ES2923458T3 - Una microcápsula para detectar y/o cuantificar un analito en una muestra - Google Patents
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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Abstract
La presente invención se refiere a una microcápsula para detectar y/o cuantificar un analito en una muestra. Además, la invención se refiere a un método de detección y/cuantificación de un analito en una muestra utilizando dicha microcápsula. Además, la presente invención se refiere a un método para preparar microcápsulas para detectar y/o cuantificar un analito en una muestra. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Una microcápsula para detectar y/o cuantificar un analito en una muestra
La presente invención se refiere a una microcápsula para detectar y/o cuantificar un analito en una muestra. Además, la invención se refiere a un método de detección y/cuantificación de un analito en una muestra utilizando dicha microcápsula. Además, la presente invención se refiere a un método de preparación de microcápsulas para detectar y/o cuantificar un analito en una muestra.
Existen numerosas metodologías para detectar analitos en una muestra o para cuantificar pequeñas diferencias de concentraciones de analitos. Estas tecnologías también se han empleado, en particular, en formatos de ensayos multiplex. Por ejemplo, una plataforma de adquisición y análisis de datos multiplex para el análisis de citometría de flujo de ensayos con base en microesferas que realiza la medición simultánea de hasta 64 analitos diferentes, se divulga en Fulton et al., Clinical Chemistry, 1997, 43(9); pp. 1749-1756. Para detectar analitos individuales en una muestra o para cuantificar pequeñas diferencias de concentraciones de analitos, se han establecido técnicas de análisis digital (Witters et al., Lab. Chip, 2014, 14(17); pp. 3225-3232). Con el fin de proporcionar un confinamiento definido para una reacción bioquímica concreta, se han establecido técnicas de emulsión que se han utilizado para establecer esquemas de detección digital (Kanagal-Shamanna, Methods Mol. Biol., 2016, 1392; pp. 33-42). La calidad de estos ensayos depende considerablemente de la estabilidad de la emulsión. Para ello, se ha utilizado una combinación de ciertos emulsionantes, proporcionados en una fase no acuosa y albúmina de suero bovino (BSA) en la fase acuosa de una emulsión de agua en aceite para formar gotas con una piel proteica (véase el documento US 2011/0217711 A1). Este enfoque también se ha utilizado en Hindson et al. (Anal. Chem., 2011, 83(22); pp. 8604 8610). En este enfoque, los reactivos de la PCR, incluyendo la BSA, se mezclan con una muestra acuosa diluida, y se utiliza un dispositivo de microfluidos para producir una emulsión de gotas acuosas en un aceite de fluorocarbono que contiene emulsionantes adecuados. Tras el calentamiento a 95 °C, se forma una piel alrededor de la gota que protege contra la coalescencia durante los pasos posteriores de termociclaje para la amplificación del ácido nucleico. El efecto real de formación de piel se conoce desde hace mucho tiempo y también se ha utilizado para producir microcápsulas para la administración de fármacos y como aditivos alimentarios (Acton et al., Journal of Food Science, 1972, 37(5); pp. 795-796 y Gires et al., J. Mech. Behav. Biomed. Mater., 2016, 58, pp. 2-10).
También se han utilizado microcápsulas para realizar reacciones en cadena de la polimerasa individuales altamente paralelas (Mak et al., Advanced Functional Materials 2008, 18(19); pp. 2930-2937). Se construyeron microcápsulas estables a la temperatura con una pared de cápsula permeable selectiva mediante la técnica de Capa por Capa (LbL) asistida por la matriz en cápsula sobre partículas de gel de agarosa con reactivos incrustados y disueltos, incluyendo un objetivo a amplificar (Bai et al., Angewandte Chemie, 2010, 122(30); pp. 5316-5320). En este enfoque, durante la reacción en cadena de la polimerasa, los bloques de construcción de pequeño peso molecular, por ejemplo, los nucleótidos (dNTPs) se suministran externamente y se difunden a través de la pared permeable de la cápsula hacia el interior, de manera que los productos de PCR de alto peso molecular resultantes durante la PCR se acumulan dentro de la microcápsula.
El documento US 4,483,928 divulga microcápsulas que comprenden un material de núcleo líquido aceitoso y un material de pared y que han sido sensibilizadas con un anticuerpo contra antígeno de linfocito, en el que el anticuerpo se une a las microcápsulas mediante un enlace covalente entre el material de pared y el anticuerpo.
El documento WO2014/028537 divulga unas microcápsulas que comprenden un compartimento interno envuelto por una segunda capa que está encapsulada por una cubierta o membrana sólida o semipermeable. Las microcápsulas comprenden varias fases fluidas, por ejemplo, en forma de emulsión.
Kaijalainen et al. Nucleic Acids Research, 1993, vol. 21, No. 12, páginas 2959-2960el artículo de la revista "Nucleus Acid Research" divulga perlas de componentes de reacción PCR incrustadas en cera y secadas en trehalosa.
Todas las tecnologías mencionadas anteriormente requieren una generación de gotas in situ o son difíciles de realizar y requieren el funcionamiento de un protocolo elaborado. Además, las cápsulas resultantes no permiten el almacenamiento o son difíciles de manipular y requieren el seguimiento de elaborados protocolos. En consecuencia, existe la necesidad en la técnica de una metodología mejorada que permita la fácil fabricación, almacenamiento y uso de las microcápsulas para detectar y/o cuantificar un analito en una muestra. También existe una necesidad en la técnica de proporcionar una cápsula que sea prefabricada y que permita ser utilizada para preconfeccionar reactivos para la detección de un analito. Existe además una necesidad en la técnica de proporcionar una cápsula que sea prefabricada que permita capturar un analito.
La invención se expone en el juego de reivindicaciones adjunto.
En consecuencia, en el primer aspecto, la presente invención se refiere a una microcápsula para detectar y/o cuantificar un analito en una muestra, comprendiendo dicha microcápsula
• reactivos capaces de generar y/o amplificar una señal en presencia de un analito que debe detectarse y/o cuantificarse; en los que dichos reactivos están en estado seco;
• una matriz porosa que rodea dichos reactivos, teniendo dicha matriz porosa medios para recibir un analito que debe detectarse y/o cuantificarse; en la que dichos reactivos en estado seco están separados de dicha matriz porosa por una barrera, por ejemplo, al menos una capa de barrera que abarca dichos reactivos.
En una realización, dichos medios para recibir un analito que va a ser detectado y/o cuantificado es un espacio de poros intersticial que está dimensionado para acomodar una muestra líquida que contiene dicho analito.
En una realización, dicho espacio de poros intersticiales está dimensionado para acomodar suficiente muestra líquida para disolver dichos reactivos secos.
En una realización, dichos medios para recibir un analito que debe detectarse y/o cuantificarse son dicho espacio de poros intersticial para acomodar dicha muestra líquida o una combinación de dicho espacio de poros intersticial y uno o más agentes de captura que, tras la exposición de dichas microcápsulas a una muestra que rodea a dicha microcápsula y que contiene un analito que se va a detectar y/o cuantificar, son capaces de unir selectiva y específicamente dicho analito, en la que dicho uno o más agentes de captura están unidos a una porción de dicha microcápsula expuesta a los alrededores de dicha microcápsula.
En una realización, la microcápsula de acuerdo con la presente invención comprende:
• uno o varios núcleos impermeables, preferentemente impermeables al agua, que contengan y/o incrusten dichos reactivos capaces de generar y/o amplificar una señal, y así, separar dichos reactivos en estado seco de dicha matriz porosa;
• una cubierta hidrófoba porosa que forma dicha matriz porosa y que rodea dicho uno o varios núcleos impermeables; en la que dicho uno o más agentes de captura, si están presentes, están unidos a dicha cubierta hidrófoba porosa.
El término "impermeable", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere preferentemente a una impermeabilidad frente al agua. En una realización preferida, un "núcleo impermeable al agua" impide la difusión de agua desde los alrededores de dicho núcleo hacia y/o a través de dicho núcleo. Un "núcleo impermeable", tal y como se utiliza en el presente documento, contiene y/o incorpora reactivos capaces de generar y/o amplificar una señal cuyos reactivos están en estado seco. Por lo tanto, un "núcleo impermeable", tal y como se utiliza en el presente documento, separa eficazmente dichos reactivos en estado seco del entorno y los mantiene en estado seco. En las realizaciones de la invención, el núcleo impermeable representa por lo tanto dicha al menos una capa de barrera que engloba dichos reactivos.
En una realización, dicha concha hidrofílica porosa está compuesta por un agente formador de hidrogeles o está compuesta por un polímero termoresponsable.
En una realización,
- dicho agente formador de hidrogeles se selecciona del grupo que comprende a) polímeros sintéticos, tal como poli(metil)metacrilato, poliamida; b) polímeros con base en silicona, por ejemplo, polidimetilsiloxanos; c) polímeros naturales seleccionados entre polisacáridos, por ejemplo agarosa, quitina, quitosano, dextrano, alginato, carragenina, celulosa, fucoidán, laminar, gomas seleccionadas entre goma xantana, goma arábiga, goma ghatti, goma guar, goma de garrofín, goma tragacanto, goma karaya e inulina; polipéptidos, colágenos, gelatinas, poli-aminoácidos, como la poli-lisina; polinucleótidos; y combinaciones de los mismos; y
- dicho polímero termorresponsable es un polímero termorresponsable LCST, seleccionado preferentemente entre poli(N-isopropilacrilamida) (PNlPAm), poli[2-(dimetilamino)metacrilato de etilo] (pDMAEMA), hidroxipropilcelulosa, poli(vinilcaprolactamo) (P(VCL) y polivinilmetiléter o dicho polímero termorresponsable es un polímero termorresponsable que tiene una temperatura crítica superior de solución (UCST), seleccionado preferentemente entre poli(N-acriloilglicinamida) (PNAGA), poli(alilamina)-co-poli(alilurea) y sus derivados, poli(metacrilamida), poli(N-acriloilglicinamida), poli(N-metacriloilglutamida), poli(acrilamida)-co-(acrilonitrilo) poli(sulfobetaína)s, poli(fosforilcolina)s.
En una realización, dicho núcleo impermeable se compone de un material adecuado para contener y/o incrustar dichos reactivos y en el que dicho material engloba dichos reactivos y los aísla de otras partes de dicha microcápsula, por ejemplo, dicha matriz porosa, en particular dicha concha hidrofílica, en la que dicho material se selecciona preferentemente entre parafinas, triglicéridos, ceras, en particular ceras vegetales, por ejemplo, cera de carnauba, ceras animales, por ejemplo, cera de abeja, ceras derivadas del petróleo, ceras minerales.
En una realización, dicho núcleo impermeable contiene y/o incrusta dichos reactivos capaces de generar y/o amplificar una señal, en estado seco, y los separa de dicha matriz porosa. Debido a que, en una realización preferida, dicho
núcleo impermeable es un núcleo impermeable al agua, dicho núcleo impermeable al agua mantiene dichos reactivos en dicho estado seco.
En una realización, dichos reactivos capaces de generar y/o amplificar una señal son
- reactivos capaces de realizar una amplificación de ácido nucleico con un analito de ácido nucleico y, en la que, preferentemente, dichos reactivos incluyen una molécula capaz de amplificar dicho analito en dicha muestra, tal como una enzima de amplificación, una o varias moléculas necesarias para facilitar la amplificación de dicho analito, tal como uno o varios cebadores de ácido nucleico, nucleótidos, sales y tampones, y, opcionalmente, uno o varios agentes de detección, o
- uno o varios agentes de detección para detectar una proteína o péptido o célula como analito en dicha muestra, en la que preferentemente dicho uno o varios agentes de detección se seleccionan de entre anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, ácidos nucleicos, incluyendo aptámeros, espiegelares, proteínas que no son de anticuerpos, tales como receptores , fragmentos de receptores, proteínas de afinidad, por ejemplo, estreptavidina, cada una de las cuales está opcionalmente marcada con una molécula informadora adecuada, tal como un colorante, una enzima, un catalizador químico o una mezcla de reactivos capaces de iniciar una reacción química que produzca una señal detectable ópticamente o de otro modo que indique la presencia de una proteína o péptido o célula como analito que se va a detectar.
En una realización, dicha microcápsula no contiene un analito que se va a detectar.
En una realización, dicha microcápsula no es una cápsula o partícula generada in situ.
