JPH01250393A - アミノ誘導化されたオリゴヌクレオチドの合成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、脂肪族アミノ基を有するオリゴヌクレオチド
を含有する組成物及びその製造方法に関するものである
。

従来の技術 オリゴヌクレオチドは、所定順序における４個のヌクレ
オチドの線状配列よシなる短鎖重合体である。ヌクレオ
チドのサブユニットはホスホジエステル結合によシ結合
されて、１個のヌクレオチドの３′ヒドロキシル部分を
次のヌクレオチドの３′ヒドロキシ部分に結合させる。

オリゴヌクレオチドの例は５　’　ＡｐＣｐＧｐＴｐＡ
ｐＴｐＧｐＧｐＣｐ　３　’である。記号Ａ、Ｃ，Ｇ及
びＴはデオキシリボースの１−位置に結合されたプリン
若しくはピリミジン塩基の特性を意味する。すなわちＡ
はアデニン、Ｃはシトシン、ＧＦｉグアニン、Ｔはチミ
ジンである。記号Ｐはホスホジエステル結合を示す。オ
リゴヌクレオチドの部分構造を第１図に示す。

本発明の単一鎖オリゴヌクレオチドは、さらにヌクレオ
シドサブユニットの配列に関しホモジニアスであること
を特徴とし、さらに均一な分子量を有する。

合成オリゴヌクレオチドは、最近の分子生物学及び組換
ＤＮＡ技術における強力な武器である。

これらの分子に対する用途は多く、たとえば（ａ）遺伝
子の蛋白配列に基づく特性遺伝子のｊＰ陰のための試料
として、（ｂ）Ｐｆｒ望の遺伝子の試験管内突然変異を
指令するため、（ｅ）単一鎖雛型に対するＤＮＡ合成の
プライマーとして、（由遺伝子の全合成における手順と
してなど多くの用途が含まれ、これらについてはダプリ
ュエム・アール・パール（Ｗｍ。

Ｒ，Ｂａｈｌ　）等、グログレツシプ・ヌクレイツク・
アシッド・リサーチ・モレキュラ・バイオロジー、第２
１巻、第１０１頁（１９７８）を参照するととができる
。

したがって、この種のオリゴヌクレオチドの効率的カ化
学合成法を開発するため他めて多くの努力が払われてい
る。現在まで開発されているこれら方法の簡単な説明は
ジー・シー・り四ケット（Ｃｒｏｅｋｅｔｔ、　Ｇ、　
Ｃ，）、アルドリヒミカ・アクタ、第１６（３１巻、第
４７−５５頁（１９８３）に見られる。現在使用し得る
最良の方法は、ヌクレオシドのホスホルアミダイト肪導
体を固相合成法と組み合せて利用する〔マテウツ、チ等
、ジャーナル・アメリカン・ケミカル・ソサエティー、
第１０３巻、第３１８５頁（１９８１）及びボーケージ
等、Ｍ、Ｈ，テトラヘドロン・レター、第２２　（２−
０）巻、第１８５８−１８６２頁（１９８１））。３０
個までの塩基の長さより表るオリゴヌクレオチドはこの
ような常法にしたがって作成することができ、５０個塩
基の程度の長さの分子も作成されている。

この技術を使用する装置も現在市販されている。

ＤＮＡの誘導体化に関する他の報告も文献に見られる。

改変ヌクレオシド三ｆｉ４ｙが開発されており、ここで
ビオチン基はウラシルの５位置における脂肪族アミン基
に結合されている〔ランガー等、プロシーディング・ナ
ショナル・アカデミ−・サイエンス、Ｕ、　Ｓ、　Ａ、
第７８巻、第６６５５−６６５７頁（１９８１）”］。

このヌクレオチド討導体は二重鎖ＤＮＡ中に効果的に組
み込まれる。ＤＮＡに組み込まれると、これは抗ビオチ
ン抗体により結合され、次いでこれを螢光法又は酵素法
により検出するために使用することができる。ランガー
等の方法により組み込まれたビオチン結合ヌクレオシド
を有するＤＮＡはより小さい単一鎖及び二重鎖のものに
断片化され、これら社ヌクレオシドサブユニットの配列
に対しヘテロジニアスであって、分子量が異なっている
。トレーパー及びゴールド〔バイオケミストリー、第１
９巻、第１７７４−１７８１頁（１９８０）は、重亜硫
酸塩で触媒されたアミン又換反広及びその後の螢光性標
識との反応による脂肪族アミノ基の導入を報告している
。

