KR100240310B1 - 음이온교환크로마토그래피법을이용한고순도의바이러스불활성화된인자8회수방법 - Google Patents

음이온교환크로마토그래피법을이용한고순도의바이러스불활성화된인자8회수방법 Download PDF

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Abstract

본원은 하기 일반식(Ⅰ)로 표현되는 같거나 또는 서로상이한 반복단위를 함유하며 공유결합된 중합체로 표면이 피복되어 있는 하이드록실 그룹을 함유하는 캐리어가 주성분인 분리물질이 음이온 교환물질로 사용됨을 특징으로 하는, 혈장 또는 동결침전물로 부터 음이온 교환 크로마토그래피법으로 고순도의 바이러스 불활성화된 인자 Ⅷ를 회수하는 경제적인방법에 관한다.
식중, R1은 H 또는 CH3, Y는, -CN, -CHO, -OH, -CH2-NH2또는 -CH2NR2R3, R'와 R"는 각기 독립하여 H 또는 CH3, (단, Y=-OH인 경우, R'와 R"중 하나는 -OH가 될 수 있음), X는 -OH, -NR2R3또는 -OR4, R2와 R3는 알콕시, 시아노, 아미노, 모노-또는 디알킬아미노, 트리알킬암모늄, 카복실, 설폰산, 아세톡시 또는 아세트아미노성분으로 일치환 또는 다치환 될 수 있고 알킬성분이 10개의 탄소원자를 지니는 알킬페닐그룹 또는 페닐알킬그룹, 페닐그룹 알킬그룹, 1개 이상의 CH- 또는 CH2- 그룹이 N 또는 NH, N 또는 NH 및 S, 또는 N 또는 NH 및 0로 치환되며 5개 내지 10개의 탄소원자를 지니는 사이클릭 또는 비사이클릭성분, 또는 -(CH2)n-SO2-(CH2)nOH(n=2 - 6 임)의 구조식을 지니는 설폰설파이드(단, R2와 R3중 하나는 H가 될 수 있고, 또한, R2와 R3는 산성그룹이나 염기성그룹중 하나를 함유하거나 또는 둘중 하나가 중성이 되도록 조정될 수 있음), R4는 알콕시, 시아노, 카복실 설폰산 또는 아세톡시 성분으로 일치환 또는 다치환 될 수 있으며, 알킬성분이 10개의 탄소원자를 지니는 알킬페닐그룹 또는 페닐알킬그룹, 페닐그룹, 알킬그룹임.

Description

음이온 교환 크로마토그래피법을 이용한 고순도의 바이러스 불활성화된 인자 Ⅷ 회수방법
본원은 음이온 교환 크로마토그래피법을 이용한, 혈장 또는 동결침전물로 부터의 고순도의 바이러스불활성화된 인자 Ⅷ 회수방법에 관한다.
EP-A 제 0 238 701 호에는 동결침전물로 부터 피브리노겐, 글로뷸린, 알부민 및 다른 간섭성분을 에탄올 침전법으로 제거하여 고순도의 비감염성 항혈우병 인자를 제조하는 방법이 기재되어 있다. 동결침전물로부터의 인자 Ⅷ축적은 필수적인바, 이는 인자 Ⅷ를 당해 동결침전물질이 매우 소량 함유하는 때문이다. 하지만, 축적 단계는 최종생성물내 AHF 함량을 격감시킨다. 지금까지 공지된 인자 Ⅷ 제조방법으로는 매우적은 양의 물질만을 얻을 수 있을 뿐이었다. 따라서, 종전의 방법으로 얻은 인자 Ⅷ를 투여받는 환자들은 다량의 항원물질도 함께 투여받아야 했다. 이상과 같이 종전의 방법은 위험을 안고 있었다. 따라서, 다른 분리방법으로 인자 Ⅷ를 축적하려는 많은 시도가 있어 왔던바, 그중 한가지가 인자 Ⅷ에 대항하는 동물항체를 사용한 친화성 크로마토그래피법으로 높은 고유활성을 지니는 생성물을 얻고자 하는 것이었다. 하지만, 당해방법은 많은 비용이 들어감은 물론, 일정량의 동물 단백질이 당해 크로마토그래피법에의한 분리시마다 컬럼에서 계속하여 용리되는 단점도 지닌다.
유럽특허 제 88 108 458.6호의 바람직한 구체예에는 인자 Ⅷ를 함유하는 동결침전물을 알루미늄 하이드록사이드와 생물학적 융화성을 지니는 유기용매/세제로 차례로 세척한뒤, 이온교환 물질을 이용한 겔투과 크로마토그래피법으로 크로마토그래피시켜 고순도의, 바이러스를 함유치아니하는 항혈우병 인자를 얻는 방법이 기재되어 있다. 유럽특허 제 88 118 478.2 호에는 고순도의 바이러스 비함유 인자 Ⅷ 수득용으로 특히 적합한, 올리고에틸렌 글리콜, 글리시딜 메타그릴레이트 및 펜타에리스리톨 디메타크릴레이트의 공중합체를 주성분으로 하는 크로마토그래피 물질이 기재되어 있다.
