horas. Uma solução de pirofosfato de tri-n-butilamônio (197 mg, 0,4 mmol) e tri-n-butilamina (100 μL) em DMF anidra (0,8 mL) foi adicionada. Depois de cinco minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trieti- lamônio (1 M, pH 7,5, 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora, e em seguida liofilizada até a secura. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado e purificado por cromatografia de permuta de ânion usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de NH4HCO3 (50 mM a 500 mM em 300 minutos) a uma taxa de fluxo de 4,5 mL/minuto. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas para produzir 5-[1-(2-nitrofenil)etiloximetil]-2'-desoxiuridina-5'-trifosfatoWW2p043 (32 mg, 55%, mistura 1:1 de diastereômeros) como um sólido macio branco.1H RMN (400 MHz, D2O) para diastereômeros: δ 7,93 (m, 1 H, Ph-H), 7,71 - 7,61 (m, 3 H, H-6 e Ph-H), 7,49 (m, 1 H, Ph-H), 6,18 e 6,12 (2 t, J = 6,6 Hz, 1 H, H-1), 5,13 (m, 1 H, CH), 4,53 (m, 1 H, H-3), 4,39 (m, 1 H, H-4), 4,20 (m, 4 H, CH2 e H-5), 2,28 (m, 2 H, H-2), 1,54 (d, 3 H, J = 6,3 Hz, CH3);31P RMN (162 MHz, D2O): δ -7,98 (br), -12,64 (br), -23,33 (br);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C18H24N3O17P3Na [M+Na]+, a massa calculada foi 670.0216, e a massa observada foi 670.0176.Síntese de 5-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrobenziloximetil]-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato rotulado por 6-JOE (WW2p075)

Esquema. Síntese de 5-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrobenzil-oximetil]- 2'-desoxiuridina-5'-trifosfato rotulado por 6-JOE. (i) álcool 4-iodo-2-nitrobenzílico, líquido, 110-115°C, 10 minutos, 10%; (ii) N-propargiltrifluoroacetamida, Pd(PPh3)4(0), CuI, Et3N, DMF anidra, quatro horas, 50%; (iii) POCl3, esponja de próton, (MeO)3PO, 0°C, quatro horas; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF, cinco minutos; 1 M de HNEt3HCO3, uma hora; NH4OH, uma hora; 31%; (iv) 6-JOE-SE, tampão de 0,1 M de Na2CO3/NaHCO3 (pH 9,2), uma hora. 5-(4-Iodo-2-nitrobenziloximetil)-2'-desoxiuridina (dT.08)

[000113] O composto dT.05 (0,59 g, 1,06 mmol) e álcool 4-iodo-2- nitrobenzílico (1,09 g, 3,9 mmols) foi aquecido líquido a 110-115°C du-rante 10 minutos sob uma atmosfera de N2. A mistura foi arrefecida em temperatura ambiente, dissolvida em acetato de etila, e purificada por cromatografia em sílica-gel para produzir 5-(4-iodo-2- nitrobenziloximetil)-2'-desoxiuridina dT.08 (52 mg, 10%) como um sólido de de baixa fusão.1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 11,42 (s, 1 H, D2O permutável, N-H), 8,34 (d, 1 H, J = 1,7 Hz, Ph-H), 8,09 (dd, 1 H, J = 1,7 e 8,2 Hz, Ph-H), 7,96 (s, 1 H, H-6), 7,56 (d, 1 H, J = 8,2, Ph-H), 6,16 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1), 5,25 (d, 1 H, D2O permutável, 3'-OH), 5,02 (t, 1 H, D2O permutável, 5'-OH), 4,77 (s, 2 H, CH2), 4,20 (m, 1 H, H-3), 4,22 (s, 2 H, CH2), 3,79 (m, 1 H, H-4), 3,57 (m, 2 H, H-5), 2,11 (m, 2 H, H-2).5-[4-(3-Trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrobenziloximetil]-2- desoxiuridina (dT.09)

[000114] Uma solução de composto dT.08 (51 mg, 0,1 mmol), N- propargiltrifluoroacetilamida (45 mg, 0,3 mmol), tetracis(trifenilfosfina)- paládio(0) (12 mg, 0,01 mmol), CuI (4 mg, 0,02 mmol) e Et3N (28 μL, 0,2 mmol) em DMF anidra (1,2 mL) foi agitada em temperatura ambiente durante quatro horas. A mistura foi concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel para produzir 5-[4-(3- trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrobenziloximetil]-2'-desoxiuridina dT.09 (27 mg, 50%) como um sólido ceroso.1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 11,44 (s, 1 H, D2O permutável, N3-H), 10,44 (1 H, D2O permutável, N-H (COCF3)), 8,06 (s, 1 H, Ph-H), 7,97 (s, 1 H, H-6), 7,79 (s, 2 H, Ph-H), 6,16 (t, J = 6,8 Hz, 1 H, H-1), 5,25 (d, 1 H, D2O permutável, 3'-OH), 5,02 (t, 1 H, D2O permutável, 5'-OH), 4,83 (s, 2 H, Ph-CH2), 4,30 (s, 2 H, CH2), 4,23 (m, 3 H, CH2 e H-3), 3,79 (m, 1 H, H- 4'a), 3,57 (m, 2 H, H-5), 2,10 (m, 2 H, H-2'a e H-2'b); ES+ MS (ESI): 543 [M+H]+; ES-MS (ESI): 541 [M+H]+5-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrobenziloximetil]-2'-desoxiuridina-5'- trifosfato (dT.10)

[000115] POCl3 (8 μL, 88 μmol) foi adicionado a uma solução de composto dT.09 (24 mg, 44 μmol) e esponja de próton (14 mg, 66 μmol) em trimetilfosfato (0,5 mL) a 0°C e agitada durante duas horas. POCl3 adicional (8 μL, 88 μmol) foi adicionado e agitado durante outras duas horas. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n-butilamônio (104 mg, 0,22 mmol) e tri-n-butilamina (50 μL) em DMF anidra (0,5 mL) foi adicionada. Depois de cinco minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora, seguida pela adição gota a gota de hidróxido de amônio concentrado (5 mL, 27%) a 0°C. A mistura foi agitada durante uma hora adicional em temperatura ambiente, e em seguida liofilizada até a secura. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado e purificado por cromatografia de permuta de ânion usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de NH4HCO3 (50 mM a 500 mM em 300 minutos) a uma taxa de fluxo de 4,5 mL/minuto. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas para produzir para trifosfato dT.10 (10 mg, 31%) como um sólido macio branco.1H RMN (400 MHz, D2O): δ 8,10 (d, J = 5,1 Hz, 1 H, Ph-H), 7,75 (m, 2 H, H-6 e Ph-H), 7,65 (m, 1 H, J = 8,0 Hz, Ph-H), 6,27 (t, J = 6,8 Hz, 1 H, H-1), 4,95 (m, 2 H, CH2), 4,58 (m, 1 H, H-3), 4,43 (s, 2 H, CH2), 4,22 (m, 3 H, H-4 e H-5), 3,64 (s, 2 H, CH2), 2,33 (m, 2 H, H-2);31P RMN (162 Hz, D2O): δ -6,51 (d, J = 15,0 Hz), -11,56 (d, J = 15,6 Hz), -19,82 (t, J = 15,0 Hz);TOF-MS (ESI): Para o íon molecular C20H23N4O17P3Na [M- 2H+Na]-, a massa calculada foi 707.0169, e a massa observada foi 707.0321. 5-[4-(3-A mino-1 -propinil)-2-nitrobenziloximetil]-2 '-desoxiuridira-5'- trifosfato rotulado por 6-JOE (WW2p075)

[000116] Uma solução de 6-JOE-SE (1,25 mg, 2 μmol) em DMSO anidroso (50 μL) foi adicionada a uma solução de trifosfato dT.10 (1,4 μmol) em tampão de Na2CO3/NaHCO3 (0,1 M, pH 9,2; 0,5 mL) e incubada em temperatura ambiente durante uma hora. A reação foi purificada por HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD- 300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir o trifosfato rotulado por 6-JOE WW2p075. Fase móvel: A, 100 mM de acetato de trietilamônio (TEAA) em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). A eluição foi realizada com um gradiente linear de 5-38% de B durante 40 minutos e em seguida 38-90% de B durante 10 minutos. A concentração de WW2p075 foi estimada por espectroscopia de adsorção usando o coeficiente de extinção do corante de 6-JOE (isto é, 75.000 a 520 nm).Síntese de 5-{1 -[4-(3-Amino-1-propinil)-2-nitrofenil]etil-oximetil}-2‘-desoxiuridina-5'-trifosfato rotulado por 6-JOE (WW2p113).

WW2p113Esquema. Síntese de 5-{1-[4-(3-Amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-etilóxi- metil}-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato rotulado por 6-JOE. (i) Boc2O,DMAP, DMF anidra, temperatura ambiente, 16 horas, 78%; (ii) NBS, peróxido de benzoíla, CCl4, refluxo, uma hora, 43%; (iii) 1-(4-iodo-2- nitrofenil)etanol, líquido, 95°C, 50 minutos, 13%; (iv) N-propargiltrifluoroacetamida, Pd(PPh3)4 (0), CuI, Et3N, DMF anidra, quatro horas, 76%; (v) POCl3, esponja de próton, (MeO)3PO, 0°C; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; 1 M de HNEt3HCO3, uma hora; NH4OH, uma hora; 31%; (vi) 6-JOE-SE, tampão de 0,1 M de Na2CO3/NaHCO3 (pH 9,2), uma hora.N3-terc-Butiloxicarbonil-3\5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-timidina (dT.11)

[000117] Em uma solução de composto dT.04 (2,43 g, 5,15 mmols) e DMAP (1,39 g, 11,34 mmols) em DMF anidra (45 mL), uma solução de di-terc-butildicarbonato (2,47 g, 11,34 mmols) em DMF (9 mL) foi adicionado gota a gota. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 16 horas sob uma atmosfera de N2. A mistura foi concentrada em vácuo, e o resíduo cristalino foi dissolvido em CH2Cl2 (80 mL), lavado com solução de NH4Cl saturada (10 mL), secada em Na2SO4, e concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel para produzir N3-terc-butiloxicarbonil-3',5'-O-bis-terc- butildimetilsilil-timidina dT.11 (2,30 g, 78%) como um sólido branco.1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 7,50 (d, 1 H, J = 1,1 Hz, H-6), 6,34 (dd, 1 H, J = 5,8 e 7,9 Hz, H-1), 4,42 (m, 1 H, H-3), 3,95 (m, 2 H, H-4), 3,87 (dd, 1 H, J = 2,5 e 11,4 Hz, H-5'a), 3,76 (dd, 1 H, J = 2,5 e 11,4 Hz, H- 5'b), 2,17 (m, 1 H, H-2'a), 2,01 (m, 1 H, H-2'b), 1,92 (d, 3 H, J = 1,2 Hz, CH3), 1,60 (s, 9 H, (CH3)3COCON), 0,93 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,88 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,11 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0,08 (s, 6 H, (CH3)2Si).N3-terc-Butiloxicarbonil-5-bromometil-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2- desoxiuridina (dT.12)

[000118] Uma solução de composto dT.11 (570 mg, 1,00 mmol), N- bromossucinimida (0,37 g, 2,10 mmols) e peróxido de benzoíla (10 mg, solução aquosa a 75%) em CCl4 (10 mL) foi refluxada durante uma hora. A mistura foi filtrada, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel, para produzir N3-terc-butiloxicarbonil-5-bromometil-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'- desoxiuridina dT.12 (281 mg, 43%) como um sólido ceroso.1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 7,89 (s, 1 H, H-6), 6,27 (dd, 1 H, J = 5,7 e 7,7 Hz, H-1), 4,39 (m, 1 H, H-3), 4,27 (d, 1 H, J = 10,6 Hz, CH2Br), 4,20 (d, 1 H, J = 10,6 Hz, CH2Br), 3,98 (m, 2 H, H-4), 3,89 (dd, 1 H, J = 2,5 e 11,4, Hz, H-5'b), 3,78 (dd, 1 H, J = 2,6 e 11,4 Hz, H-5'a), 2,30 (m, 1 H, H-2'a), 2,04 (m, 1 H, H-2'b), 1,61 (s, 9 H, (CH3)3COCON), 0,95 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,89 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,14 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0,07 (s, 6 H, (CH3)2Si);13C RMN (100 MHz, CDCl3): δ 159,21 (C), 147,99 (C), 147,32 (C), 138,46 (CH), 111,30 (C), 88,34 (CH), 87,22 (C), 86,00 (CH), 72,28 (CH), 63,04 (CH2), 41,93 (CH2), 27,42 (CH3), 25,99 (CH3), 25,71 (CH3), 25,65 (CH3), 24,91 (CH2), 18,47 (C), 17,97 (C), -3,58 (CH3), -4,65 (CH3), -4,86 (CH3), -5,32 (CH3).5-[1-(4-Iodo-2-nitrofenil)etiloximetil]-2'-desoxiuridina (dT.13)

[000119] O composto dT.12 (323 mg, 0,50 mmol) e 1-(4-iodo-2-nitro- fenil)etanol (293 mg, 2,23 mmols) foi aquecido líquido a 95-97°C durante 50 minutos sob uma atmosfera de N2. A mistura foi arrefecida em temperatura ambiente, dissolvida em acetato de etila, e purificada por cromatografia em sílica-gel para produzir 5-[1-(4-iodo-2- nitrofenil)etiloximetil]-2'-desoxiuridina dT.13 (34 mg, 13%, mistura 1:1 de diastereômeros) como um sólido ceroso.1H RMN (400 MHz, MeOH-d4) para diastereômeros: δ 8,26 (t, 1 H, J = 1,7 Hz, H-6), 8,05 (dd, 1 H, J = 1,6, 8,3 Hz, Ph-H), 8,02 (d, 1 H, J = 10,6 Hz, Ph-H), 7,60 (dd, 1 H, J = 1,1, 8,3 Hz, Ph-H), 6,26 (m, 1 H, H- 1), 5,03 (m, 1 H, PhCH), 4,41 (m, 1 H, H-3), 4,10 (m, 2 H, CH2), 3,94 (m, 1 H, H-4), 3,80 (m, 1 H, H-5'a), 3,74 (m, 1 H, H-5'b), 2,30 (m, 1 H, H-2'a), 2,20 (m, 1 H, H-2'b), 1,50 (m, 3 H, CH3).5-{1-(4-(3-Trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrofenil]etiloximetil}-2- desoxiuridina (dT.14)

[000120] Uma solução de composto dT.13 (52 mg, 0,1 mmol), N- propargiltrifluoroacetilamida (44 mg, 0,29 mmol), tetracis(trifenilfosfina)- paládio(0) (12 mg, 0,01 mmol), CuI (4 mg, 0,02 mmol) e Et3N (27 μL, 0,2 mmol) em DMF anidra (1,5 mL) foi agitada em temperatura ambiente durante quatro horas. A mistura foi concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel para produzir 5-[1-(4- {3-trifluoroacetamido-1-propinil}-2-nitrofenil)etiloximetil]-2'-desoxiuridina dT.14 (41 mg, 76%, mistura 1:1 de diastereômeros) como um sólido ceroso.1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para diastereômeros: δ 11,36, 11,35(2 s, 1 H, D2O permutável, NH), 10,11 (t, 1 H, J = 5,6 Hz, D2O permutável, NH), 7,98 (s, 1 H, H-6), 7,88 (d, 1 H, J = 8,1 Hz, Ph-H), 7,78 (m, 2 H, Ph-H), 6,14 (t, J = 7,0 Hz, 1 H, H - 1'), 5,25 (m, 1 H, D2O permutável, 3'-OH), 5,01 (m, 1 H, D2O permutável, 5'-OH), 4,98 (m, 1 H, PhCH), 4,33 (m, 2 H, CH2), 4,24 (m, 1 H, H-3), 4,00 (m, 1 H, H-5'a), 3,94 (m, 1 H, H-5'b), 3,78 (m, 1 H, H-4), 3,57 (m, 2 H, CH2), 2,08 (m, 2 H, H-2'a e H-2'b), 1,41 (d, J = 8,1 Hz, 3 H, CH3);ES+MS (ESI): 579 [M+Na]+.5-{1-[4-(3-Amino-1-propinil)-2-nitrofeni]etiloximetil}-2'-desoxiuridina-5'- trifosfato (dT.15)

[000121] POCl3 (10 μL, 0,11 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dT.14 (30 mg, 0,054 mmol) e esponja de próton (17 mg, 0,08 mmol) em trimetilfosfato (0,5 mL) a 0°C e agitado durante duas horas. POCl3 adicional (2,5 μL, 0,03 mmol) foi adicionado e agitado durante outra hora. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n-butilamônio (128 mg, 0,27 mmol) e tri-n-butilamina (60 μL) em DMF anidra (0,54 mL) foi adicionada. Depois de cinco minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora, seguida pela adição gota a gota de hidróxido de amônio concentrado (5 mL, 27%) a 0°C. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora adicional e em se-guida liofilizada até a secura. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado e purificado por cromatografia de permuta de ânion usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de NH4HCO3 (50 mM a 500 mM em 300 minutos) a uma taxa de fluxo de 4,5 mL/minuto. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas para produzir para trifosfato dT.15 (16 mg, 40%, 1: 1 mistura de diaste- reômeros) como um sólido macio branco.1H RMN (400 MHz, D2O) para diastereômeros: δ 8,01 (m, 1 H, Ph-H), 7,74 - 7,55 (m, 3 H, H-6 e Ph-H), 6,18 e 6,12 (2 t, J = 6,4 Hz, 1 H, H-1), 5,11 (m, 1 H, PhCH), 4,53 (m, 1 H, H-3), 4,37 (m, 1 H, H-4), 4,20 (m, 4 H, CH2 e H-5), 3,65 (s, 2 H, CH2), 2,35 (m, 1 H, H-2'a), 2,25 (m, 1 H, H- 2'b), 1,54 (d, 3 H, J = 6,4 Hz, CH3);31P RMN (162 MHz, D2O) para diastereômeros: δ -5,87 (d, J = 19,8 Hz), -11,18 e -11,30 (2 d, J = 19,4 Hz), -21,62(t, J = 19,6 Hz);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C21H27N4O17P3Na [M+Na]+, a massa calculada foi 723.0482, e a massa observada foi 723.0497.5-{1 -[4-(3-A mino-1 -propinil)-2-nitrofenil]etiloximetil}-2 '-desoxiurídira-5 - trifosfato rotulado por 6-JOE (WW2p113)

[000122] Uma solução de 6-JOE-SE (0,75 mg, 1,2 μmol) em DMSO anidroso (30 μL) foi adicionada a uma solução de trifosfato dT.15 (0,56 μmol) em tampão de Na2CO3/NaHCO3 (0,1 M, pH 9,2; 200 μL) e incubada em temperatura ambiente durante uma hora. A reação foi purificada por HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD- 300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir o trifosfato rotulado por 6-JOE WW2p113. Fase móvel: A, 100 mM de TEAA em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). A eluição foi realizada com um gradiente linear de 5-50% de B durante 40 minutos e em seguida 5090% de B durante 10 minutos. A concentração de WW2p113 foi estimada por espectroscopia de adsorção usando o coeficiente de extinção do corante de 6-JOE (isto é, 75.000 a 520 nm).Síntese de 5-[1 -(2-nitrofenil)-2-(metil)propiloximetil]-2'-desoxiuridina- 5'-trifosfato (WW2p148)

5-[1-(2-nitrofenil)-2-(metil)propiloximetil]-2'-(i) 1-(2-nitrofenil)-2-metilpropanol, 100110°C, 35 minutos, 14%; (ii) POCl3, esponja de próton, (MeO)3PO, 0°C, três horas; (n-Bu3NH)2 H2P2O7, n-Bu3N, DMF; 1 M de HNEt3HCO3, uma hora.5-[1-(2-Nitroferil)-2-(metil)propiloximetil]-2'-desoxiuridira (dT. 16)

[000123] O composto dT.12 (0,316 g, 0,486 mmol) e 1-(2-nitrofenil)-2-metilpropanol (0,706 g, 3,62 mmols) foi aquecido líquido a 100- 110°C durante 35 minutos sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura foi arrefecida em temperatura ambiente, dissolvida em acetato de etila, e purificada por cromatografia em sílica-gel para produzir 5-[1-(2- nitrofenil)-2-(metil)propiloximetil]-2'-desoxiuridina dT.16 (30 mg, 14%, mistura 1:1 de diastereômeros).1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para diastereômeros: δ 11,33 e 11,34 (2 br s, 1 H, D2O permutável, NH), 7,95 (m, 1 H, Ph-H), 7,83 (m, 1 H, Ph- H), 7,72 (m, 1 H, Ph-H), 7,68 (m, 1 H, H-6), 7,54 (m, 1 H, Ph-H), 6,14 (m, 1 H, H-1), 5,26 (d, 1 H, D2O permutável, 3'-OH), 4,97 (m, 1 H, 1 H D2O permutável, 5'-OH), 4,66 (m, 1 H, CH), 4,22 (m, 1 H, H-3), 3,98 (m, 2 H, CH2), 3,78 (m, 1 H, H-4), 3,55 (m, 2 H, H-5), 2,08 (m, 2 H, H- 2), 1,72 (m, 1 H, CH), 0,85 (m, 3 H, CH3), 0,80 (m, 3 H, CH3);13C RMN (100 MHz, CDCl3) para diastereômeros: δ 165,04 (C),152,20/ 151,09 (C), 141,19/141,04 (CH), 139,28 (C), 138,05 (C), 134,08 (CH), 130,57/ 130,51 (CH), 129,60 (CH), 125,25/125,19 (CH),112,62/112,43 (C), 89,12 (CH)/86,64 (CH), 82,72/82,40 (CH), 72,45 (CH), 65,78/65,61 (CH2), 63,01 (CH2), 41,50/41,45 (CH2), 36,21 (CH), 26,68 (CH), 19,85/19,80 (CH3), 18,20/18,14 (CH3);5-[1-(2-Nitrofenil)-2-(metil)propiloximetil]-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato (WW2p148)

[000124] POCl3 (13 μL, 0,17 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dT.16 (30 mg, 0,07 mmol) e esponja de próton (30 mg, 0,14 mmol) em trimetilfosfato (0,5 mL) a 0°C e agitada durante três horas. Uma solução de pirofosfato de tri-n-butilamônio (166 mg, 0,35 mmol) e tri-n-butilamina (70 μL) em DMF anidra (0,7 mL) foi adicionada. Depois de cinco minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trietilamô- nio (1 M, pH 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora e em seguida liofilizada até a secura. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado, e parte da solução foi purificada por cromatografia de permuta de ânion usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de NH4HCO3 (50 mM a 500 mM em 240 minutos) a uma taxa de fluxo de 4,5 mL/minuto. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofi- lizadas para produzir 5-[1-(2-nitrofenil)-2-(metil)propiloximetil]-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato WW2p148 (mistura 1:1 de diastereômeros) como um sólido macio branco.1H RMN (400 MHz, D2O) para diastereômeros: δ 7,93 (m, 1 H, Ph-H), 7,74 - 7,64 (m, 3 H, H-6 e Ph-H), 7,52 (m, 1 H, Ph-H), 6,19 e 6,1 3 (2 t, J = 6,6 Hz, 1 H, H-1), 4,55 (m, 1 H, H-3), 4,40 (m, 1 H, H-4), 4,21 (m, 4 H, CH2 e H-5), 2,38 - 2,22 (m, 2 H, H-2), 1,99 (m, 1 H, CH), 1,01 (m, 3 H, CH3), 0,78 (m, 3 H, CH3).31P RMN (162 MHz, D2O) para diastereômeros: δ -5,26 (d, J = 20,1 Hz), -10,66 e - 10,72 (2 d, J = 19,6 Hz), -21,17 (t, J = 19,6 Hz).ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C20H27N3O17P3 [M-H]-, a massa calculada foi 674.0553, e a massa observada foi 674.0470.