トレーバー及びゴールドの報告においては、アミノ基を
ピリミジン塩基に直接結合させる。このように結合した
アミン基は水素結合を抑制し、この理由でこれら物負は
ハイブリッド化などに有用でない。チュー等〔ヌクレイ
ツク・アシッド・リサーチ、第１１（１８）巻、第６３
′５−６５２９頁、（１９８３））は、アミンをオリゴ
ヌクレオチド又は核酸の末ｍｓ’　ｍ酸塩に結合させる
方法を報告している。

多くの理由で他の化学物質を合成オリゴヌクレオチドに
共有結合させる方法が望まれている。オリゴヌクレオチ
ドに結合された螢光染料は、放射性同位元素をこれらが
使用される研究、診断及び臨床法から排除することを可
能にし、かつ使用寿命及び入手性を向上させる。ＤＮＡ
配列決定装置のための不出−入による特詐出ＭＥ記載し
たように、螢光標識したオリゴヌクレオチドの合成はＤ
ＮＡ配列決定法の自動化を可能くする。適当な技術の開
発及び螢光標識したオリゴヌクレオチドの検出及び使用
に対する装置化は、現在面銅な他の実験的及び臨床的技
術の自動化を可能くする。

たとえばシュルツ（５ｃｈｕｌｔｚ　）等によりジャー
ナル・アメリカン・ケミカル・ソサエティー、第１０４
巻、第６８６１頁（１９８２）Ｋ開示されたもの及びヘ
ルツベルク（Ｈｅｒｔｚｂｅｒｇ　）等によりジャナル
・アメリカン・ケミカル・ソサエティー、第１０４＠、
第３１３頁（１９８２）Ｋ開示されたようなりＮＡ開裂
薬品の結合は合成制限酵素の作成を可能にし、その特異
性はオリゴヌクレオチド配列により指令される。

発明が解決しようとする問題点 本発明は、遊離脂肪族アミノ基を合成オリゴヌクレオチ
ドに尋人する一般的方法を提供する。このアミノ基は各
種のアミノ反応性官能基と柊易かつ特異的に反応し、そ
れにより広範な′ｎＪ＠の化学物質の共有結合を可能く
する。

問題点を解決するための手段 喪するに、本発明は、検出可能な成分に結合された新規
な脂肪族アミノ誘導化単一鎖オリゴヌクレオチドからな
り、検出可能な成分は発色団、螢光剤、蛋白質、＃素な
どのｒｉ識」である。

さらに、本発明はホスホルアミダイト先駆体を介して少
なくとも１柚のアミノ誘導化ヌクレオシドを挿入した新
規かオリゴヌクレオチドをも包含する。

他の面において、本発明は同相支持体上のオリゴヌクレ
オチドの合成方法をも包合し、ここでオリゴヌクレオチ
ドは保護されたアミノ誘導化ヌクレオシドホスホルアミ
ダイトと反応させる。

本発明は、−面において、合成された分子ｓ　＋　−ト
リフルオロアセトアミド−３′−デオキシ−３１−Ｎ、
Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミドチミジン（第２図）
及び面相オリゴヌクレオチド合成における最後の付加と
しての３′末端に対するその付加である。オリゴヌクレ
オチドの開裂及び保護解除の際、トリフルオロアセチル
基は加水分解されて遊離の脂肪族アミノ基をオリゴヌク
レオチドの３′末端に放出する。このアミノ誘導化され
たオリゴヌクレオチドは次いで広範なａ類のアミン反応
性分子のいずれかと反応して、対応のオリゴヌクレオチ
ド誘導体を生成することができる。これは、５′炭素で
は表〈塩基部分に保護脂肪族アミノ基を有する改変ヌク
レオシドを使用する一般的方法の特殊麦例である。この
棟の分子は、数個の遊離アミノ基をオリゴヌクレオチド
の内ｓＶＣかつオリゴヌクレオチド配列における所望位
置に組み込むことを可能にする。