WO 90/4886 호에는 단백질 분리용 매질이 기재되어 있다. 당해 물질은 복수개의 폴리아민 성분을 지니는 수불용성 매트릭스로서, 당해 폴리아민 성분은 최소한 3개의 염기성질소 원자를 함유하고 당해 질소원자 각각의 사이에는 최소한 2개의 탄소원자쇄가 존재하며, 각 폴리아민 그룹이 총 3개의 질소원자를 함유케되는 경우에는 최소한 5개의 상술한 탄소원자들이 존재케된다. 이상과 같은 분리매질은 적어도 인자 Ⅷ를 부분정제함에 있어 적합한 용도를 지닌다.
EP 제 0 343 275 호에는 동결침전물 정제시 동결침전물을 생물학적 융화성을 갖는 유기용매/세제로 처리하여 바이러스가 존재치 않게 만들므로서 고순도의 항혈우병인자(AHF 또는 인자 Ⅷ)를 얻는 방법이 기재되어 있다. 당해 방법은 동결침전물로 부터의 바이러스 제거에 앞서, 당해 동결침전물을 해동시켜 m1 당 1 내지 3μ의 헤파린을 함유하는 pH 6.5-7.5의 물로 추출하는 단계, 알루미늄 하이드록사이드 현탁액과 혼합하는 단계, 10℃ 내지 18℃로 냉각시키고 pH 값을 6-7로 맞추는 단계, 원심분리 및 여과하는 단계, 공지의 방법으로 가공하는 단계가 행해짐을 특징으로 한다. 샘플을 바이러스 제거후 이온교환 물질상에서 겔투과 크로마토그래피시키는 것이 특히 유리하다.
유럽특허 제 88 108 458.6호에 기재된 방법은 인자 Ⅷ의 수율을 증가시켜 주기는 하나 생물학적 활성을 지니는 인자 Ⅷ의 수율은 만족할만한 수준까지 끌어올려 주지 못한다.
본원목적은 상술한 바와 같은 기술적 문제를 해결해줄 수 있는 방법을 제공함에 있는바, 본원은 동결침전물 또는 혈장소스로 부터의 생물학적 활성을 지닌 인자 Ⅷ의 회수율을 높여줄 수 있는, 훨씬 더 경제적인 방법을 제공해주게 된다.
상술한 바와 같은 문제는 본원 청구범위 제1항의 방법으로 해결된다. 종속항들은 본원방법의 바람직한 구체예에 관한다.
본원에 사용되는 분리물질은 EP-A 0 337 144 호에 기재된 바와 같은 캐리어 입자들로 구성된다. 당해 캐리어입자들은 하이드록실 그룹을 지니는 것으로서, 하이드록실 그룹에 대해 α-위치에 존재하는 탄소원자들을 통하여 중합물질이 그래프팅되어 있는 것들이다. 캐리어 물질들은 자신의 표면에 1차 또는 2차 지방족 하이드록실 기능기들을 지니는 공지의 다공성 및 비-다공성 크로마토 그래피 지지체들을 포함할 수 있다. 바람직한 것들로는 아크릴레이트 및/또는 메타크릴레이트 주성분의 친수성 중합체, 폴리비닐 알콜 주성분의 중합체, 디올치환된 실리카겔, 아가로즈 주성분의 폴리사카라이드, 셀룰로즈, 셀룰로즈 유도체 또는 덱스트란 주성분의 중합체를 들 수 있다. 물론, 비닐 화합물, 아크릴 아마이드, 하이드록실화된 형태의(메트) 아크릴산 에스테르 또는(메트)아크릴로 니트릴과 같은 단량체를 주성분으로 하는 다른 중합체 또는 공중합체가 또한 사용될 수 있다.
하이드록시 그룹에 대해 α-위치에 존재하는 탄소원자를 통하여 캐리어 입자에 결합케되는 청구범위 제1항 일반식(Ⅰ)의 중합물질은 하기 정의된 바와 같은 치환체들을 갖는 하기 일반식(Ⅰ)의 중합물질은 하기 정의된 바와 같은 치환체들을 갖는 하기 일반식(Ⅱ) 및/또는 (III)으로 표현되는 단량체로 부터 유도해낼 수 있다.
CR7R8=CR1-Y (Ⅱ)
상술한 단량체들은(메트) 아크릴산(Y=-COOH),(메트)-아크릴산 유도체, 아릴아민(Y=-CH2NH2, -CH2NR2R3), (메트) 아크닐로니트릴(Y=-CN), 아크롤레인(Y=-CHO), 비닐카복실레이드(Y=-OCOCHR5R6) 또는 비닐렌 카보네이트[일반식(Ⅲ)]를 말한다.
이들 단량체들 모두는 유리라디칼에 의해 개시되는 중합화 반응을 통해 수성용액내에서 중합화되며, 중성, 산성 또는 염기성인 가역적 결합그룹을 지니는 물질들이다.
일반식(Ⅲ)의 비닐렌 카보네이트 또는 일반식(Ⅱ)의 비닐 카복실레이트 CR7R8=CR1-OCOCHR5R6를 사용하는 경우에는 결과의 생성물을 하이드록실 그룹을 갖는 분리물질로 전환시키는 것이 바람직하다. 하이드록실상으로의 전환은 당업계 공지의 순한 알칼리성 또는 산성 비누화 방법을 사용해 실행할 수 있다. 예컨데, 당해반응은 실온에서 K2CO3의 메탄올 용액을 사용하여 (예컨데, Y. Tezuka 등이 Macromol, chem. 186, 685-694(1985)에 기고한 바와 같은 방법)행할 수 있다.