[000125] Síntese de 5-{1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil-2- (metil)propiloximetil}-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato rotulado por 6-JOE (WW2p150)

Esquema. Síntese de 5-{1-[4-(3-Amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2-(metil)propiloximetil}-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato rotulado por 6-JOE. (i) 1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2-metilpropanol, líquido, 108°C, 45 minutos, 18%; (ii) N-propargiltrifluoroacetamida, Pd(PPh3)4(0), CuI, Et3N, DMF anidra, 4,5 horas, 99%; (iii) POCl3, esponja de próton, (MeO)3PO, 0°C, três horas; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; 1 M de HNEt3HCO3, uma hora; NH4OH, uma hora; (iv) 6-JOE-SE, tampão de 0,1 M de Na2CO3/NaHCO3 (pH 9,2), uma hora.5-[1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2-(metil)propiloximetil]-2'-desoxiuridina (dT. 17)

[000126] O composto dT.12 (400 mg, 0,615 mmol) e 1-(4-iodo-2- nitrofenil)-2-metiletanol (800 mg, 2,49 mmols) foi aquecido líquido a 108°C durante 45 minutos sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura foi arrefecida em temperatura ambiente, dissolvida em acetato de etila, e purificada por cromatografia em sílica-gel para produzir 5-[1-(4-iodo- 2-nitrofenil)-2-(metil) propiloximetil]-2'-desoxiuridina dT.17 (64 mg, 18%, mistura 1:1 de diastereômeros) como um sólido ceroso.1H RMN (400 MHz, MeOH-d4) para diastereômeros: δ 8,22 (m, 1 H, H- 6), 8,02 (m, 2 H, Ph-H), 7,49 (m, 1 H, Ph-H), 6,22 (m, 1 H, H-1), 4,69 (m, 1 H, CH), 4,41 (m, 1 H, H-3), 4,10 (m, 2 H, CH2), 3,92 (m, 1 H, H- 4), 3,75 (m, 2 H, H-5'a), 2,17 (m, 1 H, H-2'a), 2,15 (m, 1 H, H-2'b), 1,90 (m, 1 H, CH), 0,92 (m, 3 H, CH3), 0,85 (m, 3 H, CH3);13C RMN (100 MHz, CDCl3) para diastereômeros: δ 165,11 (C), 152,16/ 151,18 (C), 143,12 (CH), 141,44/141,32 (CH), 137,91/137,88 (C), 133,83/ 133,77 (CH), 132,37/132,33 (CH), 130,80/129,67 (C), 112,40/112,24 (C), 92,75 (C), 89,12 (CH)/86,90 (CH), 82,43/82,18 (CH), 72,39/72,37 (CH), 65,83/65,70 (CH2), 62,96 (CH2), 41,56/41,49 (CH2), 36,01 (CH), 27,83/26,37 (CH), 19,82/19,78 (CH3), 17,91/17,88 (CH3);5-(1-[4-(3-Trifluoroacetamido- 1-propinil)-2-nitrofenil)-2-(metil)] propi- loximetil(-2'-desoxiuridina (dT.18)

[000127] Uma solução de composto dT.17 (60 mg, 0,107 mmol), N- propargil-trifluoroacetilamida (48,5 mg, 0,321 mmol), tetra- cis(trifenilfosfina)-paládio(0) (12,4 mg, 0,01 mmol), CuI (4 mg, 0,02 mmol) e Et3N (30 μL, 0,214 mmol) em DMF anidra (1,5 mL) foi agitada em temperatura ambiente durante 4,5 horas. A mistura foi concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel para produzir 5-[1-(4-(3-trifluoroacetamido-1-propinil(-2-nitrofenil)-2-(metil)propiloximetil]-2'-desoxiuridina dT.18 (62 mg, 99%, mistura 1:1 de diastereômeros) como um sólido ceroso.1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para diastereômeros: δ 11,36, 11,35(2 s, 1 H, D2O permutável, N3-H), 10,11 (t, 1 H, J = 5,3 Hz, D2O permutável, NHTFA), 7,99 (m, 1 H, H-6), 7,86 (m, 1 H, Ph-H), 7,75 (m, 1 H, Ph- H), 7,65 (m, 1 H, Ph-H), 6,12 (m, 1 H, H-1), 5,26 (m, 1 H, D2O permutável, 3'-OH), 4,97 (m, 1 H, D2O permutável, 5'-OH), 4,62 (m, 1 H, CH), 4,31 (m, 2 H, CH2), 4,30 (m, 1 H, H-3), 3,98 (m, 2 H, CH2), 3,78 (m, 1 H, H-4), 3,55 (m, 2 H, H-5'a e H-5'b), 2,08 (m, 2 H, H-2'a e H-2'b), 1,77 (m, 1 H, CH), 0,82 (m, 6 H, 2 CH3);5-{1-[4-{3-Amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2-(metil)propiloximetil}-2'- desoxiuridina-5'-trifosfato (dT.19)

[000128] POCl3 (8 μL, 0,09 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dT.18 (34 mg, 0,06 mmol) e esponja de próton (26 mg, 0,12 mmol) em trimetilfosfato (0,3 mL) a 0°C e agitada durante duas horas. POCl3 adicional (4 μL, 0,045 mmol) foi adicionado e agitado durante outra hora. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n-butilamônio (142 mg, 0,3 mmol) e tri-n-butilamina (60 μL) em DMF anidra (0,6 mL) foi adicionada. Depois de cinco minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora, seguida pela adição gota a gota de hidróxido de amônio concentrado (5 mL, 27%) a 0°C. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora adicional e em seguida liofilizada até a secura. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado, e parte da solução foi purificada por croma- tografia de permuta de ânion usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de NH4HCO3 (50 mM a 500 mM em 240 minutos) a uma taxa de fluxo de 4,5 mL/minuto. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas para produzir trifosfato dT.19 (mistura 1:1 de diastereômeros) como um sólido macio branco. 1H RMN (400 MHz, D2O) para diastereômeros: δ 8,06 e 8,04 (2 s, 1 H, Ph-H), 7,78 (m, 1 H, Ph-H), 7,69 - 7,59 (m, 2 H, H-6 e Ph-H), 6,13 (m, 1 H, H-1), 4,55 (m, 1 H, H-3), 4,46 e 4,34 (2 d, 2 H, CH2), 4,20 (m, 3 H, H-4 e H-5), 3,87 e 3,83 (2 s, 2H, CH2), 2,40 -2,20 (m, 2 H, H-2), 1,99 (m, 1 H, CH), 1,02 (m, 3 H, CH3), 0,79 (m, 3 H, CH3);31P RMN (162 MHz, D2O) para diastereômeros: δ -5,15 (d, J = 19,8 Hz), -10,48 e - 10,54 (2 d, J = 19,6 Hz), -21,0 (m);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C23H30N4O17P3 [M-H]-, a massa calculada foi 727.0819, e a massa observada foi 727.0828. 5-{1-[4-(3-Amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2-(metil)propiloximetil}-2'-deso- xiurídina-5'-trífosfato rotulado por 6-JOE (WW2p150)

[000129] Uma solução de 6-JOE-SE (0,75 mg, 1,2 μmol) em DMSO anidroso (30 μL) foi adicionada a uma solução de trifosfato WW2p145 (0,47 μmol) em tampão de Na2CO3/NaHCO3 (0,1 M, pH 9,2; 0,3 mL) e incubada em temperatura ambiente durante uma hora. A reação foi purificada por HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD-300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir o trifosfato rotulado por 6- JOE WW2p150. Fase móvel: A, 100 mM de TEAA em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). A purificação por HPLC foi obtida usando um gradiente linear de 5-50% de B durante 40 minutos, e em seguida 50-90% de B durante 10 minutos. A concentração de WW2p150 foi estimada por espectroscopia de adsorção usando o coeficiente de extinção do corante de 6-JOE (isto é, 75.000 a 520 nm). Síntese de 5-{(R ou S)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2-(metil) propiloximetil}-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato rotulado por 6-JOE(WW3p024)

Esquema. Síntese de 5-{(R ou S)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2- (metil) propiloximetil}-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato rotulado por 6-JOE. (i) (S ou R)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2-metilpropanol, líquido, 108°C, 45 minutos, 20%; (ii) N-propargiltrifluoroacetamida, Pd(PPh3)4 (0), CuI, Et3N, DMF anidra, 4,5 horas, 81%; (iii) POCl3, esponja de próton, (MeO)3PO, 0°C, duas horas; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; 1 M de HNEt3HCO3, uma hora; NH4OH, duas horas; (iv) 6-JOE-SE, tampão de 0,1 M de Na2CO3/NaHCO3 (pH 9,2), uma hora.5-[(R ou S)-1-(4-Iodo-2-nitrofenil)-2-(metil)propiloximetil]-2'-desoxiuridina(dT.20)

[000130] O composto dT.12 (143 mg, 0,22 mmol) e enantio-puro (S ou R)-1-(4-iodo-2-nitrofenil)-2-metilpropanol (282 mg, 0,88 mmol, con-figuração absoluta não determinada) foi aquecido líquido a 108°C durante 45 minutos sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura foi arre- fecida em temperatura ambiente, dissolvida em acetato de etila, e puri-ficada por cromatografia em sílica-gel para produzir 5-[(R ou S)-1-(4- iodo-2-nitrofenil)-2-(metil)propiloximetil]-2'-desoxiuridina dT.20 (25 mg, 20%, configuração absoluta não determinada) como um sólido ceroso. 1H RMN (400 MHz, MeOH-d4) δ 8,22 (d, 1 H, J = 1,8 Hz, H-6), 8,01 (m, 2 H, Ph-H), 7,50 (d, 1 H, J = 8,3 Hz, Ph-H), 6,25 (t, 1 H, J = 7,2 Hz, H-1), 4,69 (d, 1 H, J = 5,8 Hz, PhCH), 4,41 (m, 1 H, H-3), 4,10 (m, 2 H, CH2), 3,92 (m, 1 H, H-4), 3,75 (m, 2 H, H-5'a), 2,1 7 (m, 1 H, H-2'a), 2,15 (m, 1 H, H-2'b), 1,90 (m, 1 H, CH), 0,92 (m, 3 H, CH3), 0,85 (m, 3 H, CH3);5-{(R ou S)-1-[4-(3-Trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrofenil]-2-(metil)- propiloximetil}-2'-desoxiuridina (dT.21)

[000131] Uma solução de composto dT.20 (24 mg, 0,043 mmol), N- propargil-trifluoroacetilamida (28 mg, 0,186 mmol), tetra-cis(trifenilfosfina)-paládio(0) (7,2 mg, 0,006 mmol), CuI (2,4 mg, 0,012 mmol) e Et3N (17 μL, 0,124 mmol) em DMF anidra (1,5 mL) foi agitada em temperatura ambiente durante 4,5 horas. A mistura foi concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel para produzir 5-{(R ou S)-1-[4-(3-trifluoro-acetamido-1-propinil)-2-nitrofenil]- 2-(metil)propiloximetil]-2'-desoxiuridina dT.21 (19,8 mg, 81%, configuração absoluta não determinada) como um sólido ceroso.1H RMN (400 MHz, MeOH-d4): δ 8,01 (br s, 1 H, H-6), 7,95 (d, 1 H, J = 1,2 Hz, Ph-H), 7,72 (m, 2 H, Ph-H), 6,25 (t, 1 H, J = 6,7 Hz, H-1), 4,74 (d, 1 H, J = 5,8 Hz, PhCH), 4,38 (m, 1 H, H-3), 4,34 (s, 2 H, CH2), 4,05 (m, 2 H, CH2), 3,55, 3,93 (m, 1 H, H-4), 3,77 (m, 2 H, H-5'a e H-5'b), 2,15 (m, 2 H, H-2'a e H-2'b), 1,90 (m, 1 H, CH), 0,92 (m, 6 H, 2 x CH3); 5-{(R ou S)-1-[4-(3-Amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2-(metil)-propiloximetil}-2'-desoxiuridina-5'-tnfosfato (dT.22)

[000132] POCl3 (6 μL, 0,06 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dT.21 (18 mg, 0,03 mmol) e esponja de próton (13 mg, 0,06 mmol) em trimetilfosfato (0,3 mL) a 0°C e agitada durante duas horas. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n-butilamônio (73 mg, 0,15 mmol) e tri-n-butilamina (30 μL) em DMF anidra (0,3 mL) foi adicionado. Depois de cinco minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH 7,5; 5 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente, e em seguida liofilizada até a secura. O resíduo foi dissolvido em água (5 mL), filtrado, e parte da solução foi purificada com HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD-300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir 5-{(R ou S)-1-[4-(3-trifluoroacetamido-1-propinil)-2- nitrofenil]-2-(metil)propiloximetil}-2'-desoxiuridina-5'trifosfato. Fase móvel:A, 100 mM de acetato de trietilamônio (TEAA) em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). A purificação por HPLC foi obtida usando um gradiente linear de 5-50% de B durante 40 minutos, e em se-guida 50-90% de B durante 10 minutos. O trifosfato purificado foi em se-guida tratado com hidróxido de amônio concentrado (27%; 0,5 mL) em temperatura ambiente durante duas horas para produzir 5-{(R ou S)-1-[4- (3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2-(metil)-propiloximetil}-2'-desoxiuridina-5'- trifosfato (dT.22, configuração absoluta não determinada).1H RMN (400 MHz, D2O): δ 8,01 (s, 1 H, Ph-H), 7,76 (d, 1 H, J = 6,9 Hz, Ph-H), 7,62 (m, 2 H, H-6 e Ph-H), 6,17 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 4,55 (m, 1 H, H-3), 4. 39 e 4,29 (2 d, 2 H, J = 6,4 Hz, CH2), 4,17 (m, 3 H, H-4 e H-5), 3,74 (s, 2 H, CH2), 2,28 (m, 2 H, H-2), 2,00 (m, 1 H, CH), 0,79 (m, 3 H, CH3);31P RMN (162 MHz, D2O): δ -5,40 (d, J = 19,4 Hz), -10,75 (d, J = 19,4 Hz), -21,23 (t, J = 19,4 Hz).5-{(R ou S)-1-[4-(3-Amino-1-propinil)-2-nitrofenil]-2-(metil)-propiloximetil}-2'-desoxiuridina-5'-trífosfato rotulado por 6-JOE(WW3P024)

[000133] Uma solução de 6-JOE-SE (0,625 mg, 1 μmol) em DMSO anidroso (25 μL) foi adicionada a uma solução de trifosfato dT.22 (0,31 μmol) em tampão de Na2CO3/NaHCO3 (0,1 M, pH 9,2; 180 μL) e incu- bada em temperatura ambiente durante uma hora. A reação foi purificada por HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD- 300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir o trifosfato rotulado por 6-JOE WW3p024. Fase móvel: A, 100 mM de TEAA em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). A purificação por HPLC foi obtida usando um gradiente linear de 5-50% de B durante 40 minutos, e em seguida 50-90% de B durante 10 minutos. A concentração de WW3p024 foi estimada por espectroscopia de adsorção usando o coeficiente de extinção do corante de 6-JOE (isto é, 75.000 a 520 nm).Exemplo 3: compostos dCSíntese de N4-(2-nitrobenzil)-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato (WW2p044)

Esquema. Síntese de trifosfato de N4-(2-nitrobenzil)-2'-desoxicitidina. (i) TBSCL, imidazol, DMF anidra, temperatura ambiente, durante a noite, 84%; (ii) Boc2O, DMAP, Et3N, CH2Cl2, temperatura ambiente, durante a noite, 56%; (iii) brometo de 2-nitrobenzila, NaH, DMF anidra, 0°C, em seguida gradualmente aquecidos em temperatura ambiente, durante a noite, 37%; (iv) SiO2, vácuo, 70-80°C, 48 horas, 79%; (v) n- Bu4NF, THF, 0°C, em seguida gradualmente aquecidos em temperatura ambiente, duas horas, 59%; (vi) POCl3, esponja de próton, (MeO)3PO, 0°C, duas horas; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF, cinco minutos; 1 M de HNEt3HCO3, uma hora, 52%.3',5'-O-Bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxicitidina (dC.01)

[000134] 2'-desoxicitidina dC (2,85 g, 12,54 mmols), imidiazol (6,49 g, 95,31 mmols) e TBSCl (7,18 g, 47,65 mmols) foram adicionados à DMF anidra (27 mL) e agitada em temperatura ambiente durante a noite sob uma atmosfera de N2. Metanol (20 mL) foi adicionado, e a mistura foi agitada durante 30 minutos e em seguida concentrada em vácuo. Acetato de etila (60 mL) e água (60 mL) foram em seguida adicionados. A camada orgânica foi separada e lavada duas vezes com água (20 mL), e a camada aquosa combinada foi extraída com acetato de etila (20 mL). A camada orgânica combinada foi secada com Na2SO4, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia em sílica-gel para produzir 3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxicitidina dC.01 (4,79 g, 84%) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 7,95 (d, 1 H, J = 7,4 Hz, H-6), 6,26 (t, 1 H, J = 5,6 Hz, H-1), 5,69 (d, 1 H, J = 7,4 Hz, H-5), 4,37 (m, 1 H, H-3), 3,90 (m, 2 H, H-4 e H-5'a), 3,76 (m, 1 H, H-5'b), 2,40 (m, 1 H, H-2'a), 2,08 (m, 1 H, H-2'b), 0,91 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,87 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,10 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0,05 (s, 6 H, (CH3)2Si).N4-terc-Butiloxicarbonil-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxicitidina(dC.02)

[000135] Sob uma atmosfera de nitrogênio, uma solução de di-terc- butildicarbonato (0,34 g, 1,58 mmol) em CH2Cl2 anidroso (3 mL) foi adicionada lentamente a uma solução de composto dC.01 (0,5 g, 1,10 mmol), Et3N (0,15 mL, 1,10 mmol) e DMAP (0,13 g, 1,10 mmol) em CH2Cl2 anidroso (5 mL). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante a noite, concentrada em vácuo e purificada por cromatogra- fia em sílica-gel para produzir N4-terc-butiloxicarbonil-3',5'-O-bis-terc- butildimetilsilil-2'-desoxicitidina dC.02 (0,34 g, 56%) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,30 (d, 1 H, J = 7,4 Hz H-6), 7,47 (bs, 1 H, NH), 7,14 (d, 1 H, J = 7,4 Hz, H-5), 6,25 (t, 1 H, J = 5,6 Hz, H-1), 4,38 (m, 1 H, H-3), 3,95 (m, 2H, H-4 e H-5'a), 3,78 (m, 1 H, H-5), 2,50 (m, 1 H, H-2'a), 2,10 (m, 1 H, H-2'b), 1,51 (s, 9 H, (CH3)3CO), 0,93 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,88 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,11 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0,06 (s, 6 H, (CH3)2Si).N4-terc-Butiloxicarbonil-N4-(2-nitrobenzil)-3,5 '-O-bis-terc- butildimetilsilil-2 '-desoxicitidina (dC.03)

[000136] NaH (32 mg, 1,26 mmol, seco) foi adicionado a uma solução de composto dC.02 (540 mg, 0,97 mmol) em DMF anidra (6 mL) a 0°C e agitada durante 30 minutos sob uma atmosfera de nitrogênio. Uma solução de brometo de 2-nitrobenzila (313 mg, 1,45 mmol) em DMF anidra (1,5 mL) foi adicionada gota a gota. A mistura reacional foi gradualmente aquecida em temperatura ambiente e agitada durante a noite. Depois da adição de acetato de etila (60 mL), a mistura foi lavada três vezes com solução de NH4Cl saturada (40 mL), e a camada aquosa combinada foi extraída com acetato de etila (40 mL). A camada orgânica combinada foi secada com Na2SO4, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia em sílica-gel para produzir N4-terc- butiloxicarbonil-N4-(2-nitrobenzil)-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'- desoxicitidina dC.03 (250 mg, 37%) como uma espuma branca. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,29 (d, 1 H, J = 7,6 Hz, H-6), 8,05 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, Ph-H), 7,53 (t, 1 H, J = 7,5 Hz, Ph-H), 7,38 (t, 1 H, J = 7,6 Hz, Ph-H), 7,28 (m, 2 H, Ph-H e H-5), 6,26 (t, 1 H, J = 5,6 Hz, H-1), 5,60 (q, 2 H, Ph-CH2), 4,41 (m, 1 H, H-3), 3,96 (m, 2 H, H-4 e H-5'a), 3,80 (m, 1 H, H-5'b), 2,51 (m, 1 H, H-2'a), 2,1 5 (m, 1H, H-2'b), 1,28 (s, 9 H, (CH3)3CO), 0,95 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,88 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,14 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0,07 (s, 6 H, (CH3)2Si).N4-(2-Nitrobenzil)-3,5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxicitidina(dC.04)

[000137] Sílica-gel 60 (2,5 g, malha 100-200, ativada por aquecimento a 50-60°C sob pressão reduzida durante 24 horas) foi adicionada a uma solução de composto dC.03 (250 mg, 0,36 mmol) em CH2Cl2 (5 mL), e a mistura foi evaporada em vácuo até a secura. O resíduo foi aquecido a 60-70°C sob pressão reduzida durante 48 horas, lavado três vezes com MeOH (30 mL) e filtrado usando um funil de buchi. O filtrado combinado foi concentrado em vácuo e purificado por cromato- grafia em sílica-gel para produzir N4-(2-nitrobenzil)-3',5'-O-bis-terc- butildimetilsilil-2'-desoxicitidina dC.04 (0,185 g, 79%) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,02 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, Ph-H), 7,92 (d, 1 H, J = 7,2 Hz, H-6), 7,79 (d, 1 H, J = 7,5 Hz, Ph-H), 7,57 (t, 1 H, J = 7,3 Hz, Ph-H), 7,41 (t, 1 H, J = 7,5 Hz, Ph-H),6,38 (bs, 1 H,NH),6,26 (t, 1 H, J = 5,2 Hz, H-1), 5,68 (d, 1 H, J = 7,2 Hz, H-5), 4,92 (m, 2 H, Ph-CH2), 4,36 (m, 1 H, H-3), 3,88 (m, 2 H, H-4 e H-5'a), 3,75 (m, 1 H, H-5'b), 2,39 (m, 1 H, H-2'a), 2,07 (m, 1 H, H-2'b), 0,91 (s, 9 H, (CH3)3CSi),0,87 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,09 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0,05 (s, 6 H, (CH3)2Si). N4-(2-Nitrobenzil)-2'-desoxicitidina (dC.05)

[000138] Uma solução de n-NBu4F (190 mg, 0,73 mmol) em THF (1,4 mL) foi adicionada gota a gota a uma solução de composto dC.04 (170 mg, 0,29 mmol) em THF (3,4 mL) a 0°C sob uma atmosfera de nitro gênio. A mistura reacional foi agitada durante duas horas, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia em sílica-gel para produzir N4-(2-nitrobenzil)-2'-desoxicitidina dC.05 (62 mg, 59%) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,23 (t, 1 H, D2O permutável, NH), 8,07 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, Ph-H), 7,83 (d, 1 H, J = 7,4 Hz, H-6), 7,74 (t, 1 H, J = 7,5 Hz, Ph-H), 7,54 (m, 2 H, Ph-H), 6,13 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1), 5,91 (d, 1 H, J = 7,4 Hz, H-5), 5,19 (d, 1 H, D2O permutável, 3'-OH), 4,97 (t, 1 H, D2O permutável, 5'-OH), 4,78 (m, 2 H, Ph-CH2), 4,19 (m, 1 H, H-3), 3,76 (m, 1 H, H-4), 3,55 (m, 2 H, H-5'a e H-5'b), 2,09 (m, 1 H, H-2'a), 1,93 (m, 1 H, H-2'b);13C RMN (100 MHz, CD3OD): δ 165,71, 158,51, 149,70, 141,75, 135,09, 134,73, 131,30, 129,43, 125,94, 96,75, 88,83, 87,57, 72,03, 62,78, 42,71, 42,00.N4-(2-Nitrobenzil)-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato (WW2p044)