本発明の目的は、ＤＮＡ配列決定に使用しうる新規な試
薬及び技術を提供することである。

さらに本発明の目的は、★伝病の検出及び他の目的に対
するＤＮＡハイブリット化の改良を提供することである
。

本発明のこれら及びその他の目的及び利点は、以下の記
載から当業者には明らかとなるであろう。

脂肪族アミノ基をオリゴヌクレオチド中へ導入するため
に使用する方法は、保護された脂肪族アミノ基を含有す
るヌクレオシド同族体の３１ホスホルアミダイト誘導体
を合成することである。次いで、このホスホルアミダイ
トを、非誘導化ヌクレオシドホスホルアミダイトの反応
と則様な方法で、同体支持体上で合成されるオリゴヌク
レオチドと反応させることができる。同相からの開裂及
び塩基成分と脂肪族アミン基との保護解除はアミン誘導
化オリゴヌクレオチドを与える。

例　　■ ■の合成：第３図には、市販化合物Ｉ（チミジン）から
の化合物■の合成を示す。化合物■〜■の合成はホロヒ
ッッ（Ｈｏｒｏｗｉｔ　）等、ジャーナル・オーガニッ
ク・ケミストリー、第２７巻、第３０４５−３０４８頁
（１９６２）Ｋ開示され、さらにギプス（Ｇｉｂｂｓ　
）及びオルゲル（Ｏｒｇｅｌ　）、ジャーナル・カーボ
ハイドレーツーヌクレオシズ・アンド・ヌクレオシド、
第３（５及び６）巻、第３１５−５５４頁（１９７１５
）に開示されている。化合物■及び■の合成は次の通り
である。

例■ アミノ−５′　−デオキシチミジンを２５ｍの乾燥ジメ
チルホルムアミドＶＣ浴解させた。これにｔ３−（１０
ミリモル）のＳ−エチルトリフルオロチオアセテート（
アルドリッチ社）を加えた。反応物を室温で静かに攪拌
した。Ｍ　ｅ　ＯＨ：アセトン１：１で行なったシリカ
ゲルＦ−２５４プレートにおける前記反応混合物のＴＬ
Ｃは、短波長ＵＶにより検出される生成物の単一スポッ
トを示す。この生成物は、殆んど移動し危い出発化合物
ＭＫ対比してこの溶剤系において高移動性を有する。

反応混合物を減圧下で回転式に蒸発させ、３〇−のイソ
プロパツールの三角フラスコに移し、沸とうインプロパ
ツール：　Ｍ　ｅ　ＯＨから再結晶化させた。収率−ｔ
３１ｓｇ（工９ミリモル、８０チ収率）、融点２６１°
　−２６２℃（分解）、分析予測値Ｃ４２，７％％Ｈ４
１８％　　Ｎ　　１２．５％；実験値Ｃ４２，７１Ｈ４
，１４チ、Ｎ１２．４チ。■の構造をさらＫＭ　　ＮＭ
Ｒにより確認した。

例　　■ この例は、保護されたアミノｖｊ４化ヌクレオシドホス
ホルアミダイトの製造を示している。

使用した注射器及び毛細管は、乾燥オープン内で１晩焼
成した。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は、４人のモ
レキュラシープ（リンデ社）で貯蔵した。ジイソプロピ
ルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）は、水酸化カリウムから
、次いで水素化カルシウムから蒸留し、そして４人のモ
レキュラシーブで貯蔵した。

撹拌棒を備える乾燥した三首の５０−丸底フラスコＫ　
６３１１Ｆ（α１９ミリモル）の化合物■を加えた。三
首にはそれぞれゴム橙を施こし、これら栓に針を挿入し
た。このフラスコを、乾燥Ｃａ　Ｃ１ｔのデシケータに
おいて数時間減圧した。７′７スコを乾燥窒素ガスの静
かな流れの下に保ち、２−の乾燥ＤＭＦを注射器で加え
た。６０μｊのＤ　Ｉ　ＰＥＡ（（［４ミリモル）を乾
燥１００μ！毛細管で加えた。

４０μｌのクロル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノメト
キシホスフィン（アメリカン・ビオヌクレア社、カリホ
ルニア州、エメルビル在）を加えた（乾燥１００μ！毛
細管による）。反応物を全出発物質が溶層するまで静か
に攪拌し、次いで室温に静置した（常にＮ、の下で）。

１時間後、ＨＣＣｌ、：ＥｔＯＨ：　ＥＬｍＮ＝８８　
：　１０　：　２におけるシリカゲルＦ−２５４プレー
ト上のＴＬＣは、出発物質■よりもずっと移動度の高い
生成物の単一スポットを示した。ヌクレオシドホスホル
アミダイト（４）Ｋつき記載したと同様な方法で、この
生成物を生成する試みは、生成物の分解により不成功に
終った。したがって、粗製反応混合物を、同相支持体上
の合成オリゴヌクレオチドに対する結合のために直接使
用した。■の構造は、オリゴヌクレオチドへの付加にお
けるこの生成物の反応性及び文献の結果に基づく反応の
予想生成物から推定される。