En una realización, dichos agentes de captura se seleccionan de entre anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, ácidos nucleicos, incluyendo aptámeros, espiegeladores, proteínas que no son de anticuerpos y que son capaces de unirse específicamente a un analito o a un complejo de analitos, tales como receptores, fragmentos de receptores, proteínas de afinidad, por ejemplo estreptavidina, elementos químicos tales como biotina, un Strep-tag®, digoxigenina, dinitrofenol, un ácido nucleico o un análogo de ácido nucleico o elementos químicos similares capaces de unirse específicamente, con una afinidad en el intervalo de Kd = 10-8 a 10-15 M, a anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, ácidos nucleicos, incluyendo aptámeros, espiegeladores, proteínas que no sean de anticuerpos, tales como receptores, fragmentos de receptores, proteínas de afinidad, por ejemplo, estreptavidina, etc., por ejemplo estreptavidina, o se seleccionan entre estructuras hidrófobas capaces de unir específicamente moléculas hidrófobas o moléculas con grupos hidrófobos, en las que, preferentemente, dichas estructuras hidrófobas tienen un logD superior a 2 bajo las condiciones en las que se realiza dicha detección de dicho analito.
El término "Strep-tag®", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere típicamente a un péptido con la secuencia -Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-COOH (Strep-tag®) o ...-Asn-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-... (Strep-tag® II) que se unen de forma reversible pero con alta afinidad a la estreptavidina (Strep-Tag® y Strep-tag® II) o a una forma modificada de estreptavidina, es decir, "StrepTactin®", (Strep-tag® II).
El término "logD", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere al logaritmo del coeficiente de distribución (D), que es la relación de las concentraciones de un compuesto en una mezcla de dos fases inmiscibles en equilibrio. En una realización preferida, el término "coeficiente de distribución", tal y como se utiliza en el presente documento, es sinónimo de "coeficiente de partición". En una realización preferida, el "coeficiente de distribución" se refiere a la relación de concentraciones de un compuesto en una mezcla de agua y 1-octanol. Típicamente, la medición de dicho coeficiente de distribución se realiza mediante cualquier metodología adecuada conocida por un experto en la técnica. Dichas metodologías adecuadas incluyen el "método del frasco agitado" en el que el compuesto en cuestión se disuelve en un volumen de octanol y agua y en el que luego se mide la concentración de dicho compuesto en cada disolvente. Otras metodologías adecuadas son la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). En dicha metodología HPLC, el coeficiente de distribución (D) y su logaritmo pueden determinarse correlacionando su tiempo de retención con compuestos similares con valores de coeficiente de distribución conocidos.
En una realización, dicha microcápsula contiene adicionalmente uno o varios agentes protectores para proteger uno o varios de los reactivos capaces de generar y/o amplificar en dicha solución acuosa, en la que, preferentemente, dicho uno o varios agentes protectores se seleccionan entre ciclodextrinas y poli(óxidos de alquileno).
En una realización, dicha microcápsula contiene además una etiqueta para etiquetar dicha microcápsula y/o un componente magnético en el que dicho componente magnético permite una manipulación posterior de dicha microcápsula.
En una realización, dichos reactivos capaces de llevar a cabo una amplificación de ácido nucleico incluyen además uno o varios agentes de detección, en la que dicho uno o varios agentes de detección se seleccionan entre anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, ácidos nucleicos, incluyendo aptámeros, espiegámeros, proteínas que no son de anticuerpos, tales como receptores , fragmentos de receptores, proteínas de afinidad, por ejemplo, estreptavidina, estreptavidina, cada una de las cuales puede estar marcada con una molécula informadora adecuada, tal como un
colorante, una enzima, un catalizador químico o una mezcla de reactivos capaces de iniciar una reacción química que produzca una señal detectable ópticamente o de otro modo que indique la presencia de un analito que deba detectarse.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de detección y/o cuantificación de un analito en una muestra, comprendiendo dicho método:
i. Proporcionar una microcápsula de acuerdo con la presente invención, como se define en cualquiera de las realizaciones anteriores;
ii. exponer dicha microcápsula a una muestra acuosa que rodea dicha microcápsula y que contiene o se sospecha que contiene un analito que debe detectarse y/o cuantificarse;
iii. retirar dicha microcápsula de dicha muestra acuosa y transferir dicha microcápsula a una fase no acuosa;
iv. disolver o interrumpir dicha microcápsula, preferentemente disolviendo o interrumpiendo dichos núcleos impermeables solos o dichos núcleos impermeables junto con dicha envoltura hidrofílica porosa, para generar una gota acuosa en un medio no acuoso, en la que dicha gota acuosa contiene dichos reactivos capaces de generar y/o amplificar una señal en presencia de un analito que se va a detectar y/o cuantificar, en forma disuelta;
v. realizar una reacción de generación y/o amplificación de una señal dentro de dicha gota acuosa, en la que sólo se genera y/o amplifica una señal si dicho analito ha estado presente en dicha muestra.
En una realización, dicha reacción realizada en el paso v. es una reacción de amplificación de ácido nucleico o una reacción de amplificación de señal, en la que preferentemente dicha reacción realizada en el paso v. es una reacción de amplificación de ácido nucleico seleccionada de la PCR, o de reacciones de amplificación isotérmica tal como TMA, NASBA, LAMP, 3SR, SDA, RCA, LCR, RPA, NEAR.
En una realización, en el paso iv. dicha microcápsula, preferentemente dicho núcleos impermeables, se disuelven o se interrumpen por medios seleccionados entre los medios mecánicos, la escisión química, el cambio de temperatura, el cambio de pH, el cambio de disolvente, la aplicación de un campo eléctrico, la aplicación de un campo magnético, la exposición de dicha microcápsula a la radiación electromagnética, en particular a la luz de una gama definida de longitudes de onda, tal como la luz UV, preferentemente un cambio de temperatura, más preferentemente un aumento de la temperatura.
En una realización, dicha microcápsula es una microcápsula de acuerdo con cualquiera de las realizaciones definidas anteriormente, y dicha envoltura hidrofílica porosa está compuesta por un polímero termoresponsivo LCST (="temperatura crítica inferior de la solución").
En una realización, en la que dicha concha hidrofílica porosa está compuesta por un polímero termoresponsable LCST, dicho método incluye, entre los pasos ii. y iii., un paso adicional
ii.a calentar dicha microcápsula a una temperatura superior a la temperatura crítica inferior de la solución (LCST) de dicho polímero termorresponsable LCST y posteriormente enfriar, o dejar enfriar, dicha microcápsula a una temperatura inferior a la temperatura crítica inferior de la solución (LCST) de dicho polímero termorresponsable LCST, con el fin de lograr un enriquecimiento del analito unido a dicha microcápsula, y realizar dicha etapa ii.a n-veces, en la que n es un número entero de 1 a 1.000, preferentemente de 1 a 500, y/o un paso adicional
ii.b lavar dicha microcápsula en una solución acuosa para eliminar el analito no unido, en la que si el paso ii.b se realiza además del paso ii.a, se realiza antes o después del paso ii.a.
En otra realización, dicha microcápsula es una microcápsula de acuerdo con cualquiera de las realizaciones definidas anteriormente, y dicha envoltura hidrofílica porosa está compuesta por un polímero termoresponsivo UCST (="temperatura crítica superior de la solución").
En una realización, en la que dicha concha hidrofílica porosa está compuesta por un polímero termoresponsivo UCST, dicho método incluye, entre los pasos ii. y iii, un paso adicional ii.a enfriar dicha microcápsula a una temperatura inferior a la temperatura crítica superior de la solución (UCST) de dicho polímero termoresponsivo UCST y posteriormente calentar, o permitir que se caliente, dicha microcápsula a una temperatura superior a la temperatura crítica superior de la solución (UCST) de dicho polímero termoresponsivo UCST de nuevo, con el fin de lograr un enriquecimiento del analito unido a dicha microcápsula, y realizar dicha etapa ii.a n veces, siendo n un número entero de 1 a 1.000, preferentemente de 1 a 500, y/o un paso adicional ii.b de lavado de dicha microcápsula en una solución acuosa para eliminar el analito no unido, en la que si el paso ii.b se realiza además del paso ii.a, se realiza antes o después del paso ii.a.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de preparación de microcápsulas para detectar y/o cuantificar un analito en una muestra, siendo dichas microcápsulas como se definen en cualquiera de las realizaciones anteriores de acuerdo con la presente invención, comprendiendo dicho método los pasos:
a) proporcionar una solución acuosa de reactivos capaz de generar y/o amplificar una señal en presencia de un analito que se va a detectar y/o cuantificar, en la que dicha solución acuosa de reactivos, además de dichos reactivos, comprende además, opcionalmente, uno o varios agentes protectores para proteger uno o varios de los reactivos capaces de generar y/o amplificar en dicha solución acuosa;
b) secar, preferentemente por atomización o liofilización, dicha solución acuosa de a), generando así reactivos secos capaces de generar y/o amplificar una señal, preferentemente en forma nanoparticulada;
c) incorporar dichos reactivos secos a un material adecuado para contener y/o incrustar dichos reactivos, de manera que dicho material abarque dichos reactivos y los aísle, en la que dicho material se selecciona preferentemente entre parafinas, triglicéridos, ceras, en particular ceras vegetales, por ejemplo, cera de carnauba, ceras animales, por ejemplo, cera de abeja, ceras derivadas del petróleo, ceras minerales;
d) generar micropartículas a partir del producto de c) mediante el secado, preferentemente por atomización o liofilización de dicho producto de c), generando así núcleos impermeables ;
e) incorporar dichos núcleos impermeables a una envoltura hidrofílica porosa que forme una matriz porosa y que rodee dicho uno o varios núcleos impermeables mediante
■ incorporar dichos núcleos impermeables a un agente formador de hidrogeles e inducir a dicho agente formador de hidrogeles que se van a formar un hidrogel alrededor de dichos núcleos impermeables, o
■ incorporar dichos núcleos impermeables a precursores/monómeros de un polímero termorresistente e inducir a dichos precursores/monómeros que se van a polimerizar en un polímero termorresistente alrededor de dichos núcleos impermeables, o
■ incorporar dichos núcleos impermeables a un polímero termorresistente preformado y permitir que dicho polímero termorresistente preformado se forme alrededor de dichos núcleos impermeables;
f) Opcionalmente, acoplar uno o varios agentes de captura a dicha envoltura hidrofílica porosa que rodea a dicho núcleo impermeable, generando así microcápsulas con uno o varios agentes de captura adheridos, en la que dicho uno o varios agentes de captura, tras la exposición de dichas microcápsulas a una muestra que rodea a dicha microcápsula y que contiene un analito que se va a detectar y/o cuantificar, son capaces de unir selectiva y específicamente dicho analito;
g) opcionalmente, recoger dichas microcápsulas;
h) opcionalmente, lavar y/o secar, preferentemente por liofilización, dichas microcápsulas.
En realizaciones de acuerdo con la presente invención, se proporciona una microcápsula para detectar y/o cuantificar un analito en una muestra, en la que la microcápsula comprende reactivos capaces de generar y/o amplificar una señal en presencia de un analito que se va a detectar y/o cuantificar, en la que dichos reactivos están en estado seco y están separados de una matriz porosa que rodea dichos reactivos por una barrera apropiada. Las microcápsulas de acuerdo con la presente invención son fáciles y sencillas de fabricar, pueden almacenarse durante largos periodos de tiempo, pueden ser enviadas y transportadas a conveniencia y no necesitan ser preparadas in situ en el momento y lugar de su uso previsto. La barrera utilizada en dichas microcápsulas de acuerdo con la presente invención permite mantener los reactivos en estado seco. La barrera puede adoptar muchas formas diferentes y puede ser, por ejemplo, al menos una capa de barrera que abarque dichos reactivos. En otra realización, dicha barrera puede ser uno o varios núcleos impermeables que contienen y/o incrustan dichos reactivos y los aíslan así de la matriz porosa que los rodea. En otra realización, los reactivos capaces de generar y/o amplificar una señal pueden estar contenidos en la microcápsula dentro de un compartimento que está separado de la matriz porosa que rodea dichos reactivos. En una realización preferida, la barrera está formada por la envoltura de uno o varios núcleos impermeables que contienen y/o incrustan dichos reactivos. En dicha realización, dichos núcleos impermeables tienen una carcasa en el exterior que actúa como barrera para proteger, separar y aislar los reactivos situados dentro de dicho núcleo.
De acuerdo con las realizaciones de la presente invención, la matriz porosa que rodea dichos reactivos tiene medios para recibir un analito que va a ser detectado.
