JP2023506261A - 複数の生物学的液体サンプル中の目的分析物を検出および／または定量化する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、複数の生物学的液体サンプル中の目的分析物を検出および／または定量化する方法に関する。さらに、本発明は、複数のサンプル中の目的分析物を検出および／または定量化するための方法を行うためのキットおよびカートリッジに関する。前記方法は、２つのサブプロセス、つまり１つのサンプル特異的サブプロセスおよび１つの一般的サブプロセスを含む。前者は、サンプルの各々が、後に識別され、他のサンプルと区別され得るように、特異的に標識される（本明細書中で「コード化される」とも呼ばれることがある）手順または条件に別々に供される部分である。後者は、すべてのサンプルが、分析物の検出を可能にする同じ操作を受ける部分である。

Description

本発明は、複数の生物学的液体サンプル中の目的分析物を検出および／または定量化する方法に関する。

発明の背景
診断学の分野において、サンプルをプールするストラテジーおよびサンプルにバーコードを付けるストラテジーは確立されており、多数の生物学的サンプルを処理する際に通常使用される。

診断学の分野におけるサンプルプーリングストラテジーは、通常、規定体積の種々のサンプルの混合プールを試験することに基づく。通常、サンプルを２つ組で入手し、２つ組の一方を保存のために維持し、２つ組の他方を混合プールに加える。そのような混合プールが陽性と判定された場合、陽性サンプルを最終的に特定するために、同じプール由来の保存された２つ組サンプルを個々に試験する。陽性の結果をもたらした混合プール由来の個々の２つ組サンプルを試験するプロセスは、「リフレキシング（ｒｅ－ｆｌｅｘｉｎｇ）」とも呼ばれることがある。特に、試験されるそれぞれの分析物について陰性の結果を提供すると通常予想されるサンプルにおいて、そのようなプーリングストラテジーは、安価なアプローチを提供する。しかしながら、プーリングの程度は、試験の感度に直接影響を及ぼし、リフレキシングは、１つの起源から少なくとも２つ組サンプルを得ること、およびそのような２つ組サンプルの慎重かつ制御された保存、ならびに複雑な試験ロジスティックスを必要とする。

サンプルインデクシングと呼ばれることがあるサンプルバーコーディングは、マルチプレックスシーケンシングおよびマルチプレックス分析に向けてサンプルにラベルを付けるために多用されるアプローチである。サンプル中のすべての核酸を同じ配列タグで標識し、得られたライブラリーを他のライブラリーとともにプールし、単一のランで並行して配列決定する。その後、サンプル特異的インデックスによって、ソフトウェアがサンプル特異的データセット内の多重化された配列データを分離することが可能になる。

分子バーコーディングは、サンプル中の各分子がＰＣＲ増幅の前に異なるユニークな配列で標識されるという点でサンプルインデクシングと異なる。出発物質中（すなわち、サンプル内）の各核酸は、ユニークな配列、すなわち「分子バーコード」（「ＭＢＣ」）で標識されていると、配列分析ソフトウェアは、２つ組のリードおよびＰＣＲエラーを除外して、ユニークなリードを報告できる。サンプルバーコーディングと分子バーコーディングは、特異的な分子配列ラベルで核酸がタグ化されるという共通点がある。

別の種類のバーコーディング法としては、ハイスループットフローサイトメトリー用の細胞ベースの多重化法である蛍光細胞バーコーディング（ＦＣＢ）がある。バーコードが付けられたサンプルをひとまとめにして染色し、取得することができることため、染色のばらつきおよび抗体の消費が最小限に抑えられ、必要なサンプル体積が少なくなる（Ｋｒｕｔｚｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１ “Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｃｅｌｌ ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ”，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｃｙｔｏｍ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ６，Ｕｎｉｔ ６．３１）。

特に、カートリッジベースの試験の状況、特に１カートリッジ／１サンプルアプローチの状況では、カートリッジのサイズおよびコストに起因して、処理能力に関して限界がある。そのような種類のカートリッジの例は、ＣｅｐｈｅｉｄのＧｅｎＥｘｐｅｒｔ、ＢｉｏｃａｒｔｉｓのＩｄｙｌｌａ、Ａｂｂｏｔｔのｍ－Ｐｉｍａなどである。より高い処理能力は、通常、同一の装置リソースを追加し、一度に多くのカートリッジを実行することによって達成される。また、単一のプラットフォームで複数のサンプルを処理できるカートリッジも存在する。しかしながら、そのようなカートリッジは、通常、例えば、サンプルを種々の分析物について試験する場合に、個々のサンプルについて別個の分析プロセスを行うように設計されているので、そのようなカートリッジは、それぞれのサンプルに対する個々の分析ツールに似た、構成要素の構成物に過ぎない。そのようなセットアップは、複数のサンプルを並行して処理する必要があるとき（例えば、同じ分析物について多数のサンプルを試験するとき）にも有用であり、そのようなセットアップは、それぞれの装置の処理能力の向上、または単に分析カートリッジにサンプルをロードする際の作業時間の短縮に役立つ。そのようなツールの一例は、ＢＤＭＡｘ Ｓｙｓｔｅｍである。既存のカートリッジベースの診断ツールに関する包括的なレビューは、Ｒｅｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．２０１８；“Ｓｙｎｄｒｏｍｉｃ ａｎｄ Ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－Ｃａｒｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｓｔｉｎｇ”，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １（１）：９７－１１３にある。
処理能力を高め、装置をより活用するのと同時に、廃棄物の発生を抑え、コストを低減することが当該分野で引き続き求められている。また、ハードウェアおよび試薬のリソースを最大限に利用できるように、１つのシステム内で複数のサンプルを単一プロセスで処理することも引き続き求められている。さらに、当該分野では、分析される個々のサンプルに個々の識別を割り当てることで、そのような個々に割り当てられた識別可能な多数のサンプルに対して単一の検出反応を行うことを容易にすることができるプロセスを提供することが必要とされている。

Ｋｒｕｔｚｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１ "Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｃｅｌｌ ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ"，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｃｙｔｏｍ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ６，Ｕｎｉｔ ６．３１ Ｒｅｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．２０１８；"Ｓｙｎｄｒｏｍｉｃ ａｎｄ Ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－Ｃａｒｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｓｔｉｎｇ"，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １（１）：９７－１１３

発明の要旨
本発明は、これらのニーズおよび関連するニーズに対処する。１つの態様において、本発明は、複数の生物学的液体サンプル中の目的分析物を検出および／または定量化する方法に関し、前記方法は、２つのサブプロセス、つまり１つのサンプル特異的サブプロセスおよび１つの一般的サブプロセスを含む。

本明細書中で「サンプル特異的プロセス部分」、「特異的プロセス部分」または「特異的部分」とも呼ばれることがある「サンプル特異的サブプロセス」は、サンプルの各々が、後に識別され、他のサンプルと区別され得るように、特異的に標識される（本明細書中で「コード化される」とも呼ばれることがある）手順または条件に別々に供される部分である。

「一般的サブプロセス」または「一般的プロセス部分」もしくは「一般的部分」は、すべてのサンプルが、分析物の検出を可能にする同じ操作を受ける部分である。そのような一般的部分は、いかなるサンプル特異的な手順、取り扱いまたは操作も含まず、通常、サンプルの正体に関係なく調査中のすべてのサンプルで行われる。

１つの実施形態において、サンプル特異的プロセス部分は、以下の工程：
－目的分析物を含むと疑われる複数の異なる生物学的液体サンプル、および異なって標識された複数の多孔性微粒子サブセットを任意の順序で別々に提供する工程であって、前記複数の多孔性微粒子サブセットにおいて、前記サブセットの各々は、他のサブセットから分離している、工程；
－前記別個の微粒子サブセットの各々をそれぞれ１つの生物学的液体サンプルに別々に曝露することで、各サンプルが、水性環境において、特異的に標識された１つの多孔性微粒子サブセットによって吸収されることが可能になることによって、前記異なる生物学的サンプルの各々を特異的に標識する工程；
－多孔性微粒子の各サブセットを前記水性環境から非水性環境に別々に移す工程
を含む。

１つの実施形態において、前記一般的プロセス部分は、以下の工程：
－前記非水性環境中の異なって標識された多孔性微粒子サブセットを一緒に混合することで、異なって標識された複数の多孔性微粒子サブセットの懸濁液が生成される工程；
－前記異なって標識された複数の多孔性微粒子サブセットの前記懸濁液に対して、前記目的分析物を検出するための検出反応を行う工程；および
－前記異なって標識された懸濁微粒子サブセットのいずれかに前記目的分析物が存在する場合、前記目的分析物を検出および／または定量化する工程
を含む。

本明細書中で使用される句「前記複数のサブセットにおいて、前記多孔性微粒子サブセットの各々は、他のサブセットから分離している」および用語「別個のサブセット」は、そのような微粒子サブセットが他のサブセットから物理的に分離しているシナリオのことを指すと意味される。１つの実施形態において、互いから「分離」している２つのサブセットは、異なる位置に存在し、かつ／または巨視的に識別可能であり得、かつ／または好ましくはサンプル間の混合または相互汚染が起き得ないように、物理的障壁によって隔てられている。ゆえに、「別個のサブセット」はそれぞれ、そのようなサブセットの別個の取扱いを可能にする形態で提供されることが好ましい。異なるサブセットの物理的な分離は、例えば、そのようなサブセットのまわりの障壁によって達成され得る。単純な実施形態では、そのような別個のサブセットは、独自の容器またはコンパートメントに配置され得る。通常、本発明の実施形態によると、（分析物の）検出および／または定量化の反応を行う前に、それらのサブセットは、互いから分離されている。使用中、例えば、検出反応中、より詳細には、そのような検出反応の一般的部分の間に、微粒子ライブラリーのいくつかまたはすべてのサブセットが、最終的に合わされるようになることがある。驚くべきことに、本発明者らは、そのような混合物において、異なる微粒子が、非水相に移されたことによって互いから隔離されるようになるならば、それらを合わせても／混合しても、溢出またはそれらの異なる微粒子間の「クロストーク」が実際に生じないことを見出した。結果として、それぞれの微粒子が混合されるようになったという事実にもかかわらず、（分析物の存在について試験される）サンプル間の相互汚染も生じない。本明細書中で使用される用語「異なって標識された複数の多孔性微粒子サブセット」は、「微粒子のライブラリー」とも呼ばれることがある。

