JP2021508040A - サンプル中の分析物を検出および/または定量するためのマイクロカプセル - Google Patents
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Abstract
Description
・ 検出および/または定量されるべき分析物の存在下でシグナルを生成および/または増幅し得る試薬であって、ここで前記試薬は、乾燥状態にある試薬;
・ 前記試薬を包囲する多孔性マトリクスであって、前記多孔性マトリクスは、検出および/または定量されるべき分析物を受容する手段を有し、ここで前記乾燥状態の試薬は、前記多孔性マトリクスから、バリア、例えば、前記試薬を取り囲む少なくとも1つのバリア層によって分離される、多孔性マトリクス、
を含むマイクロカプセルに関する。
・ 前記シグナルを生成および/または増幅し得る試薬を含むおよび/または埋め込む、従って、前記乾燥状態の試薬を前記多孔性マトリクスから分離する、1またはいくつかの不透過性コア、好ましくは水不透過性コア;
・ 前記多孔性マトリクスを形成しかつ前記1もしくはいくつかの不透過性コアを包囲する多孔性親水性シェルであって、ここで前記1種もしくはこれより多くの捕捉薬剤は、存在する場合、前記多孔性親水性シェルに付着される、多孔性親水性シェル、
を含む。
− 前記ヒドロゲル形成薬剤は、a)合成ポリマー(例えば、ポリ(メチル)メタクリレート、ポリアミド); b)シリコーンベースのポリマー(例えば、ポリジメチルシロキサン); c)ポリサッカリド、例えば、アガロース、キチン、キトサン、デキストラン、アルギネート、カラギーナン、セルロース、フコイダン、ラミナランから選択される天然に存在するポリマー、キサンタンガム、アラビアガム、ガティーガム、グアールガム、ローカストビーンガム、トラガカントガム、カラヤガムから選択されるガム;ならびにイヌリン;ポリペプチド、コラーゲン、ゼラチン、ポリアミノ酸(例えば、ポリリジン);ポリヌクレオチド;ならびにこれらの組み合わせ、を含む群から選択され;そして
− 前記熱応答性ポリマーは、LCST熱応答性ポリマーであり、好ましくは、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAm)、ポリ[2−(ジメチルアミノ)エチルメタクリレート](pDMAEMA)、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリ(ビニルカプロラクタム)(P(VCL)、およびポリビニルメチルエーテルから選択されるか、または前記熱応答性ポリマーは、上限臨界溶液温度(UCST)を有する熱応答性ポリマーであり、好ましくは、ポリ(N−アクリロイルグリシンアミド)(PNAGA)、ポリ(アリルアミン)−co−ポリ(アリルウレア)およびその誘導体、ポリ(メタクリルアミド)、ポリ(N−アクリロイルアスパラギンアミド)、ポリ(N−メタクリロイルグルタミンアミド)、ポリ(アクリルアミド)−co−(アクリロニトリル)、ポリ(スルホベタイン)、ポリ(ホスホリルコリン)から選択される。
− 核酸分析物での核酸増幅を行い得る試薬であって、ここで好ましくは、前記試薬は、前記サンプル中の前記分析物を増幅し得る分子(例えば、増幅酵素)、前記分析物を増幅することを容易にするために必要な1種またはいくつかの分子(例えば、1種またはいくつかの核酸プライマー、ヌクレオチド、塩および緩衝液)、および必要に応じて1種またはいくつかの検出薬剤を含む試薬、あるいは
− 前記サンプル中の分析物としてタンパク質もしくはペプチドまたは細胞を検出するための1種またはいくつかの検出薬剤であって、ここで好ましくは、前記1種またはいくつかの検出薬剤は、抗体もしくは抗体フラグメント、核酸(アプタマー、Spiegelmerを含む)、非抗体タンパク質(例えば、レセプター、レセプターフラグメント、アフィニティータンパク質(例えば、ストレプトアビジン)から選択され、これらの各々は、必要に応じて、適切なレポーター分子(例えば、色素、酵素、化学触媒、または光学的にもしくは別の方法で検出可能なシグナルを生成する化学反応を開始させ得る試薬の混合物)で標識され、検出されるべき分析物として、タンパク質もしくはペプチドまたは細胞の存在を示す、検出薬剤。
i.上記の実施形態のいずれかに既定される本発明に記載のマイクロカプセルを提供する工程;
ii.前記マイクロカプセルを、前記マイクロカプセルを包囲しかつ検出および/または定量されるべき分析物を含むかもしくは含むと疑われる水性サンプルに曝露する工程;
iii.前記マイクロカプセルを前記水性サンプルから除去し、前記マイクロカプセルを非水性相へと移す工程;
iv.非水性環境における水性液滴を生成するために、前記マイクロカプセルを溶解もしくは破壊する工程であって、好ましくは、前記不透過性コア単独もしくは前記多孔性親水性シェルと一緒の前記不透過性コアを溶解または破壊し、ここで前記水性液滴は、検出および/または定量されるべき分析物の存在下で、溶解した形態において、シグナルを生成および/または増幅し得る前記試薬を含む工程;