En las realizaciones de acuerdo con la presente invención, la microcápsula misma abarca un volumen, cuyo volumen, durante el uso de la microcápsula, sirve como espacio de reacción para la detección y/o cuantificación del analito. Este volumen, previo al uso de la microcápsula, es ocupado y llenado por los reactivos capaces de generar y/o amplificar una señal y por los núcleos impermeables que contienen dichos reactivos, y por la matriz porosa que rodea dichos reactivos y que incluye los medios para recibir un analito.
En una realización, dicho medio para recibir un analito es un espacio poroso intersticial de la matriz porosa que está dimensionado para acomodar una muestra líquida (es decir, típicamente acuosa) que contiene dicho analito. En una realización, las dimensiones de dicho espacio de poros intersticiales se eligen de forma que se pueda acomodar una
cantidad suficiente de muestra líquida (por ejemplo, típicamente acuosa) para disolver la cantidad de reactivos secos que se encuentran en una microcápsula. En otras palabras, las dimensiones de la microcápsula y, en particular, de la matriz porosa se eligen en correspondencia con la cantidad de reactivos secos que contiene dicha microcápsula. En una realización, la matriz porosa que tiene medios para recibir un analito que debe ser detectado y/o cuantificado actúa, por medio de dicho espacio intersticial de poros, como una esponja para tomar una muestra líquida que puede incluir un analito. Al tomar dicha muestra líquida, el analito es, efectivamente, recibido por dicha microcápsula. En una realización, el medio para recibir un analito que va a ser detectado es, además de dicho espacio de poros intersticiales, adicionalmente formado por la presencia de uno o más agentes de captura que se unen a una porción de dicha microcápsula expuesta a los alrededores de la misma. En aquellas realizaciones en las que la microcápsula comprende una concha hidrofílica porosa que forma dicha matriz porosa, dicho uno o más agentes de captura se unen a dicha concha hidrofílica porosa, ya que esta concha hidrofílica porosa está expuesta a los alrededores de dicha microcápsula y entra en contacto con cualquier muestra a la que dicha microcápsula pueda estar expuesta.
En una realización, la microcápsula de acuerdo con la presente invención tiene un tamaño en el intervalo de 1 pm a 2.000 pm, preferentemente de 1 pm a 1.500 pm, más preferentemente de 10 pm a 1.000 pm, incluso más preferentemente de 20 pm a 500 pm, incluso más preferentemente de 30 pm a 300 pm y cualquier intervalo entre ellos.
El término "tiene un tamaño", tal como se utiliza en el presente documento en el contexto de una microcápsula de acuerdo con la presente invención, se refiere típicamente a las dimensiones de dicha microcápsula y típicamente se refiere a la dimensión más larga de dicha microcápsula. En una realización, el término "tamaño" se refiere al diámetro medio de una microcápsula.
En una realización, dicha microcápsula tiene la forma de una esfera, un elipsoide, una bola, un huevo o un cuerpo irregular de forma redonda.
El término "micro", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere típicamente a dimensiones en el intervalo de los micrómetros.
En una realización, una "microcápsula" es efectivamente una microesfera encapsulada que tiene, en su interior, reactivos capaces de generar que va a ser detectado y/o cuantificado; en la que dichos reactivos están en estado seco; y además comprende una matriz porosa que rodea dichos reactivos, teniendo dicha matriz porosa medios para recibir un analito que va a ser detectado y/o cuantificado; en el que dichos reactivos en estado seco están separados de dicha matriz porosa por una barrera, por ejemplo, al menos una capa de barrera que abarca dichos reactivos. En una realización, dicha microesfera encapsulada comprende uno o varios núcleos impermeables que contienen y/o incrustan dichos reactivos capaces de generar y/o amplificar una señal, y por lo tanto, separan dichos reactivos en estado seco de dicha matriz porosa; y además comprende una concha hidrofílica porosa que forma dicha matriz porosa y rodea dicho uno o varios núcleos impermeables; en la que dicho uno o más agentes de captura, si están presentes, están unidos a dicha matriz porosa, o, en una realización, a dicha concha hidrofílica porosa.
De acuerdo con las realizaciones de la presente invención, una microcápsula de acuerdo con la presente invención también puede caracterizarse por el volumen que abarca. Dicho volumen abarcado por dicha microcápsula representa efectivamente el espacio de reacción en el que tiene lugar la detección y/o cuantificación de un analito. En una realización, el volumen abarcado por dicha microcápsula representa el máximo espacio de reacción disponible para la detección y/o cuantificación de un analito. Por lo tanto, la microcápsula, mediante el volumen abarcado, proporciona un espacio de reacción disponible para la detección y/o cuantificación de un analito, cuyo espacio de reacción se llena parcial o totalmente con agua o una solución acuosa durante la detección y/o cuantificación de un analito. Normalmente, el agua o la solución acuosa con la que se llena dicho espacio de reacción durante la detección y/o cuantificación procede de la muestra que se sospecha que contiene un analito, o procede de una solución de lavado o tampón a la que se expone dicha microcápsula después de que se haya unido el analito (es decir, después de que dicha microcápsula se haya expuesto previamente a una muestra que se sospecha que contiene un analito).
En una realización, una microcápsula tiene un volumen en el intervalo de 0,5 fl a 4,2 pl, preferentemente de 0,5 fl a 1,8 nl, más preferentemente de 500 fl a 525 nl, incluso más preferentemente de 4 pl a 65 nl, incluso más preferentemente de 14 pl a 14 nl, y cualquier intervalo entre ellos.
En las realizaciones en las que la microcápsula comprende una concha hidrofílica porosa que forma dicha matriz porosa, dicha concha hidrofílica porosa no es una cubierta formada por polielectrolitos. Más concretamente, no se trata de una envoltura formada por polielectrolitos que han sido depositados mediante una técnica de deposición capa a capa.
Dado que los reactivos capaces de generar y/o amplificar una señal, antes de la utilización de la microcápsula, están presentes en la microcápsula, en estado seco, la microcápsula de acuerdo con la presente invención puede producirse de manera fácil y, lo que es importante, separada, tanto en el tiempo como en el espacio, del tiempo y el espacio en los que la microcápsula está destinada a ser utilizada. Por lo tanto, las microcápsulas de acuerdo con la presente
invención también pueden almacenarse fácilmente durante periodos de tiempo prolongados y pueden enviarse sin requerir grandes esfuerzos en el mantenimiento de la temperatura u otras condiciones de almacenamiento.
Durante su uso, una microcápsula de acuerdo con las realizaciones de la presente invención puede ser expuesta a una muestra líquida acuosa que contiene un analito, cuya muestra líquida acuosa será entonces absorbida por la matriz porosa de dicha microcápsula. Efectivamente, si dicha muestra contiene un analito, así dicha matriz porosa recibe un analito que va a ser detectado. Los medios para recibir un analito que va a ser detectado y/o cuantificado pueden ser, además de dicho espacio de poros intersticial, también uno o más agentes de captura que se adhieren a una porción de dicha microcápsula expuesta a los alrededores de la misma. Dichos agentes de captura, tras la exposición de dichas microcápsulas a una muestra que rodea a dicha microcápsula y que contiene un analito o se sospecha que contiene un analito que va a ser detectado y/o cuantificado, son capaces de unirse selectiva y específicamente a dicho analito. Por lo tanto, mediante la presencia de estos agentes de captura, la capacidad de la microcápsula para recibir y unir selectivamente un analito que va a ser detectado y/o cuantificado aumenta considerablemente. En las realizaciones de la presente invención, el espacio poroso intersticial de dicha matriz porosa facilita la inmovilización y captación de la muestra líquida a la microcápsula. Por la presencia del espacio poroso intersticial, la matriz porosa de dicha microcápsula actúa como un reservorio para la captación de líquido que incluye o se sospecha que incluye un analito que va a ser detectado y/o cuantificado.
Durante el uso, después de haber sido expuesta a una muestra que se sospecha que contiene un analito, una microcápsula de acuerdo con las realizaciones de la presente invención puede exponerse adicionalmente a un líquido acuoso, tal como un tampón de lavado u otro medio acuoso preferido, tal como un tampón de intercambio con concentraciones y condiciones definidas, tal como concentraciones de sal, concentraciones de tampón, pH, etc. El líquido acuoso será entonces típicamente absorbido por la matriz porosa de dicha microcápsula y llenará el volumen de dicha microcápsula parcial o totalmente y/o, posiblemente, reemplazará el líquido que está presente allí desde reacciones o exposiciones anteriores. El volumen de dicha microcápsula representa entonces efectivamente el espacio de reacción en el que tiene lugar la detección y/o cuantificación de un analito.
Durante el uso, una vez que la microcápsula ha tomado la muestra líquida y, opcionalmente, se ha sometido a uno o varios pasos de lavado o de intercambio de tampón, la microcápsula de acuerdo con la presente invención se retira de dicha muestra acuosa o de la fase acuosa de dicha muestra acuosa y se transfiere a una fase no acuosa. Una vez que las microcápsulas han sido transferidas a una fase no acuosa, los núcleos impermeables, solos, o los núcleos impermeables y la concha hidrofílica porosa que forman dicha matriz porosa y que rodean dichos núcleos impermeables, se disuelven o se interrumpen. Como resultado de ello, se genera una gota acuosa en un entorno no acuoso para cada microcápsula disuelta/interrumpida. Dicha gota acuosa tiene un volumen que se corresponde con el volumen de líquido acuoso que ha tomado previamente dicha microcápsula. En una realización, el volumen de dicha gota acuosa corresponde sustancialmente al volumen de la microcápsula. En otra realización, la microcápsula no ha absorbido previamente el líquido acuoso en toda su capacidad, es decir, en todo su volumen. En este caso, el volumen de dicha gota acuosa corresponde a una fracción del volumen de dicha microcápsula. La disolución/disrupción se produce por cualquier medio adecuado, seleccionado entre medios mecánicos, escisión química, cambio de temperatura, en particular un aumento de la temperatura que permita la fusión de los núcleos impermeables y de las conchas hidrofílicas porosas. Otros medios adecuados incluyen un cambio de pH, un cambio de disolvente, la aplicación de un campo eléctrico y/o un campo magnético, la exposición de dicha microcápsula a la radiación electromagnética, en particular a la luz de una longitud de onda definida, tal como la luz ultravioleta. La gota acuosa que se genera por dicha disolución/interrupción tiene el mismo volumen o esencialmente el mismo volumen que abarca/engloba la microcápsula. La gota acuosa contiene todos los reactivos capaces de generar y/o amplificar una señal y, si la muestra líquida a la que la microcápsula había sido expuesta previamente, también había contenido un analito, la gota acuosa también contiene dicho analito. La gota acuosa proporciona así un espacio de reacción que permite la detección y/o cuantificación de un analito en una muestra. En dicho espacio de reacción, típicamente se genera y/o amplifica una señal dentro de dicha gota acuosa, en el que dicha señal sólo se genera y/o amplifica si dicho analito ha estado presente en dicha muestra a la que la microcápsula había sido expuesta previamente. En una realización, la reacción de generación y/o amplificación de una señal es una reacción de amplificación de ácido nucleico o es una reacción de amplificación de señal. En una realización, el analito se amplifica mediante una reacción de amplificación, y el producto así amplificado se detecta mediante un agente de detección, siendo esto particularmente preferido en el caso de que el analito sea un ácido nucleico y la reacción de amplificación sea una reacción de amplificación de ácido nucleico. Ejemplos de estas reacciones de amplificación de ácidos nucleicos son la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o las reacciones de amplificación isotérmica, tales como la amplificación mediada por transcripción (TMA), la amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA), la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), la replicación de secuencia autosostenida (3SR), la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), la amplificación por círculo rodante (RCA), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación de la recombinasa polimerasa (RPA) y la reacción de amplificación de la enzima con mella (NEAR). Un experto en la técnica conoce bien cualquiera de estas reacciones de amplificación y es capaz de realizarlas, según sea necesario. En otra realización, la detección del analito puede producirse realizando primero una reacción de amplificación de la señal y detectando posteriormente la señal así amplificada. En esta última realización, una señal sólo se amplifica si hay una señal en primer lugar, es decir, una señal sólo se produce cuando hay un analito que detectar, y la reacción de amplificación de la señal puede ser, por ejemplo, una amplificación de ácido nucleico si
un ácido nucleico es o forma parte del agente de detección. Alternativamente, la reacción de amplificación de la señal puede ser una amplificación enzimática de una señal, si una enzima es o forma parte del agente de detección.