[000139] POCl3 (17 μL, 0,2 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dC.05 (36 mg, 0,1 mmol) e esponja de próton (32 mg, 0,15 mmol) em trimetilfosfato (0,5 mL) a 0°C e agitada durante duas horas. POCl3 adicional (9 μL, 0,1 mmol) foi adicionado e agitado durante outra hora. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n-butilamônio (237 mg, 0,5 mmol) e tri-n-butilamina (100 μL) em DMF anidra (1 mL) foi adicionada. Depois de cinco minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trie- tilamônio (1 M, pH 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada du-rante uma hora em temperatura ambiente, e em seguida liofilizada até a secura. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado e purificado por cromatografia de permuta de ânion usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de NH4HCO3 (50 mM a 500 mM em 300 minutos) a uma taxa de fluxo de 4,5 mL/ minuto. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas para produzir para o trifosfato WW2p044 (34 mg, 52%) como um sólido macio branco. 1H RMN (400 MHz, D2O): δ 8,12 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, Ph-H), 7,83 (d, 1 H, J = 7,6 Hz, H-6), 7,69 (t, 1 H, J = 7,6 Hz, Ph-H), 7,60 (d, 1 H, J = 7,6 Hz, Ph-H), 7,53 (t, 1 H, J = 8,0 e 7,6 Hz, Ph-H), 6,29 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1), 6,15 (d, 1 H, J = 7,6 Hz, H-5), 4,85 (bs, 2 H, Ph-CH2), 4,58 (m, 1 H, H-3), 4,21 (m, 3 H, H-4, H-5'a e H-5'b), 2,38 (m, 1 H, H-2'a), 2,28 (m, 1 H, H-2'b);31P RMN (162 MHz, D2O): δ -5,61 (d, J = 15,9 Hz), -10,60 (d, J = 15,4 Hz), -19,26 (br);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C16H21N4O15P3Na [M+Na]+, a massa calculada foi 625.0114, e a massa observada foi 624.9993.Síntese de N4 -[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrobenzil]-2'-desoxicitidina-5‘- trifosfato e rotulagem de tintura (WW2p080)

Esquema. Síntese de N4-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrobenzil]- 2'- desoxicitidina-5'-trifosfato rotulado por 6-TAMRA. (i) brometo de 4-iodo-2- nitrobenzila, n-Bu4NBr, CH2Cl2, 1 M de NaOH, temperatura ambiente, quatro horas, 45%; (ii) N-propargiltrifluoroacetamida, PdCl2(PPh3)2, CuI, Et3N, THF, refluxo, três horas, 82%; (iii) SiO2, vácuo, 70-80°C, 48 horas, 81%; (iv) n-Bu4NF, THF, 0°C, duas horas, em seguida temperatura ambi-ente durante a noite, 39%; (v) POCl3, esponja de próton, (MeO)3PO, 0°C, duas horas; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF, cinco minutos; 1 M de HNEt3HCO3, uma hora; NH4OH, uma hora; 39%; (vi) 6-TAMRA-SE, tam-pão de 0,1 M de Na2CO3/NaHCO3 (pH 9,2), uma hora.N4-terc-Butiloxicarbonil-N4-(4-iodo-2-nitrobenzil)-3',5'-O-bis-terc- butildimetilsilila - 2'-desoxicitidina (dC.06)

[000140] Uma solução de brometo de 4-iodo-2-nitrobenzila (461 mg, 1,35 mmol) em CH2Cl2 (4 mL) foi adicionada gota a gota a uma mistura de composto dC.02 (250 mg, 0,45 mmol) e n-Bu4NBr (145 mg, 0,45 mmol) em CH2Cl2 (4 mL) e NaOH (1 M; 4,5 mL). A reação foi agitada vigorosamente em temperatura ambiente durante quatro horas. A camada orgânica foi separada, e a camada aquosa foi extraída duas vezes com CH2Cl2 (4 mL cada). A camada orgânica combinada foi secada com Na2SO4, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia em sílica-gel para produzir N4-terc-butiloxicarbonil-N4-(4-iodo-2- nitrobenzil)-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxicitidina dC.06 (167mg, 45%) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,37 (d, 1 H, J = 1,8 Hz, Ph-H), 8,30 (d, 1 H, J = 7,5 Hz, H-6), 7,82 (dd, 1 H, J = 1,8 Hz e 8,3 Hz, Ph-H), 7,26 (d, 1 H, J = 7,5 Hz, H-5), 6,99 (d, 1 H, J = 8,4 Hz, Ph-H), 6,24 (dd, 1 H, J = 6,3 e 5,0 Hz, H-1), 5,52 (q, 2 H, Ph-CH2), 4,41 (m, 1 H, H-3), 3,96 (m, 2 H, H-4 e H-5'a), 3,80 (m, 1 H, H-5'b), 2,51 (m, 1 H, H-2'a), 2,14 (m, 1 H, H-2'b), 1,34 (s, 9 H, (CH3)3CO), 0,95 (s, 9H, (CH3)3CSi), 0,89 (s, 9H, (CH3)3CSi), 0,14 (s, 3 H, (CH3)Si), 0,13 (s, 3 H, (CH3)Si), 0,08 (s, 3 H, (CH3)Si), 0,07 (s, 3 H, (CH3) Si).N4-terc-Butiloxicarbonil-N4-[4-(3-trifluoroacetamido-1-propinil)-2- nitrobenzil]-35'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxicitidina (dC.07)

[000141] Sob uma atmosfera de nitrogênio, uma solução de dicloreto de bis(trifenilfosfina)paládio(II) (41 mg, 0,058 mmol) em THF anidroso (3 mL) foi adicionada rapidamente a uma mistura de composto dC.06 (315 mg, 0,39 mmol), CuI (15 mg, 0,078 mmol), Et3N (0,73 mL, 5,2 mmols) e N-propargiltrifluoroacetamida (82 mg, 0,54 mmol) em THF anidroso (7 mL). A mistura reacional foi refluxada durante duas horas, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia em sílica-gel para produzir N4-terc-butiloxicarbonil-N4-[4-(3-trifluoroacetamido-1-propinil)- 2-nitrobenzil]-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxicitidina dC.07 (268 mg, 82%) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, CDCh): δ 8,33 (d, 1 H, J = 7,7 Hz, H-6), 8,03 (d, 1 H, J = 1,5 Hz, Ph-H), 7,61 (bs, 1 H, NH), 7,50 (dd, 1 H, J = 1,5 Hz e 8,2 Hz, Ph-H), 7,32 (d, 1 H, J =7,7 Hz, H-5), 7,18 (d, 1 H, J = 8,2 Hz, Ph- H), 6,24 (t, 1 H, J = 6,0 Hz, H-1), 5,56 (q, 2 H, PhCH2), 4,42 (m, 1 H, H- 3), 4,35 (d, 2 H, CH2), 3,97 (m, 2 H, H-5'a e H-4), 3,80 (m, 1 H, H-5'b), 2,50 (m, 1 H, H-2'a), 2,05 (m, 1 H, H-2'b), 1,31 (s, 9 H, (CH3)3CO), 0,96 (s, 9H, (CH3)3CSi), 0,89 (s, 9H, (CH3)3CSi), 0,15 (s, 3 H, (CH3)Si), 0,14 (s, 3 H, (CH3) Si), 0,07 (s, 6 H, (CH3)2Si). N4-[4-(3-Trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrobenzil]-3',5'-O-bis-terc- butildimetilsilil-2'-desoxicitidina (dC.08)

[000142] Sílica-gel 60 (3,1 g, malha 100-200, ativada por aquecimento a 50-60°C sob pressão reduzida durante 24 horas) foi adicionada a uma solução de composto dC.07 (305 mg, 0,36 mmol) em CH2Cl2 (4 mL), e a mistura foi evaporada em vácuo até a secura. O resíduo foi aquecido a 60-70°C sob pressão reduzida durante 24 horas, lavado três vezes com MeOH (30 mL) e filtrado usando um funil de buchi. O filtrado combinado foi concentrado em vácuo e purificado por cromato- grafia em sílica-gel para produzir N4-[4-(3-trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrobenzil]-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxicitidina dC.08 (219 mg, 81%) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,25 (bs, 1 H, N-H), 7,94 (d, 1 H, J = 7,4 Hz, H-6), 7,84 (s, 1 H, Ph-H), 7,62 (d, 1 H, J = 7,7 Hz, Ph-H), 7,41 (d, 1 H, J = 7,8 Hz, Ph-H), 6,25 (m, 2 H, N-H e H-1), 5,67 (d, 1 H, J = 7,3 Hz, H-5), 4,83 (m, 2 H, Ph-CH2), 4,38 (m, 2 H, CH2 e H-3), 3,90 (m, 2 H, H- 4 e H-5'a), 3,75 (m, 1 H, H-5'b), 2,36 (m, 1 H, H-2'a), 2,05 (m, 1 H, H- 2'b), 0,90 (s, 9H, (CH3)3CSi), 0,87 (s, 9H, (CH3)3CSi), 0,08 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0,05 (s, 6 H, (CH3)2Si).N4-[4-(3-Trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrobenzil]-2-desoxicitidina (dC.09)

[000143] Uma solução de n-Bu4NF (94 mg, 0,36 mmol) em THF (2,5 mL) foi adicionada gota a gota a uma solução de composto dC.08 (200 mg, 0,27 mmol) em THF (1 mL) a 0°C sob uma atmosfera de N2. A mistura reacional foi agitada a 0°C durante duas horas e em seguida em temperatura ambiente durante a noite, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia em sílica-gel para produzir N4-[4-(3- trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrobenzil]-2'-desoxicitidina dC.09 (54mg, 39%) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, (DMSO-d6): δ 10,12 (t, 1 H, N-H), 8,26 (t, 1 H, N-H), 8,08 (s, 1 H, Ph-H), 7,84 (d, 1 H, J = 7,5 Hz, H-6), 7,78 (d, 1 H, J = 8,1 Hz, Ph-H), 7,50 (d, 1 H, J = 8,1 Hz, Ph-H), 6,13 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1), 5,91 (d, 1 H, J = 7,4 Hz, H-5), 5,20 (d, 1 H, 3'-OH), 5,10 (t, 1 H, 5'-OH), 4,77 (d, 2 H, Ph-CH2), 4,35 (m, 1 H, H-3), 4,31 (m, 2 H, CH2), 3,80 (m, 1 H, H-4), 3,55 (m, 2H, H-5), 2,10 (m, 1 H, H-2'a), 1,92 (m, 1 H, H-2'b).N4-[4-(3-Amino-1-propinil)-2-nitrobenzil]-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato (dC.10)

[000144] POCl3 (18 μL, 0,2 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dC.09 (49 mg, 0,1 mmol) e esponja de próton (32 mg, 0,15 mmol) em trimetilfosfato (0,5 mL) a 0°C e agitada durante duas horas. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n-butilamônio (237 mg, 0,5 mmol) e tri-n-butilamina (100 uL) em DMF anidra (1 mL) foi adicionada. Depois de cinco minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trieti- lamônio (1 M, pH 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente, seguida pela adição gota a gota de hidróxido de amônio concentrado (5 mL, 27%) a 0°C. A mistura foi agitada durante uma hora adicional em temperatura ambiente, e em seguida liofilizada até a secura. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado e purificado por cromatografia de permuta de ânion usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de NH4HCO3 (50 mM a 500 mM em 300 minutos) a uma taxa de fluxo de 4,5 mL/minuto. As frações que contêm trifosfato foi combinadas e liofilizadas para produzir para o trifosfato dC.10 (28 mg, 39%) como um sólido macio branco.1H RMN (400 MHz, D2O): δ 8,22 (s, 1 H, Ph-H), 7,88 (d, 1 H, J = 7,6 Hz, H-6), 7,74 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, Ph-H), 7,59 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, Ph- H), 6,33 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1), 6,18 (d, 1 H, J = 7,6 Hz, H-5), 4,61 (m, 1 H, H-3), 4,24 (m, 3 H, H-4, H-5), 3,63 (s, 2 H, CH2), 2,42 (m, 1 H, H-2'a), 2,29 (m, 1 H, H-2'b);31P RMN (162 MHz, D2O): δ -5,88 (d, J = 15,6 Hz), -10,69 (d, J = 15,6 Hz), -19,25 (t, J = 15,6 Hz);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C19H22N5O15P3Na [M- 2H+ Na]-, a massa calculada foi 676.0223, e a massa observada foi 676.0563.N4-[4-(3-Amino-1-propinil)-2-nitrobezil]-2'-desoxicitidina-5'-trífosfato ro-tulado por 6-TAMRA (WW2p080)

[000145] Uma solução de 6-TAMRA-SE (0,75 mg, 1,4 μmol) em DMSO anidroso (30 μL) foi adicionada a uma solução de trifosfato dC.10 (1,6 μmol) em tampão de Na2CO3/NaHCO3 (0,1 M, pH 9,2; 0,3 mL) e incubada em temperatura ambiente durante 30 minutos. A reação foi purificada com HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD-300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir o trifosfato rotulado por 6-TAMRA WW2p080. Fase móvel: A, 100 mM de acetato de trietilamônio (TEAA) em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). A purificação por HPLC foi obtida com um gradiente linear de 5-50% de B durante 40 minutos e em seguida 50-90% de B durante 10 minutos. A concentração de WW2p080 foi estimada por espectroscopia de adsorção usando o coeficiente de extinção do corante de 6-TAMRA (isto é, 65.000 a 555 nm).Síntese de N4 -[1 -(2-nitrofenil)etil]-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato(WW2p115)

Esquema. Síntese de N4 -[1-(2-nitrofenil)etil]-2'-desoxicitidina-5‘-trifosfato. (i) TBSCL, imidiazol, DMF, temperatura ambiente, três horas, 92%; (ii) TPSC1, DMAP, CH2Cl2, temperatura ambiente, 88%; (iii) 1-(2- nitrofenil)etilamina dC.13c, DMF, 90°C, 1,5 horas, 39%; (iv) n-Bu4NF, THF, 0°C, duas horas, em seguida temperatura ambiente, uma hora, 90%; (v) POCl3, esponja de próton, (MeO)3PO, 0°C, duas horas; (n- Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF, cinco minutos; 1 M de HNEt3HCO3, uma hora.3',5'-O-Bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiuridina (dC.11)

[000146] Sob uma atmosfera de nitrogênio, uma mistura de 2'- desoxiuridina dU (2,5 g, 10,95 mmols), TBSCl (7,26 g, 48,2 mmols) e imidiazol (6,56 g, 96,4 mmols) em DMF anidra (25 mL) foi agitada a 0°C durante duas horas e em seguida aquecida em temperatura ambiente durante uma hora. A mistura reacional foi concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel, para produzir 3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiuridina dC.11 (4,62 g, 92%)como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 9,48 (s, 1 H, NH), 7,80 (d, 1 H, J = 8,1 Hz, H-6), 6,19 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 5,59 (d, 1 H, J = 8,1 Hz, H-5), 4,31 (m, 1 H, H-3), 3,81 (m, 2 H, H-4 e H-5'a), 3,65 (m, 1 H, H-5'b), 2,21 (m, 1 H, H-2'a), 1,97 (m, 1H, H-2'b), 0,81 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,79 (s, 9 H, (CH3) 3CSi), 0,00 (s, 6 H, (CH3)2Si), -0,02 (2s, 3 H cada, (CH3)2Si).O4-(2,4,6- Triisopropilbenzenossulfonil)-3, 5 —-O-b)Sí-t:e)i^c-t)ut:idimie)t:iSiiii- 2-desoxiurídina (dC.12)

[000147] Cloreto de 2,4,6-triisopropilbenzenossulfonila (660 mg, 2,19 mmols) foi adicionado a uma solução de composto dC.11 (500 mg, 1,09 mmol), DMAP (6,7 mg, quantidade catalítica) e Et3N (0,62 mL, 4,38 mmols) em CH2Cl2 anidroso (6 mL) sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente duran- te a noite, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel, para produzir O4-(2,4,6-Triisopropilbenzenossulfonil)-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-deso- xiuridina dC.12 (690 mg, 88%) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,46 (d, 1 H, J = 7,3 Hz, H-6), 7,20 (s, 2 H, Ph-H), 6,08 (dd, 1 H, J = 4,3 Hz, H-1), 6,01 (d, 1 H, J = 7,3 Hz, H-5), 4,33 (m, 1 H, H-3), 4,25 (m, 2 H, CH), 3,94 (m, 2 H, H-4 e H-5'a), 3,76 (m, 1 H, H-5'b), 2,91 (m, 1 H, CH), 2,48 (m, 1 H, H-2'a), 2,12 (m, 1 H, H-2'b), 1,31 (d, 6 H, CH3), 1,26 (dd, 12 H, CH3), 0,91 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,86 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,10 e 0,09 (2 s, 6 H, (CH3)2Si), 0,04 (s, 6 H, (CH3)2Si).N4-[1-(2-nitrofenil)etil]-3 '.5-O-bis-terc-butildimetilsilil-2 'desoxicitidina(dC.13)

[000148] Uma solução de composto dC.12 (410 mg, 0,56 mmol) e 1- (2-nitrofenil)etilamina dC.13c (470 mg, 2,82 mmols) em DMF anidra (3 mL) foi aquecida a 90°C durante 1,5 hora e em seguida concentrada em vácuo. O resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 (50 mL), lavado com solução de NH4Cl saturada (30 mL), com água (30 mL) e com solução de NaHCO3 saturada (30 mL). A camada orgânica foi secada com Na2SO4, filtrada, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel, para produzir N4-[1-(2-nitrofenil)etil]-3',5'-O-bis- terc-butildimetilsilil-2'desoxicitidina dC.13 (130 mg, 39%, mistura 1:1 de diastereômeros) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, CDCl3) para diastereômeros: δ 7,97 (m, 1 H, Ph- H), 7,89 (d, 1 H, J = 7,1 Hz, H-6), 7,65 (m, 2 H, Ph-H), 7,41 (m, 1 H, Ph-H), 6,19 (m, 1 H, H-1), 5,91 (m, 1 H, H-5), 5,37 (m, 1 H, Ph-CH), 4,34 (m, 1 H, H-3), 3,86 (m, 2 H, H-4 e H-5'a), 3,72 (m, 1 H, H-5'b), 2,05 (m, 1 H, H-2'a), 1,83 (m, 1 H, H-2'b), 1,59 (bs, 3 H, CH3), 0,86 (s, 12 H, (CH3)3CSi), 0,03 (s, 12 H, (CH3)2Si).N4-[1-(2-nitrofenil)etil]-2 ’-desoxicitidina (dC.14)

[000149] Uma solução de n-Bu4NF (142 mg, 0,54 mmol) em THF (3 mL) foi adicionada a uma solução de composto dC.13 (130 mg, 0,22 mmol) em THF (2 mL) a 0°C. A mistura reacional foi agitada a 0°C durante duas horas e em seguida em temperatura ambiente durante uma hora, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel para produzir N4-[1-(2-nitrofenil)etil]-2-desoxicitidina dC.14 (80 mg, 90%, mistura 1:1 de diastereômeros) como um pó branco.1H RMN (400 MHz, CD3OD) para diastereômeros: δ 7,95 (m, 2 H, Ph-H e H-5), 7,65 (m, 2 H, Ph-H), 7,45 (m, 1 H, Ph-H), 6,22 (m, 1 H, H-1), 5,97 (m, 1 H, H-5), 5,74 (m, 1H, Ph-CH), 4,34 (m, 1 H, H-3), 3,93 (m, 1 H, H-4), 3,75 (m, 2 H, H-5), 2,32 (m, 1 H, H-2'a), 2,09 (m, 1 H, H-2'b), 1,59 (m, 3 H, CH3).N4-[1-(2-nitrofenil)etil]-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato (WW2p115)

[000150] POCI3 (14 μl, 0,15 mmol) foi adicionado a uma solução de composto dC.14 (28 mg, 0,08 mmol) e esponja de próton (23 mg, 0,11 mmol) em trimetilfosfato (0,5 mL) a 0°C e agitado durante duas horas. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n-butilamônio (180 mg, 0,38 mmol) e tri-n-butilamina (80 μL) em DMF anidra (0,8 mL) foi adicionada. Depois de cinco minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente e em seguida liofilizada até a secura. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado e purificado por cromatografia de permuta de ânion usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de NH4HCO3 (50 mM a 500 mM em 300 minutos) em uma taxa de fluxo de 4,5 mL/minuto. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofiliza- das para produzir o trifosfato WW2p115 (24 mg, 47%, mistura 1:1 de diastereômeros) como um sólido macio branco.1H RMN(400 MHz, D2O) para diastereômeros: δ 7,98 (m, 1 H, Ph-H), 7,80 (m, 1 H, H-6), 7,66 (m, 2 H, Ph-H), 7,49 (m, 1 H, Ph-H), 6,24 (m, 1 H, H-1), 6,11 (m, 1 H, H-5), 5,60 (m,1 H, Ph-CH), 4,55 (m, 1 H, H-3), 4,19 (m, 3 H, H-4 e H-5), 2,35 (m, 1 H, H-2'a), 2,24 (m, 1 H, H-2'b), 1,59 (d, 3 H, J = 6,7 Hz, CH3);31P RMN (162 MHz, D2O) para diastereômeros: δ -6,00 (d, J = 14,1 Hz), -10,82 (d, J = 15,6 Hz), -19,36 (t, J = 15,9 Hz);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C17H23N4O15P3Na [M+Na]+, a massa calculada foi 639,0271, e a massa observada foi 639,0332.Síntese de 1-(2-nitrofenil)etilamina (dC.13c)

Esquema para dC.13c. Síntese de 1-(2-nitrofenil)etilamina. (i) NaBH4, MeOH, dioxano, temperatura ambiente, uma hora, 92%; (ii) Ftalimida, DIAD, Ph3P, THF, 0°C, três horas, 99%; (iii) NH2NH2, CH3CH2OH, re-fluxo, uma hora, 80%.1-(2-Nitrofenil)etanol (dC.13a)

[000151] NaBH4 (3,24 g, 85,60 mmols) foi adicionado lentamente a uma solução de 2'-nitroacetofenona NAP (3,74 g, 22,65 mmols) em uma mistura de metanol (34 mL) e dioxano (22 mL). A mistura reacio- nal foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora e em seguida diluída com acetato de etila (100 mL) e lavada com água (25 mL). A camada orgânica foi secada com Na2SO4, filtrada, e concentrada em vácuo para produzir 1-(2-nitrofenil)etanol dC.13a (3,49 g, 92%) como um pó branco.1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 7,89 (d, 1 H, J = 8,1 Hz, Ph-H), 7,83 (d, 1 H, J = 7,4 Hz, Ph-H), 7,65 (t, 1 H, J = 7,4 Hz, Ph-H), 7,42 (t, 1 H, J = 8,1 Hz, Ph-H), 5,41 (q, 1 H, J = 6,0 Hz, Ph-CH), 2,48 (s, 1 H, OH), 1,57 (d, 3 H, J = 6,4 Hz, CH3).N-[1-(2-nitrofenil)etil]ftalimida (dC.13b)

[000152] Ftalimida (660 mg, 4,5 mmols) foi adicionada a uma solução de composto dC.13a (750 mg, 4,5, mmols) e Ph3P (1,41 g, 5,4 mmols) em THF (12 mL). A suspensão foi resfriada a 0°C e agitada durante 10 minutos, e em seguida azodicarboxilato di-isopropila (1,1 mL, 5,4 mmols) foi adicionado gota a gota. Depois da agitação a 0°C durante três horas, a mistura reacional foi concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel para produzir N-[1- (2-nitrofenil)etil]ftalimida dC.13b (1,33 g, 99%) como um óleo marrom. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 7,93 (d, 1 H. J = 7,9 Hz, Ph-H), 7,81 (m, 3 H, Ph-H), 7,71 (m, 2 H, Ph-H), 7,61 (t, 1 H, J = 7,6 Hz, Ph-H), 7,44 (t, 1 H, J = 7,6 Hz, Ph-H), 6,08 (q, 1 H, J = 7,2 Hz, Ph-CH), 1,97 (d, 3 H, J = 7,2 Hz, CH3).1-(2-nitrofenil)etilamina (dC.13c)