일반식(Ⅰ)[비교, 청구범위 (1)], (Ⅱ)의 R1은 수소가 되는 것이 바람직한바, 즉, 아크릴산 유도체가 바람직하다.
일반식(Ⅱ)의 Y는, -OCOHR5R6또는 -CH2NH2가 되는 것이 바람직하고, 두번째로는 -CN 또는 -CHO가 되는 것이 바람직하다. 따라서, 일반식(Ⅰ)의 는 첫째로, -OH(성분 -OCOCHR5R6가 하이드록실상으로 전환되는 것이 바람직하므로) 또는 -CH2NH2가 되는 것이 바람직하고, 두번째로는 -CN 또는 -CHO가 되는 것이 바람직하다.
R5와 R6는 독립하여, 5개의 탄소원자를 지니는 알킬그룹 또는 수소가 된다. R5와 R6그룹중 최소한 1개는 수소가 되는 것이 바람직하다. 하기 성분들은 특히 바람직하다 : 아세틸 옥시그룹, 프로피오닐 옥시그룹, 부티릴옥시 그룹, 발레릴 옥시 그룹, 및 헥사노일 옥시그룹.
일반식(Ⅱ)와 일반식(Ⅰ)의 X는 -OR4, -OH 또는 -NR2R3가 되며, -NR2R3가 되는 것이 좀 더 바람직하다.
X가 NR2R3가 되고, R2와 R3가운데 하나가 수소가 되는 화합물이 바람직하다.
성분 R2및/또는 R3는 알킬그룹 및/또는 페닐그룹이 알콕시, 시아노, 아미노, 모노알킬아미노 또는 디알킬아미노, 트리알킬암모늄, 카복실, 설폰산, 아세톡시 또는 아세트아미노그룹으로 일치환 또는 다치환, 바람직하기로는 일치환 또는 이치환, 특히 바람직하기로는 일치환될 수 있는 알킬페닐그룹 또는 페닐알킬그룹, 페닐, 알킬이 되는 것이 바람직하다.
성분 R2및/또는 R3는 선상 또는 분지상인 알킬그룹이 10개의 탄소원자, 바람직하기로는 6개의 탄소원자, 특히 바람직하기로는 4개의 탄소원자를 갖는 설폰산알킬 또는 카복시알킬, 트리알킬암모늄 알킬, 모노알킬아미노알킬 또는 디알킬아미노알킬, 아미노알킬, 시아노알킬, 알콕시알킬, 알킬이 되는 것이 바람직하다. 따라서, R2및/또는 R3는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 메톡시메틸, 에톡시메틸, 2-메톡시에틸, 2-, 3- 또는 4-옥사펜틸, 2-, 3-, 4- 또는 5-옥사헥실, 2-, 3-, 4-, 5 또는 6-옥사헵틸, 이소프로필, 2-부틸, 이소부틸, 2-메틸부틸, 이소펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 2-옥사-3-메틸부틸, 3-옥사-4-메틸부틸, 2-메틸-3-옥사펜틸, 2-메틸-3-옥사헥실 및 추가로 헵틸, 옥틸, 노닐 또는 데실의 바람직한 의미를 지닌다.
바람직한 것은 또한 시아노 그룹, 카복시그룹 또는 설폰산그룹으로 치환된 알킬그룹이다. 따라서, R2및/또는 R3는 시아노메틸, 시아노에틸, 시아노프로필, 시아노부틸, 시아노펜틸, 시아노헥실, 2-시아노프로필, 2-시아노부틸, 카복실메틸, 카복실에틸, 카복실프로필, 카복실이소프로필, 카복실부틸, 카복실펜틸, 카복실헥실, 카복실-2-메틸프로필, 카복실-2-메틸부틸, 설폰-메틸, 설폰산-에틸, 설폰산-프로필, 설폰산-부틸, 설폰산-펜틸, 설폰산-헥실, 설폰산-2-메틸프로필, 설폰산-2-메틸부틸, 설폰산-3-메틸부틸, 설폰산-2-메틸펜틸, 설폰산-3-메틸헥실 또는 설폰산-2-에틸펜틸의 바람직한 의미를 지닌다.
알킬그룹이 아미노그룹, 모노-또는 디알킬아미노 또는 트리알킬암모늄그룹으로 일치환되는 것이 또한 바람직하다. 알킬그룹은 동일 또는 서로 상이할 수 있고, 10개의, 바람직스럽기로는 6개의, 특히 바람직하기로는 4개의 탄소원자를 지닐 수 있다. 따라서, 알킬그룹은 디메틸아미노에틸, 디에틸아미노에틸, 메틸아미노에틸, 메틸아미노프로필, 디메틸아미노프로필, 에틸아미노에틸, 프로아미노에틸, 프로필아미노프로필, 디프로필아미노에틸, 디프로필아미노부틸, 디에틸아미노에틸, 트리메틸암모늄에틸, 트리메틸암모늄프로필, 트리메틸암모늄부틸, 트리에틸암모늄에틸, 트리에틸암모늄프로필, 트리에틸암모늄에틸, 아미노에틸, 아미노프로필, 아미노부틸 또는 아미노펜틸의 바람직한 의미를 지닌다. 이들 알킬그룹과 치환된 알킬그룹 모두는 또한 페닐그룹의 치환체로서 바람직하다.
