JPH01248057A - アフイニテイークロマトグラフイー用担体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

に産業上の利用分野Ｘ 本光明は、タンパク質，ペプチド、アミノ酸等のアミノ
基を有するものをリガンドとして固定化し、アフィニテ
ィークロマトグラフィーを行うのに好適な担体の製造法
に関するものである。 Ｋ従来の技術】 従来、キトサンを用いてアフィニティークロマトグラフ
ィーを行うのに、アミノ基をもっているリガンドを利用
し、ゲルタールアルデヒド等のジアルデヒドを用いるこ
とはよく知られている。又。 カルボジイミド試薬でペプチド結合として利用すること
も特公昭５３−　　１０１５０号に開示されている。 本発明者等は、先に特願昭６２−　９２６２３号で、カ
ルボキシル基を有する多孔質キトサン誘導体をジシクロ
ヘキシルカルボジイミド シンイミドで処理して担体を得る方法を、又、特願昭６
２−　３１５７３４号で、部分アセチル化した粒状多孔
質キトサンを無水コハク酸で処理した後、ジシクＯへキ
シルカルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドで
処理して、抗体固定化用担体を得る方法を提案している
。 Ｋ発明が解決しようとする課題】 本発明者等が先に出願した担体は、抗体や酵素の如きリ
ガンドを温和な条件で容易に固定化でき、固定化後の非
特買的吸着もなく、アフィニティークロマトグラフィー
を行う場合に有効であった。 しかしながら、スペーサーがコハク酸等の鎖長の短いも
の一場合は問題がないが、リガンドの立体障害等が予想
される場合にはスペーサーの鎖長を長くしなければなら
ず、この時に長鎖アルキル基をスペーサーとして導入す
ると疎水性が強まって非特異的吸着を生ずる欠点がある
。 本発明は上述の欠点を解決し、任意の鎖長のスペーサー
の導入を可能にし、しかも疎水的相互作用を小さくして
非特異的吸着の小さいアフィニティークロマトグラフィ
ー用担体を得ることを目的とする。 「課題を解決するための手段】 本発明は、粒状多孔質キトサンを無水酢酸で部分アセチ
ル化した後、無水コハク酸で処理し、更にジアミンと縮
合剤で処理し、次いで無水コハク酸、更にジシクロへキ
シルカルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドで
処理してアフィニティークロマトグラフィー用担体を得
るものである。 本発明に用いられる粒状多孔質キトサンは、先に特開昭
６１−４０３３７号で開示した方法により得ることが出
来る。本発明に使用されるキトサンは特に限定されない
が、平均分子量が１０．０００〜２３０．０００の低分
子量キトサンを用いることが好ましい。 キトサンを酢酸、ジクロロ酢酸、蟻酸等の単独若しくは
混合物の水溶液に溶解させてキトサン酸性水溶液を得る
。該キ］・サン酸性水溶液を水酸化ナトリウム、水酸化
カリウム、炭酸すｌ・リウム、炭酸カリウム、アンモニ
ア、エチレンジアミン等のアルカリ性物質を含む塩基性
の水溶液中に加圧下で吐出孔より一定量ずつ落下σせ、
粒状に凝固再生させ、中性になる迄充分水洗を行って粒
状多孔質キトサンを得る。この時塩基性水溶液にアルコ
ール等の極性溶媒を併用することも出来る。 上述の如くして得られた粒状多孔質キトサンを無水酢酸
で処理して部分アセチル化を行う。その後鎖長の短いジ
カルボン酸無水物である無水コハク酸を作用させカルボ
キシル基を導入する。更にジアミンと縮合剤で処理する
。この際、ジアミンをカルボキシル基の山よりも３倍モ
ル以上の大過剰量を反応させることが架橋反応の進行を
極カ押えるのに重要なことである。使用されるジアミン
としては、目的に応じてエチレンジアミン、テトラメチ
レンジアミン、ヘキサメチレンジアミン。 オクタメチレンジアミン等が用いられるが、これ以上鎖
長が長いと非特異的吸着を生じて好ましくない。縮合剤