v.前記水性液滴内でシグナルを生成および/または増幅する反応を行う工程であって、ここでシグナルは、前記分析物が前記サンプル中に存在している場合にのみ生成および/または増幅される工程。
ii.a 前記マイクロカプセルに結合した分析物の富化を達成するために、前記マイクロカプセルを、前記LCST熱応答性ポリマーの下限臨界溶液温度(LCST)を上回る温度へと加熱する工程、その後、前記マイクロカプセルを、前記LCST熱応答性ポリマーの下限臨界溶液温度(LCST)を下回る温度へと冷却または冷却させる工程、このような工程ii.aをn回行う工程、ここでnは、1〜1000、好ましくは1〜500の整数である工程、ならびに/あるいはさらなる工程
ii.b 水性溶液中の前記マイクロカプセルを洗浄する工程であって、結合していない分析物を除去する工程、ここで工程ii.bが工程ii.aに追加して行われる場合、工程ii.bは、工程ii.aの前または後のいずれかに行われる工程、
を包含する。
ii.a 上記マイクロカプセルを、上記UCST熱応答性ポリマーの上限臨界溶液温度(UCST)を下回る温度へと冷却し、その後、上記マイクロカプセルに結合した分析物の富化を達成するために、上記マイクロカプセルを、上記UCST熱応答性ポリマーの上限臨界溶液温度(UCST)を上回る温度へと再び、加熱するかまたは加熱させる工程、およびこのような工程ii.aをn回行う工程であって、ここでnは、1〜1000、好ましくは1〜500の整数である工程、ならびに/またはさらなる工程:
ii.b 上記マイクロカプセルを水性溶液中で洗浄して、結合していない分析物を除去する工程であって、ここで工程ii.bが工程ii.aに加えて行われる場合、その工程ii.bは、工程ii.aの前または後のいずれかに行われる工程、
を包含する。
a) シグナルを生成および/または増幅し得る試薬の水性溶液を、検出および/または定量されるべき分析物の存在下で提供する工程であって、ここで前記試薬の水性溶液は、前記試薬に加えて、さらに必要に応じて、前記水性溶液中で生成および/または増幅し得る前記試薬のうちの1種またはいくつかを保護するための1種またはいくつかの保護剤を含む工程;
b) 工程a)の前記水性溶液を乾燥させる工程であって、好ましくは噴霧乾燥させるまたは凍結乾燥させ、それによって、シグナルを生成および/または増幅し得る乾燥した試薬を、好ましくはナノ粒子形態で生成する工程;
c) 前記乾燥した試薬を、前記試薬を含むおよび/または埋め込むための適した材料に組み込む工程であって、前記材料が前記試薬を取り囲み、前記試薬を隔離し、ここで前記材料は、好ましくは、パラフィン、トリグリセリド、ワックス(特に植物性ワックス(例えば、カルナウバ蝋)、動物性ワックス(例えば、蜜蝋)、石油由来ワックス、ミネラルワックス)から選択される工程;
d) 工程c)の前記生成物を乾燥させる工程であって、好ましくは、噴霧乾燥させるかまたは凍結乾燥させることによって、前記工程c)の生成物から微粒子を生成し、それによって、不透過性コアを生成する工程;
e) 以下によって、前記不透過性コアを、多孔性マトリクスを形成しかつ前記1もしくはいくつかの不透過性コアを包囲する多孔性親水性シェルへと組み込む工程:
・前記不透過性コアをヒドロゲル形成薬剤へと組み込むことであって、前記ヒドロゲル形成薬剤を誘導して、前記不透過性コアの周りにヒドロゲルを形成すること、または
・前記不透過性コアを熱応答性ポリマーの前駆体/モノマーへと組み込むことであって、前記前駆体/モノマーを誘導して、前記不透過性コアの周りに熱応答性ポリマーを重合すること、または
・前記不透過性コアを予め形成した熱応答性ポリマーへと組み込むことであって、前記予め形成した熱応答性ポリマーを、前記不透過性コアの周りに形成させること;
f) 必要に応じて、1種またはいくつかの捕捉薬剤を、前記1もしくはいくつかの不透過性コアを包囲する前記多孔性親水性シェルに連結することであって、それによって、1種またはいくつかの捕捉薬剤が付着したマイクロカプセルを生成し、ここで前記1種またはいくつかの捕捉薬剤は、前記マイクロカプセルを、前記マイクロカプセルを包囲しかつ検出および/または定量されるべき分析物を含むサンプルへと曝露すると、このような分析物を選択的にかつ特異的に結合し得ること;
g) 必要に応じて、前記マイクロカプセルを集めること;
h) さらに必要に応じて、前記マイクロカプセルを洗浄および/または乾燥させる好ましくは凍結乾燥させること、
を包含する方法に関する。
− ヒドロゲル形成薬剤へと上記不透過性コアを組み込み、上記ヒドロゲル形成薬剤を誘導して、上記不透過性コアの周りにヒドロゲルを形成すること、または
− 熱応答性ポリマーの前駆体/モノマーへと上記不透過性コアを組み込み、上記前駆体/モノマーを誘導して、上記不透過性コアの周りの熱応答性ポリマーへと重合すること、または
− 予め形成した熱応答性ポリマーへと上記不透過性コアを組み込み、上記予め形成した熱応答性ポリマーを上記不透過性コアの周りに形成させること。
マイクロカプセル溶液の調製