R2및/또는 R3는 또한 -(CH2)n-SO2-(CH2)n-S-(CH2)nOH(n=2,3,4,5 또는 6, 바람직하기로는 2, 3 또는 4)의 구조식을 지니는 설폰설파이드가 되는 것이 바람직하다.
R2및/또는 R3는 또한 시아노, 시아노알킬, 아미노, 아미노알킬, 모노알칼아미노 또는 디알킬아미노, 알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 모노알킬아미노알킬 또는 디알킬아미노알킬, 트리알킬암모늄 또는 트리알킬암모늄알킬, 카복시, 카복시알킬, 설폰산 또는 설폰산알킬로 일치환되는 페닐그룹의 의미를 지니는 것이 바람직하다. 이들 치환체들은 상기 바람직한 것으로 명시된 알킬그룹 및 치환된 알킬그룹에 대응한다. 페닐그룹의 치환체는 바람직하기로는 P-위치에 부착된다.
R2및/또는 R3의 바람직한 의미는 또한 P-아세톡시페닐, P-아미노페닐 또는 P-아세트아미노페닐이 된다. R2및/또는 R3성분으로 바람직한 것은 또한 알킬페닐그룹 또는 페닐알킬그룹이며, 바람직한 것으로 명시된 의미들은 또한 알킬, 치환된-알킬 또는 치환된-페닐그룹에도 적용된다.
따라서, 예컨데, 하기 치환된 페닐그룹들이 특히 바람직한 것으로 사료된다: 4-시아노페닐, 4-알킬페닐, 4-(N, N-디메틸아미노)-페닐, 4-(N,N-디알킬아미노에틸)-페닐, 4-에톡시페닐, 4-에톡시에틸페닐, 4-트리알킬암모늄페닐, 4-카복실페닐, 4-설폰산-페닐, 페닐에틸, 4-(N-에틸아미노)페닐프로필 또는 4-시아노페닐에틸.
바람직한 것은 또한 R2및 R3가 방향족이거나 포화된 것일 수 있으며, 5개내지 10개의 탄소원자를 함유하는 사이클릭 또는 비사이클릭 그룹(1개의 이상의 CH-또는 CH2그룹이 N 또는 NH, N 또는 NH 및 S, 또는 N 또는 NH 및 0로 치환되는)이 되는 일반식(Ⅰ)의 성분 및/또는 일반식(Ⅱ)의 단량체이다.
따라서, R2및 R3는 또한 바람직하기로는, 피리딘 성분, 이미다졸일 그룹, 인돌일그룹, 더욱 바람직하기로, 피롤, 피리미딘, 피라잔, 퀴놀린 또는 이소퀴놀린 성분을 뜻한다.
R2및/또는 R3는 또한, 예컨데, 티아졸, 티아디아졸, 모폴린, 트리아진, 피페라진, 벤조티아졸, 퓨린, 피라졸, 트리아졸, 피롤리딘 또는 이속사졸성분이 될 수도 있다.
이들 가운데서, 방향족 복소환식 그룹이 특히 바람직하다.
적합한 교환물질을 얻기 위하여는, R2와 R3그룹은 산성그룹이나 염기성 그룹중 하나를 함유하거나 또는 둘중 하나가 중성이 되도록 조정되어야 한다. 당업자는 당해그룹을 용이하게 그같이 조정할 수 있을 것이며, 원하는 이온교환목적 및 기능에 따라 적합한 R2와 R3성분들을 결합시켜 사용할 수 있을 것이다.
R2와 R3성분중 1개가 중성성분이 되는 것이 바람직하다.
R4의 바람직한 의미는 선상 또는 분지상인 알킬그룹이 10개의 탄소원자, 바람직하기로는 6개의 탄소원자, 특히 바람직하기로는 4개의 탄소원자를 갖는 설폰산알킬 및 카복시알킬, 시아노알킬, 알콕시알킬, 알킬을 포함한다. 따라서, R4는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 헥실, 메톡시메틸, 에톡시메틸, 2-메톡시에틸, 2-, 3- 또는 4-옥사펜틸, 이소프로필, 2-부틸, 이소부틸, 2-메틸부틸, 이소펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 2-옥사-3-메틸부틸, 3-옥사-4-메틸부틸, 2-메틸-3-옥사펜틸 또는 2-메틸-3-옥사헥실이 되는 것이 바람직하다. 바람직한 것은 또한 시아노, 카복시 또는 설폰산그룹으로 치환된 알킬그룹이다. 따라서, R4는 시아노메틸, 시아노에틸, 시아노프로필, 시아노부틸, 시아노펜틸, 시아노헥실, 2-시아노프로필, 2-시아노부틸, 카복실메틸, 카복시에틸, 카복실프로필, 카복실이소프로필, 카복실부틸, 카복실펜틸, 카복실헥실, 카복실-2-메틸프로필, 카복실-2-메틸부틸, 설폰산-메틸, 설폰산-에틸, 설폰산-프로필, 설폰산-부틸, 설폰산-펜틸, 설폰산-헥실, 설폰산-2-메틸프로필, 설폰산-2-메틸부틸, 설폰산-3-메틸부틸, 설폰산-2-메틸펜틸, 설폰산-3-메틸헥실 또는 설폰산-2-에틸펜틸이 되는 것이 바람직하다.