De acuerdo con las realizaciones de la presente invención, también se proporciona un método de preparación de microcápsulas para detectar y/o cuantificar un analito en una muestra, siendo dichas microcápsulas como se define en cualquiera de las realizaciones anteriores. En este método, de acuerdo con el paso a), se proporciona una solución acuosa de reactivos, en la que dichos reactivos son capaces de generar y/o amplificar una señal en presencia de un analito que va a ser detectado y/o cuantificado, en el que dicha solución acuosa de reactivos, además de dichos reactivos, comprende además, opcionalmente, uno o varios agentes protectores para proteger uno o varios de los reactivos capaces de generar y/o amplificar, en dicha solución acuosa. De acuerdo con este método de preparación, en un paso adicional, concretamente el paso b), la solución acuosa del paso a) se seca, preferentemente por pulverización o liofilización, con lo que se generan reactivos secos capaces de generar y/o amplificar una señal. Preferentemente, dicho secado hace que los reactivos estén en forma nanoparticulada. En un paso adicional, concretamente el paso c), dichos reactivos secos resultantes del paso b) se incorporan a un material adecuado para contener y/o incrustar dichos reactivos, de manera que dicho material abarque dichos reactivos y los aísle. En una realización preferida, el material que abarca dichos reactivos se selecciona entre parafinas, triglicéridos, ceras, en particular ceras vegetales, por ejemplo, cera de carnauba, ceras animales, por ejemplo, cera de abejas, ceras derivadas del petróleo y ceras minerales. La finalidad de dichas parafinas, triglicéridos y/o ceras es proporcionar una barrera mediante la cual los reactivos capaces de generar y/o amplificar una señal se separan de dicha matriz porosa de la microcápsula. En una realización, dichas parafinas, triglicéridos y/o ceras tienen un punto de congelación en el intervalo de 50 °C a 80 °C. En una realización, el punto de congelación se mide de acuerdo con la norma ASTM D938. Como se ha indicado anteriormente, los reactivos se encuentran en estado seco/secado y deben mantenerse en ese estado durante el mayor tiempo posible, es decir, hasta que la barrera se disuelva deliberadamente. Como también se ha indicado más arriba, la matriz porosa comprende preferentemente un espacio de poros intersticial para alojar una muestra líquida con la que, sin embargo, no deben entrar en contacto prematuro los reactivos capaces de generar y/o amplificar una señal. Las ceras/triglicéridos/parafinas mencionadas anteriormente son materiales de barrera adecuados para tal fin.
Una vez que los reactivos secos del paso b) han sido incorporados a dicho material en el paso c), sigue otro paso d) en el que se generan micropartículas a partir del producto del paso c) por secado, preferentemente por pulverización o liofilización de dicho producto del paso c), generando así núcleos impermeables que contienen y/o incrustan dichos reactivos capaces de generar y/o amplificar una señal. Los núcleos impermeables generados en el paso d) se incorporan posteriormente a una concha hidrofílica porosa en un paso posterior, es decir, el paso e). Dicha concha hidrofílica porosa forma una matriz porosa y rodea dicho uno o varios núcleos impermeables. La incorporación de dichos núcleos impermeables en dicha concha hidrofílica porosa se logra mediante
- incorporación de dichos núcleos impermeables a un agente formador de hidrogeles e induciendo a dicho agente formador de hidrogeles a formar un hidrogel alrededor de dichos núcleos impermeables, o
- incorporación de dichos núcleos impermeables a precursores/monómeros de un polímero termorresistente e inducir a dichos precursores/monómeros a polimerizar en un polímero termorresistente alrededor de dichos núcleos impermeables, o
- incorporación de dichos núcleos impermeables a un polímero termorresponsable preformado y permitiendo que dicho polímero termorresponsable preformado se forme alrededor de dichos núcleos impermeables.
Cabe señalar que, en las realizaciones mencionadas anteriormente que implican un polímero termorresponsable, dicho polímero termorresponsable forma dicha concha hidrofílica porosa en la que se incorporan dichos núcleos impermeables.
En una realización, el método de preparación de microcápsulas de acuerdo con la presente invención contiene opcionalmente el paso adicional f) acoplamiento de uno o varios agentes de captura a dicha concha hidrofílica porosa que rodea a dicho uno o varios núcleos impermeables, por lo que se generan microcápsulas con uno o varios agentes de captura adheridos, en el que dicho uno o varios agentes de captura, tras la exposición de dicha microcápsula a una muestra que rodea a dicha microcápsula y que contiene un analito que va ser detectado y/o cuantificado, son capaces de unir selectiva y específicamente dicho analito.
En una realización, el método de preparación de microcápsulas de acuerdo con la presente invención contiene opcionalmente el paso adicional g) en el que se recogen dichas microcápsulas. En una realización, el método de preparación de microcápsulas de acuerdo con la presente invención contiene adicionalmente el paso opcional h) de lavar y/o secar, preferentemente liofilizar, dichas microcápsulas.
En las realizaciones de una microcápsula de acuerdo con la presente invención, la microcápsula contiene sólo un núcleo impermeable rodeado por una concha hidrofílica porosa. En otra realización, la microcápsula de acuerdo con la presente invención contiene una pluralidad de núcleos impermeables, estando dicha pluralidad de núcleos rodeados por dicha concha hidrofílica porosa.
En una realización, dicha concha hidrofílica porosa está compuesta por un agente formador de hidrogeles o está compuesta por un polímero termoresponsable. En una realización, el agente formador de hidrogeles se selecciona del grupo que comprende a) polímeros sintéticos, tales como el poli(metil)metacrilato, poliamida; b) polímeros con base en silicona, por ejemplo, polidimetilsiloxanos; c) polímeros naturales seleccionados de entre polisacáridos, por ejemplo agarosa, quitina, quitosano, dextrano, alginato, carragenina, celulosa, fucoidán, laminar, gomas seleccionadas entre goma xantana, goma arábiga, goma ghatti, goma guar, goma de garrofín, goma tragacanto, goma karaya e inulina; polipéptidos, colágenos, gelatinas, poliaminoácidos, tales como polilisina; polinucleótidos y combinaciones de los mismos. Los agentes formadores de hidrogeles son conocidos por un experto en la técnica y se describen, por ejemplo, en Calo, European Polymer Journal, 2015, 65, pp. 252-267.
En una realización, la concha hidrofílica porosa se compone de un polímero termoresponsivo que puede, o no, formar un hidrogel. Los polímeros termoresponsables son polímeros que presentan un cambio discontinuo de una o varias de sus propiedades físicas en función de la temperatura. Un ejemplo típico de propiedad física que se modifica es la solubilidad, por ejemplo en el agua. Un polímero termoresponsable típico ejemplar es soluble y transparente en agua a baja temperatura y experimenta una transición de fase reversible, con respecto a su solubilidad en agua, con el aumento de la temperatura que da lugar a una nube o forma un precipitado en solución acuosa a alta temperatura. La temperatura intrínseca a la que se produce dicha transición de fase se denomina temperatura crítica inferior de la solución (LCST). Otro polímero termoresponsable típico ejemplar es soluble y transparente en agua a alta temperatura y sufre una transición de fase reversible, con respecto a su solubilidad en agua, al bajar la temperatura, lo que da lugar a una nube o forma un precipitado en solución acuosa a baja temperatura. La temperatura intrínseca a la que se produce dicha transición de fase se denomina temperatura crítica superior de la solución (TSC).
En una realización de las microcápsulas de acuerdo con la presente invención, la envoltura hidrofílica porosa está compuesta por un polímero termorresponsable, en el que, preferentemente, dicho polímero termorresponsable es un polímero termorresponsable LCST (= temperatura crítica inferior de la solución). En una realización, dicho polímero termoresponsivo LCST se selecciona entre poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAm), poli[2-(dimetilamino)metacrilato de etilo] (pDMAEMA), hidroxipropilcelulosa, poli(vinilcaprolactamo) (P(VCL) y polivinilmetiléter.
En otra realización de las microcápsulas de acuerdo con la presente invención, la concha hidrofílica porosa está compuesta por un polímero termorresponsable, en el que, preferentemente, dicho polímero termorresponsable es un polímero termorresponsable UCST (= temperatura crítica superior de la solución). En una realización, dicho polímero termorresponsable UCST se selecciona entre poli(N-acriloilglicinamida) (PNAGA), poli(alilamina)-co-poli(alilurea) y sus derivados, poli(metacrilamida), poli(N-acriloilaspargineamida), poli(N-metacriloilglutamida), poli(acrilamida)-co-(acrilonitrilo) poli(sulfobetaína)s, poli(fosforilcolina)s
Las realizaciones de las microcápsulas de acuerdo con la presente invención en las que la concha hidrofílica porosa está compuesta por un polímero termorresistente, en particular un polímero termorresistente LCST, son particularmente adecuadas para enriquecer un analito con la microcápsula. Esto se debe a que, con dicha realización, es posible calentar la microcápsula a una temperatura superior a la temperatura crítica inferior de la solución (LCST) del polímero termoresponsable LCST, como resultado de lo cual su solubilidad en el agua disminuirá rápidamente y como resultado de lo cual toda la microcápsula se contraerá/condensará y, por lo tanto, cambiará el volumen global abarcado o comprendido por dicha microcápsula. Mediante dicha contracción, el disolvente, en particular el agua, será expulsado de la microcápsula, en particular de la concha hidrofílica porosa. A continuación, la microcápsula se enfría o se deja enfriar hasta una temperatura inferior a la temperatura crítica inferior de la solución (LCST) de dicho polímero termorresponsable LCST, como resultado de lo cual el polímero termorresponsable aumentará de nuevo su solubilidad y, por lo tanto, la concha hidrofílica porosa se expandirá de nuevo, permitiendo así que los poros de dicha concha hidrofílica porosa se llenen con la solución que contiene el analito. Mediante este proceso de calentamiento y enfriamiento por encima y por debajo de la temperatura crítica inferior de la solución, se consigue un enriquecimiento del analito en dicha concha hidrofílica porosa. Este paso de calentamiento y enfriamiento es reversible y, opcionalmente, puede repetirse una o varias veces, por ejemplo, hasta 1.000 veces o incluso más, preferentemente hasta 500 veces, lo que producirá un enriquecimiento del analito. En algunas realizaciones, el paso de calentamiento y enfriamiento puede repetirse varios miles de veces, por ejemplo hasta 10.000 o cualquier número de veces entre 1000 y 10.000. El efecto será incluso mayor, si uno o más agentes de captura están unidos a dicha concha hidrofílica porosa, en cuyo caso, al expandirse la concha hidrofílica porosa, el analito puede quedar unido a dichos agentes de captura.
Otras realizaciones de las microcápsulas de acuerdo con la presente invención en las que la cubierta hidrófila porosa está compuesta por un polímero termoresponsable, en particular un polímero termoresponsable UCST, son particularmente adecuadas para enriquecer un analito con la microcápsula. Esto se debe a que, con dicha realización, es posible enfriar la microcápsula a una temperatura inferior a la temperatura crítica superior de la solución (UCST) del polímero termoresponsable UCST, como resultado de lo cual su solubilidad en el agua disminuirá rápidamente y como resultado de lo cual toda la microcápsula se contraerá/condensará y, por lo tanto, cambiará el volumen global abarcado o comprendido por dicha microcápsula. Mediante dicha contracción, el disolvente, en particular el agua, será expulsado de la microcápsula, en particular de la concha hidrofílica porosa. A continuación, la microcápsula se calienta o se deja calentar a una temperatura superior a la temperatura crítica superior de la solución (UCST) de dicho polímero termorresponsable UCST, nuevamente, como resultado de lo cual el polímero termorresponsable aumentará de nuevo
su solubilidad y, por tanto, la concha hidrofílica porosa se expandirá de nuevo, permitiendo así que los poros de dicha concha hidrofílica porosa se llenen con la solución que contiene el analito. Mediante este proceso de enfriamiento y calentamiento por debajo y por encima de la temperatura crítica superior de la solución, se consigue un enriquecimiento del analito en dicha concha hidrofílica porosa. Opcionalmente, este paso de enfriamiento y calentamiento puede repetirse una o varias veces, por ejemplo, hasta 1.000 veces o incluso más, preferentemente hasta 500 veces, y esto dará lugar a un enriquecimiento del analito. El efecto será incluso mayor, si uno o más agentes de captura están unidos a dicha concha hidrofílica porosa, en cuyo caso, al expandirse la concha hidrofílica porosa, el analito puede quedar unido a dichos agentes de captura.