ゲル化点≦20℃および融解点≦62℃を有する超低温ゲル化温度アガロースA2576(Sigma)を、反応性ビオチンモノクロロトリアジニル色素(INNOVENT)で標識する。あるいは、そのアガロースを、先ず活性化し得、次いで、EZ−LinkTM Amine−PEG11ビオチンに連結し得る。さらに、その活性化を、臭化シアン改変(bromine cyan modification)、軽度酸化(アルデヒド基の生成)、カルボニルジイミダゾール(CDI)によって、または公知の他の方法によって行い得る。最適なビオチン適用範囲を、アガロースのマトリクス特性(融解挙動およびゲル形成挙動、低い非特異的結合)を維持しながら、ストレプトアビジン結合能を最大化するために、予備試験における力価測定によって決定する。
・ 超低温ゲル化温度アガロースA2576溶液(1% w/v)(ビオチン標識)
・ ヌクレアーゼ非含有水
・ 2% (v/v) ポリビニルアルコール
・ 1.25 U/μl Hot Start Taq DNAポリメラーゼ(biotechrabbit GmbH)
・ 4.0mM dNTP(biotechrabbit GmbH)
・ 8.0μM センスプライマー(5’−GCAGTGGCGCCCGAACAGG−3’) (Metabion International AG)
・ 8.0μM アンチセンスプライマー(5’−ACTGACGCTCTCGCACCCATCT−3’) (Metabion International AG)
・ 8.0μM Taq−Manプローブ(5’−Cy5−CTCCGACGCAACGGGCTCG−BHQ3−3’) (Metabion International AG)または10× EvaGreen(登録商標) Fluorescent DNA染色(Jena Bioscience GmbH)
・ ポリリン酸ナトリウム(Merck)
・ 9% (w/v) (2−ヒドロキシプロピル)−у−シクロデキストリン(Sigma)
構成要素3:
a.
・ ミネラルオイル/パラフィンオイル(Sigma)
・ 2% (w/v) Span80
または
b.
・ HFE 7500(Dolomite Microfluidics)
・ 2〜5% Picosurf 1(Dolomite MIcrofluidics)
マイクロカプセルを、洗浄緩衝液(20mM Trix−HCl、22mM KCl、22mM NH4Cl、3mM MgCl2、5% (v/v) グリセロール)で1回洗浄する。ストレプトアビジンでのマイクロカプセルのコーティングを、同じ緩衝液中で達成する。ストレプトアビジンの濃度を、そのマイクロカプセルの表面上にアクセス可能なビオチンが残らないように選択する。いずれにしても、そのマイクロカプセルの架橋を回避するために、ストレプトアビジンを過剰量で適用する。最適なストレプトアビジン濃度を、プラトーの表面適用範囲を決定することによって、標識したストレプトアビジンでの予備試験において決定した。ストレプトアビジンとの連結の後に、そのマイクロカプセルを、44μm SEFAR PETEX遠心分離ユニットで、ストレプトアビジンなしの洗浄緩衝液で数回洗浄する。その後、そのマイクロカプセル濃度を、DHC−N01(Neubauer Improved)計数チャンバ(INCYTO)において顕微鏡下で、またはCytoFlexフローサイトメーター(Beckman Coulter)で細胞計測して、計数することによって決定する。標識/コーティングの程度をまた、モノクロロトリアジニル色素標識を分光光度法的に利用して評価する。およそ100,000個のビーズを含むアリコートを、9% (w/v) (2−ヒドロキシプロピル)−у−シクロデキストリン溶液中に再懸濁し、凍結乾燥するかまたは代わりに真空乾燥する。
分析物捕捉
逆転写によってビオチンで標識した精製HIV−1 RNA(サブタイプO)を、ストレプトアビジン改変試薬被包ヒドロゲルマイクロ粒子上に富化する。その逆転写(RT)反応の容積全体を、規定量の凍結乾燥または乾燥させたマイクロカプセルに添加する。そのビーズを注意深く再懸濁し、RT−反応ミックスとともにインキュベートする。マイクロカプセルに、その適用した液体の一部を吸収させ、そのマイクロカプセルを膨潤させ、ビオチン標識したcDNAを結合させる。塊になるのを回避するために、超音波を使用してもよい。その後、その懸濁物を、SEFAR PETEX(登録商標)組織(w=44μm)を備えた遠心分離チューブに適用する。その上清を、300×gでのカラムの遠心分離によって除去する。洗浄のために、以前使用した洗浄緩衝液をそのカラムに添加し、同様に300×gで遠心分離する。洗浄を数回反復し、そのマイクロカプセルに、構成要素4を最終的に吸収させる。この工程において、そのマイクロカプセルは、その溶液からの分析物に結合し、拡散によってPCRに必要な構成要素を残して吸収する。
・ 20mM Trix−HCl、22mM KCl、22mM NH4Cl、3mM MgCl2、5% (v/v) グリセロール
・ MgCl2[Invitrogen]またはMgSO4[Sigma]
・ 以下の配列を有するビオチン標識したcDNAテンプレート:
5‘-Bio-CAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTTAAAGAGAAAGTGAAACCAGGGAAGAAAACCTCCGACGCAACGGGCTCGGCTTAGCGGAGTGCACCTGCTAAGAGGCGAGAGGAACTCACAGAGGGTGAGTAATTTTGCTGGCAGTGGCCAGACCTAGGGGAAGGGCGAAGTCTCTAGGGGAGGAAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGT-3‘
マイクロカプセルを、界面活性剤Triton−X 100(0.1% w/w)(Sigma)および乳化剤ABIL EM−90(3% w/w)(Evonik Industries)またはそのマイクロカプセルの凝集を回避する他のものを含むパラフィンオイル(Sigma)で3回洗浄することによって、非水性相へと移す。SEFAR PETEX(登録商標)組織(w=44μm)を備えた遠心分離チューブを使用して200×gにおいて1分間遠心分離することによって洗浄を行う。
そのオイルとそのマイクロカプセルとを、およそ2cm2の面積およびおよそ50〜1000μmの層の厚みを有する検出チャンバに移す。そのチャンバの反対側の表面を、透明な疎水性材料から作製する。パラフィンオイル中に懸濁したマイクロカプセルに、その反応チャンバの寸法によろうが可撓性の管材のような他の手段によろうが、単層を形成させる。従って、そのマイクロカプセルは、その後のデジタルPCRのための等間隔の微小反応容器を提供する。
2分間、95℃の初期変性(その試薬を放出しかつそのアガロース粒子を融解するために十分であり得る)、続いて、95℃で15秒間の変性、65℃で15秒間のアニーリングおよび72℃で30秒間の伸長を45サイクル。そのサーマルプロトコールの完了後、そのチャンバの内容物を室温において透過した白色光および励起λexc=470nmおよび>496nmのロングパス発光または励起λexc=660nmおよび発光670nmを有する蛍光モードで画像化する。マイクロカプセルの総数および規定の強度閾値を上回る蛍光シグナルを有するマイクロカプセルの数を決定する。その閾値を、以前に行ったテンプレートなしでの増幅反応から導出する。その反応におけるテンプレートの数を、ポワソン統計に陽性の液滴および陰性の液滴の決定した数を適用することによって決定する。
代替のアプローチにおいて、およそ1.5mmの直径を有するカプセルを、以下のプロトコールを使用して生成した。
この例は、組み合わされた核酸標的捕捉/デジタルPCRアッセイを行うためのpNIPAMベースの単分散性増幅マイクロカプセルの使用を記載する。この適用において、そのマイクロカプセルは、いくつかの機能性を提供する:
1. それらは、結合基ならびに外側表面または内側表面および外側表面を提供して、その場所でアッセイ標的を捕捉する。その場所では、さらなる工程において増幅が起こる。
2. それらは、pNIPAMポリマーのLCST挙動を容易に利用して、水性溶液で満たされ得かつ空にされ得るマトリクスを提供する。
3. そのポリマーはまた、その粒子中に含まれるその水性相をオイルエマルジョンにすることを可能にするマトリクスを提供する。そのマイクロカプセルをマトリクスとして使用するという利点は、油中の水の容積の均質なサイズ分布が、微小流体デバイスまたは他の複雑な技術のデバイスを使用する必要性なしに達成され得ることである。
4. そのpNIPAMマイクロカプセルは、水不透過性コアの中に埋め込まれて、PCR増幅を行うために必要な全ての試薬を含む。
構成要素1(水性重合相):
ビオチン改変モノマーミックスの作製:
ビオチン改変アクリルモノマーを、別個の反応において作製した。その反応ミックスは、アクリル酸 N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(活性化アミノ反応性アクリル酸モノマー)およびビオチン−dPEG7−NH2(アミノ基で末端化されたPEG7スペーサーアームで改変されたビオチン誘導体)からなった。
・ 1.25 U/μl Hot Start Taq DNAポリメラーゼ(biotechrabbit GmbH)
・ 4.0mM dNTP(biotechrabbit GmbH)
・ 8.0μM センスプライマー(5’−GCAGTGGCGCCCGAACAGG−3’)(Metabion International AG)
・ 8.0μM アンチセンスプライマー(5’−ACTGACGCTCTCGCACCCATCT−3’)(Metabion International AG)
・ 8.0μM Taq−Manプローブ(5’−CF647−CTCCGACGCAACGGGCTCG−BHQ3−3’)(Metabion International AG)または10× EvaGreen(登録商標)蛍光DNA染色(Jena Bioscience GmbH)
・ ポリリン酸ナトリウム(Merck)
・ 9% (w/v) (2−ヒドロキシプロピル)−у−シクロデキストリン(Sigma)