としてはジシクロへキシルカルボジイミド等のカルボジ
イミド系の縮合剤が一般的であるが、カルボキシル基と
アミノ基間にアミド結合を形成させる化学物質であれば
よい。その後無水コハク酸を反応させて任意のカルボキ
シル基を有する粒状多孔質キトサン誘導体を得る。本発
明においてはカルボキシル基の導入とその後のアミド結
合の生成の工程を複数回繰返して行うことができる。こ
の様に、本発明においては一度に長鎖のアルキル基化合
物を用いるのではなく、矧鎖の化学物質を順次アミド結
合によって長くしていくために長鎖アルキル基化合物を
使用する方法に比べて疎水性を弱めることが出来る。そ
してこの場合のカルボキシル基の密度は、最初に粒状多
孔質キトサンをアセチル化する時の無水酢酸の量で制御
することが出来る。 その後、中性になる迄充分水洗をする。活性基の導入量
は好ましくは５〜１４０μｌ１ｏｔ／ｒｄ、粒状体であ
る。活性基密度が５μＴＩＯＩ／ｉ粒状体以下では固定
化されるリガンド量が少なく、使用する粒状体の容量の
みが大きくなり好ましくなく、又、１４０μｍ０１／−
粒状体以上では固定化されたリガンドに立体障害が生じ
、リガンドの活性が充分有効に発揮されない欠点がある
。 得られたカルボキシル基を導入した粒状多孔質キトサン
を、例えばジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチ
ルアセトアミド、ジメチルスルフオキシド、テトラヒド
ロフラン、メチルアルコール、イソプロピルアルコール
等の極性溶媒に懸濁させた後にジシクロヘキシルカルボ
ジイミドヒドロキシスクシンイミドを加えて室温で約２
４時間攪拌反応させる。反応終了後、使用した極性溶媒
で充分洗浄してリガンド固定化用アフィニティークロマ
トグラフィー用担体が得られる。

【実　施　例】

以下実施例により本発明を説明するが、本発明は実施例
の記載に限定されるものではない，尚、活性基の密度（
ＣＴＶ）及び比表面積は次の方法で求めた。 （Ａ）活性基密度 試料量５０ｄをＩ　Ｎ−１１ｃ１１，５００威中て緩か
に攪拌しながらｌＲ間処理し、脱イオン水で中性になる
まで充分洗浄し、空気中の炭酸ガスを吸収させない様に
注意しながら脱水した試料３０戒を迅速に計り採り、１
１５０　Ｎ−ＮａＯＨ１００ｒｄ、中に投入し、緩かに
攪拌しながら５時間数置する。この、１：澄液を１０ｄ
採取しメチルレッド溶液を指示薬として１／１００　Ｎ
−ＭＣＩで中和滴定し次式より求める。 ａ：試験液１０ｒｄを中和するのに要した１／１００　
Ｎ−ＨＣｌ量 ｂ：試料を入れる前の１１５０　Ｎ−ＮａＯＨ１０−を
中和するのに要した１／１００　Ｎ−ＨＣｌφｆ　：　
１／１００　Ｎ−ＨＣｌ力価 Ｖ：湿潤試料量（３ｆ）＋ｙｅ） （Ｂ）比表面積 比表面積測定装置を用いてＢＥＴ沫で測定する。 実施例１ 脱アセチル化度７７％、平均分子ｆｆ１４２，０００の
キトサン６５ｇを、３．２５％酢酸水溶液６３５ｇに溶
解し、該溶液を７％ＮａＯＨ，３０％エチルアルコール
、６３％の水からなる混合溶液中に０．１５ｒＨｍφの
孔径ノズルから一定圧で落下させ、凝固再生させた後に
中性になる迄水洗し、平均粒径０．３ｒａｍφの粒状多
孔質キトサン０．９文を得た。該粒状多孔質キトサンを
夫々５０蛇（湿潤状Ｒ）ずつ３つの容器に採取し、５０
ｄエチルアルコールで４回置換し水を完全に除去した。 夫々にエチルアルコール５０ｄを加えて無水酢Ｂ　２．
６ｇ、　　５．２ｇ、　　７．８９をｈ口えｒ：２５℃
で１８時間反応させた。　Ｉ　Ｎ−Ｎａ叶で１時間処理
後ジオキサン５０威で２回置換し、５０緘のジオキサン
にヘキサメチレンジアミンとジシクロへキシルカルボジ
イミドを０．１Ｈになる様に加え、２５℃で１８時間攪
拌して反応させた。ジオキサン、メチルアルコール、ジ
オキサンの順に各５０−を用いて２回繰返し洗浄した。 次いで５０ｄのジオキサンと無水コハク酸を５ｇずつ加
え２５℃で１８時間撹拌反応させた後、充分に中性にな