[000153] Composto dC.13b (1,33 g, 4,5 mmols) foi dissolvido em etanol (21 mL) ao aquecer a 50°C e em seguida resfriado em temperatura ambiente. Hidrazina (0,55 mL, 11,22 mmols) foi adicionada, e a mistura reacional foi refluxada durante uma hora e em seguida resfriada com gelo. Éter de dietílico (40 mL) foi adicionado para precipitar o composto que foi isolado por filtração e lavado duas vezes com éter dietílico (40 mL cada). O filtrado combinado foi lavado duas vezes com água (40 mL cada) e em seguida com salmoura (40 mL). A camada orgânica foi secada em Na2SO4 e concentrada em vácuo para produzir 1-(4-iodo-2-nitrofenil)etilamina dC.13c (600 mg, 80%) como um óleo marrom.1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 7,78 (m, 2 H. Ph-H), 7,61 (t, 1 H, J = 7,6 Hz, Ph-H), 7,37 (t, 1 H, J = 7,6 Hz, Ph-H), 4,59 (q, 1 H, J = 6,4 Hz, Ph- CH), 1,45 (d, 3 H, J = 6,4 Hz, CH3).Síntese de N4-[1-(2-nitrofenil)etil]-citidina-5'-trifosfato (WW2p152 e WW3p026)

Esquema. Síntese de N4-[1-(2-nitrofenil)etil]-citidina-5'-trifosfato. (i) TBSCl, imidiazol, DMF, temperatura ambiente, 60 horas, 95%; (ii) TPSC1, Et3N, DMAP, CH2Cl2, temperatura ambiente, durante a noite, 80%; (iii) l-(2-nitrofenil)etilamina, DMF, 90°C, 45 minutos; n-Bu4NF, THF, 0°C, em seguida gradualmente aquecidos em temperatura ambiente, duas horas; 60% para dois diastereoisômeros; (iv) POCl3, esponja de próton, (MeO)3PO, 0°C, duas horas; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF, cinco minutos; 1 M de HNEt3HCO3, uma hora. 2',3',5'-O-Tris-terc-butildimetilsilil-uridina (C,1)

[000154] TBSCl (995 mg, 6,6 mmols) foi adicionado a uma solução de uridina (244 mg, 1 mmol) e imidiazol (898 mg, 13,2 mmols) em DMF anidra (5 mL) a 0°C sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura foi aquecida em temperatura ambiente e agitada durante 60 horas. Acetato de etila (30 mL) foi adicionado, e a mistura foi lavada duas vezes com solução de NH4Cl saturada (20 mL cada) e com água (20 mL), secada em Na2SO4, concentrada e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel para produzir 2',3',5'-O-tris-terc-butildimetilsilil-uridina C.1 (558 mg, 95%) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, CDCh): δ 8,79 (s, 1 H, NH), 8,03 (d, 1 H, J = 8,2 Hz, H-6), 5,87 (d, 1 H, J = 3,5 Hz, H-1), 5,68 (d, 1 H, J = 8,2 Hz, H-5), 4,08 (m, 3 H, H-2, H-3 e H-4), 3,99 (d, 1 H, J = 11,6 Hz, H-5'a), 3,77 (d, 1 H, J = 11,6 Hz, H-5'b), 0,95 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,91 e 0,90 (2 s, 18 H, (CH3) 3CSi), 0,09 (5 s, 18 H, (CH3)Si).O4-(2,4,6-Triisopropil-benzenossulfonil)-2',3',5'-O-tris-terc- butildimetilsilil-uridina (C.2)

[000155] Cloreto de 2,4,6-triisopropilbenzenossulfonila (557 mg, 1,84 mmol) foi adicionado a uma solução de composto C.1 (540 mg, 0,92 mmol), DMAP (12 mg, quantidade catalítica) e Et3N (0,5 mL, 3,68 mmols) em CH2Cl2 anidroso (10 mL) sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante a noite, CH2Cl2 (20 mL) foi adicionado, lavada com solução de NH4Cl saturada (15 mL), secada em Na2SO4, concentrada e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel para produzir O4-(2,4,6-triisopropil- benzenossulfonil)-2',3',5'-O-tris-terc-butildimetilsilil-uridina C.2 (629 mg, 80%) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,62 (d, 1 H, J = 7,3 Hz, H-6), 7,20 (s, 2 H, Ph-H), 5,99 (d, 1 H, J = 7,3 Hz, H-5), 5,68 (d, 1 H, J = 1,0 Hz, H-1), 4,23 (m, 2 H, CH), 4,09 (m, 3, H, H-2, H-3 e H-4), 4,00 (m, 1 H, H-5'a), 3,78 (1 H, d, J = 11,8 Hz, H-5'b), 2,90 (m, 1 H, CH), 1,31 (d, 6 H, CH3), 1,26 (dd, 12 H, CH3), 0,94 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,88 (2 s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,17 - 0,05 (6 S, 18 H, (CH3)2Si).N4-[1-(2-Nitrofenil)etil]-citidina (diastereoisômero simples C.3 ds1 e C.3 ds2)

[000156] Uma solução de composto C.2 (476 mg, 0,56 mmol) e 1-(2- nitrofenil)etilamina dC. 13c (498 mg, 3 mmols) em DMF anidra (4 mL) foi aquecida a 90°C durante 45 minutos. Acetato de etila (40 mL) foi adicionado, a mistura foi lavada com solução de NH4Cl saturada (20 mL) e água (20 mL) e secada com Na2SO4, concentrada. Os dois dias- tereoisômeros foram separados por cromatografia de coluna em sílica- gel para produzir N4-[1-(2-nitrofenil)etil]-2',3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-citidina diastereoisômero simples ds1 (eluição rápida, 290 mg) e ds2 (eluição lenta, 203 mg). Ambos diastereoisômeros simples foram usados na próxima etapa sem outra purificação.N4 -[(R ou S)-1-(2-nitrofenil)etil]-citidina (diastereoisômero simples C.3 ds1)

[000157] Uma solução de n-Bu4NF (235 mg, 0,9 mmol) em THF (3 mL) foi adicionada a uma solução de N4-[1-(2-nitrofenil)etil]-2',3',5'-O- bis-terc-butildimetilsilil-citidina diastereoisômero simples ds1 (264 mg) em THF (4 mL) a 0°C. A mistura reacional foi gradualmente aquecida em temperatura ambiente e agitada durante duas horas. Sílica-gel 60 (1 g) foi adicionada, e a mistura foi evaporada em vácuo até a secura. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel para produzir N4-[(R ou S)-1-(2-nitrofenil)etil]-citidina diastereoisômero simples C.3 ds1 (65 mg, aprox. 30% para duas etapas, configuração absoluta não determinada) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,39 (d, 1 H, D2O permutável, NH), 7,92 (dd, 1 H, J = 1,1 e 8,1 Hz, Ph-H), 7,82 (d, 1 H, J = 7,5 Hz, H-6), 7,70 (dt, 1 H, J = 1,1 e 7,5 Hz, Ph-H), 7,64 (dd, 1 H, J = 1,2 e 7,5 Hz, Ph-H), 7,49 (dt, 1 H, J = 1,3 e 7,5 Hz, Ph-H), 1 H, Ph-H), 5,80 (d, 1 H, J = 7,5 Hz, H-5), 5,65 (d, 1 H, J = 3,4 Hz, H-1), 5,50 (m, 1 H, Ph-CH), 5,30 (d, 1 H, D2O permutável, 3'-OH), 5,02 (t, 1 H, D2O permutável, 5'- OH), 4,96 (d, 1 H, D2O permutável, 2'-OH), 3,90 (m, 2 H, H-2 e H-3), 3,78 (m, 1 H, H-4), 3,59 (m, 1 H, H-5'a), 3,50 (m, 1 H, H-5'b), 1,48 (d, 3 H, J = 6,9 Hz, CH3).N4-[(S ou R)-1-(2-nitrofenil)etil]-citidina (diastereoisômero simples C.3 ds2)

[000158] Uma solução de n-Bu4NF (167 mg, 0,64 mmol) em THF (2 mL) foi adicionada a uma solução de N4-[1-(2-nitrofenil)etil]-2',3',5'-O- bis-terc-butildimetilsilil-citidina diastereoisômero simples ds2 (188 mg) em THF (3 mL) a 0°C. A mistura reacional foi gradualmente aquecida em temperatura ambiente e agitada durante uma hora. Sílica-gel 60 (1 g) foi adicionada, e a mistura foi evaporada em vácuo até a secura. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel para produzir N4-[(S ou R)-1-(2-nitrofenil)etil]-citidina diastereoisômero simples C.3 ds2 (67 mg, aprox. 30% para duas etapas, configuração absoluta não determinada) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,38 (d, 1 H, D2O permutável, NH), 7,92 (dd, 1 H, J = 1,1 e 8,1 Hz, Ph-H), 7,80 (d, 1 H, J = 7,5 Hz, H-6), 7,72 (dt, 1 H, J = 1,0 e 7,5 Hz, Ph-H), 7,63 (dd, 1 H, J = 1,1 e 7,5 Hz, Ph-H), 7,49 (dt, 1 H, J = 1,3 e 7,5 Hz, Ph-H), 5,79 (d, 1 H, J = 7,5 Hz, H-5), 5,68 (d, 1 H, J = 4,0 Hz, H-1), 5,51 (m, 1 H, Ph-CH), 5,20 (d, 1 H, D2O permutável, 3'- OH), 5,01 (t, 1 H, D2O permutável, 5'-OH), 4,93 (d, 1 H, D2O permutável, 2'-OH), 3,87 (m, 2 H, H-2 e H-3), 3,78 (m, 1 H, H-4), 3,59 (m, 1 H, H-5'a), 3,50 (m, 1 H, H-5'a), 1,49 (d, 3 H, J = 6,9 Hz, CH3).N4-[(R ou S)-1-(2-Nitrofenil)etil]-citidina-5'-trifosfato diastereoisômero simples (WW3p 026)

[000159] POCl3 (14 μL, 0,15 mmol) foi adicionado a uma solução de composto C.3 ds1 (29 mg, 0,074 mmol) e esponja de próton (32 mg, 0,15 mmol) em trimetilfosfato (0,5 mL) a 0°C e agitada durante duas horas. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n-butilamônio (175 mg, 0,37 mmol) e tri-n -butilamina (74 μL) em DMF anidra (0,74 mL) foi adicionada. Depois de cinco minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente e em seguida liofi- lizada até a secura. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL) e parte da solução foi purificada com HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD-300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir N4-[(R ou S)-1-(2-nitrofenil)etil]-citidina-5'-trifosfato diastereoisômero simplesWW3p026 (configuração absoluta não determinada). Fase móvel: A, 100 mM de acetato de trietilamônio (TEAA) em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). Purificação de HPLC foi obtida usando um gradiente linear de 5-50% de B durante 20 minutos e em seguida 50-90% de B durante 10 minutos.1H RMN (400 MHz, D2O): δ 8,0 (d, 1 H, J = 8,1 Hz, Ph-H), 7,92 (d, 1 H, J = 7,6 Hz, H-6), 7,70 (m, 2 H, Ph-H), 7,50 (t, 1 H, J = 8,0 Hz, Ph-H), 6,14 (d, 1 H, J = 7,6 Hz, H-5), 5,92 (d, 1 H, J = 4,1 Hz, H-1), 5,61 (q, 1 H, J = 6,8 Hz, Ph-CH), 4,33 - 4,21 (m, 3 H, H-2, H-3 e H-4), 4,01 (m, 2 H, H-5), 1,60 (d, 3 H, J = 6,8 Hz, CH3);N4-[(S ou R)-1-(2-nitrofenil)etil]-citidina-5'-trifosfato diastereoisômero simples (WW2p152)

[000160] POCl3 (11 μL, 0,12 mmol) foi adicionado a uma solução de composto C.3 ds2 (31 mg, 0,08 mmol) e esponja de próton (26 mg, 0,12 mmol) em trimetilfosfato (0,5 mL) a 0°C e agitada durante duas horas. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n-butilamônio (190 mg, 0,4 mmol) e tri-n-butilamina (80 μL) em DMF anidra (0,8 mL) foi adicionada. Depois de cinco minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente e em seguida liofilizada até a secura. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado e puri-ficado por cromatografia de permuta de ânion usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de NH4HCO3 (50 mM a 500 mM em 240 minutos) em uma taxa de fluxo de 4,5 mL/minuto. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofiliza- das para produzir N4-[(S ou R)-1-(2-nitrofenil)etil]-citidina-5'-trifosfato diastereoisômero simples WW2p152 (26 mg, 47%, configuração absoluta não determinada) como um sólido macio branco.1H RMN (400 MHz, D2O): δ 7,99 (d, 1 H, J = 8,2 Hz, Ph-H), 7,82 (d, 1 H, J = 7,6 Hz, H-6), 7,68 (m, 2 H, Ph-H), 7,50 (t, 1 H, J = 7,8 Hz, Ph-H), 6,12 (d, 1 H, J = 7,5 Hz, H - 5), 5,91 (d, 1 H, J = 4,4 Hz, H-1), 5,60 (q, 1 H, J = 6,8 Hz, Ph-CH), 4,26 (m, 5 H, H-2, H-3, H-4 e H-5), 1,60 (d, 3 H, J = 6,8 Hz, CH3);31P RMN (162 MHz, D2O): δ -5,18(d, J = 19,8 Hz), -10,46 (d, J = 19,1 Hz), -20,98 (t, J = 19,6Hz);ToF- MS (ESI): Para o ion molecular CyH^O^Na [M-2H+Na]-, a massa calculada foi 653,0063, e a massa observada foi 652,9975.Síntese de 5-[1 -(2-nitrofenil)etiloximetil]-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato (WW3p ###)

Esquema. Síntese de 5-[1-(2-nitrofenil)etiloximetil]-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato.

[000161] (i) TBSCL, imidazol, DMF, temperatura ambiente, 24 horas,42%; (ii) TPSC1, DMAP, Et3N, CH2Cl2, temperatura ambiente, 48 horas, 56%; (iii) NH3, 1,4-dioxano, 80°C, duas horas, 56%; (iv) n-BU4NF, THF, temperatura ambiente; (v) POCl3, esponja de próton, (MeO)3PO, 0°C; (n-Bu3NH)2 H2P2O7, n-BU3N, DMF, cinco minutos; 1 M deHNEt3HCO3, uma hora.3 ',5 '-bis-terc-butlldimetllsllll-^-ll-fê-nitrofenll)-etiloximetill-2'- desoxiurdina (dC.15)

[000162] Uma solução de TBSCl (114 mg, 0,76 mmol) em DMF anidra (0,5 mL) foi adicionada a uma solução de composto dT.07 (97 mg, 0,24 mmol) e imidiazol (103 mg, 1,52 mmol) em DMF anidra (1 mL). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 24 horas sob uma atmosfera de nitrogênio, em seguida concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel, para produzir 3',5'- bis-terc-butildimetilsilil-5-[1-(2-nitrofenil)-etiloximetil]-2'-desoxiuridina dC.15 (64 mg, 42%, mistura 1:1 de diastereômeros).1H RMN (400 MHz, CDCl3) para diastereômeros: δ 9,39 e 9,33 (2 br s, 1 H, NH), 7,92 (m, 2 H, Ph-H), 7,70 (m, 2 H, H-6 e Ph-H), 7,42 (m, 1 H, Ph-H), 6,29 (m, 1 H, H-1), 5,11 (m, 1 H, Ph-CH), 4,41 (m, 1 H, H-3), 4,04 (m, 2 H, CH2), 3,96 (m, 1 H, H-4), 3,80 (m, 2 H, H-5), 2,38 (m, 1 H, H-2'a), 2,04 (m, 1 H, H-2'b), 1,55 (m, 3 H, CH3), 0,91 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,10 (s, 12 H, (CH3)2Si);13C RMN (100 MHz, CDCl3) para diastereômeros: δ 162,89/162,76 (C), 150,15 (C), 148,40 (C), 139,21/139,17 (C), 138,94/138,68 (CH),133,86/ 133,76 (CH), 128,22/128,19 (CH), 128,17/128,07 (CH), 124,23 (CH), 111,30/111,22 (C), 87,97/87,94 (CH), 85,43/85,37 (CH),73,46/73,43 (CH), 72,34/72,28 (CH), 63,92/63,77 (CH2), 63,07 (CH2), 41,27/41,17 (CH2), 25,97/25,93 (CH3), 23,69/23,57 (CH3), 18,43/18,41 (C), -4,64/-4,82 (CH3), -5,37/-5,40 (CH3).ES+ MS (ESI): 658 [M+Na]+;O4-(2,4,6- Triisopropilbenzenossulfonil)-3', 5 --bisi-t:e)i1:b)ut:ldimie)t:lsilill-5>-11 - (2-nitro-fenil)etiloximetil]-2'-deoxiuridina (dC.16)

[000163] Uma solução de cloreto de 2,4,6-triisopropilbenzenos- sulfonila (61 mg, 0,20 mmol) foi adicionada a uma solução de dC.15 (64 mg, 0,10 mmol) e DMAP (6 mg, 0,05 mmol) em CH2Cl2 anidroso (3 mL) seguido por Et3N (63 μL, 0,45 mmol). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 48 horas sob uma atmosfera de nitrogênio, em seguida concentrada em vácuo e purificada por cromatogra- fia de coluna em sílica-gel, para produzir O4-(2,4,6-triisopropilbenze- nossulfonil)-3',5'-bis-terc-butildimetilsilil-5-[1-(2-nitrofenil)etilóxi-metil]- 2'-deoxiuridina dC.16 (50 mg, 56%, mistura 1:1 de diastereômeros).1H RMN (400 MHz, CDCl3) para diastereômeros: δ 8,33 e 8,28 (2 s, 1 H, Ph-H), 7,90 (m, 3 H, Ph-H), 7,67 (m, 2 H, H-6 e Ph-H), 7,44 (m, 1 H, Ph-H), 6,27 (m, 1 H, H-1), 5,11 (m, 1 H, Ph-CH), 4,40 (m, 1 H, H-3), 4,06 (m, 2 H, CH2), 3,97 (m, 1 H, H-4), 3,79 (m, 2 H, H-5), 2,38 (m, 1 H, H-2'a), 2,04 (m, 1 H, H-2'b), 1,54 (m, 3 H, CH3), 1,60 (m, 3 H, CH), 0,91 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,80 (m, 18 H, CH3), 0,09 (s, 12 H, (CH3)2Si); 3 ',5 '-b)is:-1:e>i'c:-b)u1:lldimie>1:llsilrll-5>-[1-(2!-n'i1:i'ofe>nl))e>1:lloxiimie>1:ll]-2' -desoxicitidina (dC.17)

[000164] Uma solução de NH3 (1 mL, 0,5 M em dioxano) foi adicionada a uma solução de composto dC.16 (48 mg, 0,05 mmol) em 1,4- dioxano anidro (1 mL). A mistura foi agitada a 80°C durante duas horas, em seguida concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel, para produzir 3',5'-bis-teic-butildimetilsilil-5-[1- (2-nitrofenil)etilóxi-metil]-2'-desoxicitidina dC.18 (25 mg, 58%, mistura 1:1 de diastereômeros).Exemplo 4: compostos de dGSíntese de N2-(2-nitrobenzil)-2'-desoxiguanidina-5'-trifosfato (WW2p067)

Esquema. Síntese de N2-(2-nitrobenzil)-2'-desoxiguanidina-5'-trifosfato. (i) TBSCl, imidazol, DMF anidroso, 0°C, em seguida gradualmente aquecidos em temperatura ambiente, durante a noite, 96%; (ii) Ac20, piridina anidrosa, temperatura ambiente, 100°C, 72%; (iii) Boc2O, Et3N, DMAP, CH2Cl2, refluxo, duas horas, 54%; (iv) K2CO3, MeOH, 95%; (v). 2-nitrobenzilbrometo, NaH, DMF, 0°C, em seguida gradualmente aquecidos em temperatura ambiente, uma hora, 91%; (vi) SiO2, vácuo, 70-80°C, 48 horas, 97%; (vii) n-Bu4NF, THF, 0°C, uma hora, em seguida temperatura ambiente, duas horas, 83%; (viii) POCl3, (MeO)3PO, menos 20-30°C, duas horas; (n-Bu3NH)2H2 P2O7, n-Bu3N, DMF, cinco minutos; 1 M de HNEt3HCO3, uma hora, 62%. 3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiguanosina (dG.01)

[000165] 2'-desoxiguanosina dG (0,89 g, 3,30 mmols), imidazol (2,0 g, 29,32 mmols) e TBSCl (2,34 g, 15,55 mmols) foram adicionados a DMF anidra (8 mL) a 0°C sob uma atmosfera de N2. A mistura reacio- nal foi gradualmente aquecida em temperatura ambiente e agitada durante a noite. A mistura foi em seguida concentrada em vácuo, tratada com uma mistura de CHCl3 (8 mL) e MeOH (8 mL), concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de sílica-gel para produzir 3',5'-O- bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiguanosina dG.01 (1,57 g, 96%) como um pó branco.1H RMN (400 MHz, DMSO-fa): δ 10,60 (br s, 1 H, H-1), 7,88 (s, 1 H, H- 8), 6,47 (br s, 2 H, NH2), 6,10 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1), 4,48 (m, 1 H, H- 3), 3,80 (m, 1 H, H-4), 3,70 (m, 2 H, H-5'a e H-5'b), 2,64 (m, 1 H, H- 2'a), 2,18 (m, 1 H, H-2'b), 0,89 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,86 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,11 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0,03 (s, 6 H, (CH3)2Si).N2-Acetil-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiguanosina (dG.02)

[000166] Anidro acético (1,22 mL, 12,92 mmols) foi adicionado lentamente a uma solução de composto dG.01 (0,51 g, 1,03 mmol) em piridina anidroso (10 mL) em temperatura ambiente e agitada a 100°C durante três hora. A reação foi concentrada em vácuo, co-evaporada três vezes com etanol anidroso (15 mL) e purificada por cromatografia de sílica-gel para produzir N2-acetil-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'- desoxiguanosina dG.02 (0,34 g, 56%) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 12,03 (s, 1 H, NH), 11,70 (s. 1 H, NH), 8,20 (s, 1 H, H-8), 6,19 (t, 1 H, J = 6,2 Hz, H-1), 4,51 (m, 1 H, H- 3), 3,84 (m, 1 H, H-4), 3,68 (m, 2 H, H-5'a e H-5'b), 2,71 (m, 1 H, H- 2'a), 2,17 (m, 1 H, H-2'b), 0,89 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,86 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,11 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0,04 (s, 6 H, (CH3)2Si).N1,N2-bis-terc-butilóxi-carbonil-N2-acetil-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil- 2'-desoxiguanidina (dG.03)

[000167] Uma solução de di-terc-butildicarbonato (8,75 g, 40 mmols) em CH2Cl2 anidroso (27 mL) foi adicionada a uma solução de composto dG.02 (1,85 g, 3,44 mmols), Et3N (12,17 mL, 15,48 mmols), e DMAP (1,72 g, 14,10 mmols) em CH2Cl2 anidroso (20 mL) sob uma atmosfera de N2. A mistura reacional foi refluxada durante duas horas, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de sílica-gel para produzir N1,N2-bis-terc-butilóxi-carbonil-N2-acetil-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiguanidina dG.03 (1,37 g, 54%) como uma es-puma branca.1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,25 (s, 1 H, H-8), 6,43 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 4,59 (m, 1 H, H-3), 3,99 (m, 1 H, H-4), 3,87 (m, 1 H, H-5'a), 3,87 (m, 1 H, H-5'b), 2,60 (um, 3H, CH3CO), 2,52 (m, 1 H, H-2'a), 2,41 (m, 1 H, H-2'b), 1,71 (s, 9H, (CH3)3CO), 1,36 (s, 9H, (CH3)3CO), 0,92 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,91 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,10 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0,09 (s, 6 H, (CH3)2Si).N1,N2 -bis-terc-butiloxicarbonil-3',5'- O-bis-terc-butildimetilsilil-2'- desoxiguanidina (dG.04)