이들 알킬 및 치환된 알킬그룹 모두는 페닐그룹의 치환체로서 또한 바람직하다.
바람직하기로는, R4는 또한 시아노, 시아노알킬, 알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 카복시, 카복시알킬, 설폰산 또는 설폰산알킬로 일치환된 페닐그룹의 의미를 지닌다. 이들 치환체들의 바람직한 의미들은 상기 바람직한 것으로 명기된 알킬그룹 및 치환된 알킬그룹에 대응한다. 페닐그룹의 치환체는 P-위치에 부착되는 것이 바람직하다.
일반식(Ⅱ)를 지니는 단량체의 R7과 R8은 바람직하기로 수소가 되므로서 일반식(Ⅰ)의 R'와 R"역시 바람직하기로 수소가 된다.
바람직한 것은 또한 Y가 -OH가 되고, R'와 R"성분 하나가 역시 -OH가 되는 일반식(Ⅰ)의 분리물질이다. 일반식(Ⅲ)의 비닐렌 카보네이트는 단량체로서 사용되어야 하고, 결과 생성물은 하이드록실상으로 전환되어야 한다.
일반식(Ⅲ)의 R7과 R1은 수소가 되는 것이 바람직하다. 일반식(Ⅰ)의 n은 2개 내지 100개의 반복단위, 바람직하기로, 5개 내지 60개의 반복단위를 나타내는바, 특히, 쇄길이가 10개 내지 30개의 반복단위로 이루어지는 것이 바람직하다.
EP-A-제 0 239 859호(Woods, K., 및 Orme, Th.,의)에는 바이러스 제거 또는 불활성화후 크로마토그래피법에 의한 분리전, 샘플을 오일, 바람직하기로는 콩기름, 파마자유 및/또는 면실유로 추출하는 것이 바람직하다는 견해가 기재되어 있다.
최초로, 본원방법은 지금까지 얻지못했던 특이적 활성을 지닌 항혈우병 인자를 고순도, 고수율로 얻을 수 있도록 해준다.
시판되는 동결 침전물을 약 1㎝ 내지 2㎝를 지니는 단편으로 나눈뒤, 실온에서 3 내지 4시간 동안 해동시킨다. 당해 단편을 10℃ 내지 25℃ 사이의 온도에서 교반하면서 m1 당 1 내지 3μ의 헤파린-소듐을 함유하는 물(단편 부피의 약 2배)에 현탁시켰다. 당해 현탁액의 pH를 0.1M 아세트산을 사용해 최소한 7.0 내지 8.0, 바람직하기로 7.0 내지 7.1로 맞추었다. 실온에서 15 내지 60분, 바람직하기로 30분 동안 교반을 계속하였다. 다음에는 동결침전물 1㎏당 약 108g의 2% 알루미늄 하이드록사이드 현탁액을 부가한뒤, 당해 혼합물을 실온에서 1 내지 10분, 바람직하기로는 5분 동안 교반하였다. 이후에는, 산, 바람직하기로, 0.1M 아세트산을 사용하여 산도를 조정, pH가 6.0 내지 7.0, 바람직하기로는 6.5 내지 6.6이 되도록 하였다. 샘플을 18℃ 내지 10℃, 바람직하기로는 16℃ 내지 14℃로 냉각시켰다. 당해온도에서, 혼합물을, 예컨데, Sharples AS-16(Cepa 61) 원심 분리기에서 분당 1.0ℓ의 속도로 원심분리시켰다. 다음에는, 원심분리시 얻은 상청액을 Pall AB-1 U0102P 여과기로 여과하였다. 당원심분리와 여과후, 바이러스를 불활성화시켰다. 바이러스 불활성화 수단으로는 Tween/TNBP(트리-n-부틸-포스페이트)가 특히 유용함이 입증되었다. 소듐콜레이트/TNBP를 썼을때도 양호한 결과를 얻을 수 있었다. 다음에는, Tween/TNBP 또는 소듐콜산염 /TNBP 혼합물을 오일을 사용한 추출법으로 제거하였다.
겔투과 물질[이온교환 활성을 보여주며, EMD-TMAE-Fract ogel(M) 650 이라는 상표명으로 알려진]을 함유하는 크로마토그래피컬럼에 샘플을 충전시켰다. EMD-TMAE-Fractogel(M) 650은 이미 위에서 성격규명이 이루어진바 있다. 컬럼용량은 동결침전물 1㎏ 당 0.5㎏의 컬럼물질이 존재하는 정도가 된다. 컬럼에 샘플을 충전시킨후 완충용액으로 세척하였다. 높은 이온세기를 지니는 완충액으로 샘플을 용리시킨다음, 결과의 생성물을 낮은 염함량을 갖는 완충용액으로 희석하고, 필요한 경우, pH 값을 조정하여 pH가 6.5 내지 7.5, 바람직하기로는 6.9 내지 7.1 이 되도록 하였다. 다음에는, 니트로셀룰로 여과기상에서 다시한번 여과한뒤, 살균여과시켰다.