トリステアリンに埋め込まれた試薬を含む単分散性pNIPAMベースの(=ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)ベースの)微粒子を、単純な二重フローフォーカスデバイス(Dolomite Microfluidics)を使用する二重エマルジョン形成の1工程プロセスにおいて製作し得る。特に、2つのDolomite Droplet Junctionチップ(一方は改変のないガラスチップ(親水性、100μm)であり、もう一方は疎水性性質(190μm)である)を、流体の入り口および出口用に直線状のコネクターを使用して、チップホルダーに取り付ける。このチップ順序を選択することによって、安定な油/水/油2相液滴形成に適切なチャネル表面の濡れが達成される。ワックス 対 試薬比 最大10:1を有する構成要素2、ならびに構成要素1および構成要素3を、これらをその液滴システムのP−Pump(Mitos)へと配置する前に、2μmフィルタでともに予め濾過した。チップ1の温度制御ユニットを、Softenolの凝固点(75℃)より上に、チップ2に関しては25℃に設定する。その流体ラインを、2000mbarで1分間、Flow Control Softwareを使用して準備する。その直線状のコネクターの両側を、そのインターフェースを使用してチップに接続する。内側:中央:外側がそれぞれ1:10:100の流速比を調節する。流速は、安定な2相液滴形成のために最適化される必要がある。パラメーターを、Dolomite Flow Control Advanced Softwareでモニターする。その試薬を含むトリグリセリドは、第2の接合部において被包される液滴を生成する第1の接合部において剪断される。O/W/O液滴を20℃のチューブの中に集めて、そのトリグリセリドの凝固およびそのpNIPAMの重合を開始する。
その重合プロセスが終了した後に、可能か限り多くの油相を、そのpNIPAM粒子を除去しないように注意を払いながら、ピペットを使用してその液滴レザバから穏やかに引き抜く。次いで、水中の1% (v/v) Triton X−100、50μlをその粒子にピペットで移す。その容積を、ピペットを上下させることによって混合し、その結果、その粒子は、その液滴チップの壁に貼り付かない。その容積をエッピンドルフチューブに移し、そのプロセスをもう一度反復する。その移動プロセスを、双眼顕微鏡下でモニターして、このチップにおける粒子の大きな喪失を防止し得る。
ストレプトアビジンでのそのマイクロカプセルのコーティングを、前に使用した洗浄緩衝液で達成する。ストレプトアビジンの濃度を、そのマイクロカプセルの表面上にアクセス可能なビオチンが残らないように選択する。いずれにしても、マイクロカプセルの架橋を回避するために、ストレプトアビジンを過剰量で適用する。最適なストレプトアビジン濃度を、プラトーの表面適用範囲を決定することによって、標識したストレプトアビジンでの予備試験において決定した。
ビオチン化HIV−1 cDNAを、PCR逆方向プライマーの存在下で、逆転写を行うことによって生成した。その反応ミックスを、15分間、50℃においてインキュベートし、その反応を、その反応ミックスを70℃へと10分間加熱することによって停止させた。
○ 精製HIV−1 RNA(約106コピー)
○ 1μM ビオチン化逆方向プライマー 5’ ビオチン−ACT GAC GCT CTC GCA CCC ATC T−3’
○ 1× 反応緩衝液(cDNA Synthesis Kit Thermo Fisher)
○ dNTP(各々1mM)
○ RevertAid逆転写酵素(200 U, Thermo Fisher)
逆転写によってビオチンで標識したHIV−1 RNAを、ストレプトアビジン改変マイクロカプセルで捕捉する
約100000 pNIPAM マイクロカプセルを、反応チューブへと移し、50℃へと加熱して、その液体相をその粒子から吐き出させる。その粒子を、2000gで短時間遠心分離し、40℃で保持する。その縮小しかつペレット化した粒子は、一緒になって密に貼り付き、その結果、その吐き出された液体は、そのペレットから完全に除去され得る。次いで、以下のインキュベーションミックスを、そのペレットに添加する:
○ 1μl cDNAミックス(約104 コピー)
○ 0.1% Triton X−100を含む49μl PBS
規定の容積を有する微小区画を、マイクロカプセルをフルオロカーボンオイル(例えば、Novec 7500オイル(Dolomite Microfluidics, # 3200214)中に分散させたPicoSurfTM 5%)中に分散させることによって作製する。重いフルオロカーボンオイルの代わりに、乳化剤を有するライトミネラルオイル(例えば、5% (w/w) Span 80(Sigma Aldrich, # 85548)を有するミネラルオイル(Sigma−Aldrich, # M5904 Sigma))を適用してもよい。