[000168] Composto dG.03 (1,31 g, 1,78 mmol) foi tratado com K2CO3 (1,23 g, 8,90 mmols) em MeOH (20,5 mL) em temperatura ambiente durante 30 minutos. A reação foi concentrada em vácuo, dissolvida em acetato de etila (50 mL) e lavada duas vezes com água (10 mL). A camada orgânica foi secada com Na2SO4 e concentrada em vácuo para produzir N1,N2-bis-terc-butiloxicarbonil-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiguanidina dG.04 (1,18 g, 95%) como uma es-puma branca.1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 9,82 (bs, 1 H,N-H), 8,24 (s, 1 H, H-8), 6,27 (t, 1 H, J = 6,6 Hz, H-1), 4,71 (m, 1 H, H-3), 3,82 (m, 1 H, H-4), 3,79 (m, 1 H, H-5'a), 3,73 (m, 1 H, H-5'b), 2,95 (m, 1 H, H-2'a), 2,30 (m, 1 H, H-2'b), 1,66 (s, 9 H, (CH3)3CO), 1,48 (s, 9 H, (CH3)3CO), 0,89 (s, 9H, (CH3)3CSi), 0,83 (s, 9H, (CH3)3CSi), 0,11 (2 S, 6 H, (CH3)2Si), -0,01 (2 S, 6 H, (CH3)2Si).N1,N2-bis-terc-butiloxicarbonil-N2 -(2-nitrobenzil)-3',5‘-O -bis-terc- butildimetilsilil-2'-desoxiguanidina (dG.05)

[000169] NaH (22 mg, 0,93 mmol, seco) foi adicionado a uma solução de composto dG.04 (500 mg, 0,72, mmol) em DMF anidra (6 mL) a 0°C e agitada durante 30 minutos sob uma atmosfera de N2. Uma solução de brometo de 2-nitrobenzila (202 mg, 0,94 mmol) em DMF anidra (3 mL) foi adicionada gota a gota. A reação foi agitada a 0°C durante uma hora e em seguida concentrada em vácuo. Acetato de etila (50 mL) foi adicionado, e a mistura foi lavada duas vezes com solução de NH4Cl saturada (20 mL). A camada aquosa combinada foi extraída com acetato de etila (20 mL), e a camada orgânica combinada foi secada com Na2SO4, concentrada em vácuo e purificada por cromatogra- fia de sílica-gel para produzir N1,N2-bis-terc-butiloxicarbonil-N2-(2- nitrobenzil)-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiguanidina dG.05(543 mg, 91%) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,12 (s, 1 H, H-8), 8,06 (m, 1 H, Ph-H), 7,68 (m, 1 H, Ph-H), 7,56 (m, 1 H, Ph-H), 7,38 (m, 1 H, Ph-H), 6,41 (6, J = 6,2 Hz, 1 H, H-2), 5,49 (s, 2 H, Ph-CH2), 4,56 (m, 1 H, H-3), 4,00 (m, 1 H, H-4), 3,80 (m, 2 H, H-5), 2,52 (m, 1 H, H-2'a), 2,39 (m, 1 H, H- 2'b), 1,54 (s, 9 H, (CH3)3CO), 1,45 (s, 9 H, (CH3)3CO), 0,92 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,10 (s, 12 H, (CH3)2Si).N2-(2-Nitrobenzil)-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiguanidina (dG.06)

[000170] Sílica-gel 60 (4,5 g, 100-200 mesh, ativada por aquecimento a 50-60°C sob pressão reduzida durante 24 horas) foi adicionada a uma solução de composto dG.05 (450 mg, 0,54 mmol) em CH2Cl2 (5 mL), e a mistura foi evaporada em vácuo até a secura. O resíduo foi aquecido a 60-70°C sob pressão reduzida durante 48 horas, lavado três vezes com MeOH (50 mL) e filtrado usando um funil de buchi. O filtrado combinado foi concentrado em vácuo e purificado por cromato- grafia de sílica-gel para produzir N2-(2-nitrobenzil)-3',5'-O-bis-terc- butildimetilsilil-2'-desoxiguanidina dG.06 (333 mg, 97%) como uma es-puma branca.1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 10,85 (s, 1 H,N-H), 8,05 (m, 1 H, Ph- H), 7,85 (s, 1 H, H-8), 7,69 (m, 1 H, Ph-H), 7,62 (m, 1 H, Ph-H), 7,54 (m, 1 H, Ph-H), 7,10 (t, 1 H, NH), 6,07 (t, 1 H, J =, H-1), 4,78 (m, 2 H, Ph-CH2), 4,40 (m, 1 H, H-3), 3,79 (m, 1 H, H-4), 3,62 (m, 2 H, H-5), 2,60 (m, 1 H, H-2'a), 2,15 (m, 1 H, H-2'b), 0,86 (s, 9H, (CH3)3CSi), 0,85 (s, 9H, (CH3)3CSi), 0,06 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0,01 (s, 6 H, (CH3)2Si).N2-(2-Nitrobenzil)-2'-desoxiguanidina (dG.07)

[000171] Uma solução de n-Bu4NF (393 mg, 1,5 mmol) em THF (6 mL) foi adicionada gota a gota a uma solução de composto dG.06 (313 mg, 0,5 mmol) em THF (12 mL) a 0°C. A mistura reacional foi agitada a 0°C durante uma hora e em seguida em temperatura ambiente durante duas horas. A reação foi concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de sílica-gel para produzir N2-(2-nitrobenzil)-2'- desoxiguanidina dG.07 (165 mg, 83%) como uma espuma amarela.1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 10,82 (s, 1 H, D2O permutável,N-H), 8,06 (m, 1, H, Ph-H), 7,90 (s, 1 H, H-8), 7,72 (m, 1 H, Ph-H), 7,64 (m, 1 H, Ph- H), 7,55 (m, 1 H, Ph-H), 7,06 (t, 1 H, D2O permutável,N-H), 6,08 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 5,23 (d, 1 H, D2O permutável, 3'-OH), 4,80 (t, 3 H, entre eles 1 H D2O permutável, 5'-OH e Ph-CH2), 4,25 (m, 1 H, H-3), 3,77 (m, 1 H, H- 4), 3,42 (m, 2 H, H-5), 2,45 (m, 1 H, H-2'a), 2,12 (m, 1 H, H-2'b).N2-(2-Nitrobenzil)-2'-desoxiguanidina-5'-trífosfato (WW2p067)

[000172] POCl3 (17 μL, 0,18 mmol) foi adicionado gota a gota a uma solução de composto dG.07 (50 mg, 0,12 mmol) em trimetilfosfato (0,5 mL) e mantido a menos 20-30°C durante duas horas. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n-butilamônio (205 mg, 0,6 mmol) e tri-n- butilamina (120 μL) em DMF anidra (1,2 mL) foi adicionada. Depois de cinco minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente e em seguida liofilizada até a secura. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado e purificado por croma- tografia de permuta de ânion usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de NH4HCO3 (50 mM a 500 mM em 300 minutos) em uma taxa de fluxo de 4,5 mL/minuto. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas para produzir N2-(2- nitrobenzil)-2'-desoxiguanidina-5'-trifosfato WW2p067 (52 mg, 62%)como um sólido macio branco.1H RMN (400 MHz, D2O): δ 8,08 (d, 1 H, Ph-H), 8,04 (s, 1 H, H-8), 7,68 (m, 2 H, Ph-H),7,51 (t, 1 H,Ph-H),6,27(t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1), 4,63 (m, 1 H,H-3), 4,21 (m, 1 H, H-4), 4,10 (m, 2 H, H-5), 2,66 (m, 1 H, H-2'a), 2,41 (m, 1 H, H-2'b);31P RMN (162 MHz, D2O): δ -6,48 (d, J = 15,7 Hz), -11,40 (d, J = 15,2 Hz), -19,94 (br);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C17H19N6O15P3Na [M- 2H+Na]-, a massa calculada foi 663,0019, e a massa observada foi 663,0143.Síntese de O6 -(2-nitrobenzil)-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato(WW2p077)

Esquema. Síntese de O6-(2-nitrobenzil)-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato. (i) cloreto de 2-mesitileno-sulfonila, Et3N, DMAP, CH2Cl2 ani- droso, HMPA, temperatura ambiente, durante a noite, 98%; (ii) álcool 2-nitrobenzílico, DABCO, DBU, peneiras moleculares, 1,2-DME ani- droso, 0°C, em seguida gradualmentre aquecido em temperatura ambiente, 24 horas, 77%; (iii) n-BU4NF, THF, temperatura ambiente, 1,5 hora, 94%; (iv) POCl3, (MeO)3PO, menos 20-30°C, duas horas; (n- Bu3NH)2H2P2O7, n-BU3N, DMF, cinco minutos; 1 M de HNEt3HCO3, uma hora, 35%.O6-(2-Mesitilenossulfonil)-3',5'-bis-O-(terc-butildimetilsilil)-2'- desoxiguanosina (dG.08)

[000173] Cloreto de 2-mesitilenossulfonila (510 mg, 2,34 mmols), Et3N (0,56 mL, 4,0 mmols) e DMAP (27 mg, 0,197 mmol) foram adicionados a uma solução de composto dG.01 (500 mg, 1,0 mmol) em uma mistura de hexmetilfosforamida (1,5 mL) e CH2Cl2 anidroso (7 mL). A reação foi agitada em temperatura ambiente durante a noite e em seguida diluída com éter etílico (25 mL). A solução de éter foi lavada duas vezes com uma solução saturada de NaHCO3 (10 mL cada) e em seguida com salmoura (10 mL). A camada orgânica foi secada em Na2SO4 e concentrada em vácuo para produzir um semi-sólido que foi dissolvido em éter etílico (2 mL) e gradualmente diluída com hexano (40 mL). O precipitado foi coletado por filtração para produzir O6-(2- mesitilenossulfoni1)-3',5'-bis-O-(terc-butildimetilsilil)-2'-desoxiguano- sina dG.08 (737 mg, 98%).1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 7,98 (s, 1 H, H-8), 6,98 (s, 2 H, Ph-H), 6,28 (t, 1 H, J = 6,5 Hz, H-1), 4,84 (br s, 2 H, NH2), 4,57 (m, 1 H, H-3), 3,97 (m, 1 H, H-4), 3,78 (dd, 1H, J = 2,9 e 11,0 Hz, H-5'a), 3,75 (dd, 1 H, J = 2,9 e 11,0 Hz, H-5'b), 2,75 (s, 6 H, CH3), 2,53 (m, 1 H, H-2'a), 2,34 (m, 1 H, H-2'b), 2,31 (s, 3 H, CH3), 0,91 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,90 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,09 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0,06 (s, 6 H, (CH3)2Si). O6-(2-Nitrobenzil)-3',5'-bis-O-(terc-butildimetilsilil)-2'-desoxiguanosina(dG.09)

[000174] DABCO (139 mg, 1,24 mmol) e álcool 2-nitrobenzílico (474 mg, 3,10 mmols) foram adicionados a uma solução de composto dG.08 (420 mg, 0,62 mmol) e peneiras moleculares de 4 Â (200 mg) em 1,2-DME anidroso (6,2 mL) a 0°C. A mistura foi aquecida em temperatura ambiente e agitada durante 30 minutos. DBU (139 μL, 0,93 mmol) foi adicionado, e a reação foi agitada em temperatura ambiente durante 24 horas. Acetato de etila (100 mL) foi adicionado, e a camada orgânica foi lavada com água (20 mL) e salmoura (20 mL), secada em Na2SO4, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de sílica-gel para produzir O6-(2-nitrobenzil)-3',5'-bis-O-(terc-butildimetilsilil)- 2'-desoxiguanosina dG.09 (300 mg, 77%).1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,09 (dd, 1 H, J = 1,1 e 8,2 Hz, Ph-H), 7,94 (s, 1 H, H-8), 7,86 (d, 1 H, J = 7,7 Hz, Ph-H), 7,60 (dt, 1 H, J = 1,1 e 7,7 Hz, Ph-H), 7,45 (dt, 1H, J = 1,0 e 8,2 Hz, Ph-H), 6,32 (t, 1 H, J = 6,5 Hz, H-1), 5,94 (s, 2H, NH2), 4,89 (s, 2 H, PhCH2), 4,59 (m, 1 H, H- 3), 3,98 (m, 1 H, H-4), 3,81 (dd, 1 H, J = 2,9 e 11,0 Hz, H-5'a), 3,75 (dd, 1 H, J = 2,9 e 11,0 Hz, H-5'b), 2,58 (m, 1 H, H-2'a), 2,37 (m, 1H, H-2'b), 0,91 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,10 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0,08 (s, 6 H, (CH3)2Si).O6 -(2-Nitrobenzil)-2'-desoxiguanosina (dG.10)

[000175] Uma solução de n-Bu4NF (252 mg, 0,80 mmol) em THF (4 mL) foi adicionada a uma solução de composto dG.09 (200 mg, 0,32 mmol) em THF (4 mL) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada durante 1,5 hora, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de sílica-gel para produzir O6-(2-nitrobenzil)-2'-desoxiguanosina dG.10 (119 mg, 94%).1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,16 (dd, 1 H, J = 1,0 e 8,2, Hz, Ph- H), 8,13 (s, 1 H, H-8), 7,79 (m, 2 H, Ph-H), 7,63 (m, 1 H, Ph-H), 6,49 (br s, 2 H, D2O permutável, NH2), 6,22 (dd, 1 H, J = 6,1 e 7,7 Hz, H-1), 5,87 (s, 2 H, PhCH2), 5,28 (br, 1 H, D2O permutável, 5'-OH), 4,99 (br, 1 H, D2O permutável, 3'-OH), 4,35 (m, 1 H, H-3), 3,82 (m, 1 H, H-4), 3,55 (m, 1 H, H-5'b), 3,52 (m, 1 H, H-5'a), 2,58 (m, 1 H, H-2'a), 2,23 (m, 1 H, H-2'b).O6 -(2-Nitrobenzil)-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato (WW2p077)

[000176] POCl3 (14 μL, 0,1 mmol) foi adicionado gota a gota a uma solução de composto dG.10 (43 mg, 0,1 mmol) em trimetilfosfato (0,5 mL) e mantido a menos 20-30°C durante duas horas. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n-butilamônio (237 mg, 0,5 mmol) e tri-n- butilamina (100 μL) em DMF anidra (1,0 mL) foi adicionada. Depois de cinco minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente e em seguida liofilizada até a secura. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado e purificado por croma- tografia de permuta de ânion usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de NH4HCO3 (50 mM a 500 mM em 300 minutos) em uma taxa de fluxo de 4,5 mL/minuto. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas para produzir O6-(2- nitrobenzil)-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato WW2p077 (24 mg, 35%) como um sólido macio branco.1H RMN (400 MHz, D2O): δ 8,21 (s, 1 H, H-8), 8,13 (d, J = 8,2 Hz, 1 H, Ph-H), 7,83 (d, 1 H, J = 7,8 Hz, Ph-H), 7,74 (t, 1 H, J = 7,8 Hz, Ph-H), 7,51 (t, J = 7,8 Hz, 1 H, Ph-H), 6,35 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1), 5,86 (s, 2 H, Ph-CH2), 4,28 (m, 1 H, H-4), 4,23 (m, 2 H, H-5), 2,82 (m, 1 H, H- 2'a), 2,57 (m, 1 H, H-2'b);31P RMN (162 MHz, D2O): δ -6,48 (br), -10,96 (br), -21,83 (br);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C17H19N6O15P3Na [M- 2H+ Na]-, a massa calculada foi 663,0019, e a massa observada foi 663,0228. Síntese de O6-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrobenzil]-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato rotulado por 6-ROX (WW2p121).

Esquema. Síntese de O6-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrobenzil]-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato rotulado por 6-ROX. (i) álcool 4-iodo-2- nitrobenzílico, DABCO, DBU, peneiras moleculares de 4Â, 1,2-DME anidroso, 0°C, em seguida gradualmente squentado em temperatura ambiente, 24 horas, 77%; (ii) n-BU4NF, THF, temperatura ambiente, 1,5 hora, 62%; (iii) N-propargiltrifluoroacetamida, Pd(PPh3)4, CuI, Et3N, DMF anidroso, quatro horas, 42%; (iv) POCl3, esponja de próton, (MeO)aPO, 0°C, uma hora; (n-BuaNH)2H2P2O?, n-BuaN, DMF, cinco minutos; 1 M de HNEt3HCO3, uma hora; NH4OH, uma hora; (v) 6-ROX- SE, 0,1 M de tampão de Na2CO3/NaHCO3 (pH 9,2), uma hora. O6-(4-Iodo-2-nitrobenzil)-3',5'-bis-O-(terc-butildimetilsilil)-2- desoxiguanosina (dG.11)

[000177] DABCO (90 mg, 0,80 mmol) e álcool 4-iodo-2-nitrobenzílico (555 mg, 2,00 mmols) foram adicionados a uma solução de composto dG.08 (270 mg, 0,40 mmol) e peneiras moleculares de 4Â (129 mg) em 1,2-DME anidroso (4 mL) a 0°C. A mistura foi aquecida em temperatura ambiente e agitada durante 30 minutos. DBU (91 μL, 0,60 mmol) foi adicionado, e a reação foi agitada em temperatura ambiente durante 24 horas. Acetato de etila (70 mL) foi adicionado, e a solução orgânica foi lavada com água (10 mL) e salmoura (10 mL), secada em Na2SO4, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de sílica-gel para produzir O6-(4-iodo-2-nitrobenzil)-3',5'-bis-O-(terc-butildimetilsilil)-2-desoxiguanosina dG.11 (233 mg, 77%).1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,40 (d, 1 H, J = 1,7 Hz, Ph-H), 7,94 (s, 1 H, H-8), 7,86 (dd, 1 H, J = 1,7 e 8,3 Hz, Ph-H), 7,60 (d, 1 H, J = 8,3 Hz, Ph-H), 6,31 (t, 1 H, J = 6,5 Hz, H-1), 5,86 (s, 2 H, NH2), 4,87 (s, 2 H, PhCH2), 4,59 (m, 1 H, H-3), 3,98 (m, 2 H, H-4), 3,82 (dd, AB, 1 H, J = 4,2 e 11,2 Hz, H-5'a), 3,75 (dd, 1 H, J = 4,2 e 11,2 Hz, H-5'b), 2,57 (m, 1 H, H-2'a), 2,37 (m, 1 H, H-2'b), 0,91 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,10 (s, 6 H, CH3)2Si), 0,08 (s, 6 H, (CH3)2Si).O6-(4-Iodo-2-nitrobenzil)-2-desoxiguanosina (dG.12)

[000178] Uma solução de n-Bu4NF (291 mg, 0,924 mmol) em THF (2 mL) foi adicionada a uma solução de composto dG.11 (233 mg, 0,3 1 mmol) em THF (4 mL) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada durante 1,5 hora, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de sílica-gel para produzir O6-(4-iodo-2-nitrobenzil)-2-desoxiguanosina dG.12 (101 mg, 62%).1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,43 (d, 1 H, J = 1,8 Hz, Ph-H), 8,16 (dd, 1 H, J = 1,8 e 8,2 Hz, Ph-H), 8,13 (s, 1 H, H-8), 7,52 (d, 1 H, J = 8,2 Hz, Ph-H), 6,48 (br s, 2 H, D2O permutável, NH2), 6,22 (dd, 1 H, J = 6,2 e 7,7 Hz, H-1), 5,79 (s, 2 H, PhCH2), 5,27 (d, 1 H, D2O permutável, 5'-OH), 4,97 (t, 1 H, D2O permutável, 3' - OH), 4,35 (m, 1 H, H-3), 3,82 (m, 1 H, H-4), 3,52 (m, 2 H, H-5'a e H-5'b), 2,58 (m, 1 H, H-2'a), 2,22 (m, 1 H, H-2'b).O6-[4-(3-Trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrobenzil]-2- desoxiguanosina (dG.13)

[000179] Uma solução de composto dG.12 (95 mg, 0,18 mmol),N- propargiltrifluoroacetilamida (82 mg, 0,53 mmol), tetracis(trifenilfosfina)- paládio(0) (21 mg, 0,018 mmol), CuI (7 mg, 0,036 mmol) e Et3N (51 μL, 0,36 mmol) em DMF anidra (1,4 mL) foi agitada em temperatura ambiente durante quatro horas. CH2Cl2 (1 mL), metanol (1 mL) e NaHCO3 (84 mg, 1 mmol) foram adicionados, e a mistura foi agitada durante 20 minutos, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel e HPLC preparativa para produzir O6-[4-(3- trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrobenzil]-2'-desoxiguanosina dG.13 (42 mg, 42%).1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 10,11 (br 1 H, NH), 8,16 (d, 1 H, J = 1,7 Hz, Ph-H), 8,13 (s, 1 H, H-8), 7,86 (dd, 1 H, J = 1,7 e 8,2 Hz, Ph- H), 7,75 (d, 1 H, J = 8,2 Hz, Ph-H), 6,50 (br s, 2 H, D2O permutável, NH2), 6,22 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 5,87 (s, 2H, PhCH2), 5,27 (d, 1 H, D2O permutável, 5'-OH), 4,97 (t, 1 H, D2O permutável, 3'-OH), 4,35 (m, 1 H, H-3), 4,33 (s, 2 H, CH2), 3,82 (m, 2 H, H-4), 3,55 (m, 1 H, H-5'b), 3,51 (m, 1 H, H-5'a), 2,58 (m, 1 H, H-2'a), 2,23 (m, 1 H, H-2'b).O6-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrobenzil]-2'-desoxiguanosina-5-trifosfato(dG.14)

[000180] dG.13 (33 mg, 0,06 mmol) e esponja de próton (26 mg,0,12 mmol) foram evaporados três vezes a partir de piridina anidrosa (3 mL) e dissolvidos em trimetilfosfato (0,3 mL). POCl3 (8 μL, 0,09 mmol) foi adicionado, e a mistura foi agitada durante uma hora a 0°C. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n-butilamônio (142 mg, 0,3 mmol) e tri-n-butilamina (60 μL) em DMF anidra (0,6 mL) foi adicionada. Depois de cinco minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trieti- lamônio (1 M, pH 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente, seguido pela adição gota a gota de hidróxido de amônio concentrado (5 mL, 27%) a 0°C. A mistura foi agitada durante uma hora adicional em temperatura ambiente e em seguida liofilizada até a secura. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado e purificado com HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD-300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir O6-[4- (3-amino-1-propinil)-2-nitrobenzil]-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato dG.14. Fase móvel: A, 100 mM de acetato de trietilamônio (TEAA) em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). Purificação por HPLC foi obtida usando um gradiente linear de 5-50% de B durante 20 minutos e em seguida 50-90% de B durante 10 minutos.1H RMN (400 MHz, D2O): δ 8,28 (s, H-8), 8,26 (s, 1 H, Ph-H), 7,80 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, Ph-H), 7,63 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, Ph-H), 6,38 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 5,88 (br s, 2 H, Ph-CH2), 4,29 (m, 3 H, H-4, H-5), 3,67 (s, 2 H, CH2), 2,80 (m, 1 H, H-2'a), 2,56 (m, 1 H, H-2'b);31P RMN (162 MHz, D2O): δ -5,85 (d, J = 19,4 Hz), -10,98 (d, J = 19,4 Hz), -21,78 (t, J = 19,4 Hz);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C20H24N7O15P3Na [M+Na]+, a massa calculada foi 718,0441, e a massa observada foi 718,0600.O6-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrobenil]-2'-desoxiguanosina - 5’-trifosfato rotulado por 6-ROX (WW2p121)

[000181] Uma solução de 6-ROX-SE (0,3 mg, 0,47 (mol) em DMSO anidroso (12 μL) foi adicionado a uma solução de trifosfato dG.14 (0,36 (mol) em tampão de Na2CO3/NaHCO3 (0,1 M, pH 9,2; 0,6 mL) e incubada em temperatura ambiente durante uma hora. A reação foi purificada com HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD-300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir o trifosfato rotulado por 6- ROX WW2p121. Fase móvel: A, 100 mM de TEAA em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). Purificação por HPLC foi obtida usando um gradiente linear de 5-50% de B durante 20 minutos e em seguida 50-90% de B durante 10 minutos. A concentração de WW2p121 foi calculada por espectroscopia de adsorção usando o coeficiente de extinção do corante de 6-ROX (isto é, 82.000 em 575 nm). Síntese de Q6-[1 -(2-nitrofenil)etil]-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato(WW2p143)

Esquema. Síntese de Q6-[1-(2-nitrofenil)etil]-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato.