る迄洗浄して活性化以前のカルボキシル基をもった粒状
多孔質キトサン誘導体３種（試料番号１′〜３′　）を
夫々４７得た。夫々のイオン交換容Φを測定したところ
、５９．０２μＰＯＩ／ｄ粒状体、　２５．０２　、ｃ
ｚｍｏｌ／ｄ粒状体、　１８．７６　μｍｏｌ／戒粒状
体であった。夫々をジオキサン５０　ｍｌ！で２回置換
処理後、５０ｄのジオキサンにジシクロへキシルカルボ
ジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドを０．１Ｈに
なる様に加えて２５゛Ｃて１８時間攪拌した。 そして、ジオキサン、メチルアルコール、ジオキサン、
イソプロピルアルコールの順で各５０ｄを用い２回繰返
し洗浄してアフィニティークロマトグラフィー用担体を
夫々４０彪（試料１〜３）を得た。 これらの比表面積を測定したら夫々６５．３ｍ／　９　
。 ７２．６ｍ／　ｇ、　８０．５ｒＩｔ／　ｇであった。 応用例１ 実施例１で得た３種のアフィニティークロマトグラフィ
ー用担体く試料番号１．２．３＞を夫々１１ｄ採取し水
で洗浄後、直ちに０．５ＨのＮａＣｌを含む０．１Ｈ炭
Ｍ緩衝液（ｐＨ８，３）に溶解させた２５ｍｇ／−のト
リプシンインヒビター溶液２厩を加え、４℃で１８時間
穏やかに攪拌した。未反応のトリプシンインヒビター溶
液を除去した後、０．１Ｍトリス−１１Ｃ１緩′＃ｌ液
（ｐｔｌ　７．４）　　０．１ｄを加え１時間反応させ
た後、０．１Ｍトリス−１１ＣＩ緩衝液で洗浄して固定
化トリプシンインヒビター粒状体を得た。 これを直径１ｃ＃、長さ５　ｃｍのカラムに詰め、０．
１Ｈトリス−ＨＣｌ緩衝液で充分洗浄した後、０．１Ｍ
トリス−ＨＣｌ緩？！ｔＪ′ｆｉに溶解した　１％トリ
プシン溶液２ｄを流速２Ｍ！／１ｌｉｎで流した。終了
後０．ＩＭ　トリス−ＨＣｌ緩衝液で洗浄し、０．５Ｈ
のＮａＣＩを含む０、０１Ｎ−ＨＣｌ　１０７を流して
吸着したトリプシンを溶出させた。再びｏ、ｉ＋’トリ
ス−ＨＣｌ緩衝液で洗浄し、０．１Ｍ　トリス−ＨＣｌ
緩Ｖ！Ｊ液に溶解した牛血清アルブミン（ＢＳ＾）溶液
２成を流速２戒／Ｆｉｎで流して吸着させた。この結果
を第１表に示した。 尚、吸着量は吸着前後の反応液のタンパク買置をＢＣＡ
プロティンアッセイキット　（米国、　Ｐｉｅｒｃｅｃ
ｈｅＩＩｉｃａｌ　ｃｏ１１ｐａｎｙ製）を用いて測定
した。１１Ｃ１吸Ｗｌは、１１Ｃ１によって溶出したト
リプシンの吊を示す。 第　　１　　表 この結果から明らかな如く、リガンドとして用いたトリ
プシンインヒビターに対してアフィニティーを有するト
リプシンが試料番号１．２．３共に１０贋ｇ／−粒状体
以上吸肴して居り、又、０．０１Ｎ−ＨＣｌを流すこと
により８割以上溶出されている。 従って、トリプシンのアフィニティークロマトグラフィ
ーは満足すべき結果である。そしてリガンドとアフィニ
ティーを持たないＢＳＡが殆ど吸着していない。即ち、
非特異的吸着が殆ど生じていないから、本発明の担体は
アフィニティークロマトグラフィー用担体として優れて
いる。 実施例２．応用例２ 実施例１と同様にして得た平均粒径０．３ｍ、φの粒状
多孔質キトサンについて実施例１と同様で無水酢酸の吊
を７．８ｇに固定し、ヘキサメチレンジアミンの代りに
夫々エチレンジアミン及びテトラエチレンジアミン又オ
クタメチレンジアミンに変えて処理し、次いで無水コハ
ク酸で処理して活性化以前のカルボキシル基をもった３
種の粒状多孔質キトサン誘導体（試料番号４′〜６′　
）を夫々４２戒得た。これらのイオン交換容量は５０．
３μｍｏｌ／−粒状体、　７６．２μｎｏｌ／ｍ粒状体
、及び６８．５μｍ０１／ｉ粒状体であった。この試料
を夫々実施例１と同様に夫々ジシクロヘキシルカルボジ
イミドドロキシスクシンイミドで処理してアフィニティ
ークロマトグラフィー用担体（試料番号４〜６）を夫々
４〇−得た。これらの比表面積は夫々６５．３ｍ／　ｇ