例　　■ この例は、ホスホジエステル結合を介してｓｌ−アミノ
−３′−デオキシチミジンの３′　−ヒドロキシル九対
し３′末端で結合されたオリゴヌクレオチドの製造を示
している。

付加＝３１末端にて固相に結合された配列３′ＯＨ−Ａ
ＧＣＡＣＴ　　ＴＴＴ　ＡＧＡ　ＧＴ　　５’　　の塩
基保護された合成オリゴヌクレオチドを、カリフォルニ
ア州・フォスターシティ−在、アプライド・パイオシス
テムス・インコーポレーション社により発行された「固
体支持体上のジメトキシトリチルヌクレオシドホスホル
ア之ダイトを用いるデオキシオリゴヌクレオチドの合成
法」と題する論文に許ｍＫ記載された方法により作成し
た。オリゴヌクレオチドと■との反応の相違点は、（Ｊ
Ｌ）工程４．２２及び４．２５の代りＫＭを含有する新
たに調製された反応混合物１−をアセトニトリル中の（
Ｌ５Ｍテトラゾール１ｔＲｔと混合し、これを反応容器
に加えること、（ｂ）工程４３３の後にアセトニトリル
で３０秒間にわたり２回洗浄すること、及び（Ｃ）キャ
ツビング工程５を省略すること（後の付加における未反
応ヒドロキシル基の分析を可能にする）である。

結合反応の効率は、比色分析を可能くする「正常」なホ
スホルアミダイトとの結合及びジメトキシトリチル基の
開裂により容易に監視される。オリゴヌクレオチドの３
′−ヒドロキシル基が■と最初の結合で反応すれば、こ
れはもはや後の結合において反応に利用されず、第２結
合の後のＤＣＡ処理に際し殆んど発色しない。この例に
おいて、ＤＭＴ基に対するＯ　Ｄａ　ｓ・＝１１２（希
釈後）が、■と反応する前のオリゴヌクレオチドから発
生した。ＤＭＴに対するＯＤ４！。＝１０２６（希釈後
）が、■との反応後に加えられたＧ残基から発生した。

したがって、５’　　−ＯＨ基の９８％が■との反応に
より保護された。このオリゴヌクレオチドを保護解除し
、かつチオフェノールと濃厚ＮＨ，ＯＨとＫよる常法で
の処理によって固相から開裂させ、セしてＮＨ，ＯＨを
減圧下で除去した。

オリゴヌクレオチドを１−の蒸留水に溶解させた。

０Ｄｚｓｅはこの溶液につき１２８であり、これはＤＮ
Ａの＃度が４．５　ｑ／Ｗ１ｔであることを示す。この
＠ｆｉ５０μノを水で１−まで希釈し、そして数百（１
００〜２００）岬のＡＧ５０Ｗ−Ｘ４（ナトリウム型）
イオン交換側脂と１５分間混合して、ＤＮＡをアンモニ
ウム塩からナトリウム塩に変換させた（アンモニウムイ
オンは後のニンヒドリン分析をｌ！１１害する）。この
樹脂を遠心分離により除去し、上澄液をサバント型回転
濃縮機で乾燥した。定量ニンヒドリン分析〔グイ・ター
・サリン（５ａｒｉｎ＊Ｖ、　Ｋ、　）等、アナリチカ
ル・バイオケミストリー、第１１７巻、第１４７−１５
７頁（１９８１））はオリゴヌクレオチド１モル当り約
１モルのアミノ基を与えた（オリゴヌクレオチドのモル
ｅ度は計算吸光係数Ｅａｓｅ　＝ｔ５５Ｘ１Ｑ’　　か
らヌクレオチド組成に基づいて決定した）。■が結合さ
れてない比較オリゴヌクレオチドの同モル量に対するニ
ンヒドリン分析は、アミン陽性反応を示さなかった。

例　　５ レオチドの上記溶液へ、２００μｊのａ、ｏト５０μノ
の１モル炭酸塩／Ｘ炭酸綬衡液（ｐＨ９，０）と２５μ
ノの新たに調製した１０１１９７−のフルオレシンイソ
チオシアネート（ＦＩＴＣ）（オレゴン州、ジャンクシ
ョンシティ−在、モレキュラー・ブローブス・インコー
ポレーション社）とのジメチルスルホキシドにおける溶
液を加えた。