[000182] (i) 1-(2-nitrofenil)etanol, PPh3, DIAD, THF anidroso, temperatura ambiente, seis horas, 74%; (ii) n-BU4NF, THF, 0°C, em seguida gradualmente esquenta em temperatura ambiente, quatro horas, 64%; (iii) POCl3, esponja de próton, (MeO)3PO, 0°C, duas horas; (n- Bu3NH)2H2P2O7, n-BuaN, DMF, cinco minutos; 1 M de HNEtaHCOa, uma hora; NH4OH, 60 °C, três horas.Q6-[1-(2-Nitrofenil)etil]-N2-acetil-3',5'-bis-Q-(terc-butildimetilsihl)-2'-desoxiguanosina (dG.15)

[000183] Uma solução de composto dG.02 (108 mg, 0,2 mmol), 1-(2- nitrofenil)etanol (33 mg, 0,23 mmol) e PPh3 (79 mg, 0,3 mmol) em THF anidroso (2 mL) foi tratada com azodecarboxilaro de di-isopropila azo- dicarboxilato (DIAD, 59 μL, 0,3 mmol) e agitada durante seis horas em temperatura ambiente. A mistura foi diluída com CH2Cl2 (20 mL), lavada uma vez com solução de NH4Cl saturada (10 mL), secada em Na2SO4, concentrada, e purificada por cromatografia de sílica-gel para produzir O6-[1-(2-nitrofenil)etil]-N2-acetil-3',5'-bis-O-(terc-butildimetilsilil)-2'-desoxiguanosina dG.15 (102 mg, 74%, mistura 1:1 de diastereômeros) como uma espuma amarela.1H RMN (400 MHz, CDCl3) para diastereômeros: δ 8,13 e 8,12 (2 s, 1 H, H-8), 7,89 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, Ph-H), 7,83 (m, 1 H, Ph-H), 7,74 (br s., 1 H, NH), 7,57 (t, 1 H, J = 7,2 Hz, Ph-H), 7,40 (t, 1 H, J = 8,0 Hz, Ph-H), 6,69 (m, 1 H, PhCH), 6,36 (t, 1 H, J = 6,3 Hz, H-1), 4,56 (m, 1 H, H-3), 3,98 (m, 1 H, H-4), 3,82 (m, 1 H, H-5'a), 3,76 (m, 1 H, H-5'b), 2,50 (m, 1 H, H-2'a), 2,41 (m, 4 H, H-2'b e CH3CO), 1,88 (2 d, J = 6,5 Hz, CH3), 0,91 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,10 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0,09 (s, 6 H, (CH3)2Si).O6-[1-(2-Nitrofenil)etil]-N2-acetil-2'-desoxiguanosina (dG.16)

[000184] Uma solução de n-Bu4NF (95mg, 0,36 mmol) em THF (2 mL) foi adicionada a uma solução de composto dG.15 (100 mg, 0,15 mmol) em THF (5 mL) a 0°C. A mistura foi gradualmente aquecida em temperatura ambiente e agitada durante quatro horas. Sílica-gel (500 mg, 60-200 mesh) foi adicionada, e a mistura foi evaporada em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de sílica-gel para produzir O6-[1-(2-nitrofenil)etil]-N2-acetil-2'-desoxiguanosina dG.16 (43 mg, 64%, mistura 1:1 de diastereômeros).1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para diastereômeros: δ 10,19 e 10,18 (2 s, 1 H, D2O, trocável, NH), 8,43 (2 s, 1 H, H-8), 8,04 (d, J = 8,2 Hz, Ph- H), 7,79 - 7,74 (m, 2, H, Ph-H), 7,56 (t, 1 H, J = 8,1 Hz, Ph-H), 6,84 (m, 1 H, PhCH), 6,26 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1), 5,29 (2 d, 1 H, D2O permu-tável, 5'-OH), 4,88 (m, 1 H, D2O permutável, 3'-OH), 4,39 (m, 1 H, H-3), 3,82 (m, 1 H, H-4), 3,56 (m, 1 H, H-5'b), 3,51 (m, 1 H, H-5'a), 2,56 (m, 1 H, H-2'a), 2,23 (m, 1 H, H-2'b), 2,12 (s, 3 H, CH3CO), 1,79 (2 d, J = 6,4 Hz, CH3);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C20H21N6O7 [M-H]-, a massa calculada foi 457,1472, e a massa observada foi 457,1392. O6-[1-(2-Nitrofenil)etil]-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato (WW2p143)

[000185] Composto dG.16 (25 mg, 0,055 mmol) e esponja de próton (23 mg, 0,11 mmol) foi evaporado três vezes a partir de piridina anidrosa (2 mL) e dissolvido em trimetilfosfato (0,3 mL). POCl3 (8 μL, 0,08 mmol) foi adicionado, e a mistura foi agitada durante duas horas a 0°C. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n-butilamônio (130 mg, 0,28 mmol) e tri- n -butilamina (55 μL) em DMF anidra (0,55 mL) foi adicionada. Depois de cinco minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente e em seguida liofilizada até a secura. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado, e parte da solução foi purificada com HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD- 300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir O6-[1-(2-nitrofenil)etil]-N2-acetil-2'- desoxiguanosina-5'-trifosfato. Fase móvel: A, 100 mM de acetato de trieti- lamônio (TEAA) em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). Purificação por HPLC foi obtida usando um gradiente linear de 5-50% de B durante 40 minutos e em seguida 50-90% de B durante 10 mi-nutos. O trifosfato purificado foi em seguida tratado com hidróxido de amônio concentrado (2 mL, 27%) a 60°C durante três horas. Purificação usando HPLC de fase reversa foi realizada como descrito acima para produzir O6-[1-(2-nitrofenil)etil]-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato WW2p143 (mistura 1:1 de diastereômeros).1H RMN (400 MHz, D2O) para diastereômeros: 8,26 e 8,25 (2 s, 1 H, H-8), 8,02 (d, J = 8,2 Hz, Ph-H), 7,88 (d, 1 H, J = 7,8 Hz, Ph-H), 7,72 (t, 1 H, J = 7,6 Hz, Ph-H), 7,53 (t, 1 H, J = 8,2 Hz, Ph-H), 6,71 (m, 1 H, PhCH), 6,34 (t, 1 H, J = 6,8 Hz, H-1), 4,25-4,16 (m, 3 H, H-4 e H-5), 2,80 (m, 1 H, H-2'a), 2,51 (m, 1 H, H-2'b), 1,86 (d, 1 H, J = 6,4 Hz, CH3);31P RMN (162 MHz, D2O) para diastereômeros: δ -5,18 (d, J = 20,4 Hz), -10,25 (d, J = 19,3 Hz), -21,07 (t, J = 19,8 Hz);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C18H22N6O15P3 [M-H]-, a massa calculada foi 655,0356, e a massa observada foi 655,0430. Síntese de O6 -{1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]etil}-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato rotulado por 6-ROX (WW3p008)

Esquema. Síntese de O6-{1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]etil}-2'-deso- xiguanosina-5'-trifosfato rotulado por 6-ROX. (i) 1-(4-iodo-2-nitrofenil)etanol, PPh3, DIAD, THF anidroso, temperatura ambiente, durante a noite, 76%; (ii) n-Bu4NF, THF, 0°C, em seguida gradualmente aquecido em temperatura ambiente, DUAS horas, 52%; (iii) N- propargiltrifluoroacetamida, Pd(PPh3)4, CuI, Et3N, DMF anidroso, quatro horas, 96%; (iv) POCl3, esponja de próton, (MeO)3PO, 0°C, duas horas; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF, cinco minutos; 1 M de HNEt3HCO3, uma hora; NH4OH, 60°C, seis horas; (v) 6-ROX-SE, 0,1 M de tampão de Na2CO3/NaHCO3 (pH 9,2), uma hora.O6-[1-(4-Iodo-2-nitrofenil)etil]-N2-acetil-3',5'-bis-O-(terc-butildimetilsilil)- 2-desoxiguanosina (dG.17)

[000186] Uma solução de composto dG.02 (146 mg, 0,27 mmol), 1- (4-iodo-2-nitrofenil)etanol (79 mg, 0,27 mmol) e PPh3 (106 mg, 0,4 mmol) em THF anidroso (2 mL) foi tratada com di- azodicarboxilato de isopropila (DIAD, 79 μL, 0,4 mmol) e agitada em temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi diluída com CH2Cl2 (20 mL), lavada uma vez com solução de NH4Cl saturada (10 mL), secada em Na2SO4, concentrada, e purificada por cromatografia de sílica-gel para produzir O6- [1-(4-iodo-2-nitrofenil)etil]-N2-acetil-3',5'-bis-O-(terc-butildimetilsilil)-2'- desoxiguanosina dG.17 (168 mg, 76%, mistura 1:1 de diastereômeros) como uma espuma amarela.1H RMN (400 MHz, CDCI3) para diastereômeros: δ 8,20 (s, 1 H, Ph-H), 8,13 e 8,12 (2 s, 1 H, H-8), 7,87 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, Ph-H), 7,73 (brs, 1 H, NH), 7,55 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, Ph-H), 6,62 (m, 1 H, PhCH), 6,35 (t, 1 H, J = 6,5 Hz, H-1), 4,56 (m, 1 H, H-3), 3,98 (m, 1 H, H-4), 3,82 (m, 1 H, H-5'a), 3,77 (m, 1 H, H-5'b), 2,50 (m, 1 H, H-2'a), 2,41 (m, 4 H, H-2'b e CH3CO), 1,85 (d, J = 6,4 Hz, CH3), 0,91 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,09 (2 s, 12 H, (CH3)2Si).O6-[1-(4-Iodo-2-nitrofenil)etil]-N2-acetil-2'-desoxiguanosina (dG.18)

[000187] Uma solução de n-Bu4NF (125 mg, 0,48 mmol) em THF (1,5 mL) foi adicionada a uma solução de composto dG.17 (155 mg, 0,19 mmol) em THF (2 mL) a 0°C. A mistura reacional foi gradualmente aquecida em temperatura ambiente e agitada durante duas horas. Sílica-gel 60 (1 g, 60-200 mesh) foi adicionada, e a mistura foi evaporada em vácuo até a secura. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel para produzir O6-[1-(4-iodo-2-nitrofenil)etil]-N2- acetil-2'-desoxiguanosina dG.18 (58 mg, 52%, mistura 1:1 de diaste- reômeros) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para diastereômeros: δ 10,21 e 10,20 (2 s, 1 H, D2O, permutável, NH), 8,43 (2 s, 1 H, H-8), 8,34 (2 s, Ph-H), 8,08 (2 d, 1 H, J = 8,3 Hz, Ph-H), 7,54 (2 d, 1 H, J = 8,3 Hz, Ph-H), 6,75 (m, 1 H, PhCH), 6,27 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 5,30 (m, 1 H, D2O permutável, 5'-OH), 4,89 (m, 1 H, D2O permutável, 3'-OH), 4,39 (m, 1 H, H-3), 3,82 (m, 1 H, H-4), 3,56 (m, 1 H, H-5'b), 3,50 (m, 1 H, H-5'a), 2,60 (m, 1 H, H-2'a), 2,22 (m, 1 H, H-2'b), 2,12 (s, 3 H, CH3CO), 1,75 (2 d, J = 6,4 Hz, CH3).O6-{1-[4-(3-Trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrofenil]etil}-N2-acetil-2- desoxiguanosina (dG.19)

[000188] Uma solução de composto dG.18 (58 mg, 0,1 mmol), N- propargil trifluoroacetilamida (45 mg, 0,3 mmol), tetracis(trifenilfosfina)- paládio(0) (11,5 mg, 0,01 mmol), iodeto de cobre(I) (3,8 mg, 0,02 mmol) e trietilamina (27 μL, 0,19 mmol) foi agitada em temperatura ambiente durante quatro horas. Metanol (1 mL), CH2Cl2 (1 mL) e bicarbonato de sódio (80 mg, 0,95 mmol) foram adicionados, e a mistura foi agitada durante mais meia hora, em seguida concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel para produzir O6-{1-[4-(3-trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrofenil]etil}-N2-acetil-2'- desoxiguanosina dG.19 (58 mg, 96%, mistura 1:1 de diastereômeros).1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para diastereômeros: δ 10,21 e 10,20 (2 s. 1 H, D2O, trocável, NH), 10,08 (br, 1 H, NHCOCF3), 8,43 (2 s, 1 H, H-8), 8,06 (s, 1 H, Ph-H), 7,77 (m, 2 H, Ph-H), 6,78 (m, 1 H, PhCH), 6,28 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 5,29 (2 d, 1 H, D2O permutável, 5'-OH), 4,89 (t, 1 H, D2O permutável, 3'-OH), 4,39 (m, 1 H, H-3), 4,29 (d, 2 H, CH2), 3,82 (m, 2 H, H-4), 3,50 (m, 1 H, H-5'a), 3,44 (m, 1 H, H-5'b), 2,67 (m, 1 H, H-2'a), 2,23 (m, 1 H, H-2'b), 2,11 (s, 3 H, CH3), 1,78 (d, 3 H, J = 6,4 Hz, CH3);O6-{1 -[4-(3-A mido-1 -propinil)-2-nitrofenil]etil}-2 '-desoxiguanosina-5 trifosfato (dG.20)

[000189] Compostos dG.19 (44 mg, 0,07 mmol) e esponja de próton (30 mg, 0,14 mmol) foram evaporados três vezes a partir de piridina anidrosa (3 mL) e dissolvidos em trimetilfosfato (0,5 mL). POCl3 (10 μL, 0,11 mmol) foi adicionado, e a mistura foi agitada durante três horas a 0°C. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n-butilamônio (166 mg, 0,35 mmol) e tri-n -butilamina (70 μL) em DMF anidra (0,7 mL) foi adicionada. Depois de cinco minutos de agitação, tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente e em seguida liofilizada até a secura. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado, e parte da solução foi purificada com HPLC fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD-300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir O6-{l-[4-(3- trifluoroacetamido-1-propinil)-2-nitrofenil]etil}-N2-acetil-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato. Fase móvel: A, 100 mM de acetato de trietilamônio (TEAA) em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). Purificação por HPLC foi alcançada usando um gradiente linear de 5-50% de B durante 20 minutos e em seguida 5090% de B durante 10 minutos. O trifosfato purificado foi em seguida tratado com hidróxido de amônio concentrado (2 mL, 27%) a 60°C durante seis horas para produzir O6-{1-[4-(3-amido-1-propinil)-2- nitrofenil]etil}-2'-desoxiguanosina-5-trifosfato dG.20 (mistura 1:1 de di- astereômeros). 1H RMN (400 MHz, D2O) para diastereômeros: 8,21 e 8,20 (2 s, 1 H, H-8), 7,85 e 7,75 (2 s, 1 H, Ph-H), 7,64 (m, 1 H, Ph-H), 7,45 (m, 1 H, Ph-H), 6,53 (m, 1 H, PhCH), 6,28 (m, 1 H, H-1), 4,23 - 4,1 2 (m, 3 H, H- 4 e H-5), 3,97 (s, 2 H, CH2), 2,70 (m, 1H, H-2'a), 2,50 (m, 1 H, H-2'b), 1,74 (m, 1 H, CH3);31P RMN (162 MHz, D2O) para diastereômeros: δ -5,53 (d, J = 20,1 Hz), -10,50 (d, J = 19,3 Hz), -21,29 (t, J = 19,8 Hz);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C21H25N7O15P3 [M-H]-, a massa calculada foi 708,0622, e a massa observada foi 708,0609. O6-{1-[4-(3-Amido-1-propinil)-2-nitrofenil]etil}-2 '-desoxiguanosina-5 -Trifosfato rotulado por 6-ROX (WW3p008)

[000190] Uma solução de 6-ROX-SE (3 mg, 4,7 μmol) em DMSO anidroso (120 μL) foi adicionada a uma solução de trifosfato dG.20 (1,45 (mol) em tampão de Na2CO3/NaHCO3 (0,1 M, pH 9,2; 0,3 mL) e incubada em temperatura ambiente durante uma hora. A reação foi purificada com HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD-300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir o trifosfato rotulado por 6- ROX WW3p008. Fase móvel: A, 100 mM de TEAA em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). Purificação por HPLC foi obtida usando um gradiente linear de 5-50% de B durante 20 minutos e em seguida 50-90% de B durante 10 minutos. A concentração de WW3p008 foi calculada por espectroscopia de adsorção usando o coeficiente de extinção do corante de 6-ROX (isto é, 82.000 em 575 nm). Separação dos dois diastereoisômeros de O6-{1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]etil}-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato (dG.20 ds1 e dG.20 ds2)

[000191] Separação dos dois diastereoisômeros de dG.20 foi realizada por HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD- 300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir trifosfato de O6-{(R ou S)-1-[4-(3- amino-1-propinil)-2-nitrofenil]etil}-2'-desoxiguanosina dG.20 ds1 (dias- tereoisômero simples, configuração absoluta não determinada) e trifos- fato de O6-{(S ou R)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]etil}-2'- desoxiguanosina dG.20 ds2 (diastereoisômero simples, configuração absoluta não determinada). Fase móvel: A, 100 mM de acetato de trie- tilamônio (TEAA) em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). Purificação por HPLC foi obtida usando um gra-diente linear de 5-25% de B durante 70 minutos e em seguida 5-50% de B durante 30 minutos.

Síntese de diastereoisômero simples rotulado por 6-ROX O6 -{(R ou S)- 1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]etil}-2'-desoxiguanosina-5'- trifosfato (WW3p037).

Esquema. Síntese de diastereoisômero simples rotulado por 6-ROX O6- {(R ou S)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]etil}-2'-desoxiguanosina-5'- trifosfato. (i) 6-ROX-SE, 0,1 M de NaHCO3/Na2CO3, pH 9,2, uma hora.Diastereoisômero simples rotulado por 6-ROX O6-{(R ou S)-1-[4-(3- amino-1-propinil)-2-nitrofenil]etil}-2'-desoxiguanosina-5'-trífosfato (WW3p037).

[000192] Uma solução de 6-ROX-SE (1,5 mg, 2,38 (μmol) em DMSO anidroso (120 μL) foi adicionada a uma solução de trifosfato dG.20 ds1 (0,67 μmol, diastereoisômero simples, configuração absoluta não determinada) em tampão de Na2CO3/NaHCO3 (0,1 M, pH 9,2; 150 μL) e incubada em temperatura ambiente durante uma hora. A reação foi purificada por HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD-300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir o diastereoisômero simples rotulado por 6-ROX trifosfato WW3p037. Fase móvel: A, 100 mM de acetato de trietilamônio (TEAA) em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). Purificação por HPLC foi obtida usando um gradiente linear de 5-50% de B durante 20 minutos e em seguida 5090% de B durante 20 minutos. A concentração de WW3p037 foi calculada por espectroscopia de adsorção usando o coeficiente de extinção do corante de 6-ROX (isto é, 82.000 em 575 nm).Síntese de diastereoisômero simples rotulado por 6-ROX O6 -{(S ou R)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]etil}-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato (WW3p039)

Esquema. Síntese de diastereoisômero simples rotulado por 6-ROX O6-{(S ou R)-1-[4-(3-amino-1-propinil)-2-nitrofenil]etil}-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato. (i) 6-ROX-SE, 0,1 M, NaHCO3/Na2CO3, pH 9,2, uma hora.Diastereoisômero simples rotulado por 6-ROX O6-{(S ou R)-1-[4-(3- amino-1-propinil)-2-nitrofenil]etil}-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato (WW3p039)

[000193] Uma solução de 6-ROX-SE (2,5 mg, 3,96 μmol) em DMSO anidroso (200 μL) foi adicionada a uma solução de trifosfato dG.20 ds2 (0,97 (mol, diastereoisômero simples, configuração absoluta não determinada) em tampão de Na2CO3/NaHCO3 (0,1 M, pH 9,2; 150 μL) e incubada em temperatura ambiente durante uma hora. A reação foi purificada por HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD-300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir o diastereoisômero rotulado por 6-ROX simples trifosfato WW3p039. Fase móvel: A, 100 mM de acetato de trietilamônio (TEAA) em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). Purificação por HPLC foi obtida usando um gradiente linear de 5-50% de B durante 20 minutos e em seguida 5090% de B durante 20 minutos. A concentração de WW3p039 foi calculada por espectroscopia de adsorção usando o coeficiente de extinção do corante de 6-ROX (isto é, 82.000 em 575 nm).Síntese de diastereoisômero simples rotulado por 6-ROX O6 -{(R ou S)- 1-(4-[3-(6-amino-caproil)amino-1-propinil]-2-nitrofenil}etil}-2'- desoxiguanosina-5'-trifosfato (WW3p041)

Esquema. Síntese de diastereoisômero simples rotulado por 6-ROX trifosfato de O6-{(R ou S)-1-{4-[3-(6-aminocaproil)amino-1-propinil]-2- nitrofenil}etil}-2'-desoxiguanosina. (i) éster de N-sucinimidila de ácido 6-N-(trifluoroacetil) aminocapróico, 0,1 M de NaHCO3/Na2CO3, pH 9,2, uma hora; NH4OH, uma hora; (ii) 6-ROX-SE, 0,1 M de NaHCO3/Na2CO3, pH 9,2, uma hora.O6-{(R ou S)-1-{4-[3-(6-Aminocaproil)amino-1-propinil]-2-nitrofenil}etil}- 2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato (diastereoisômero simples dG.21 ds1)

[000194] Uma solução de éster de N-succinimidila de ácido 6-N- (trifluoroacetil)aminocapróico (1,0 mg, 3,08 (mols) em DMSO anidroso (20 μL) foi adicionada a uma solução de trifosfato dG.20 ds1 (0,89 μmol, diastereoisômero simples, configuração absoluta não determinada) em tampão de Na2CO3/NaHCO3 (0,1 M, pH 9,2; 200 μL) e incubada em temperatura ambiente durante uma hora. Hidróxido de amô- nio concentrado (25% aq., 0,5 mL) foi adicionado, e a mistura foi incubada em temperatura ambiente durante mais uma hora. A reação foi purificada por HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD-300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir o trifosfato dG.21 ds1 (dias- tereoisômero simples, configuração absoluta não determinada). Fase móvel: A, 100 mM de acetato de trietilamônio (TEAA) em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). Purificação por HPLC foi obtida usando um gradiente linear de 5-50% de B durante 20 minutos e em seguida 50-90% de B durante 10 minutos.Síntese de diastereoisômero simples rotulado por 6-ROX O6-{(R ou S)- 1-{4-[3-(6-amino-caproil)amino-1-propinil-2-nitrofenil}etil}-2 desoxiguanosina-5'-trifosfato (WW3p041)

[000195] Uma solução de 6-ROX-SE (1,5 mg, 2,34 μmol) em DMSO anidroso (120 μL) foi adicionada a uma solução de trifosfato dG.21 ds1 (0,59 μmol, diastereoisômero simples, configuração absoluta não deter-minada) em tampão de Na2CO3/NaHCO3 (0,1 M, pH 9,2; 200 μL) e incu-bada em temperatura ambiente durante uma hora. A reação foi purificada por HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD-300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir o diastereoisômero simples rotulado por 6- ROX trifosfato WW3p041. Fase móvel: A, 100 mM de acetato de trietila- mônio (TEAA) em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). Purificação por HPLC foi obtida usando um gradiente linear de 5-50% de B durante 20 minutos e em seguida 50-90% de B durante 20 mi-nutos. A concentração de WW3p041 foi calculada por espectroscopia de adsorção usando o coeficiente de extinção do corante de 6-ROX (isto é, 82.000 em 575 nm).Exemplo 5 - Ensaios de Ponto Final de Polimerase (PEP):

[000196] Numerosos grupos empregaram ensaios qualitativos, ensaios com base em Sanger para estimar as eficiências de incorporação relativas de análogos de nucleotídeo de terminação comparados às suas contrapartes de nucleotídeo naturais. Embora úteis, a capacidade de analisar análogos de nucleotídeo modificados na ausência de nucleotídeos naturais não é possível utilizando estes ensaios. Estas duas limitações levaram a um ensaio de ponto final de polimerase, quantitativo (PEP), que é utilizado de uma maneira de alta produtividade para avaliar numerosos nucleotídeos modificados contra várias po- limerases comercialmente disponíveis, bem caracterizadas. A identificação de compostos de chumbo com um DNA polimerase específico pode em seguida ser priorizada para outros estudos cinéticos. O ensaio de PEP é projetado com a concentração de polimerase em excesso do complexo iniciador/padrão (isto é, este complexo é ligado completamente com polimerase no início da titulação), desse modo limitando a reação à ligação de nucleotídeo e etapas de acoplamento de nucleotila. Quantidades limitantes do nucleotídeo desejado são em seguida tituladas através da faixa de concentração apropriada (geralmente três ordens de magnitude) para observar a extensão de um iniciador rotulado por tintura por eletroforese de gel. A concentração de ponto final é determinada a partir de um plote de semi-log onde o número de mols de substrato e produto é igual, chamado de valor de IC50 (isto é, concentração de incorporação a 50%).