상기 분리완충용액은 특별히 유익한 것으로 입증되었는바, 우리는 당해 분리완충액의 세기를 최소한 1개의 하이드로카빌쇄(1 내지 6개의 탄소원자를 지니는)와, 콜린클로라이드와 같은 친수성 치환체를 지니는 사차암모늄염 및/또는 소듐 클로라이드를 이용해 조정하였다.
본원방법에서는 상기 Fractogel(M) 650을 함유하는 컬럼을 완충용액 A로 세척하고 평형시킨다. 완충용액 A는 50 내지 200mM의, 바람직하기로는 120mM의 소듐클로라이드 또는 콜린을 함유하며, 5.8 내지 7.8의, 바람직하기로는 6.5 내지 7.0의 pH 값을 지닌다.
샘플은 삼투압 농도가 200 내지 600 mosm, 바람직하기로는 380 내지 520 mosm 이고, pH가 5.8 내지 7.8, 바람직하기로는 6.5 내지 7.0 인 완충액으로 부터 컬럼에 적가된다. 컬럼의 용량은 겔 1ml당 인자 Ⅷ 약 50 I.U 를 초과치 않는것이 바람직한 것으로 권장된다. 컬럼을 충전한후에는 당해 컬럼을 완충용액 A로 세척하게 된다.
다음에는, 컬럼을 완충용액 A와 같이 소듐 시트레이트, 칼슘 클로라이드, 글라이신을 함유하지만, 완충용액 A와 보다 더 큰 이온세기를 지니는 완충용액 B로 세척한다. 상술한 바와 같은 종류의 사차 암모늄 염 및/또는 소듐 클로라이드의 농도는 150 mM 내지 250mM, 바람직하기로는 180 내지 200mM이 되어야 하고, pH 값은 5.8 내지 7.8, 바람직하기로는 약 7.0 이 되어야만 한다.
컬럼으로 부터 생성물을 용리시키는데 완충용액 B보다 더 큰 이온세기를 지니는 완충용액 C가 사용된다. 상술한 바와 같은 종류의 사차 암모늄염, 특히 콜린 클로라이드, 및/또는 소듐 클로라이드의 함량은 200mM 내지 500mM, 바람직하기로는 약 400mM이 되어야만 하고, pH 값은 5.8 내지 7.8, 바람직하기로는 약 7.0이 되어야만 한다.
출발물질로서는 동결침전물 대신 혈장이 사용될 수 있다. 이경우, 2단계 크로마토그래피 처리법이 권장된다.
본원방법을 사용하면 높은 안정성을 지니는 인자 Ⅷ를 고수율로 회수할 수 있게 된다. 본원방법에는 소위 Von-willebrand가 인자 Ⅷ 분획내에 잔조케되는 유리한점이 있다. 따라서, 인자 Ⅷ 제제를 Von-willebrand 인자결핍증 환자용으로도 사용할 수 있게 된다. 또한 인자 Ⅷ를 연속-주입법에 사용할 수도 있게 되는데, 이는 Von-willebrand 인자가 인자 Ⅷ의 자연적 안정화를 돕기 때문이다.
본원방법은 하기실시예에 의해 보다 상세히 설명된다.
동결침전물로 부터 인자 Ⅷ의 축적.
시판되는 동결침전물을 약 1㎝ 내지 2㎝의 크기를 지니는 단편으로 나눈뒤, 실온에서 3 내지 4 시간 동안 해동시켰다. 당해 단편을 20℃ 내지 25℃ 사이의 온도에서 교반하면서 ml 당 2μ의 헤라핀-소듐을 함유하는 물(단편부피의 약 2배)에 현탁시켰다. 당해 현탁액의 pH를 0.1M 아세트산을 사용해 7.0 내지 7.1로 맞추었다. 20℃ 내지 25℃의 온도에서 30분 동안 교반하였다. 동결침전물 1㎏당 108g의 2% 알루미늄 하이드록사이드 현탁액을 부가한뒤, 당해 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 다음에는, 0.1M의 아세트산을 사용하여 pH를 6.5 내지 6.6으로 맞추었다. 샘플을 16℃ 내지 14℃로 냉각시킨뒤, Sharples AS-16(cepa 61) 원심 분리기를 사용하여 분당 1.0ℓ의 속도로 원심분리시켰다. 상청액을 pall AB-1 U0102P 여과기로 여과하였다.
[실시예 2]
크로마토그래피컬럼 조제.
동결침전물 1㎏당 최소한 0.5ℓ의 이온교환수지를 함유하는 컬럼을 추출된 동결침전물 분리용으로 사용하였다. 컬럼의 높이는직경이었다. 컬럼을 수지로 채운후, 먼저, 5부피의 0.1M 소듐 클로라이드 용액으로 당해 컬럼을 세척하고, 다음엔 다시, 하기 조성을 지니는 완충용액 A로 세척하였다.
소듐 클로라이드 120mM
소듐 시트레이트·5H2O 10mM,
글리신 120mM
칼슘 클로라이드·2H2O 1mM,
pH 값 6.5 내지 7.0(1M HCl을 사용해 조정함).
이후에 뒤이어지는 단계들이 바이러스를 함유치아니하는 동결침전물의 추출물을 이용해 행해지는 것이기 때문에, 상술한 완충용액들 모두는 바이러스를 함유치 아니해야 한다.