オイル中に懸濁させたマイクロカプセルを、ペルチェ素子 30×30×4.7mm、19.3W(Quick−Ohm, Kuepper & Co. GmbH, #QC−71−1.4−3.7M)のサンプルチャンバにおいて、温度サイクリングに供する。そのマイクロカプセルを、そのpNIPAMカプセルの収縮およびそのSoftenolの融解をもたらす80℃という温度へと加熱する。その埋め込まれた試薬を、水相に曝露する。このプロセスは、25℃〜80℃の間のサーマルサイクリングの数回のサイクルによって支持される。その試薬は、高温でそのpNIPAMから吐き出されたその水容積中に溶解する。その凝縮したマイクロカプセルの周りに単一の水性液滴が形成され、その液滴は、微小反応区画として働く。その反応ミックスは、その捕捉された個々のcDNA標的と接触した状態になり、そのcDNAは、PCRの間にその微小区画の中で増幅される。
2分間、95℃での初期変性、続いて、95℃で15秒間の変性、65℃で15秒間のアニーリングおよび72℃で30秒間の伸長を45サイクル。そのサーマルプロトコールが完了すると、そのチャンバの内容物を21℃において透過した白色光および励起λexc=650nmおよび>670nmのロングパス発光を有する蛍光モードで画像化する。微小区画の総数および規定の強度閾値を上回る蛍光シグナルを有する微小区画の数を決定する。その閾値を、以前に行ったテンプレートなしでの増幅反応から導出する。その反応におけるテンプレートの数を、ポワソン統計に陽性の液滴および陰性の液滴の決定した数を適用することによって決定する。
Claims (16)
- サンプル中の分析物を検出および/または定量するためのマイクロカプセルであって、前記マイクロカプセルは、
・ 検出および/または定量されるべき分析物の存在下でシグナルを生成および/または増幅し得る試薬であって、ここで前記試薬は、乾燥状態にある試薬;
・ 前記試薬を包囲する多孔性マトリクスであって、前記多孔性マトリクスは、検出および/または定量されるべき分析物を受容する手段を有し、ここで前記乾燥状態の試薬は、前記多孔性マトリクスから、バリア、例えば、前記試薬を取り囲む少なくとも1つのバリア層によって分離される、多孔性マトリクス、
を含むマイクロカプセル。 - 前記検出および/または定量されるべき分析物を受容する手段は、前記分析物を含む液体サンプルを収容するような寸法である間隙細孔空間である、請求項1に記載のマイクロカプセル。
- 前記間隙細孔空間は、前記乾燥試薬を溶解するために十分な液体サンプルを収容するような寸法である、請求項2に記載のマイクロカプセル。
- 前記検出および/または定量されるべき分析物を受容する手段は、前記液体サンプルを収容する前記間隙細孔空間または間隙細孔空間と1種もしくはこれより多くの捕捉薬剤との組み合わせのいずれかであって、前記手段は、前記マイクロカプセルを、前記マイクロカプセルを包囲しかつ検出および/または定量されるべき分析物を含むサンプルに曝露すると、このような分析物を選択的にかつ特異的に結合し得、ここで前記1種もしくはこれより多くの捕捉薬剤は、前記マイクロカプセルの包囲に曝露された前記マイクロカプセルの一部に付着される、請求項2〜3のいずれか1項に記載のマイクロカプセル。
- ・ 前記シグナルを生成および/または増幅し得る試薬を含むおよび/または埋め込む、従って、前記乾燥状態の試薬を前記多孔性マトリクスから分離する、1またはいくつかの不透過性コア、好ましくは水不透過性コア;
・ 前記多孔性マトリクスを形成しかつ前記1もしくはいくつかの不透過性コアを包囲する多孔性親水性シェルであって、ここで前記1種もしくはこれより多くの捕捉薬剤は、前記多孔性親水性シェルに付着される、多孔性親水性シェル、
を含む、前述の請求項のいずれかに記載のマイクロカプセル。 - 前記多孔性親水性シェルは、ヒドロゲル形成薬剤から構成されるかまたは熱応答性ポリマーから構成され、ここで好ましくは、
− 前記ヒドロゲル形成薬剤は、a)合成ポリマー(例えば、ポリ(メチル)メタクリレート、ポリアミド); b)シリコーンベースのポリマー(例えば、ポリジメチルシロキサン); c)ポリサッカリド、例えば、アガロース、キチン、キトサン、デキストラン、アルギネート、カラギーナン、セルロース、フコイダン、ラミナランから選択される天然に存在するポリマー、キサンタンガム、アラビアガム、ガティーガム、グアールガム、ローカストビーンガム、トラガカントガム、カラヤガムから選択されるガム;ならびにイヌリン;ポリペプチド、コラーゲン、ゼラチン、ポリアミノ酸(例えば、ポリリジン);ポリヌクレオチド;ならびにこれらの組み合わせ、を含む群から選択され;そして
− 前記熱応答性ポリマーは、LCST熱応答性ポリマーであり、好ましくは、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAm)、ポリ[2−(ジメチルアミノ)エチルメタクリレート](pDMAEMA)、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリ(ビニルカプロラクタム)(P(VCL)、およびポリビニルメチルエーテルから選択されるか、または前記熱応答性ポリマーは、上限臨界溶液温度(UCST)を有する熱応答性ポリマーであり、好ましくは、ポリ(N−アクリロイルグリシンアミド)(PNAGA)、ポリ(アリルアミン)−co−ポリ(アリルウレア)およびその誘導体、ポリ(メタクリルアミド)、ポリ(N−アクリロイルアスパラギンアミド)、ポリ(N−メタクリロイルグルタミンアミド)、ポリ(アクリルアミド)−co−(アクリロニトリル)、ポリ(スルホベタイン)、ポリ(ホスホリルコリン)から選択される、