[000197] Para todas as polimerases avaliadas neste estudo, 40 nM de oligo-padrão (5'-TACGGAGCA-GTACTGGCCGTCGTTTTACA, base de interrogação está sublinhada e negritada) foram recozidos em 5 nM de iniciador rotulado por BODIPY-FL (5'-TTGTAAAACGACGGCCAGT) em tampão 1xThermoPol (20 mM de Tris-HCl, pH 8,8; 10 mM (NH4)2SO4; 10 mM de KCl; 2 mM de MgSO4; 0,1% de Triton X-100, New England Bio-Labs) a 80°C durante 30 segundos, 57°C durante 30 segundos, e em seguida resfriados a 4°C. O complexo de iniciador/padrão é em seguida diluído por meia hora (isto é, sua concentração final é 2,5 nM em um vo-lume de 10 μL) pela adição de DNA polimerase, análogo de nucleotídeo, e tampão ThermoPol. Isto define o limite inferior do valor de IC50 para titu-lações de nucleotídeo em 1,25 nM (isto é, [iniciador] = [iniciador +1]). Re-ações de polimerase foram incubadas em sua temperatura apropriada durante 10 minutos, em seguida resfriada a 4°C e extinguidas com 10 μL de solução de interrupção (98% de formamida desionizada; 10 mM de Na2EDTA, pH 8,0; 25mg/mL de Dextrana Azul, PM 2.000.000). Reações de interrupção foram aquecidas a 90°C durante 30 segundos, e em se-guida colocadas em gelo. Os produtos de extensão foram analisados em um gel de poliacrilamida Long Ranger a 10% (Cambrex) usando um se- quenciador de DNA AB modelo 377, e os dados quantitativos são exibi-dos como um plote de log linear de formação de produto versus concen-tração de composto. Os ensaios de PEP foram realizados em triplicata para cada combinação de análogo de nucleotídeo/DNA polimerase para calcular seus valores de IC50 ± um desvio-padrão.

[000198] O número de unidades de atividade para oito DNA polime- rases deficientes de 3'-exonuclease (3'-exo-), comercialmente disponíveis foi primeiro determinado por titulação com trifosfato de 2'- desoxiadenosina (dATP, faixa de concentração de 0,1 nM a 100 nM) com o objetivo de alcançar o limite de PEP IC50 de 1,25 nM (dados não mostrados). Em geral, o aumento do número de unidades reduziu os valores de IC50 para dATP para este limite, com a exceção com Taq, Terminador, e Terminador II. Para estas enzimas, houve um aumento nos valores de IC50 para dATP com concentração de enzima crescente, que também não foi investigada e presumiu-se ser devido a uma relação direta com concentração de enzima crescente e fosforólise. Para estes casos, o número de unidades utilizadas para ensaios de PEP subsequentes foi aquelas unidades de atividade que produziram os valores de IC50 mais baixos para dATP.Titulações de nucleotídeo modificado:

[000199] WW1p129 e ddATP foram em seguida titulados usando o ensaio de PEP com as oito DNA polimerases (atividades unitárias previa-mente definidas) na faixa de concentração de 0,1 nM a 100 nM, 1 nM a 1 μM, 10 nM a 10 μM, ou 100 nM a 100 μM (veja Tabela 1). Compostos sensíveis a luz UV foram controlados sempre em condições de luz baixa para minimizar a conversão em dATP. Estes dados mostram em todos os casos, exceto para TaqFS, em que WW1p129 é incorporado mais efi-cazmente (isto é, valor de IC50 inferior) do que ddATP.Tabela 1. Resumo de resultado de ensaio de PEP para WW1p129 usando oito DNA polimerases diferentes

[000200] Ensaios de PEP foram da mesma forma realizados usando vários nucleotídeos de terminação fotocliváveis usando Bst polimerase e Terminador DNA polimerase (Tabela 2), que mostra que os compos- tos são eficazmente incorporados. Os dados na Tabela 2 sugerem que os compostos de acordo com a invenção são substratos excelentes.Tabela 2: Comparação de valores de IC50 com Bst e Terminador polime- rases

NUCLEOTÍDEOS E NUCLEOSÍDEOS ROTULADOSExemplo 1: compostos dASíntese de trifosfato de N6-benzil-2'-desoxiadenosina (WW2p062)Esquema. Síntese de N6-benzil-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato. (i) NaH, DMF, brometo de benzila, 0°C, em seguida gradualmente aquecidos em temperatura ambiente, 86%; (ii) SiO2, vácuo, 70-80°C, 95%; (iii) n- Bu4NF, THF, 99%; (iv) POCl3, (MeO)3PO, menos 20-30°C; (n- Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; 1 M de HNEt3HCO3; 32%.N6-terc-Butiloxicarbonil-N6-benzil-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'- desoxiadenosina (dA.n1)

[000201] NaH (18 mg, 0,75 mmol, seco) foi adicionado a uma solução de composto dA.07 (400 mg, 0,58 mmol) em DMF anidra (5 mL) a 0°C e agitado durante 30 minutos. Uma solução de brometo de benzila (149 mg, 0,87 mmol) em DMF anidra (2,5 mL) foi adicionada gota a gota. A mistura foi gradualmente aquecida em temperatura ambiente e agitada durante duas horas. DMF foi removida em vácuo, e o resíduo foi dissolvido em acetato de etila (60 mL), lavado duas vezes com solução de NH4Cl saturada (40 mL cada) e uma vez com água (40 mL). A camada aquosa combinada foi extraída com acetato de etila (10 mL), e a camada orgânica combinada foi secada em Na2SO4, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel, para produzir N6- terc-butiloxicarbonil-N6-benzil-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'- desoxiadenosina dA.n1 (398 mg, 86%) como um óleo viscoso.1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,72 (s, 1 H, H-8), 8,32 (s, 1 H, H-2),7,39 (m, 2 H, Ph-H), 7,25 (m, 2 H, Ph-H), 7,18 (m, 1 H, Ph-H), 6,49 (t, 1H, J = 6,4 Hz, H-1), 5,28 (s, 2 H, Ph-CH2), 4,62 (m, 1 H, H-3), 4,01 (m,1 H, H-4), 3,85 (dd, 1 H, J = 4,4 e 11,2 Hz, H-5'a), 3,77 (dd, 1 H, J =3,4 e 11,2 Hz, H-5'b), 2,61 (m, 1 H, H-2'a), 2,43 (m, 1H, H-2'b), 1,65 (s, 9 H, (CH3)3CO), 0,96 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,08 (2 s, 12 H, (CH3)2Si).N6 -benzil-3',5'-O -bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiadenosina (dA.n2)

[000202] Sílica-gel 60 (3,76 g, 100-200 mesh, ativados por aquecimento a 70-80°C sob pressão reduzida durante 24 horas) foi adicionada a uma solução de composto dA.n1 (376 mg, 0,56 mmol) em CH2Cl2 (20 mL), e a mistura foi evaporada em vácuo até a secura. O resíduo foi aquecido a 70-80°C sob pressão reduzida durante dois dias, lavado três vezes com metanol (30 mL cada) e filtrado usando um funil buchi. O filtrado combinado foi concentrado em vácuo e purificado por croma- tografia de coluna em sílica-gel, para produzir N6-benzil-3',5'-O-bis- terc-butildimetilsilil-2'-desoxiadenosina dA.n2 (305 mg, 95%) como uma espuma amarela.1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,41 (s, 1 H, H-8), 8,07 (s, 1 H, H-2), 7,38 (m, 2 H, Ph-H), 7,33 (m, 2 H, Ph-H), 7,28 (m, 1 H, Ph-H), 6,45 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 6,12 (br s, 1 H, 6-NH), 4,87 (br s, 2 H, Ph-CH2), 4,62 (m, 1 H, H-3), 4,01 (m, 1 H, H-4), 3,87 (dd, 1 H, J = 4,2 e 11,2 Hz, H-5'a), 3,77 (dd, 1 H, J = 3,2 e 11,2 Hz, H-5'b), 2,64 (m, 1 H, H-2'a), 2,44 (m, 1 H, H- 2'b), 0,91 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,09 (2 s, 12 H, (CH3)2Si-).N6 -benzil-2-desoxiadenosina (dA.n3)

[000203] Uma solução de n-Bu4NF (335 mg, 1,28 mmol) em THF (2,5 mL) foi adicionada a uma solução de dA.n2 (292 mg, 0,51 mmol) em THF (6 mL) a 0°C. A mistura reacional foi gradualmente aquecida em temperatura ambiente e agitada durante duas horas. Sílica-gel 60 (1 g) foi adicionada, e a mistura foi evaporada em vácuo até a secura. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel, para produzir N6-benzil-2'-desoxiadenosina dA.n3 (173 mg, 99%) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, CD3OD): δ 8,30 (s, 1 H, H-8), 8,25 (s, 1 H, H-2), 7,36 (m, 2 H, Ph-H), 7,31 (m, 2 H, Ph-H), 7,24 (m, 1 H, Ph-H), 6,42 (dd, 1 H, J = 6,0 e 7,9 Hz, H-1), 4,81 (br s, 2 H, Ph-CH2), 4,57 (m, 1 H, H-3), 4,06 (m, 1 H, H-4), 3,83 (m, 1 H, J = 2,9 e 12,3 Hz, H-5'a), 3,73 (dd, 1 H, J = 3,3 e 12,3 Hz, H-5'b), 2,79 (m, 1 H, H-2'a), 2,40 (m, 1 H, H-2'b).N6 -benzil-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato (WW2p062)

[000204] POCl3 (22 μL, 0,24 mmol) foi adicionado a uma solução de dA.10a (42 mg, 0,12 mmol) em trimetilfosfato (0,5 mL) e mantido a me-nos 20-30°C durante duas horas. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n- butilamônio (285 mg, 0,6 mmol) e tri- n -butilamina (120 μ L) em DMF ani-dra (1,2 mL) foi adicionada. Depois de cinco minutos de agitação, o tam-pão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora e em se-guida liofilizada até a secura. O resíduo foi dissolvido em água (10 mL), filtrado e purificado por cromatografia de permuta de ânion usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de NH4HCO3 (50 mM a 500 mM em 300 minutos) em uma taxa de fluxo de 4,5 mL/minuto. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofili- zadas para produzir N6-benzil-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato WW2p062 (24 mg, 32%) como um sólido macio branco.1H RMN (400 MHz, D2O): δ 8,43 (s, 1 H, H-8), 8,20 (s, 1 H, H-2), 7,39 - 7,30 (m, 5 H, Ph-H), 6,50 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 4,85 (s, 2 H, Ph- CH2), 4,31 (s, 1 H, H-4), 4,22 (m, 2 H, H-5'a e H-5'b), 2,82 (m, 1 H, H- 2'a), 2,62 (m, 1 H, H-2'b);31P RMN (162 MHz, D2O): δ -5,72 (d, J = 15,9 Hz), -10,78 (d, J = 15,4 Hz), -19,16 (t, J = 14,9 Hz);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C17H20N5O12P3Na [M- 2H+Na]-, a massa calculada foi 602,0219, e a massa observada foi 602,0363.Síntese de trifosfato de N6 -[4-(3-amino-1-propil)benzil]-2‘-desoxiadenosina rotulado por 6-FAM (WW2p085)

Esquema. Síntese de trifosfato de N6-[4-(3-amino-1-propil)benzil]-2'- desoxiadenosina rotulado por 6-FAM. (i) NaH, DMF, brometo de 4- iodobenzila, 0°C, em seguida gradualmente aquecidos em temperatura ambiente, 99%; (ii) SiO2, vácuo, 70-80°C, 99%; (iii) n-Bu4NF, THF, 98%; (iv) N-propargiltrifluoroacetamida, Pd(PPh3)4(0), CuI, Et3N, DMF anidroso, 4,5 h, 94%; (v) POCl3, esponja de próton, (MeO)3PO, menos 20-30°C, duas horas; (n-Bu3NH)2 H2P2O7, n-Bu3N, DMF, cinco minutos; 1 M de HNEt3HCO3, uma hora; NH4 OH, uma hora; 84%; (vi) 6-FAM- SE, 0,1 M NaHCO3/Na2CO3, pH 9,2.N6-terc-Butiloxicarbonil-N6-(4-iodobenzil)-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil- 2-desoxiadenosina (dA.n4)

[000205] NaH (23 mg, 0,94 mmol, seco) foi adicionado a uma solução de composto dA.07 (500 mg, 0,72 mmol) em DMF anidra (6,5 mL) a 0°C e agitada durante 30 minutos. Uma solução de brometo de 4- iodobenzila (322 mg, 1,08 mmol) em DMF anidra (2,5 mL) foi adicionada gota a gota. A mistura foi gradualmente aquecida em temperatura ambiente e agitada durante duas horas. DMF foi removida em vácuo, e o resíduo foi dissolvido em acetato de etila (60 mL), lavado duas vezes com solução de NH4Cl saturada (40 mL cada) e uma vez com água (40 mL). A camada aquosa combinada foi extraída com acetato de eti- la (10 mL), e a camada orgânica combinada foi secada em Na2SO4, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel, para produzir N6-terc-butiloxicarbonil-N6-(4-iodobenzil)-3',5'- O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiadenosina dA.n4 (565 mg, 99%) como um óleo viscoso.1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,71 (s, 1 H, H-8), 8,33 (s, 1 H, H-2), 7,58 (d, 2 H, J = 8,2 Hz, Ph-H), 7,17 (d, 2 H, J = 8,2 Hz, Ph-H), 6,49 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 5,20 (s, 2 H, Ph-CH2), 4,62 (m, 1 H, H-3), 4,02 (m, 1 H, H-3), 3,86 (dd, 1 H, J = 4,2 e 11,2 Hz, H-5'a), 3,78 (dd, 1 H, J = 3,2 e 11,2 Hz, H-5'b), 2,63 (m, 1 H, H-2'a), 2,45 (m, 1 H, H-2'b), 1,42 (s, 9 H, (CH3)3CO), 0,92 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,08 (2 s, 12 H, (CH3)2Si-).N6-(4-Iodobenzil)-3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiadenosina(dA.n5)

[000206] Sílica-gel 60 (6,00 g, 100-200 mesh, ativados por aquecimento a 70-80°C sob pressão reduzida durante 24 horas) foi adicionada a uma solução de dA.n4 (565 mg, 0,71 mmol) em CH2Cl2 (20 mL), e a mistura foi evaporada em vácuo até a secura. O resíduo foi aquecido a 70-80°C sob pressão reduzida durante dois dias, lavado três vezes com metanol (30 mL cada) e filtrado usando um funil de buchi. O filtrado combinado foi concentrado em vácuo e purificado por croma- tografia de coluna em sílica-gel, para produzir N6-(4-iodobenzil)-3',5'-O- bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiadenosina dA.n5 (489 mg, 99%) como uma espuma amarela.1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,38 (s, 1 H, H-8), 8,06 (s, 1 H, H-2), 7,63 (d, 2 H, J = 8,2 Hz, Ph-H), 7,11 (d, 2 H, J = 8,2 Hz, Ph-H), 6,45 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 6,34 (t, 1 H, 6-NH), 4,81 (br s, 2 H, Ph-CH2), 4,61 (m, 1 H, H-3), 4,00 (m, 1 H, H-4), 3,85 (dd, 1 H, J = 4,2 e 11,2 Hz, H- 5'a), 3,76 (dd, 1 H, J = 3,2 e 11,2 Hz, H-5'b), 2,64 (m, 1 H, H-2'a), 2,44 (m, 1 H, H-2'b), 0,91 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,09 (2 s, 12 H, (CH3)2Si-).N6-(4-Iodobenzil)-2'-desoxiadenosina (dA.n6)

[000207] Uma solução de n-Bu4NF (282 mg, 1,08 mmol) em THF (1,0 mL) foi adicionada a uma solução de dA.n5 (300 mg, 0,43 mmol) em THF (1,2 mL) a 0°C. A mistura reacional foi gradualmente aquecida em temperatura ambiente e agitada durante duas horas. Sílica-gel 60 (1 g) foi adicionada, e a mistura foi evaporada em vácuo até a secura. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel para produzir N6-(4-iodobenzil)-2'-desoxiadenosina dA.n6 (266 mg, 98%) como uma espuma branca.1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,48 (br s, 1 H, D2O permutável, 6-NH), 8,40 (s,1 H, H-8), 8,27 (s, 1 H, H-2), 7,68 (d, 2 H, J = 8,0 Hz, Ph-H), 7,17 (d, 2 H, J = 8,0 Hz, Ph-H), 6,39 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 5,34 (d, 1 H, D2O permutável, 3'-OH), 5,22 (t, 1 H, D2O permutável, 5'-OH), 4,68 (br s, 2 H, Ph-CH2), 4,44 (m, 1 H, H-4), 3,91 (m, 1 H, H-3), 3,64 (m, 1 H, H-5'a), 3,55 (m, 1 H, H-5'b), 2,76 (m, 1 H, H-2'a), 2,31 (m, 1 H, H-2'b).N6-[4-(3 - trifluoroacetamido-1-propinil)-benzil]-2'-desoxiadenosina(dA.n7)

[000208] Uma solução de composto dA.n6 (266 mg, 0,57 mmol), N- propargiltrifluoroacetamida (260 mg, 1,72 mmol), CuI (22 mg, 0,11 mmol), tetracis(trifenilfosfina)-paládio(0) (65 mg, 0,06 mmol) e Et3N (160 μL, 1,14 mmol) em DMF anidra (2,1 mL) foi agitada em temperatura ambiente durante 4,5 horas. A mistura foi concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel, para produzir N6- [4-(3-trifluoroacetamido-1-propinil)-benzil]-2-desoxiadenosina dA.n7 (268 mg, 94%) como um sólido encerado.1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 10,05 (br m, 1 H, D2O permutável, NH), 8,46 (br m, 1 H, D2O permutável, NH), 8,37 (s, 1 H, H-8), 8,19 (s, 1 H, H-2), 7,37 (d, 2 H, J = 8,2 Hz, Ph-H), 7,32 (d, 2 H, J = 8,2 Hz, Ph- H), 6,35 (dd, 1 H, J = 6,4 e 7,5 Hz, H-1), 5,31 (d, 1 H, D2O permutável, 3'-OH), 5,19 (t, 1 H, D2O permutável, 5'-OH), 4,70 (br s, 2 H, Ph-CH2), 4,41 (m, 1 H, H-3), 4,26 (d, 2 H, J = 4,3 Hz, CH2) 3,88 (m, 1 H, H-4), 3,61 (m, 1 H, H-5'a), 3,53 (m, 1 H, H-5'b), 2,73 (m, 1 H, H-2'a), 2,25 (m, 1 H, H - 2'b).N6-[4-(3-amino-1-propil)benzil]-2'-desoxiadenosina-5'-trífosfato (dA.n8)

[000209] POCl3 (16 μL, 0,17 mmol) foi adicionado a uma solução de dA.n7 (56 mg, 0,11 mmol) e esponja de próton (37 mg, 0,17 mmol) em trimetilfosfato (0,5 mL) e mantido a menos 20-30°C durante duas horas. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n-butilamônio (261 mg, 0,55 mmol) e tri-n -butilamina (110 μL) em DMF anidra (1,1 mL) foi adicionada. Depois de cinco minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente, seguido pela adição gota a gota de hidróxido de amônio concentrado (10 mL, 27%) a 0°C. A mistura foi agitada durante mais uma hora em temperatura ambiente e em seguida liofilizada até a secura. O resíduo obtido foi dissolvido em água (10 mL), filtrado e purificado por cromatografia de permuta de ânion usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de NH4HCO3 (50 mM a 500 mM em 300 minutos) em uma taxa de fluxo de 4,5 mL/minuto. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas para produzir trifosfato dA.n8 (63 mg, 84%) como um sólido macio branco.1H RMN (400 MHz, D2O): δ 8,41 (s, 1 H, H-8), 8,19 (s, 1 H, H-2), 7,38 - 7,26 (m, 4 H, Ph-H), 6,47 (dd, 1 H, J = 5,5 e 6,6 Hz, H-1), 4,30 (s, 1 H, H-4), 4,21 (m, 2 H, H-5'a e H-5'b), 3,63 (s, 2 H, CH2), 2,79 (m, 1 H, H- 2'a), 2,60 (m, 1 H, H-2'b).31P RMN (162 MHz, D2O): 6 -5,80 (d, J = 20,1 Hz), -10,94 (d, J = 19,3 Hz), -21,59 (t, J = 19,3 Hz);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C20H23N6O12P3Na [M- 2H+ Na]-, a massa calculada foi 655,0485, e a massa observada foi 655,0758.N6-[4-(3-amino-1-propil) benzil]-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato rotula- do por 6-FAM (WW2p085)

[000210] Uma solução de 6-FAM-SE (3,5 mg, 7,35 μmol) em DMSO anidroso (70 μL) foi adicionada a uma solução de trifosfato dA.18a (3,5 μmol) em tampão de Na2CO3/NaHCO3 (0,1 M, pH 9,2; 600 μL) e incubada em temperatura ambiente durante uma hora. A reação foi purificada por HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD- 300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir o trifosfato rotulado por 6-FAM WW2p085. Fase móvel: A, 100 mM de acetato de trietilamônio (TEAA) em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). A eluição foi realizada com um gradiente linear de 5-20% de B durante 20 minutos e em seguida 20-90% de B durante 20 minutos. A concentração de WW2p085 foi calculada por espectroscopia de adsorção usando o coeficiente de extinção do corante de 6-FAM (isto é, 68.000 em 494 nm).ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C41H36N6O18P3 [M+H]+, a massa calculada foi 993,1299, e a massa observada foi 993,1520. Síntese de trifosfato de N6 -{l-[4-(3-amino-1-propinil)fenil]etil}-2'-desoxiadenosina rotulado por 6-FAM (WW2p093)