[실시예 3]
컬럼에 샘플을 충전시킨뒤, 280nm의 파상으로 유동액의 흡광도를 관측하였다. 컬럼분리전의 생성물이 지니는 인자 Ⅷ 활성과 수거한 영액이 지니는 인사 Ⅷ 활성을 조사하였다. 다음에는, 컬럼을 흡광도 값이 초기값에 이를때까지 완충용액 A로 세척한후, 흡광도 값이 기준선에 이를때 까지 완충용액 B로 세척하였다.
완충용액 B는 하기조성을 지닌다:
소듐 클로라이드 180 내지 200mM,
소듐 시트레이트·5H2O 10mM,
글리신 120mM,
칼슘 클로라이드·2H2O 1mM
pH 값 6.9 내지 7.0
생성물을 완충용액 C로 용리시켰다. 완충용액 C 부가후 나타난 단백질 분획물을 수거하였다.
완충용액 C는 하기조성을 지닌다:
소듐 클로라이드 400mM,
소듐 시트레이트·5H2O 1mM,
글리신 120mM,
칼슘 클로라이드·2H2O·1.0mM
pH 값 6.9 내지 7.0
원하는 생성물을 용리시킨뒤, 1M 소듐 클로라이드 용액을 함유하는 완충액 D 5 부피로 컬럼을 세척하였다.
컬럼을 0.1 N NaOH(3컬럼 부피), 0.1 N 염산(3컬럼 부피) 및 5컬럼부피의 25% 짜리 수성알콜로 차례로 세척하여 재생시켰다.
[실시예 4]
수거한 분획을 하기 조성을 지니는 완충용액 E로 26 또는 35μ/ml의 활성을 지닐때까지 희석하였다.
소듐 시트레이트 20mM,
글리신 80mM,
칼슘 클로라이·2H2O 2.5mM,
pH 값 6.9 내지 7.1.
다음에는, 필요한 경우, pH 값은 6.9 내지 7.1로 조정한후, 0.45 μm Sealklean 여과기로 여과하였다. 끝으로, 살균여과를 행하였다.
[실시예 5]
인체혈장을 인자 Ⅷ 소스로 사용할때는 하기와 같은 방법을 사용하였다.
신선한 또는 급속 동결시킨 인체혈장을 20℃의 온도가 되도록 한후(임의로, 수조를 사용함), 혈장을 물부피 50%로 희석한뒤 여과하였다. 혈장여액을 사전에 하기조성을 지니는 완충용액으로 평형시켜 놓은, EMD-TMAE-Fractogel(M) 650을 함유하는 이온교환컬럼에 충전시켰다.
소듐 클로라이드 50mM,
소듐 시트레이트 10mM,
글리신 120mM,
헤파린 ℓ 당 100μ,
pH 값 6.5 내지 6.9.
샘플을 충전시킨뒤, 이온교환수지를 세척완충용액으로 수회세척하였다. 다음에는, 수지를 소듐 클로라이드 100mM을 함유하는 완충용액, 소듐 160mM을 함유하는 완충용액 및 소듐 클로라이드 200mM을 함유하는 완충용액으로 차례로 세척하여 식염의 농도를 점진적으로 증가시켰다. 인자 Ⅷ를 함유하는 분획물을 수거한뒤, ml 당 인체혈정알부민 1.0㎎ 씩을 부가하여 안정화시켰다. 결과의 생성물을 실시예 2-4와 같은 방법(단, 여기서는, 실시예 2-4의 시판되는 동결침전물대신 수득한 컬럼분획물을 사용하였음)으로 가공처리하였다.
[실시예 6]
[비교실험]
동일한 혈장에서 얻은 동결침전물 0.3㎏을 본원방법과 EP 제 0 343 275 A1에 기재된 방법으로 각각 따로따로 가공처리하였다. 분획물을 분석한후, 성분들에 관하여 얻은 결과를 하기표에 기재하였다.
[표]
동결침전물 용액을 본원방법(Ⅰ)과 EP 제 0 343 275 A1호의 방법(Ⅱ)으로 크로마토그래피정제한 결과의 비교.
분석결과
[표]
본원방법으로 행해진 워크업에서는 각각이 270 I.U의 인자 Ⅷ(동결침전물 ㎏당 29,700 I.U의 인자 Ⅷ 수율 또는 혈장 ㎏ 당 297 I.U의 인자 Ⅷ 수율에 해당하는)를 함유하는 33개의 분획을 얻을 수 있었다.
EP 제 0 343 275 A1호의 방법으로 행해진 워크업에서는 각각이 270 I.U의 인자 Ⅷ (동결침전물 ㎏ 당 20,700 I.U의 인자 Ⅷ 수율 또는 혈장 ㎏ 당 270 I.U의 인자 Ⅷ 수율에 해당하는)를 함유하는 23개의 분획만을 얻을 수 있었다. 이러한 결과는 본원발명 방법의 수율이 EP 제 0 343 275 A1호의 워크업 방법 거의 51% 나 더 되는것을 보여준다.
피브리노겐과 면역글로뷸린 M(IgM)과 같은 바람직스럽지 아니한 단백질들은 본원방법으로 효과적으로 제거할 수 있었다.