この混合物を室温に数時間放置し、そしてＨｔＯ中のセ
ファデックスＧ−２５媒体のカラム（１ｃ！！Ｌｘ　９
　ａｍ　）　Ｋ対するクロマトグラフィーにより精製し
た。黄色生成物が溶出容量に溶出され、これを未反応染
料から綺麗に分離した。■が反応していかいオリゴヌク
レオチドとの比較反応り、カラムの溶出容量に殆んど全
く着色を与えず、これはこの染料が全く添加アミノ基と
反応しなかったことを示している。染料−オリゴヌクレ
チド結合物はＯＤ２．。＝２．、Ｓ、０Ｄ４１１　＝α
５４を有した。ＦＩＴＣにつきＥ４１ｍ　＝　７　Ｘ　
Ｉ　Ｑ’　　に基づいて、これは７．７μモルの染料溶
液を与える。Ｅ３．。＝１５５ｘ１０１　に基づき、Ｄ
ＮＡは１２．８μモルである。

したがって、およそ６０％の（〜６ｏ％）ＤＮＡ分子が
染料により標識された。これは大兄の推定であって、未
結合に対する結合フルオレフィン吸収における変化を示
さず、またより短い汚染性オリゴヌクレオチド及び非反
応オリゴヌクレオチドの変化も示さない。この着色ＤＮ
Ａの１部を２０％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動
にかけ、この長さのオリゴヌクレオチドに適切な移動度
の単一の着色（及び螢光性）バンドとして明らかに見ら
れた。

染料結合したオリゴヌクレオチドは、高性能液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）により逆転相ＣＸＳ　カラム
（ウォーターズ社）で溶出用としてアセトニトリル＝α
Ｉ　Ｍ　）　ＩＪエテルアンモニウムアセテ−）　（Ｐ
　Ｈｙ、　ｏ　）勾配を用いて容易に精製された。

上記した新規なアミノ誘導化オリゴヌクレオチドには多
くの用途が可能である。脂肪族アミノ基は容易かつ特異
的に多数の官能基と反応する。これは、実質的に任意の
所望の分子が上記のように作成されたオリゴヌクレオチ
ドに結合しうろことを意味する。これは酵素、他の蛋白
質、螢光標識、生物発光性標識、発色団などを包含する
。オリゴヌクレオチドは、多くの分野にしばしば放射性
標識と組み合せて広く使用されている。非放射性試料分
子を放射性標劾代りに使用することもできる。

これは、オリゴヌクレオチドを使用する方法をより安価
にし、かつ使用を容易と表し、さらに臨床用途に適合さ
せる。放射性標１’Ｊは大して好適でないが、このＩｒ
規なアミノ誘導化オリゴヌクレオチドを、たとえばｌ１
ｍ１のように放射性標識することもできる。新規なアミ
ノ誘導化オリゴヌクレオチドの用途に関する次の３つの
特定例のみを例示する： ｔ　自動化ＤＮＡ配列決定、 ２、　　ＤＮＡハイブリッド化による遺伝子病の検出、 五　ハイブリッド化の検出のための螢光の一般的使用。

して僧への遺伝子型を決定することができる。これは、
アミニオセンチシスにより胎児から得られたＤＮＡ試料
につき行なわれる。この情報は、６稙の遺伝子病に対す
る危険において大姉の遺伝子カウンセリングに対し不変
である。成人の遺伝子型をも決定して、効果的診断及び
早期の処置を可能にする。この技術の顕著な１例は、組
状赤血球貧血症の検出である〔コナー（Ｃｏｎｎｏｒ　
）等、グロシーデイング・ナショナル・アカデミ−・サ
イエンス、ＩＪ、　Ｓ、　Ａ、第８０巻、第２７８頁（
１９８３））。１９個の塩基対長さの合成オリゴヌクレ
オチドを合成し、一方は正常なヒトβ−グロビン遺伝子
（βＡ）Ｋ対し補完的であり、かつ一方は鎌状赤血球β
−グロビン遺伝子（βＳ）Ｋ対し補完的である。これら
の分子を放射能標識し、ＤＮＡハイブリッド化における
試料として使用した。適当なハイブリット化条件の下で
、これら試料を使用してβＡ遺伝子をβＳ対立遺伝子か
ら区別することができる。これは組状赤血球貧血症の＃
断を可能にする。より一般的には、コナー等の文献に指
摘されたように、「オリゴヌクレオチドの対立遺伝子％
−異性のハイブリッド化特性は、単一コピー遺伝子のＤ
ＮＡ配列におけるポイント突然変異を含む任意の遺伝子
病の一般的診断方法を与える」。本発明はこの技術に直
接使用するととができる。アミノ基を有するオリゴヌク
レオチド試料を作成し、これに螢光悸臓をラベルする。