Esquema. Síntese de trifosfato de N6 -{1-[4-(3-amino-1-propinil)fenil]etil}-2'-desoxiadenosina rotulado por 6-FAM. (i) TBSCl, imidazol, DMF anidroso, 0°C, em seguida gradualmente aquecidos em temperatura ambiente, 12 horas, 83%; (ii) cloreto de 2- mesitilenossulfonila, Et3N, DMAP, CH2Cl2 anidroso, temperatura ambi-ente, 1,5 hora, 20%; (iii) 1-(4-iodofenil)etilamina, peneiras moleculares, 1,4-dioxano anidroso, 50°C, 18 horas, 88%; (iv) n-Bu4NF, THF, 0°C, em seguida gradualmente aquecidos em temperatura ambiente, 93%; (v) N-propargiltrifluoroacetamida, Pd(PPh3)4(0), CuI, Et3N, DMF anidro- so, 4,5 horas, 86%; (vi) POCl3, (MeO)3PO, menos 20-30°C; (n-Bu3NH)2H2P2O7, n-Bu3N, DMF; 1 M de HNEt3HCO3; 86% (vii) 6-FAM- SE, 0,1 M de NaHCO3/Na2CO3, pH 9,2, uma hora.3',5‘-O -bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiinosina (dA.n9)1

[000211] Uma solução de TBSCl (1,91 g, 12,67 mmols) foi adicionada a uma solução de 2'-desoxiinosina (1,00 g, 3,96 mmols) e imidiazol (1,73 g, 25,34 mmols) em DMF anidra (3 mL) a 0°C sob atmosfera de nitrogênio. A mistura reacional foi gradualmente aquecida em temperatura ambiente e agitada durante 12 horas. A mistura foi em seguida concentrada em vácuo, dissolvida em CH2Cl2 (100 mL), lavada duas vezes com água (50 mL), secada em Na2SO4 anidroso, concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de sílica-gel para produzir 3',5'-O-bis-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiinosina dA.n9 (1,58 g, 83%) como um pó branco.1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): δ 12,37 (br s, 1 H, D2O permutável, NH), 8,25 (s, 1H, H-8),8,04(d, 1 H, J = 3,6 Hz, H-2),6,29 (t, 1 H, J = 6,6Hz, H-1) ,4,59 (m, 1 H, H - 3'), 3,84 (m, 1 H, H-4), 3,74 (m, 1 H, H- 5'a), 3,66 (m, 1 H, H-5'b), 2,76 (m, 1 H, H-2'a), 2,30 (m, 1 H, H-2'b), 0,89 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,85 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,11 (s, 6 H,(CH3)2Si), 0,02 (2 S, 6 H, (CH3)2Si).O6-(2-Mesitilenossulfonil)-3',5'-bis-Q-terc-butildimetilsilil-2'- desoxiinosina(dA.n10)1

[000212] Cloreto de 2-mesitilenossulfonila (0,70 g, 2,12 mmols), Et3N (0,42 mL, 3,07 mmols) e DMAP (16 mg, 0,13 mmol) foram adicionados a uma solução de dA.n9 (1,02 g, 2,12 mmols) em CH2Cl2 anidroso (15 mL). A mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 1,5 hora, em seguida diluída com éter etílico (50 mL). A solução de éter foi lavada duas vezes com uma solução saturada de NaHCO3 (25 mL cada) e em seguida com salmoura (25 mL). A camada orgânica foi secada em Na2SO4, concentrada em vácuo e purificada por cromato- grafia de sílica-gel para produzir O6-(2-mesitilenossulfonil)-3',5'-bis-O- terc-butildimetilsilil-2'-desoxiinosina dA.n10 (279 mg, 20%).1H RMN (400 MHz, CDCI3): δ 8,55 (s, 1 H, H-8), 8,38 (s, 1 H, H-2), 6,99 (s, 2 H, Ph-H), 6,48(t, 1 H, J = 6,4Hz, H-l) ,4,61 (m, 1 H, H-3) ,4,03 (m, 1 H, H-4) ,3,85 (m, 1 H, H-5'a), 3,76 (m, 1 H, H-5'b), 2,77 (s, 6 H, CH3), 2,61 (m, 1 H, H-2'a), 2,43 (m, 1 H, H-2'b), 2,32 (s, 3 H, CH3), 0,91 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,89 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0,09 (s, 6 H, (CH3)2Si), 0,08 (2 s, 6 H, (CH3)2Si).N6-[1-(4-Iodofenil)etil]3'5'-bis-O-terc-butildimetilsilil-2'-desoxiadenosina(dA.nll)

[000213] Uma solução de 1-(4-iodofenil)etilamina (312 mg, 1,26 mmol) em 1,4-dioxano anidroso (1 mL) foi adicionada a uma solução de dA.n10 (279 mg, 0,42 mmol) em 1,4-dioxano anidroso (2 mL) con-tendo peneiras moleculares (4 Â, 8-12 mesh, 0,75 g) em temperatura ambiente sob atmosfera de nitrogênio. A mistura foi agitada em seguida a 50°C durante 18 horas. O solvente foi removido em vácuo, e o produto cru foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel, para produzir N6-[1-(4-iodofenil)etil]-3',5'-bis-O-terc-butildimetilsilil-2'- desoxiadenosina dA.n11 (263 mg, 88%, mistura 1:1 de diastereoisô- meros) como uma espuma branca. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) para diastereoisômeros: δ 8,32 (s, 1 H, H- 8), 8,08 (s, 1 H, H - 2), 7,61 (m, 2 H, Ph-H), 7,15 (m, 2 H, Ph-H), 6,42 (t, 1 H, J = 6,4 Hz, H-1), 6,20 (br m, 1 H, NH), 5,50 (br s, 1 H, Ph-CH), 4,59 (m, 1 H, H-3), 3,99 (m, 1 H, H-4), 3,85 (m, 1 H, H-5'a), 3,77 (m, 1 H, H-5'b), 2,60 (m, 1 H, H-2'a), 2,42 (m, 1 H, H-2'b), 1,59 (d, 3 H, J = 7,0 Hz, CH3), 0,90 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0,08 (s, 12 H, (CH3)2Si);13C RMN (100 MHz, MeOH-d4) para diastereoisômeros: δ 153,78 (C), 151,94 (CH), 143,78/143,7l (C), 138,36 (CH), 137,57 (CH),128,17/128,16 (CH), 119,99 (C), 92,41 (C), 87,81/87,79 (CH), 84,28 (CH), 71,78/71,74 (CH), 62,72/62,68 (CH2), 49,40 (br, CH), 41,31(CH2), 25,96 (CH3), 25,75 (CH3), 22,64 (CH3), 18,41 (C), 17,99 (C), -4,66 (CH3), -4,82 (CH3), -5,39 (CH3), -5,48 (CH3).N6-[1-(4-Iodofenil)etil]-2'-desoxiadenosina (dA.n12)

[000214] Uma solução de n-Bu4NF (409 mg, 1,30 mmol) em THF (3 mL) foi adicionada a uma solução de dA.n11 (263 mg, 0,37 mmol) em THF (5 mL) a 0°C. A mistura reacional foi gradualmente aquecida em temperatura ambiente e agitada durante 30 minutos, em seguida con-centrada em vácuo até a secura. O resíduo foi purificado por cromato- grafia de coluna em sílica-gel para produzir N6-[1-(4-iodofenil)etil]-2'- desoxiadenosina dA.n12 (164 mg, 93% mistura 1:1 de diastereoisô- meros) como um sólido encerado.1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para diastereômeros: δ 8,35 (s, 1 H, H- 8), 8,32 (br s, 1 H, D2O permutável, NH), 8,13 (s, 1 H, H-2), 7,62 (d, 2 H, J = 8,2 Hz, Ph-H), 7,22 (d, 2 H, 2 H, J = 8,2 Hz, Ph-H), 6,32 (m, 1 H, H-1), 5,41 (br, 1 H, Ph-CH), 5,31 (d, 1 H, D2O permutável, 3'-OH), 5,19 (m, 1 H, D2O permutável, 5'-OH), 4,35 (m, 1 H, H-4), 3,85 (m, 1 H, H- 4), 3,58 (m, 1 H, H-5'a), 3,48 (m, 1 H, H-5'b), 2,68 (m, 1 H, H-2'a), 2,22 (m, 1 H, H-2'b), 1,49 (d, 3 H, J = 7,0 Hz, CH3).N6 -{1 -[4-(3-Trifluoroacetamido-1-propinil)fenil]etil}-2-desoxiadenosina (dA.n13)

[000215] Uma solução de dA.n12 (70 mg, 0,145 mmol), N- propargiltrifluoroacetamida (66 mg, 0,44 mmol), CuI (5,5 mg, 0,03 mmol), tetracis (trifenilfosfina)-paládio(0) (17 mg, 0,015 mmol) e Et3N (41 μL, 0,29 mmol) em DMF anidra (2,2 mL) foi agitado em temperatura ambiente durante 5,5 horas. A mistura foi concentrada em vácuo e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel para produzir N6- {1-[4-(3-trifluoroacetamido-1-propinil)fenil]etil}-2'-desoxiadenosina dA.n13 (63 mg, 86%, mistura 1:1 de diastereoisômeros) como um sólido encerado.1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) para diastereômeros: δ 10,05 (t, 1 H, J = 5,4 Hz, D2O permutável, NH), 8,36 (s, 1 H, H-8), 8,34 (br s, 1 H, D2O permutável, NH), 8,15 (s, 1 H, H-2), 7,43 (d, 2 H, J = 8,2 Hz, Ph-H), 7,36 (d, 2 H, 2 H, J = 8,2 Hz, Ph-H), 6,33 (dd, 1 H, J = 6,4 e 7,5, Hz, H- 1), 5,49 (br, 1 H, Ph-CH), 5,30 (d, 1 H, D2O permutável, 3'-OH), 5,10 (m, 1 H, D2O permutável, 5'-OH), 4,39 (m, 1 H, H-3), 4,25 (d, 2 H, J = 5,4 Hz, CH2), 3,87 (m, 1 H, H-3), 3,59 (m, 1 H, H-5'a), 3,51 (m, 1 H, H- 5'b), 2,72 (m, 1 H, H-2'a), 2,24 (m, 1 H, H-2'b), 1,52 (d, 3 H, J = 7,0 Hz, CH3);N6-{1-l4-(3-amino-1-propinil)fenil]etil}-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato (dA.n14)

[000216] POCl3 (14 μL, 0,15 mmol) foi adicionado a uma solução de dA.n14 (51 mg, 0,1 mmol) e esponja de próton (32 mg, 0,15 mmol) em trimetilfosfato (0,5 mL) e mantido a menos 20-30°C durante duas horas. Uma solução de pirofosfato de bis-tri-n-butilamônio (237 mg, 0,5 mmol) e tri-n-butilamina (100 μL) em DMF anidra (1,0 mL) foi adicionada. Depois de cinco minutos de agitação, o tampão de bicarbonato de trietilamônio (1 M, pH 7,5; 10 mL) foi adicionado. A reação foi agitada durante uma hora em temperatura ambiente, seguido pela adição gota a gota de hidróxido de amônio concentrado (10 mL, 27%) a 0°C. A mistura foi agitada durante mais uma hora em temperatura ambiente e em seguida liofilizada até a secura. O resíduo obtido foi dissolvido em água (10 mL), filtrado e purificado por cromatografia de permuta de ânion usando uma coluna Q Sepharose FF (2,5 x 20 cm) com um gradiente linear de NH4HCO3 (50 mM a 500 mM em 300 minutos) em uma taxa de fluxo de 4,5 mL/minuto. As frações contendo trifosfato foram combinadas e liofilizadas para produzir trifosfato dA.n14 (60 mg, 86%, mistura 1:1 de diastereoisômeros) como um sólido macio branco.1H RMN (400 MHz, D2O) para diastereoisômeros: δ 8,41 (s, 1 H, H-8), 8,14 (2 s, 1 H, H-2), 7,38 (m, 4 H, Ph-H), 6,46 (m, 1 H, H-1), 5,32 (br, 1 H, Ph-CH), 4,30 (s, 1 H, H-3), 4,20 (m, 2 H, H-5'a e H-5'b), 3,61 (s, 2 H, CH2), 2,78 (m, 1 H, H-2'a), 2,59 (m, 1 H, H-2'b), 1,60 (d, 3 H, J = 6,9 Hz, CH3);31P RMN (162 MHz, D2O): δ -6,02 (d, J = 19,4 Hz), -11,19 (d, J = 19,4 Hz), -21,77 (t, J = 19,4 Hz);ToF-MS (ESI): Para o íon molecular C21H25N6O12P3Na [M- 2H+Na]-, a massa calculada foi 669,0641, e a massa observada foi 669,0960.N6-{1-[4-(3-amino-1-propinil)fenil]etil}-2'-desoxiadenosina-5'-trifosfato rotulado por 6-FAM (WW2p093)

[000217] Uma solução de 6-FAM-SE (3,5 mg, 7,4 μmol) em DMSO anidroso (70 μL) foi adicionada a uma solução de trifosfato dA.n14 (4,1 μmol) em tampão de Na2CO3/NaHCO3 (0,1 M, pH 9,2; 600 μL) e incubada em temperatura ambiente durante uma hora. A reação foi purificada por HPLC de fase reversa usando uma coluna Perkin Elmer OD-300 C18 (4,6 x 250 mm) para produzir o trifosfato rotulado por 6- FAM WW2p093. Fase móvel: A, 100 mM de acetato de trietilamônio (TEAA) em água (pH 7,0); B, 100 mM de TEAA em água/CH3CN (30:70). Purificação por HPLC foi obtida usando um gradiente linear de 5-20% de B durante 20 minutos e em seguida 20-90% de B durante 20 minutos. A concentração de WW2p093 foi calculada por espectrosco- pia de adsorção usando o coeficiente de extinção do corante de 6- FAM (isto é, 68.000 em 494 nm).

[000218] Todas as patentes e publicações de patente referidas aqui estão por este meio incorporadas por referência. Certas modificações e melhorias ocorrerão por aqueles versados na técnica em uma leitura da descrição anterior. Deve ser entendido que todas as tais modificações e melhorias foram deletadas aqui por causa de concisão e legibilidade, porém estão corretamente dentro do escopo das seguintes rei-vindicações.

[000219] 1 O procedimento exato pode ser constatado em: Kiselyov,A. S.; Steinbrecher, T.; Harvey, R. G. (1995) "Synthesis of the Fjord-region cis- and trans-Amino Trio1 Derivatives of the carcinogenic Hy-drocarbon Benzo[g]chrysene and Utilization for the Synthesis of a De-oxyadenosine Adduct Linked to the N6-Amino Group" J. Org. Chem., 60: 6129-6134.

Claims (19)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a seguinte fórmula:

em que o composto é selecionado a partir do grupo que consiste nos compostos representados pelas fórmulas de I a VII ou sais dos mesmos:

R1 = H, monofosfato, difosfato ou trifosfato,R2 é H ou OH,R3 e R4 são selecionados a partir de H, uma C1-C12 alquila linear ou ramificada, uma C2-C12 alquenila ou polienila de cadeia linear ou ramificada, um C2-C12 alquinila ou polialquinila de cadeia linear ou ramificada e um grupo aromático tal como anel de fenila, naftila, ou piridinila, com a condição de que pelo menos um dentre R3 e R4 seja H;R5, R6 e R7, são cada qual independentemente selecionado a partir do grupo H, OCH3, NO2, CN, um haleto, uma C1-C12 alquila de cadeia linear ou ramificada, uma C2-C12 alquenila ou polienila de cadeia linear ou ramificada, uma C2-C12 alquinila ou polialquinila de cadeia linear ou ramificada, e um grupo aromático tal como anel de feni- la, naftila, ou piridinila, e/ou um grupo de ligação de estrutura geral:

no qualX = CH2, CH=CH, C =C, O, S ou NH,Y = CH2, O ou NH,n e m são um número inteiro de 0 a 12, eo corante é um fluoróforo.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dentre R3 ou R4 é selecionado a partir de -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, isopropila, terc-butila, fenila, 2- nitrofenila e 2,6-dinitrofenila.

3. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a seguinte fórmula:

em que o composto é selecionado a partir do grupo que consiste nos compostos representados pelas fórmulas VIII-XIV ou sais dos mesmos:

na qualR1 é H, monofosfato, difosfato ou trifosfato,R2 é H ou OH,R3 e R4 são, cada um, independentemente selecionados a partir de H, uma C1-C12 alquila de cadeia linear ou ramificada, uma C2C12 alquenila ou polienila de cadeia linear ou ramificada, uma C2-C12 alquinila ou polialcinila de cadeia linear ou ramificada e um grupo aromático, tal como um anel fenila, naftila ou piridinila;R5, R6 e R7 são, cada um, independentemente selecionados a partir de H, OCH3, NO2, CN, um haleto, uma C1-C12 alquila de cadeia linear ou ramificada, uma C2-C12 alquenila ou polenila de cadeia linear ou ramificada, uma C2-C12 alquinila ou polialcinila de cadeia linear ou ramificada, um grupo aromático, tal como um anel de fenila, naftila ou piridinila e/ou um grupo ligante de estrutura geral:

no qualX = CH2, CH = CH, C=C, O, S ou NH,Y = CH2, O ou NH,n e m são, cada um, um número inteiro de 0-12,o corante é um fluoróforo, eR8 e R9 são conforme definidos acima para R5, R6 e R7, com a condição de que R8 e R9 não sejam NO2.

4. Composto, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dentre R3 e R4 é selecionado a partir do grupo que consiste em -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, isopro- pila, terc-butila e fenila.

5. Composto, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dentre R3 ou R4 é selecionado a partir do grupo que consiste em grupos alquila e aromáticos, opcio-nalmente contendo pelo menos um heteroátomo nos grupos aromáticos ou alquila e ainda em que o grupo aromático é opcionalmente definido como um grupo policíclico ou arila.

6. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo que consiste em:

7. Composto, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o composto é selecionado a partir do grupo que consiste em:

8. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 5, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de R5, R6, R7 e Rs é um grupo aromático que consiste em grupos arila e policícli- cos.

9. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 5 e 8, caracterizado pelo fato de que o fluoróforo é selecionado a partir de BODIPY, fluoresceína, rodamina, cumarina, xanteno, cianina, pireno, ftalocianina, ficobiliproteína, alexa, corante esquareno, combinações resultando em corantes de transferência de energia e derivados dos mesmos.

10. Método para sequenciamento de um ácido nucléico alvo, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:(i) ligar um iniciador à uma superfície sólida;(ii) hibridizar um ácido nucléico alvo ao iniciador ligado à superfície sólida;(iii) adicionar pelo menos um composto como definido na reivindicação 1 ou 2, em que se mais de um tipo de base estiver presente, cada base é opcionalmente ligada a um fluoróforo diferente;(iv) adicionar uma polimerase ao complexo de iniciador hi- bridizado/ácido nucleico alvo para incorporar pelo menos um composto da etapa (iii) em uma fita de ácido nucleico de iniciador em crescimento por uma reação catalisada por polimerase, em que o pelo menos um composto incorporado da etapa (iii) termina a reação da polimera- se com uma eficiência de 70% a 100%;(v) opcionalmente lavar a superfície sólida para remover componentes não incorporados;(vi) detectar o fluoróforo incorporado para identificar o pelo menos um composto incorporado da etapa (iii), em que a detecção é opcionalmente realizada usando um detector de excitação multilinha pulsado para imagiologia de corantes fluorescentes;(vii) adicionar opcionalmente um ou mais compostos quími-cos para tampar (cap) permanentemente os iniciadores não estendidos;(viii) expor a superfície sólida a uma fonte de luz para re-mover a porção de terminação foto-clivável resultando em um ácido nucleico de iniciador estendido com componentes de ocorrência natural;(ix) opcionalmente lavar a superfície sólida para remover a porção de terminação clivável clivada;(x) repetir as etapas (iii) a (ix) uma ou mais vezes para iden-tificar uma pluralidade de bases no ácido nucleico alvo.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a incorporação do pelo menos um composto como definido na etapa (iv) ocorre em 70% a 100% e de preferência em 85% a 100% da eficiência de incorporação de um nativo substrato com a mesma base na reação da polimerase.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, carac-terizado pelo fato de que a polimerase é uma transcriptase reversa, uma transferase terminal ou uma DNA polimerase, em particular em que a polimerase é uma Taq DNA polimerase, uma Klenow (-exo-) DNA polimerase, uma Bst DNA polimerase, uma Vent (-exo-) DNA po- limerase, uma Pfu (-exo-) DNA polimerase ou uma DeepVent (exo-) DNA polimerase, ou em que a polimerase é uma polimerase modificada selecionada a partir de Taq FS DNA polimerase, DNA ThermoSe- quenase polimerase, ThermoSequenase II DNA polimerase, Thermina- tor DNA polimerase, Therminator II DNA polimerase e Vent (-exo-) A488L DNA polimerase.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que de 85% a 100% das porções de terminação foto-cliváveis são removidas por exposição à fonte de luz na etapa (viii) e/ou em que a incorporação de pelo menos um composto como defindo na etapa (iv) é seguido pela terminação do crescimento da cadeia de ácido nucleico do iniciador com uma eficiência de 90% a 100%.

14. Método para conversão de um componente de ocorrência não natural em uma molécula de ácido nucleico em um componente de ocorrência natural, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(i) incorporar um composto como definido na reivindicação 1 ou 2 em um ácido nucleico; e(ii) expor o ácido nucleico resultante a uma fonte de luz para remover a fração de terminação foto-clivável do ácido nucleico.

15. Método para incorporar um componente de ocorrência não natural em um ácido nucleico e, opcionalmente, determinar a se-quência do ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) adicionar um ácido nucleico alvo a uma reação e, opcio-nalmente, a uma reação de sequenciamento Sanger ou do tipo Sanger;(ii) adicionar pelo menos um composto como definido na reivindicação 3 à reação e opcionalmente à reação de sequenciamen- to Sanger ou do tipo Sanger, em que se mais de um tipo de base estiver presente, cada base é opcionalmente ligada a um fluoróforo diferente;(iii) adicionar um iniciador complementar e uma enzima po- limerase à reação; e(iv) realizar uma reação catalisada por polimerase para in-corporar pelo menos um composto da etapa (ii) em uma fita de ácido nucleico em crescimento; e opcionalmente(v) analisar o resultado da etapa (iv) para a incorporação de pelo menos um composto da etapa (ii) e, opcionalmente, para a de-terminação da sequência,em que as etapas (i) - (iii) podem ser realizadas em qualquer ordem.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a incorporação de pelo menos um composto como definido na etapa (iv) é seguida pelo término do crescimento da fita a uma eficiência de 90% a 100%, ou em que a incorporação de pelo menos um o composto como definido na etapa (iv) ocorre com 70% a 100% da eficiência de incorporação do substrato nativo com a mesma base na reação de polimerase.

17. Método, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, carac-terizado pelo fato de que o método é para determinar a sequência de um ácido nucleico e a polimerase é uma transcriptase reversa, uma transferase terminal ou uma DNA polimerase, em particular em que a polimerase é uma Taq DNA polimerase, uma Klenow (exo-) DNA poli- merase, uma Bst DNA polimerase, uma Vent (-exo-) DNA polimerase, uma Pfu (exo-) DNA polimerase ou uma DeepVent (exo-) DNA polime- rase, ou em que a polimerase é uma polimerase modificada selecionada de TaqFS DNA polimerase, ThermoSequenase DNA polimerase, ThermoSequenase II DNA polimerase, Therminator DNA polimerase, Therminator II DNA polimerase, e Vent (exo-) A488L DNA polimerase.

18. Método para terminar a síntese de ácido nucleico, ca-racterizado pelo fato de que compreende a etapa de colocar um nu- cleotídeo ou nucleosídeo desprotegido 3'-OH, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, no ambiente de uma polimerase e permitindo a incorporação do 3'-OH desprotegido nucleotídeo ou nu- cleosídeo em uma molécula de ácido nucleico.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a eficiência de terminação da síntese de DNA após a incorporação do nucleotídeo ou nucleosídeo desprotegido 3'-OH varia de 90% a 100%, ou em que a eficiência de incorporação do 3'- O nucleotídeo ou nucleosídeo desprotegido OH varia de 70% a 100% em comparação com a eficiência de incorporação de um nucleotídeo ou nucleosídeo de ocorrência natural com a mesma base que o nucleotí- deo ou nucleosídeo desprotegido 3'-OH.