Claims (8)

  1. 하기 일반식(Ⅰ)로 표현되는 같거나 또는 서로상이한 반복단위를 함유하며 공유결합된 중합체로 표면이 피복되어 있는 하이드록실 그룹을 함유하는 캐리어를 주성분으로 하는 분리물질이 음이온 교환물질로 사용됨을 특징으로 하는, 혈장 또는 동결침전물로 부터 음이온 교환 크로마토그래피법으로 고순도의 바이러스 불활성화된 인자 Ⅷ를 회수하는 방법.
    식중, R1은 H 또는 CH3, Y는, -CN, -CHO, -OH, -CH2-NH2또는 -CH2NR2R3, R'와 R"는 각기 독립하여 H 또는 CH3, (단, Y=-OH인 경우, R'와 R"중 하나는 -OH가 될 수 있음), X는 -OH, -NR2R3또는 -OR4, R2와 R3는 알콕시, 시아노, 아미노, 모노-또는 디알킬, 아미노, 트리알킬암모늄, 카복실, 설폰산, 아세톡시 또는 아세트아미노성분으로 일치환 또는 다치환 될 수 있고 알킬성분이 10개의 탄소원자를 지니는 알킬페닐그룹 또는 페닐알킬그룹, 페닐그룹 알킬그룹, 1개이상의 CH- 또는 CH2- 그룹이 N 또는 NH, N 또는 NH 및 S, 또는 N 또는 NH 및 0로 치환되며 5개 내지 10개의 탄소원자를 지니는 사이클릭 또는 비사이클릭성분, 또는 -(CH2)n-SO2-(CH2)nOH(n=2 - 6 임)의 구조식을 지니는 설폰설파이드(단, R2와 R3중 하나는 H가 될 수 있고, 또한, R2와 R3는 산성그룹이나 염기성그룹중 하나를 함유하거나 또는 둘중 하나가 중성이 되도록 조정될 수 있음), R4는 알콕시, 시아노, 카복실 설폰산 또는 아세톡시 성분으로 일치환 또는 다치환 될 수 있으며, 알킬성분이 10개의 탄소원자를 지니는 알킬페닐그룹 또는 페닐알킬그룹, 페닐그룹, 알킬그룹임.
  2. 제1항에 있어서, 청구범위 제1항 일반식(Ⅰ)의 Y가(식 중, X는 OH 또는 -OR4이고, R4는 제1항에서 정의한 바와 동일함)인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 청구범위 제1항 일반식(Ⅰ)의 Y가인 방법식중, X는 -NR2R3, R2와 R3는 각기 독립하여 알킬성분이 10개 이하의 탄소원자를 지니는 설폰산-알킬, 카복실알킬, 트리알킬암모늄알킬, 모노-또는 디알킬아미노알킬, 아미노알킬, 시아노알킬, 알콕시알킬, 알킬, 알킬성분이 10개이하의 탄소원자를 지니는 아세트아미노그룹 또는 아세톡시그룹, 설폰산-알킬, 설폰산, 카복시, 카복시알킬, 트리알킬암모늄알킬, 트리알킬암모늄, 모노알킬아미노알킬 또는 디알킬아미노알킬, 모노알킬아미노 또는 디알킬아미노, 아미노, 아미노알킬; 시아노알킬, 시아노알콕시알킬, 알콕시, 알킬로 일치환 또는 다치환되거나 또는 비치환된 페닐, 1개이상의 CH- 또는 CH2- 그룹이 N 또는 NH, N 또는 NH 및 S, 또는 N 또는 NH 및 0로 치환되며 5개 내지 10개의 탄소원자를 지니는 사이클릭 또는 비사이클릭성분, 또는 -(CH2)n-SO2-(CH2)n-S-CH2)nOH의 구조식(n=2-6임)을 지니는 설폰설파이드(단, R2와 R3중 하나는 H가 될 수 있고, 또한 R2와 R3는 산성그룹이나 염기성그룹중 하나를 함유하거나 또는 둘중 하나가 중성이 되도록 조정될 수 있음)임.
  4. 제1항에 있어서, 제1항의 일반식(Ⅰ)에서 Y가 -CH2NH2또는 -CH2NR2R3이고, R2와 R3가 제1항에서 정의한 바와 동일한 방법.
  5. 제1항에 있어서, 제1항의 일반식(Ⅰ)에서 Y가 -CN, CHO 또는 -OH인 방법.
  6. 완충용액의 이온세기를 1 내지 6개의 탄소원자를 갖는 최소한 1개의 하이드로 카빌쇄와 단독의 친수성 치환체 또는 식염과 컴비네이션된 친수성치환체를 지니는 사차 암모늄 염으로 조절함을 특징으로 하고 이온세기가 점차 커지는 완충용액들을 차례로 사용해 행하는 세척과 용리를 통해 인자 Ⅷ를 정제하는, 제1항 내지 제5항중 최소한 한항의 음이온 교환물질을 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피법으로 혈장 또는 동결침전물로 부터 고순도의 바이러스 불활성화된 인자 Ⅷ를 정제하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 사차암모늄염이 콜린클로라이드임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항중 최소한 한항에 있어서, 염농도기울기(사용된 완충용액 시스템에 의해 확립되는)가 제6항 및/또는 제7항의 소듐 클로라이드 및/또는 사차암모늄염 총농도가 0.1 내지 1M이 되는 방법.
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