螢光性試料分子は放射性試料の短い寿命と比べて無限に
安定であり、使用又は取り扱いに関し特殊の注意な必懺
としない。このことは、臨床用途においてこの方法を極
めて好適となし、これが事実上使用しうる主たる領域で
ある。

オリゴヌクレオチド試料は、研究並びに臨床用途に広く
使用される。これらは、「ライブラリー」すなわちプラ
スミド又はファージベクター中にクローン化されて生物
の全ゲノム（または発現ＲＮＡ）を含む配列を有するＤ
ＮＡ断片のコレクションにおいて、ＤＮＡ片及び所望配
列を検出するために一般的に使用される。さらに、これ
らは、特定ＤＮＡ片の制限分解物の「プロット」におけ
る所定配列のＤＮＡＫハイブリッド化させるためにも使
用される。これら全ての例或いはその他の例において、
オリゴヌクレオチドには一般に３′末端にｐｉｔを標識
し、かつ分子をオートラジオグラフィーにより検出する
。本発明は、螢光染料によるオリゴヌクレオチドの標識
を開示する。したがって、螢光を使用して、放射能が従
来使用されている任意の技術で分子を検出することがで
きる。これは、たとえば試料の安定性、使用のコスト及
び容易さ並びに廃棄のような放射能に対する各くの利点
を有する。

以上、本発明を説明したが、本発明はこれらのみに限定
されない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、５′末端ヌクレオシドの５′炭素原子に脂肪族アミ
   ノ基を含有し及び検出可能な成分を脂肪族アミノ基に結
   合させた単一鎖のオリゴヌクレオチドを含む化合物。 ２、検出可能な成分が発螢光団である特許請求の範囲第
   １項記載の化合物。 ３、検出可能な成分が発色団である特許請求の範囲第２
   項記載の化合物。 ４、検出可能な成分がタンパク質である特許請求の範囲
   第２項記載の化合物。 ５、検出可能な成分が酵素である特許請求の範囲第２項
   記載の化合物。 ６、検出可能な成分が放射性ヨウ素、 I −１２５であ
   る特許請求の範囲第２項記載の化合物。 ７、前記オリゴヌクレオチドが５′末端５′−アミノ−
   ５′−デオキシチミジンヌクレオシドを含有する特許請
   求の範囲第１項記載の化合物。 ８、脂肪族アミノ基を５′末端に含有するオリゴヌクレ
   オチドの製造方法において、アミノヌクレオシドホスホ
   ルアミダイトをオリゴヌクレオチド合成の最終のカップ
   リング段階で固相支持体上に反応させることによつて脂
   肪族アミノ基を導入することを特徴とする製造方法。 ９、保護された５′−アミノ−５′−デオキシ−３′−
   ホスホルアミドチミジンを反応させることによつて脂肪
   族アミノ基を導入する特許請求の範囲第８項記載の方法
   。 １０、下記の一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｂはヌクレオシド塩基或はヌクレオシド塩基類
   縁体であり、Ｒ＿１及びＲ＿２は低級アルキルである） を有するホスホルアミダイト化合物を、固相オリゴヌク
   レオチド合成における最終のカップリング段階で固体支
   持体に結合したオリゴヌクレオチドと反応させることを
   含む５′−アミノオリゴヌクレオチドの合成方法。 １１、オリゴヌクレオチドを次いで支持体から開裂する
   特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、検出可能な成分に結合させる特許請求の範囲第１
   ０項記載の方法。 １３、検出可能な成分が発螢光団である特許請求の範囲
   第１２項記載の方法。 １４、検出可能な成分が発色団である特許請求の範囲第
   １２項記載の方法。 １５、検出可能な成分がタンパク質である特許請求の範
   囲第１２項記載の方法。 １６、検出可能な成分が酵素である特許請求の範囲第１
   ２項記載の方法。 １７、検出可能な成分が放射性ヨウ素、 I −１２５を
   含有する特許請求の範囲第１２項記載の方法。