請求項5に記載のマイクロカプセル。 - 前記不透過性コアは、前記試薬を含むおよび/または埋め込むために適した材料から構成され、ここで前記材料は、前記試薬を取り囲みかつ前記試薬を前記マイクロカプセルの他の部分、例えば、前記多孔性マトリクスから、特に、前記親水性シェルから隔離し、前記材料は、好ましくは、パラフィン、トリグリセリド、ワックス、特に、植物性ワックス(例えば、カルナウバ蝋)、動物性ワックス(例えば、蜜蝋)、石油由来ワックス、ミネラルワックスから選択される、請求項5〜6のいずれか1項に記載のマイクロカプセル。
- 前記不透過性コアは、前記シグナルを生成および/または増幅し得る試薬を、乾燥状態で含みおよび/または埋め込み、前記試薬を前記多孔性マトリクスから分離する、請求項5〜7のいずれかに記載のマイクロカプセル。
- 前記シグナルを生成および/または増幅し得る試薬は、以下である、前述の請求項のいずれかに記載のマイクロカプセル:
− 核酸分析物での核酸増幅を行い得る試薬であって、ここで好ましくは、前記試薬は、前記サンプル中の前記分析物を増幅し得る分子(例えば、増幅酵素)、前記分析物を増幅することを容易にするために必要な1種またはいくつかの分子(例えば、1種またはいくつかの核酸プライマー、ヌクレオチド、塩および緩衝液)、および必要に応じて1種またはいくつかの検出薬剤を含む試薬、あるいは
− 前記サンプル中の分析物としてタンパク質もしくはペプチドまたは細胞を検出するための1種またはいくつかの検出薬剤であって、ここで好ましくは、前記1種またはいくつかの検出薬剤は、抗体もしくは抗体フラグメント、核酸(アプタマー、Spiegelmerを含む)、非抗体タンパク質(例えば、レセプター、レセプターフラグメント、アフィニティータンパク質(例えば、ストレプトアビジン)から選択され、これらの各々は、必要に応じて、適切なレポーター分子(例えば、色素、酵素、化学触媒、または光学的にもしくは別の方法で検出可能なシグナルを生成する化学反応を開始させ得る試薬の混合物)で標識され、検出されるべき分析物として、タンパク質もしくはペプチドまたは細胞の存在を示す、検出薬剤。 - 前記捕捉薬剤は、抗体、抗体フラグメント、核酸(アプタマー、Spiegelmerを含む)、分析物もしくは分析物複合体を特異的に結合し得る非抗体タンパク質(例えば、レセプター、レセプターフラグメント、アフィニティータンパク質(例えば、ストレプトアビジン)、化学部分(例えば、ビオチン、Strep−tag(登録商標)、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール、核酸もしくは核酸アナログタグ、またはKD=10−8〜10−15Mの範囲の親和性で、抗体、抗体フラグメント、核酸(アプタマー、Spiegelmerを含む)、非抗体タンパク質(例えば、レセプター、レセプターフラグメント、アフィニティータンパク質(例えば、ストレプトアビジン)によって特異的に結合し得る類似の化学部分から選択されるか、あるいは疎水性分子もしくは疎水性基を有する分子に特異的に結合し得る疎水性構造から選択され、ここで好ましくは、前記疎水性構造は、前記分析物の前記検出が行われる条件下で2より大きいlogDを有する、前述の請求項のいずれかに記載のマイクロカプセル。
- 核酸増幅を行い得る前記試薬は、1種またはいくつかの検出薬剤をさらに含み、ここで前記1種またはいくつかの検出薬剤は、抗体もしくは抗体フラグメント、核酸(アプタマー、Spiegelmerを含む)、非抗体タンパク質(例えば、レセプター、レセプターフラグメント、アフィニティータンパク質(例えば、ストレプトアビジン)から選択され、これらの各々は、必要に応じて、適切なレポーター分子(例えば、色素、酵素、化学触媒、または光学的にもしくは別の方法で検出可能なシグナルを生成する化学反応を開始し得る試薬の混合物)で標識され、検出されるべき分析物の存在を示す、請求項9〜10のいずれかに記載のマイクロカプセル。
- サンプル中の分析物を検出および/または定量する方法であって、該方法は、
i.請求項1〜11のいずれかに記載のマイクロカプセルを提供する工程;
ii.前記マイクロカプセルを、前記マイクロカプセルを包囲しかつ検出および/または定量されるべき分析物を含むかもしくは含むと疑われる水性サンプルに曝露する工程;
iii.前記マイクロカプセルを前記水性サンプルから除去し、前記マイクロカプセルを非水性相へと移す工程;
iv.非水性環境における水性液滴を生成するために、前記マイクロカプセルを溶解もしくは破壊する工程であって、好ましくは、前記不透過性コア単独もしくは前記多孔性親水性シェルと一緒の前記不透過性コアを溶解または破壊し、ここで前記水性液滴は、検出および/または定量されるべき分析物の存在下で、溶解した形態において、シグナルを生成および/または増幅し得る前記試薬を含む工程;