Además, se hace referencia a las figuras en las que:
La figura 1 muestra una representación esquemática de diversas realizaciones de microcápsulas de acuerdo con la presente invención. El panel A muestra una realización de un núcleo impermeable con una sola inclusión de reactivo incrustada. Los reactivos están en estado seco y se mantienen como tal. El núcleo impermeable está recubierto con una capa de triglicéridos que separa los reactivos secos del entorno, por ejemplo, una capa de cera; el panel B muestra una realización de un núcleo impermeable con múltiples inclusiones de reactivos incrustadas en una matriz de triglicéridos, por ejemplo, una matriz de cera; el panel C muestra una realización de una microcápsula que tiene un único núcleo impermeable en el que están contenidos reactivos capaces de generar y/o amplificar una señal. La microcápsula comprende además una matriz de concha hidrofílica que rodea dicho núcleo impermeable, y además tiene agentes de captura unidos a dicha concha hidrofílica. El panel D muestra una realización de una microcápsula con múltiples núcleos impermeables con reactivos en su interior y rodeada por una matriz de concha hidrofílica. De nuevo, los agentes de captura se adhieren a dicha concha hidrofílica. El panel E muestra una realización de una microcápsula que incluye un único núcleo impermeable con reactivos en su interior y que tiene una concha hidrofílica altamente porosa que forma una matriz porosa que rodea dicho núcleo único impermeable con reactivos. Los agentes de captura se adhieren a dicha concha hidrofílica porosa.
La figura 2 muestra un diagrama de flujo esquemático de la fabricación de las microcápsulas de acuerdo con la presente invención.
La figura 3 muestra una representación esquemática de la utilización de una realización de una microcápsula de acuerdo con la presente invención. Más concretamente, en el paso 1, una microcápsula que tiene un único núcleo impermeable con reactivos secos en su interior y que tiene agentes de captura para dicho analito, se expone a una muestra de solución acuosa que se sospecha que contiene un analito (y que, de hecho, contiene dicho analito). La muestra de solución acuosa también contiene una etiqueta de detección que también es capaz de unir dicho analito. Tras la exposición a dicha muestra, el analito se une a los agentes de captura y es etiquetado por la etiqueta de detección. Cualquier etiqueta de detección no específicamente unida se elimina posteriormente en un paso de lavado (paso 2), que, sin embargo, es opcional. En el paso 3, la microcápsula se transfiere a una fase no acuosa y se disuelve/interrumpe, por ejemplo, mediante un cambio adecuado de temperatura o de pH, con la formación concomitante de gotas acuosas y la liberación del reactivo, seguida de la amplificación y/o la detección. La microcápsula proporciona el espacio de reacción en el que tiene lugar dicha amplificación y/o detección.
La figura 4 muestra un diagrama de flujo esquemático del uso de las microcápsulas de acuerdo con la presente invención.
La figura 5 muestra una realización de una microcápsula que comprende un único núcleo impermeable con reactivos incrustados en él y que además comprende una concha hidrofílica porosa compuesta por un material capaz de sufrir un cambio de fase en respuesta al cambio de un parámetro externo, por ejemplo, un polímero termoresponsivo. En el estado expandido de la concha hidrofílica porosa, los poros se llenan con una solución acuosa que contiene el analito y una etiqueta de detección. Al cambiar las condiciones del entorno, por ejemplo la temperatura, la concha se condensa y el líquido es expulsado de los poros, mientras que el analito unido permanece en la microcápsula. El proceso es reversible, por lo que la microcápsula puede pasar de un estado expandido a otro condensado.
La figura 6 muestra imágenes fotográficas de una realización de una microcápsula que tiene una concha hidrofílica porosa que rodea un núcleo impermeable con un colorante fluorescente incrustado (fotografía superior izquierda que muestra una imagen de transmisión de luz de una sola partícula de reactivo). La microcápsula contiene una concha hidrofílica porosa completamente formada que contiene agua, y la microcápsula está rodeada por una fase no acuosa.
- microcápsula con un diámetro de aprox. 500 pm en portaobjetos en aceite mineral
- Concha de Agarosa al 1 % (tipo A0576)
- múltiples partículas del núcleo que representan el 7 % del peso de la partícula
- partículas del núcleo generadas por el secado por pulverización de un 10 % (en peso) de polvo de Rodamina/Cavasol
- Tm cera = 58 °C
- Tm agarosa = 75 °C
La serie inferior de fotografías muestra cuatro etapas de un proceso de calentamiento de dicha microcápsula de 30 °C a 70 °C a 95 °C y de nuevo a 30 °C.
T=30 °C: Baja fluorescencia, tinte seco rodeado de una matriz de núcleo hidrófobo
T=70 °C: Fusión de la matriz del núcleo, liberación del colorante fluorescente; la señal de fluorescencia aumenta al disolver el colorante fluorescente en una solución tampón acuosa contenida en la concha del gel de agarosa
T=95 °C: Matriz de agarosa fundida, colorante totalmente resuspendido; material de la matriz de núcleo fusionado en una sola gota grande
T=30 °C: Partícula con colorante fluorescente distribuido en una matriz de gel de agarosa; el material del núcleo se libera en el aceite circundante
A 30 °C el colorante seco contenido en el núcleo impermeable muestra una baja fluorescencia. Al calentar a 70 °C la matriz del núcleo impermeable se funde y el colorante fluorescente se libera. La señal de fluorescencia aumenta cuando el colorante se disuelve en la solución contenida en la concha hidrofílica porosa. Al seguir calentando a 95 °C, también se funde el material hidrofílico de la cubierta, por ejemplo, la agarosa, y el colorante fluorescente se disuelve por completo. El material del núcleo se funde en una sola gota grande. Al volver a enfriar la partícula a 30 °C, el colorante fluorescente se ha distribuido por la matriz porosa hidrofílica de la concha, mientras que el material del núcleo impermeable se ha liberado en la fase no acuosa circundante.
La figura 7 muestra un ejemplo de una realización de una microcápsula de acuerdo con la presente invención en la que se incorporaron reactivos de PCR peletizados y liofilizados en cera de parafina, y las partículas recubiertas de cera así producidas ("núcleos impermeables") se transfirieron a un volumen líquido de una solución de agarosa para generar una concha hidrofílica porosa alrededor de los núcleos impermeables. Las microcápsulas así producidas se secaron y posteriormente se incubaron con o sin analito en solución acuosa. A continuación, las microcápsulas se transfirieron a una fase no acuosa y se realizó la PCR. En las configuraciones designadas como "positivo 1", "positivo 2", "positivo 3", "positivo 4", se puede observar un aumento de la fluorescencia que muestra que se produce la amplificación/detección. En las configuraciones designadas como "control negativo 1" y "control negativo 2", no se observa ningún aumento de la fluorescencia, lo que indica que no se produce ninguna amplificación. Más concretamente, la amplificación/detección comprendía lo siguiente:
- el reactivo PCR liofilizado peletizado se recubrió con cera de parafina (Tm 58 °C) para proporcionar una capa impermeable al agua
- partículas recubiertas de cera transferidas a un volumen líquido de solución de agarosa al 1 % necesario para volver a suspender el reactivo recubierto a una concentración final de reactivo adecuada; la agarosa se ha mantenido por encima del punto de gelificación (agarosa tipo A2576, Tg < 20 °C, Tm = 62 °C)
- las partículas de agarosa secas han sido incubadas con una solución acuosa sin analito (muestras control negativo 1 y 2) y con analito (muestras positivas 1,2,3,4)
- solución acuosa se ha sustituido por aceite de parafina
- El ciclado de la PCR y la detección en tiempo real para cada uno de los envases se realizó de acuerdo con los procedimientos estándar
Además, se hace referencia a los siguientes ejemplos que se dan para ilustrar, no para limitar la presente invención.
Ejemplos
Realización 1. Fabricación de microcápsulas que contienen reactivos monodispersos
Preparación de soluciones de microcápsulas
La agarosa A2576 de temperatura de gelificación ultrabaja (Sigma) con un punto de gel <20 °C y un punto de fusión de <62 °C está marcada con un colorante reactivo de biotina monoclorotriazinilo (INNOVENT). Alternativamente, la agarosa puede activarse primero y luego acoplarse a la biotina EZ-Link™ Amine-PEG11. Además, la activación puede llevarse a cabo mediante la modificación del cian de bromo, la oxidación suave (generación de grupos aldehídos), el carbonildiimidazol (CDI) o por otros métodos conocidos. La cobertura óptima de biotina se determina por titulación en pruebas preliminares con el fin de maximizar la capacidad de unión de la estreptavidina manteniendo las propiedades de la matriz de la agarosa (comportamiento de fusión y formación de gel, baja unión inespecífica).
• Solución de agarosa A2576 de muy baja temperatura de gelificación (1 % p/v), marcada con biotina
• agua libre de nucleasas
• 2 % (v/v) Alcohol polivinílico
Los componentes del componente 1 se pipetean juntos, se agitan brevemente en un mezclador de vórtice y se centrifugan. Posteriormente, la mezcla se incuba a 72 °C durante 30 minutos con una agitación suave (100 rpm) para fundir la agarosa y obtener una solución de agarosa homogénea que se mantiene a 42°C hasta su uso posterior.
También se preparó una solución madre de (2-hidroxipropil)-ciclodextrina (100 %) en agua libre de nucleasas utilizando Cavasol W7 o W8 (Sigma) y se almacenó a temperatura ambiente. La mezcla final para la PCR, que incluía todos los reactivos que se van a encapsular, contenía lo siguiente
Componente 2:
• 1,25 U/pl de Hot Start Taq DNA Polymerase (biotechrabbit GmbH)
• 4,0 mM de dNTPs (biotechrabbit GmbH)
• 8,0 pM de cebador con sentido (5'-GCAGTGGCGCCCGAACAGG-3') (Metabion International AG)
• 8,0 pM de cebador antisentido (5'-ACTGACGCTCTCGCACCCATCT-3') (Metabion International AG)
• 8,0 pM de sonda Taq-Man (5'-Cy5-CTCCGACGCAACGGCTCG-BHQ3-3') (Metabion International AG) o 10x EvaGreen® Fluorescent DNA Stain (Jena Bioscience GmbH)
• Polifosfato de sodio (Merck)
• 9 % (p/v) (2-hidroxipropil)-ciclodextrina (Sigma)
La mezcla de reactivos se secó por pulverización utilizando el secador por pulverización Nano B-90 (Büchi Labortechnik GmbH) para obtener reactivos de tamaño nanopartícula. Posteriormente, las nanopartículas se secaron al vacío justo antes de dispersarlas en el triglicérido Softenol 3118 (IOI Oleo GmbH), que es una tristearina, a una concentración máxima del 10 % (p/v) mediante un tratamiento ultrasónico a temperatura elevada (80-90 °C) utilizando el sonificador digital S-450D (Branson).
Generación de microcápsulas monodispersas
Componente 3:
a.
• aceite mineral / aceite de parafina (Sigma)
• 2% (p/v) Span80
O
b.
• HFE 7500 (Microfluidos Dolomita)
• 2-5 % Picosurf 1 (Dolomita MIcrofluidics)
La micropartícula monodispersa de agarosa que contiene reactivo incrustado de triglicéridos puede fabricarse en un proceso de un solo paso de formación de doble emulsión utilizando un sencillo dispositivo de doble flujo-foco (Dolomite Microfluidics). En particular, dos chips de Dolomite Droplet Junction, uno de ellos de vidrio liso (hidrofílico, 100 pm) y otro de naturaleza hidrófoba (190pm) se montan en un soporte de virutas, utilizando el conector lineal para la entrada y salida de fluidos. Seleccionando este orden de viruta, se consigue una capacidad de humectación de la superficie del canal adecuada para la formación de gotas bifásicas estables de aceite/agua/aceite. El reactivo incrustado en triglicéridos con una proporción de cera a reactivo de máximo 10:1 y el componente 1 (enfriado a 42°C) así como el componente 3 son ambos prefiltrados con un filtro de 2 pm antes de colocarlos en la bomba P (Mitos) del sistema de gotas. La unidad de control de la temperatura para la viruta 1 se ajusta por encima de la temperatura de congelación del triglicérido (75 °C) y a 42 °C para la viruta 2. Los conductos de fluido se ceban a 2.000 mbar durante 1 minuto utilizando el software de control de flujo. Ambos lados del conector lineal se conectan a al virutamediante la interfaz. Se ajusta una proporción de caudal de 1:10:100 entre el interior y el medio y el exterior respectivamente. Es necesario optimizar los caudales para la formación estable de gotas bifásicas. Los parámetros se supervisan con el software Dolomite Flow Control Advanced. El triglicérido que contiene el reactivo se cizalla en la primera unión produciendo un chorro que se extiende hacia la segunda unión formando un chorro coaxial, que se vuelve a cortar o gotas que se encapsulan en la segunda unión. Las gotas O/W/O se recogen en hielo para iniciar la congelación del triglicérido y la solidificación de la agarosa.