，　７Ｇ．２ｒｒｔ／　ｇ，及び６８．５ＴＩｔ／ｇで
あった。 これら３種の試料について実施例１と同様にトリプシン
インヒビター−トリプシンでアフィニティークロマトグ
ラフィーを行ったところ、第２表の結果を得た。 第　　２　　表 この結果、実施例１同様リガンドであるトリプシンイン
ヒビターに対してアフィニティーを持つトリプシンの吸
着，脱着は満足するものであり、ＢＳＡは殆ど吸着して
居らず、アフィニティークロマトグラフィー用担体とし
て優れている。 比較例 実施例１と同様にして造粒して得た粒状多孔質キトサン
各５０−を５０ｒＩｄ！．のエチルアルコールで４回置
換し水を除去した。夫々にエチルアルコール５〇−ずつ
加え無水酢酸を７．８ｇずつ加えて２５℃で１８時間反
応させた。反応液を濾別除去し、ＩＮ−Ｎａ０１１を５
０−ずつ加えて１時間攪拌した。中性になる迄充分水洗
した後、夫々５０ｄのジオキサンで４回置換後、１試料
にアジピン酸ジクロリド、他の試料にセバシン酸ジクロ
リドの０．１Ｈジオキサン溶液を加え、次いでこの反応
系に生じた塩酸を除去さゼるために夫々について更に０
．２Ｈになる様にトリエチルアミンを加え２５℃で１時
間反応させた。 これを中性になる迄水洗して活性化前のアジピンｗ１誘
導体とセバシン酸誘導体の担体を得た。夫々の担体のイ
オン交換容ｉは２０，０μｎｏｌ／ｄ粒状体。 ２１、５μｎｏｌ／ｒＲｉ粒状体であった。 この担体につき実施例１と同様ジオキサン５０ｄで２回
置換した後、５０−のジオキサンにジシクロヘキシルカ
ルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドを０．１
Ｈになる様に加え、２５°Ｃで１８時間攪拌し、ジオキ
サン、メチルアルコール、ジオキサン、インプロピルア
ルコールの順に各５０ｍ１で２回ずつ洗浄してアフィニ
ティークロマトグラフィー用担体を夫々４０彪（試料番
号７，８）を得た。 この担体を応用例１と同様にトリプシンインヒビター−
トリプシンでアフィニティークロマトグラフィーを行っ
たところ、第３表の結果を得た。 第　　３　　表 この結果、トリプシンの吸着はうまく行くが担体の疎水
性が強くなっているので０．０１Ｎ−ＨＣＩで溶出でき
ず、目的物であるトリプシンがリガンドに対し吸着した
のではなく、非特異的に担体に吸着したためと考えられ
る。又、ＢＳＡの吸Ｗｆｆｌも多く疎水性の増加によっ
て非特異的吸着が増加していることが明らかである。 Ｋ発明の効果】 本光明によるリガンド固定化用アフィニティークロマト
グラフィー用担体は、粒状多孔質キトサンを無水酢酸で
部分アセチル化した後、無水コハク酸で処理し、更にジ
アミンと縮合剤で処理して疎水的相互作用の小さい任意
の鎖長のスペーサーの導入をした後、無水コハク酸で処
理し、更にジシクロへギシルカルボジイミドとＮ−ヒド
ロキシスクシンイミドで処理するものである。 本発明の担体は、応用例の記載からも明らかなように立
体障害が予想される場合にもリガンドに対するアフィニ
ティーを有する生理活性物質の吸着率を高くすることが
でき、しかも、リガンドとアフィニティーを持たない生
理活性物質は殆ど吸着せず、非特異的吸着は生じない。 従って、本光明の担体は、アフィニティークロマトグラ
フィー用担体として極めて好ましいものである。 特許出願人　　富士紡績株式会社 代理人　弁理士　　　大　野　克　躬 代理人　弁理士　　　大　野　令　子

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、粒状多孔質キトサンを無水酢酸で部分アセチル化し
   た後、無水コハク酸で処理し、更にジアミンと縮合剤で
   処理し、次いで無水コハク酸、更にジシクロヘキシルカ
   ルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドで処理す
   ることを特徴とするアフィニティークロマトグラフィー
   用担体の製造法。