v.前記水性液滴内でシグナルを生成および/または増幅する反応を行う工程であって、ここでシグナルは、前記分析物が前記サンプル中に存在している場合にのみ生成および/または増幅され、ここで好ましくは、工程v.において行われる前記反応は、核酸増幅反応またはシグナル増幅反応であり、より好ましくは、工程v.において行われる前記反応は、PCRから、または等温増幅反応(例えば、TMA、NASBA、LAMP、3SR、SDA、RCA、LCR、RPA、NEAR)から選択される核酸増幅反応である工程、
を包含する方法。 - 工程iv.において、前記マイクロカプセル、好ましくは前記不透過性コア単独もしくは前記多孔性親水性シェルと一緒の前記不透過性コアは、機械的手段、化学的切断、温度変化、pH変化、溶媒変化、電場の印加、磁場の印加、電磁放射線、特に規定の波長範囲の光(例えば、UV光)への前記マイクロカプセルの曝露、好ましくは温度変化、より好ましくは温度上昇から選択される手段によって溶解または破壊される、請求項12に記載の方法。
- 前記マイクロカプセルは、請求項6〜13のいずれかに規定されるとおりのマイクロカプセルであり、前記多孔性親水性シェルは、LCST熱応答性ポリマーから構成される、請求項12〜13のいずれかに記載の方法。
- 前記方法は、工程ii.と工程iii.との間に、さらなる工程:
ii.a 前記マイクロカプセルに結合した分析物の富化を達成するために、前記マイクロカプセルを、前記LCST熱応答性ポリマーの下限臨界溶液温度(LCST)を上回る温度へと加熱する工程、その後、前記マイクロカプセルを、前記LCST熱応答性ポリマーの下限臨界溶液温度(LCST)を下回る温度へと冷却または冷却させる工程、このような工程ii.aをn回行う工程、ここでnは、1〜1000、好ましくは1〜500の整数である工程、ならびに/あるいはさらなる工程
ii.b 水性溶液中の前記マイクロカプセルを洗浄する工程であって、結合していない分析物を除去する工程、ここで工程ii.bが工程ii.aに追加して行われる場合、工程ii.bは、工程ii.aの前または後のいずれかに行われる工程、
を包含する、請求項14に記載の方法。 - サンプル中の分析物を検出および/または定量するためのマイクロカプセルを調製する方法であって、前記マイクロカプセルは、請求項1〜15のいずれかに規定されるとおりであり、前記方法は、
a) シグナルを生成および/または増幅し得る試薬の水性溶液を、検出および/または定量されるべき分析物の存在下で提供する工程であって、ここで前記試薬の水性溶液は、前記試薬に加えて、さらに必要に応じて、前記水性溶液中で生成および/または増幅し得る前記試薬のうちの1種またはいくつかを保護するための1種またはいくつかの保護剤を含む工程;
b) 工程a)の前記水性溶液を乾燥させる工程であって、好ましくは噴霧乾燥させるまたは凍結乾燥させ、それによって、シグナルを生成および/または増幅し得る乾燥した試薬を、好ましくはナノ粒子形態で生成する工程;
c) 前記乾燥した試薬を、前記試薬を含むおよび/または埋め込むための適した材料に組み込む工程であって、前記材料が前記試薬を取り囲み、前記試薬を隔離し、ここで前記材料は、好ましくは、パラフィン、トリグリセリド、ワックス(特に植物性ワックス(例えば、カルナウバ蝋)、動物性ワックス(例えば、蜜蝋)、石油由来ワックス、ミネラルワックス)から選択される工程;
d) 工程c)の前記生成物を乾燥させる工程であって、好ましくは、噴霧乾燥させるかまたは凍結乾燥させることによって、前記工程c)の生成物から微粒子を生成し、それによって、不透過性コアを生成する工程;
e) 以下によって、前記不透過性コアを、多孔性マトリクスを形成しかつ前記1もしくはいくつかの不透過性コアを包囲する多孔性親水性シェルへと組み込む工程:
・前記不透過性コアをヒドロゲル形成薬剤へと組み込むことであって、前記ヒドロゲル形成薬剤を誘導して、前記不透過性コアの周りにヒドロゲルを形成すること、または
・前記不透過性コアを熱応答性ポリマーの前駆体/モノマーへと組み込むことであって、前記前駆体/モノマーを誘導して、前記不透過性コアの周りに熱応答性ポリマーを重合すること、または
・前記不透過性コアを予め形成した熱応答性ポリマーへと組み込むことであって、前記予め形成した熱応答性ポリマーを、前記不透過性コアの周りに形成させること;
f) 必要に応じて、1種またはいくつかの捕捉薬剤を、前記1もしくはいくつかの不透過性コアを包囲する前記多孔性親水性シェルに連結することであって、それによって、1種またはいくつかの捕捉薬剤が付着したマイクロカプセルを生成し、ここで前記1種またはいくつかの捕捉薬剤は、前記マイクロカプセルを、前記マイクロカプセルを包囲しかつ検出および/または定量されるべき分析物を含むサンプルへと曝露すると、このような分析物を選択的にかつ特異的に結合し得ること;
g) 必要に応じて、前記マイクロカプセルを集めること;
h) さらに必要に応じて、前記マイクロカプセルを洗浄および/または乾燥させる好ましくは凍結乾燥させること、
を包含する方法。
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