El proceso da lugar a microcápsulas de agarosa de aprox. 190 pm de diámetro con una incrustación de triglicéridos que contiene un volumen definido de mezcla de reacción seca. Las microcápsulas funcionales se extraen de la fase oleosa mediante centrifugación (200 xg) a través de una estructura de tamiz (malla SEFAR PETEX® (w=44pm)) y se
lavan 5* con TritonX-100 al 0,1 % (v/v) antes de resuspenderlas en agua libre de nucleasas, azida sódica al 0,02 % (v/v) y almacenarlas en la nevera a 7 °C para su posterior procesamiento.
En el caso de la generación de gotas en HFE 7500 (2-5 % Picosurf 1), se pipetean 50 j l de Triton X-100 al 1 % (v/v) en agua sobre las partículas.
A continuación, el tubo se centrifuga a 2000 g durante 1 minuto. La fase oleosa (inferior) y la fase acuosa (superior) están ahora bien separadas con una interfase que contiene las partículas. ahora se pipetean lentamente 200 jl de un medio de gradiente de densidad (Optiprep, Axis shield) en el tubo. Es importante evitar una mezcla excesiva de la fase acuosa con el medio de gradiente de densidad. Lo ideal es que la mayor parte del medio del gradiente de densidad se deslice bajo la fase de partículas. Los tubos se centrifugan durante 2 minutos a 2.000 g. Después, la fase media de gradiente de densidad se sitúa entre la fase de aceite y la fase de partículas. La fase de partículas puede ahora transferirse a un nuevo tubo. En este paso hay que tener cuidado de no transferir nada del volumen de aceite y un volumen lo más pequeño posible del medio de gradiente de densidad al nuevo tubo.
Se añade 1 ml de Tritón X-100 al 0,1 % (v/v) en agua de calidad PCR al tubo que contiene las partículas. El volumen se mezcla y se centrifuga a 2.000 g durante 2 minutos. Las partículas se dispersan en el fondo del tubo. El sobrenadante se elimina dejando las partículas en el tubo. se añade de nuevo al tubo 1 ml de Tritón X-100 al 0,1 % (v/v) y se repite el proceso de lavado 5 veces. Finalmente, las partículas se recogen en un volumen de agua de grado PCR, azida sódica al 0,02 % (v/v) o tampón adecuado para los siguientes procesos.
Alternativamente, se fabricaron perlas de cera que contenían un reactivo seco de tamaño submicrométrico mediante el secado por pulverización utilizando un minisecador por pulverización B-290 de Büchi, lo que dio lugar a perlas con un diámetro medio de 10 jm . A continuación, se resuspendió una cantidad definida de perlas de cera de triglicéridos en agarosa fundida por debajo del punto de fusión de la cera. Para generar una dispersión homogénea de las perlas de cera, la agarosa se suspendió inicialmente en una solución etanólica al 50 % y se agitó suavemente durante la dispensación. A continuación, se generaron microcápsulas dispensando gotas de agarosa de 200 jm de diámetro en aceite mineral utilizando un cabezal dispensador MD-K-140 (Microdrop).
Recubrimiento de microcápsulas con estreptavidina
Las microcápsulas se lavan 1 vez con tampón de lavado (20 mM Trix-HCl, 22 mM KCl, 22 mM NH4Cl, 3 mM MgCh, 5 % (v/v) de glicerol). El recubrimiento de las microcápsulas con estreptavidina se realiza en el mismo tampón. La concentración de estreptavidina se selecciona de forma que no quede biotina accesible en la superficie de las microcápsulas. En cualquier caso, la estreptavidina se aplica en exceso para evitar el entrecruzamiento de las microcápsulas. La concentración óptima de estreptavidina se ha determinado en los ensayos preliminares con estreptavidina marcada mediante la determinación de una cobertura de la superficie de la meseta. Tras el acoplamiento con estreptavidina, las microcápsulas se lavan varias veces en unidades de centrifugación SEFAR PETEX de 44 jm con un tampón de lavado sin estreptavidina. Posteriormente, se determina la concentración de microcápsulas mediante recuento al microscopio en una cámara de recuento DHC-N01 (Neubauer Improved) (INCYTO) o mediante citometría en el citómetro de flujo CytoFlex (Beckman Coulter). El grado de etiquetado/recubrimiento también se evalúa por espectrometría utilizando la etiqueta de colorante monoclorotriazinilo. Las alícuotas que contienen aproximadamente 100.000 perlas se resuspenden en una solución de (2-hidroxipropil)-ciclodextrina al 9 % (p/v) y se liofilizan o, alternativamente, se secan al vacío.
Realización 2: Aplicación de microcápsulas monodispersas para realizar la PCR digital
Captura de analitos
El ARN del VIH-1 purificado (subtipo O) marcado con biotina mediante transcripción inversa se enriquece en una micropartícula de hidrogel encapsulada con reactivo modificado con estreptavidina. Todo el volumen de la reacción de transcripción inversa (RT) se añade a una cantidad definida de microcápsulas liofilizadas o secas. Las perlas se vuelven a suspender cuidadosamente y se incuban con la mezcla de reacción RT. Se deja que las microcápsulas absorban una parte del líquido aplicado, se hinchen y liguen el ADNc marcado con biotina. Para evitar los aglomerados se puede utilizar el ultrasonido. Posteriormente, la suspensión se aplica a un tubo de centrifugación equipado con tejido SEFAR PETEX® (w = 44 jm ). El sobrenadante se elimina por centrifugación de la columna a 300 xg. Para el lavado, se añade a la columna el tampón de lavado utilizado anteriormente y también se centrifuga a 300 xg. El lavado se repite varias veces y las microcápsulas se recogen finalmente en el componente 4. En este paso, las microcápsulas fijan el analito de la solución y toman los componentes restantes necesarios para la PCR por difusión.
El componente 4 consiste en los siguientes reactivos (concentraciones finales):
• 20 mM Trix-HCl, 22 mM KCl, 22 mM NH4C 3 mM MgCE, 5 % (v/v) glicerol
• MgCl2 [Invitrogen] o MgSO4 [Sigma]
• Plantilla de ADNc marcada con biotina con la siguiente secuencia
5-Bio-CAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTTAAAGAGAAAGTGAAACCAGGGAAGAAAACCTCCGACG CAACGGGCTCGGCTTAGCGGAGTGCACCTGCTAAGAGGCGAGAGGAACTCACAGAGGGTG AGTAATTTTGCTGGCAGTGGCCAGACCTAGGGGAAGGGCGAAGTCTCTAGGGGAGGAAGA TGGGTGCGAGAGCGTCAGT -3'
Compartimentación por transferencia a fase no acuosa
Las microcápsulas se transfieren a una fase no acuosa lavándolas 3 veces con aceite de parafina (Sigma) que contiene el surfactante Triton-X 100 (0,1 % p/p) (Sigma) y el emulsionante ABIL EM-90 (3 % p/p) (Evonik Industries) u otros para evitar la coagulación de las microcápsulas. El lavado se realiza mediante centrifugación a 200 *g durante 1 minuto utilizando un tubo de centrifugación equipado con tejido SEFAR PETEX® (w = 44 pm).
Los microcompartimentos con un volumen definido se crean dispersando las microcápsulas en un aceite de fluorocarbono, por ejemplo, PicoSurf ™ 5 % dispersado en aceite Novec 7500 (Dolomite Microfluidics). En lugar de un aceite pesado de fluorocarbono puede aplicarse un aceite mineral ligero con emulsionante, por ejemplo, aceite de parafina (Sigma) con 5 % (p/p) de Span 80 (Sigma).
La fase acuosa completa se pone en contacto con un exceso de aceite en un tubo Eppendorf. Los ultrasonidos se aplican durante un minuto utilizando el Sonifier™ S-450 y el Ultrasonics Sonifier™ Cup Horn (Branson). Tanto las microcápsulas cargadas con el ADNc como el sobrenadante del componente 3 se dispersan y emulsionan en la fase oleosa. Las gotas acuosas generadas del sobrenadante del componente 3 y las microcápsulas difieren significativamente en su volumen, teniendo las gotas un volumen mucho menor. La emulsión generada se pipetea en un tejido SEFAR PETEX® con una anchura de malla de 44 pm. Las gotas más pequeñas, así como las gotas más grandes que pueden no contener microcápsulas, se eliminan mediante una centrifugación suave. El lavado repetido con el mismo aceite elimina todas las gotas de líquido. Introduciendo la unidad de filtrado en un tubo de centrifugado adecuado en la orientación opuesta, las microcápsulas concentradas se extraen del tamiz.
Liberación del reactivo y amplificación directa del ADNc capturado en los microcompartimentos
El aceite con las microcápsulas se transfiere a una cámara de detección con un área de aproximadamente 2 cm2 y un espesor de capa de aproximadamente 50-1.000 pm. Las superficies opuestas de la cámara están hechas de material hidrófobo transparente. Las microcápsulas suspendidas en aceite de parafina son forzadas a formar una monocapa ya sea por la dimensión de la cámara de reacción o por otros medios como un tubo flexible. Así, las microcápsulas proporcionan recipientes de micro-reacción uniformemente espaciados para la posterior PCR digital.
Las microcápsulas se someten a ciclos de temperatura utilizando un elemento PELTIER 30*30*4,7mm, 19,3W (Quick-Ohm, Küpper & Co. GmbH, #QC-71-1,4-3,7M). La cámara de reacción se calienta 5 °C por encima de la temperatura de fusión de la cera durante al menos 2 minutos para liberar suavemente los reactivos secos en la matriz de hidrogel antes de la fusión de la agarosa y la transformación de las microcápsulas en gotas líquidas rodeadas de aceite. La amplificación de moléculas individuales de ADNc tiene lugar en los compartimentos de microrreacción resultantes. Las condiciones térmicas aplicadas son:
Desnaturalización inicial durante 2 min a 95 ° C (puede ser suficiente para liberar los reactivos y fundir las partículas de agarosa) seguido de 45 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 15 seg, fusión a 65 °C durante 15 seg y extensión a 72 °C durante 30 seg. Una vez completado el protocolo térmico, el contenido de la cámara se visualiza a temperatura ambiente en modo de luz blanca transmitida y fluorescencia con excitación Aexc = 470 nm y emisión de paso largo de >496 nm o excitación Aexc = 660nm y emisión de 670 nm. Se determina el número total de microcápsulas y el número de las que tienen una señal de fluorescencia por encima de un umbral de intensidad definido. El valor del umbral se deriva de las reacciones de amplificación realizadas anteriormente sin plantilla. El número de plantillas en la reacción se determina aplicando los números determinados de gotas positivas y negativas a la estadística de Poisson.
Realización 3: Fabricación de cápsulas de reactivos macroscópicos
En un enfoque alternativo, las cápsulas con un diámetro de aprox. 1,5 mm se generaron utilizando el siguiente protocolo.
La mezcla completa de reactivos de PCR (véase la realización 1) se liofilizó para formar pellas de reactivos de aprox.
0,8 mm de diámetro. El recubrimiento de cera se aplicó por inmersión de los gránulos individuales de reactivo en parafina fundida a una temperatura ligeramente superior al punto de fusión de la parafina. Después, las pellas
individuales recubiertas se expusieron a un tratamiento de plasma a baja temperatura con oxígeno para reducir el ángulo de contacto de la superficie de la cera. La agarosa de alta gelificación se biotiniló utilizando el mismo protocolo que en la realización 1 y las pellas se transfirieron a cavidades que contenían un volumen definido de agarosa que se fundió y se mantuvo cerca de la temperatura de gelificación de la agarosa. A continuación, se recogió la agarosa con una pipeta de vacío, se lavó y se recubrió con estreptavidina como se describe en la realización 1. La captura del reactivo y el lavado se realizaron de forma similar al protocolo de la realización 2, mientras que las cápsulas se incubaron suavemente y se lavaron con el tampón. La transferencia de las cápsulas a la fase no acuosa y el lavado con aceite mineral se realizó mediante el lavado de la cápsula.
La PCR se realizó de forma similar a la realización 2.
Realización 4: Fabricación y uso de microcápsulas de amplificación monodispersa basadas en pNlPAM para realizar un ensayo combinado de captura de objetivo / PCR digital
Este ejemplo describe el uso de microcápsulas de amplificación monodispersa basadas en pNIPAM para realizar un ensayo combinado de captura de objetivo de ácido nucleico / PCR digital. En esta aplicación, las microcápsulas proporcionan varias funcionalidades:
1. Proporcionan grupos de unión y la superficie exterior o interna y externa para capturar el objetivo del ensayo en el lugar, donde en los pasos posteriores se producirá la amplificación.
2. Proporcionan una matriz que puede llenarse con soluciones acuosas y vaciarse fácilmente aprovechando el comportamiento LCST del polímero pNIPAM.
3. El polímero también proporciona una matriz que permite llevar la fase acuosa contenida en las partículas a una emulsión de aceite. La ventaja de utilizar las microcápsulas como matriz es que se puede conseguir una distribución homogénea del tamaño de los volúmenes de agua en el aceite sin necesidad de utilizar un dispositivo de microfluidos u otro dispositivo técnico complicado.
4. Las microcápsulas de pNIPAM contienen todos los reactivos necesarios para llevar a cabo la amplificación de la PCR incrustados en núcleos impermeables al agua
En este experimento se utilizó como plantilla de PCR un ADNc creado en un paso separado. Cuando se utiliza el ARN como plantilla, las partículas podrían llenarse con una mezcla de reacción de RT-PCr y todo el proceso de RT-PCR podría realizarse con base en DAB.
Generación de soluciones de microcápsulas de pNIPAM
Componente 1 (fase acuosa de polimerización):
Creación de una mezcla de monómeros modificados con biotina:
Se creó un monómero acrílico modificado con biotina en una reacción separada. La mezcla de reacción consistía en el éster de ácido acrílico N-hidroxisuccinimida (un monómero de ácido acrílico aminoreactivo activado) y BiotinadPEG7-NH2 (un derivado de la biotina modificado con un brazo espaciador de PEG7 terminado con un grupo amino)
La mezcla de reacción se incubó durante 30 minutos a 25 °C. Esta mezcla se utilizó sin ninguna otra purificación en las reacciones de polimerización de pNIPAM.
Componentes por ml de mezcla de polimerización
Componente 2 (fase de reactivo):
También se preparó una solución madre de (2-hidroxipropil)-ciclodextrina (100 %) en agua libre de nucleasas utilizando Cavasol W7 o W8 (Sigma) y se almacenó a temperatura ambiente. La mezcla final para la PCR, que incluía todos los reactivos que se van a encapsular, contenía lo siguiente
• 1,25 U/pl de Hot Start Taq DNA Polymerase (biotechrabbit GmbH)
• 4,0 mM de dNTPs (biotechrabbit GmbH)
• 8,0 pM de cebador con sentido (5'-GCAGTGGCGCCCGAACAGG-3') (Metabion International AG)
• 8,0 pM de cebador antisentido (5'-ACTGACGCTCTCGCACCCATCT-3') (Metabion International AG)
• 8,0 pM de sonda Taq-Man ((5-CF647-CTCCGACGCAACGGGCTCG-BHQ3-3") (Metabion International AG) o 10x EvaGreen® Fluorescent DNA Stain (Jena Bioscience GmbH)
• Polifosfato de sodio (Merck)
• 9 % (p/v) (2-hidroxipropil)-ciclodextrina (Sigma)
La mezcla de reactivos se secó por pulverización utilizando el secador por pulverización Nano B-90 (Büchi Labortechnik GmbH) para obtener reactivos de tamaño nanopartícula. Posteriormente, las nanopartículas se secaron al vacío justo antes de dispersarlas en la tristearina Softenol 3118 (IOI Oleo GmbH) a una concentración máxima del 10 % (p/v) mediante un tratamiento ultrasónico a temperatura elevada (80-90 °C) utilizando el sonificador digital S-450D (Branson).
Componente 3 (fase de aceite para la polimerización):
Generación de microcápsulas monodispersas
Las micropartículas monodispersas con base en pNlPAM (= poli(N-isopropilacrilamida)) que contienen el reactivo de la tristearina pueden fabricarse en un proceso de un solo paso de formación de una emulsión doble utilizando un sencillo dispositivo de doble flujo-foco (Dolomite Microfluidics). En particular, dos chips de Dolomite Droplet Junction, uno de ellos de vidrio liso (hidrofílico, 100 pm) y otro de naturaleza hidrófoba (190pm) se montan en un soporte de virutas, utilizando el conector lineal para la entrada y salida de fluidos. Seleccionando este orden de viruta, se consigue una capacidad de humectación de la superficie del canal adecuada para la formación de gotas bifásicas estables de aceite/agua/aceite. El componente 2, con una relación de cera y reactivo de máximo 10:1, así como el componente 1 y el componente 3, se filtran previamente con un filtro de 2 pm antes de colocarlos en la bomba P (Mitos) del sistema de gotas. La unidad de control de temperatura para la viruta 1 se ajusta por encima de la temperatura de congelación del Softenol (75 °C) y a 25 °C para la viruta 2. Los conductos de fluido se ceban a 2.000 mbar durante 1 minuto utilizando el software de control de flujo. Ambos lados del conector lineal se conectan a al virutamediante la interfaz. Se ajusta una proporción de caudal de 1:10:100 entre el interior y el medio y el exterior respectivamente. Es necesario optimizar los caudales para la formación estable de gotas bifásicas. Los parámetros se supervisan con el software Dolomite Flow Control Advanced. El triglicérido que contiene el reactivo se cizalla en la primera unión produciendo gotas que se encapsulan en la segunda unión. Las gotas de O/W/O se recogen en un tubo a 20 °C para iniciar la congelación del triglicérido y la polimerización de la pNlPAM.
El proceso da lugar a microcápsulas de pNlPAM de aprox. 190 pm de diámetro con una incorporación de tristearina que contiene un volumen definido de mezcla de reacción seca.
Recuperación de las microcápsulas y transferencia a la fase acuosa
Una vez finalizado el proceso de polimerización, se retira suavemente la mayor cantidad posible de la fase oleosa del depósito de gotas con una pipeta, prestando atención a no retirar las partículas de pNlPAM. A continuación, se pipetean 50 pl de Triton X-100 al 1% (v/v) en agua sobre las partículas. El volumen se mezcla pipeteando hacia arriba y hacia abajo, de forma que las partículas no se peguen a las paredes de la viruta de gotas. El volumen se transfiere a un tubo Eppendorf y se repite el proceso una vez más. El proceso de transferencia puede controlarse con un microscopio binocular para evitar una pérdida importante de partículas en este paso.
A continuación, los tubos se centrifugan a 2.000 g durante 1 minuto. La fase oleosa (abajo) y la fase acuosa (arriba) están ahora bien separadas con una interfase que contiene las partículas. ahora se pipetean lentamente 200pl de un medio de gradiente de densidad (Optiprep, Axis shield) en el tubo. Es importante evitar una mezcla excesiva de la fase acuosa con el medio de gradiente de densidad. Lo ideal es que la mayor parte del medio del gradiente de densidad se deslice bajo la fase de partículas. Los tubos se centrifugan durante 2 minutos a 2.000 g. Después, la fase media de
gradiente de densidad se sitúa entre la fase de aceite y la fase de partículas. La fase de partículas puede ahora transferirse a un nuevo tubo. En este paso hay que tener cuidado de no transferir nada del volumen de aceite y un volumen lo más pequeño posible del medio de gradiente de densidad al nuevo tubo.
Se añade 1 m. de PBS, Triton X-100 al 0,1 % (v/v) al tubo que contiene las partículas. El volumen se mezcla y se centrifuga a 2.000 g durante 2 minutos. Las partículas se dispersan en el fondo del tubo. El sobrenadante se elimina dejando las partículas en el tubo. Se añade de nuevo al tubo 1 ml de PBS, Triton X-100 al 0,1 % (v/v) y se repite el proceso de lavado 5 veces. Finalmente, las partículas se recogen en PBS con Triton X-100 al 0,1 % (v/v).
Recubrimiento de microcápsulas monodispersas basadas en pNIPAM con estreptavidina
El recubrimiento de las microcápsulas con estreptavidina se realiza en el tampón de lavado utilizado anteriormente. La concentración de estreptavidina se selecciona de forma que no quede biotina accesible en la superficie de las microcápsulas. En cualquier caso, la estreptavidina se aplica en exceso para evitar el entrecruzamiento de las microcápsulas. La concentración óptima de estreptavidina se ha determinado en los ensayos preliminares con estreptavidina marcada mediante la determinación de una cobertura de la superficie de la meseta.
Mezclas de incubación:
El acoplamiento se realiza en un Eppendorf Thermoshaker con agitación de la solución a 350 rpm durante 30 min y 5 oscilaciones de temperatura entre 25°C y 37°C. Después del acoplamiento con estreptavidina, las microcápsulas se lavan para eliminar el exceso de estreptavidina. Se añade 1 ml de PBS, Triton X-100 al 0,1 % (v/v) al tubo que contiene las partículas. Se mezcla el volumen y se ajusta la temperatura a 40°C. Las partículas se encogen y el líquido interior se expulsa. A continuación, las partículas se centrifugan a 2.000 g y 40 °C durante 2 minutos. Las partículas se dispersan en el fondo del tubo. El sobrenadante se elimina dejando las partículas en el tubo. Se añade al tubo 1 ml de PBS a 20 °C, Triton X-100 al 0,1 % (v/v) . La partícula se hincha y absorbe el tampón de lavado. Se mezcla el volumen y se vuelve a ajustar la temperatura a 40 °C. Este proceso de lavado se repite 5 veces. Por último, las partículas se recogen en agua con Triton X-100 al 0,1 % (v/v) . Posteriormente, se determina la concentración de las microcápsulas mediante recuento al microscopio en una cámara de recuento DHC-No1(Neubauer Improved) (INCYTo ) o citométricamente en el citómetro de flujo CytoFlex (Beckman Coulter).
Preparación de la plantilla de ADNc del VIH-1 modificada con biotina
El ADNc biotinilado del VIH-1 se generó realizando una transcripción inversa en presencia del cebador inverso de la PCR. La mezcla de reacción se incubó durante 15 minutos a 50 °C y la reacción se detuvo calentando la mezcla de reacción a 70 °C durante 10 minutos.
Mezcla de incubación:
° ARN del VIH-1 purificado (~106 copias)
° 1|j M de cebador inverso biotinilado 5' Biotin-ACT GAC GCT CTC GCA CCC ATC T-3'
° tampón de reacción 1x (kit de síntesis de ADNcThermo Fisher)
° dNTPs (imM cada uno)
° Transcriptasa inversa RevertAid (200 U, Thermo Fisher)
La mezcla de reacción de ADNc se diluye con PBS Triton X-100 al 0,1 % para obtener una concentración final de ~104 cp/jl.
Captura de un ADNcd el VIH-1 en microcápsulas modificadas con estreptavidina
El ARN del VIH-1 marcado con biotina mediante transcripción inversa se captura en microcápsulas modificadas con estreptavidina
Se transfirieron ~100.000 microcápsulas de pNIPAM a un tubo de reacción y se calentaron a 50 °C para expulsar la fase líquida de las partículas. Las partículas se centrifugan brevemente a 2.000 g y se mantienen a 40 °C. Las partículas encogidas y peletizadas se adhieren fuertemente entre sí, de manera que el líquido expulsado puede ser eliminado completamente de las pellas. A continuación, se añade la siguiente mezcla de incubación a la pella
° 1 j l de mezcla de ADNc (~104 copias)
o 49 j l de PBS con Tritón X-100 al 0,1 %
Claims (15)
1. Una microcápsula para detectar y/o cuantificar un analito en una muestra, comprendiendo dicha microcápsula:
• reactivos capaces de generar y/o amplificar una señal en presencia de un analito que va a detectarse y/o cuantificarse; en los que dichos reactivos están en estado seco;
• una matriz porosa que rodea dichos reactivos, teniendo dicha matriz porosa medios para recibir un analito que debe detectarse y/o cuantificarse; en la que dichos reactivos en estado seco están separados de dicha matriz porosa por una barrera, por ejemplo, al menos una capa de barrera que abarca dichos reactivos.
2. La microcápsula de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho medio para recibir un analito que se va a detectar y/o cuantificar es un espacio poroso intersticial dimensionado para alojar una muestra líquida que contenga dicho analito, preferentemente dimensionado para alojar suficiente muestra líquida para disolver dichos reactivos secos.
3. La microcápsula de acuerdo con la reivindicación 2, en la que dicho medio para recibir un analito que se va a detectar y/o cuantificar es dicho espacio de poros intersticial para acomodar dicha muestra líquida o una combinación de dicho espacio de poros intersticial y uno o más agentes de captura que, tras la exposición de dichas microcápsulas a una muestra que rodea a dicha microcápsula y que contiene un analito que se va a detectar y/o cuantificar, son capaces de unirse selectiva y específicamente a dicho analito, en la que dicho uno o más agentes de captura están unidos a una porción de dicha microcápsula expuesta a los alrededores de dicha microcápsula.
4. La microcápsula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende:
• uno o varios núcleos impermeables, preferentemente impermeables al agua, que contengan y/o incrusten dichos reactivos capaces de generar y/o amplificar una señal, y así, separar dichos reactivos en estado seco de dicha matriz porosa;
• una concha hidrofílica porosa que forma dicha matriz porosa y que rodea dicho uno o varios núcleos impermeables; en la que dicho uno o más agentes de captura están unidos a dicha concha hidrofílica porosa.
5. La microcápsula de acuerdo con la reivindicación 4, en la que dicha concha hidrofílica porosa está compuesta por un agente formador de hidrogeles o está compuesta por un polímero termoresponsable, en el que, preferentemente,
- dicho agente formador de hidrogeles se selecciona del grupo que comprende a) polímeros sintéticos, tales como el poli(metil)metacrilato, la poliamida; b) polímeros con base en silicona, por ejemplo, polidimetilsiloxanos; c) polímeros naturales seleccionados entre polisacáridos, por ejemplo agarosa, quitina, quitosano, dextrano, alginato, carragenina, celulosa, fucoidán, laminar, gomas seleccionadas entre goma xantana, goma arábiga, goma ghatti, goma guar, goma de garrofín, goma tragacanto, goma karaya e inulina; polipéptidos, colágenos, gelatinas, poli-aminoácidos, tales como la poli-lisina; polinucleótidos; y combinaciones de los mismos; y
- dicho polímero termorresponsable es un polímero termorresponsable LCST, seleccionado preferentemente entre poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAm), poli[2-(dimetilamino)metacrilato de etilo] (pDMAEMA), hidroxipropilcelulosa, poli(vinilcaprolactamo) (P(VCL) y polivinilmetiléter o dicho polímero termorresponsable es un polímero termorresponsable que tiene una temperatura crítica superior de la solución (UCST), seleccionado preferentemente entre poli(N-acriloilglicinamida) (PNAGA), poli(alilamina)-co-poli(alilurea) y sus derivados, poli(metacrilamida), poli(N-acriloilglicinamida), poli(N-metacriloilglutamida), poli(acrilamida)-co-(acrilonitrilo) poli(sulfobetaína)s, poli(fosforilcolina)s.
6. La microcápsula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 - 5, en la que dicho núcleo impermeable está compuesto por un material adecuado para contener y/o incrustar dichos reactivos y en la que dicho material abarca dichos reactivos y los aísla de otras partes de dicha microcápsula, por ejemplo, dicha matriz porosa, en particular dicha concha hidrofílica, en la que dicho material se selecciona preferentemente de parafinas, triglicéridos, ceras, en particular ceras vegetales, por ejemplo cera de carnauba, ceras animales, por ejemplo cera de abejas, ceras derivadas del petróleo, ceras minerales.
7. La microcápsula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 - 6, en la que dicho núcleo impermeable contiene y/o incrusta dichos reactivos capaces de generar y/o amplificar una señal, en estado seco, y los separa de dicha matriz porosa.8*
8. La microcápsula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichos reactivos capaces de generar y/o amplificar una señal son
- reactivos capaces de realizar una amplificación de ácido nucleico con un analito de ácido nucleico y, en la que , preferentemente, dichos reactivos incluyen una molécula capaz de amplificar dicho analito en dicha muestra, tal como una enzima de amplificación, una o varias moléculas necesarias para facilitar la amplificación de dicho analito, tal como uno o varios cebadores de ácido nucleico, nucleótidos, sales y tampones, y, opcionalmente, uno o varios agentes de detección, o
- uno o varios agentes de detección para detectar una proteína o péptido o célula como analito en dicha muestra, en la que preferentemente dicho uno o varios agentes de detección se seleccionan de entre anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, ácidos nucleicos, incluyendo aptámeros, espiegelares, proteínas que no son de anticuerpos, tales como receptores , fragmentos de receptores, proteínas de afinidad, por ejemplo, estreptavidina, cada una de las cuales está opcionalmente marcada con una molécula informadora adecuada, tal como un colorante, una enzima, un catalizador químico o una mezcla de reactivos capaces de iniciar una reacción química que produzca una señal detectable ópticamente o de otro modo que indique la presencia de una proteína o péptido o célula como un analito que se va a detectar.
9. La microcápsula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en la que dichos agentes de captura se seleccionan entre anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, ácidos nucleicos, incluyendo aptámeros, espiegeladores, proteínas que no son de anticuerpos y que son capaces de unirse específicamente a un analito o complejo de analitos, tales como receptores, fragmentos de receptores, proteínas de afinidad, por ejemplo estreptavidina, elementos químicos tañ como la biotina, un Strep-tag®, la digoxigenina, el dinitrofenol, un ácido nucleico o un análogo de ácido nucleico o elementos químicos similares capaces de unirse específicamente, con una afinidad comprendida entre Kd = 10'8 a 10'13 *5 M, a anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, ácidos nucleicos, incluyendo aptámeros, espiegeladores, proteínas que no sean de anticuerpos, tales como receptores, fragmentos de receptores, proteínas de afinidad, por ejemplo, estreptavidina, o se seleccionan entre estructuras hidrófobas capaces de unir específicamente moléculas hidrófobas o moléculas con grupos hidrófobos , en la que, preferentemente, dichas estructuras hidrófobas tienen un logD superior a 2 en las condiciones en las que se realiza dicha detección de dicho analito.
10. La microcápsula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 - 9, en la que dichos reactivos capaces de realizar una amplificación de ácido nucleico incluyen además uno o varios agentes de detección, en la que dicho uno o varios agentes de detección se seleccionan de entre anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, ácidos nucleicos, incluyendo aptámeros, espiegámeros, proteínas que no son de anticuerpos, tales como receptores , fragmentos de receptores, proteínas de afinidad, por ejemplo, estreptavidina, cada una de las cuales puede estar marcada con una molécula informadora adecuada, tal como un colorante, una enzima, un catalizador químico o una mezcla de reactivos capaces de iniciar una reacción química que produzca una señal detectable ópticamente o de otro modo que indique la presencia de un analito que deba detectarse.
11. Un método de detección y/o cuantificación de un analito en una muestra, comprendiendo dicho método:
i. Proporcionar una microcápsula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -10;
ii. exponer dicha microcápsula a una muestra acuosa que rodea dicha microcápsula y que contiene o se sospecha que contiene un analito que debe detectarse y/o cuantificarse;
iii. retirar dicha microcápsula de dicha muestra acuosa y transferir dicha microcápsula a una fase no acuosa; iv. disolver o interrumpir dicha microcápsula, preferentemente disolviendo o interrumpiendo dichos núcleos impermeables solos o dichos núcleos impermeables junto con dicha envoltura hidrofílica porosa, para generar una gota acuosa en un medio no acuoso, en la que dicha gota acuosa contiene dichos reactivos capaces de generar y/o amplificar una señal en presencia de un analito que se va a detectar y/o cuantificar, en forma disuelta;
v. Realizar una reacción de generación y/o amplificación de una señal dentro de dicha gota acuosa, en la que sólo se genera y/o amplifica una señal si dicho analito ha estado presente en dicha muestra, en la que, preferentemente, dicha reacción realizada en el paso v. es una reacción de amplificación de ácidos nucleicos o una reacción de amplificación de señales, en la que, más preferentemente, dicha reacción realizada en el paso v. es una reacción de amplificación de ácidos nucleicos seleccionada de entre PCR, o de entre las reacciones de amplificación isotérmica tales como TMA, NASBA, LAMP, 3SR, SDA, RCA, LCR, RPA, NEAR.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que en el paso iv. dicha microcápsula, preferentemente dicho núcleos impermeables solos o dicho núcleos impermeables junto con dicha envoltura hidrofílica porosa, se disuelven o se interrumpen por medios seleccionados entre los medios mecánicos, la escisión química, el cambio de temperatura, el cambio de pH, el cambio de disolvente, la aplicación de un campo eléctrico, la aplicación de un campo magnético, la exposición de dicha microcápsula a la radiación electromagnética, en particular a la luz de una gama definida de longitudes de onda, tal como la luz ultravioleta, preferentemente un cambio de temperatura, más preferentemente un aumento de temperatura.
13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 - 12, en el que dicha microcápsula es una microcápsula como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 5 - 10, y dicha concha hidrofílica porosa está compuesta por un polímero termoresponsable LCST.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicho método incluye, entre los pasos ii. y iii., un paso adicional
ii.a calentar dicha microcápsula hasta una temperatura superior a la temperatura crítica inferior de la solución (LCST) de dicho polímero termorresponsable LCST y, posteriormente, enfriar o dejar enfriar dicha microcápsula hasta una temperatura inferior a la temperatura crítica inferior de la solución (LCST) de dicho polímero termorresponsable LCST, con el fin de lograr un enriquecimiento del analito unido a dicha microcápsula, y realizar dicho paso ii.a n veces, en el que n un número entero de 1 a 1.000, preferentemente de 1 a 500, y/o un paso adicional
ii.b lavar dicha microcápsula en una solución acuosa para eliminar el analito no unido,
en el que si el paso ii.b se realiza además del paso ii.a, se realiza antes o después del paso ii.a.
15. Un método de preparación de microcápsulas para detectar y/o cuantificar un analito en una muestra, siendo dichas microcápsulas como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-10, comprendiendo dicho método los pasos:
a) proporcionar una solución acuosa de reactivos capaz de generar y/o amplificar una señal en presencia de un analito que se va a detectar y/o cuantificar, en la que dicha solución acuosa de reactivos, además de dichos reactivos, comprende además, opcionalmente, uno o varios agentes protectores para proteger uno o varios de los reactivos capaces de generar y/o amplificar en dicha solución acuosa;
b) secar, preferentemente por atomización o liofilización, dicha solución acuosa de a), generando así reactivos secos capaces de generar y/o amplificar una señal, preferentemente en forma nanoparticulada; c) incorporar dichos reactivos secos a un material adecuado para contener y/o incrustar dichos reactivos, de manera que dicho material abarque dichos reactivos y los aísle, en la que dicho material se selecciona preferentemente entre parafinas, triglicéridos, ceras, en particular ceras vegetales, por ejemplo, cera de carnauba, ceras animales, por ejemplo, cera de abeja, ceras derivadas del petróleo, ceras minerales; d) generar micropartículas a partir del producto de c) mediante el secado, preferentemente por pulverización o liofilización de dicho producto de c), generando así núcleos impermeables;
e) incorporar dichos núcleos impermeables a una envoltura hidrofílica porosa que forme una matriz porosa y que rodee dicho uno o varios núcleos impermeables mediante
■ incorporación de dichos núcleos impermeables a un agente formador de hidrogeles e inducción a dicho agente formador de hidrogeles para formar un hidrogel alrededor de dichos núcleos impermeables, o
incorporación de dichos núcleos impermeables a precursores/monómeros de un polímero termorresistente e ■inducción de dichos precursores/monómeros para polimerizar en un polímero termosensible alrededor de dichos núcleos impermeables, o
■incorporación de dichos núcleos impermeables a un polímero termorresponsable preformado y permitir que dicho polímero termorresponsable preformado se forme alrededor de dichos núcleos impermeables;
f) Opcionalmente, acoplar uno o varios agentes de captura a dicha envoltura hidrofílica porosa que rodea a dicho núcleo impermeable, generando así microcápsulas con uno o varios agentes de captura adheridos, en la que dicho uno o varios agentes de captura, tras la exposición de dichas microcápsulas a una muestra que rodea a dicha microcápsula y que contiene un analito que se va a detectar y/o cuantificar, son capaces de unir selectiva y específicamente dicho analito;
g) opcionalmente, recoger dichas microcápsulas;
h) opcionalmente, lavar y/o secar, preferentemente por liofilización, dichas microcápsulas.
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