本明細書中で使用される用語「生物学的液体サンプル」とは、例えば、目的分析物をさらなる分析に利用できるようにするためまたはさらなる分析の対象となるようにするために、さらに処理されていてもよいし、さらに処理されていなくてもよい、生物の身体から得られた液体サンプルのことを指す。好ましくは、そのような「生物学的液体サンプル」は、血液、血漿、血清、尿、汗、涙、痰、リンパ液、精液、腹水、羊水、胆汁、母乳、滑液、腹水、心膜液、脳脊髄液、乳糜および尿から選択され、より好ましくは、前記生物学的液体サンプルは、血漿である。好ましくは、そのような生物学的液体サンプルは、さらに処理され、例えば、本発明に係る方法に供される前に溶解もしくは消化され得るか、またはその他の方法で処理され得る。例として、生物学的液体サンプルが血漿である場合、そのような血漿は、さもないとその後の検出反応を干渉し得る成分を除くためにさらに溶解および／または消化されていることがある。例えば、目的分析物が、特定の核酸である場合、生物学的液体サンプル、例えば、血漿は、本発明に係る方法に供される前に、まず、プロテアーゼおよび他の好適な酵素で消化されて、望まれない任意のタンパク質またはペプチド、ならびに脂質または他の望まれない成分が除去され得る。ゆえに、本明細書中で使用される「生物学的液体サンプル」は、上述の体液のいずれかから得られた抽出物のことも指すことがあり；それは、例えば、好適な抽出法によって、例えば、細胞の破壊（必要であれば）、脂質、タンパク質および望まれない核酸の除去（必要であれば）、ならびに核酸の精製および／または特定の核酸の濃縮を用いて上述の体液のいずれかから得られた核酸抽出物であり得る。いくつかの実施形態において、核酸抽出物は、エタノールまたは別の好適なアルコールを用いて生成されていることがある。

本明細書中で使用されるとき、（微粒子の）「ライブラリー」という用語は、複数の微粒子または微粒子の一群のことを指すと意味され、そのような複数の微粒子または微粒子の一群または微粒子のライブラリーには、少なくとも２つの異なるタイプのそのような微粒子が存在し、それらは、本明細書中で「サブセット」とも呼ばれることがある。好ましい実施形態では、製作済みの前駆体微粒子の少なくとも２つのサブセット、好ましくは、製作済みの前駆体微粒子の３つまたはそれを超えるサブセットが存在し、各サブセットは、前記サブセット内の前記微粒子に付着された、前記微粒子内に含まれる、またはその他の方法で前記微粒子と会合された異なる標識成分を有し、前記少なくとも２つまたはそれを超える微粒子サブセットは、各サブセットに付着された、各サブセット内に含められた、またはその他の方法で各サブセットと会合された、それぞれの標識成分が異なる。そのような異なるサブセットのライブラリーにおいて、それぞれのサブセットは、通常および好ましくは、互いから離れて、例えば、異なる容器内に、保存される。これは、本明細書中で使用されるような用語「別個のサブセット」が、他のサブセットから物理的に分離している、微粒子の一群または微粒子サブセットのことを指すと意味されることを意味する。
発明の詳細な説明

１つの態様において、本発明は、複数の生物学的液体サンプル中の目的分析物を検出および／または定量化する方法に関し、前記方法は、サンプル特異的プロセス部分の後に一般的プロセス部分を含み；
前記サンプル特異的プロセス部分は、以下の工程：
－目的分析物を含むと疑われる複数の異なる生物学的液体サンプル、および異なって標識された複数の多孔性微粒子サブセットを任意の順序で別々に提供する工程であって、前記複数のサブセットにおいて、前記サブセットの各々は、他のサブセットから分離している、工程；
－前記別個の微粒子サブセットの各々をそれぞれ１つの生物学的液体サンプルに別々に曝露することで、各サンプルが、水性環境において、特異的に標識された１つの多孔性微粒子サブセットによって吸い上げられることが可能になることによって、前記異なる生物学的サンプルの各々を特異的に標識する工程；
－多孔性微粒子の各サブセットを前記水性環境から非水性環境に別々に移す工程
を含み；
前記一般的プロセス部分は、以下の工程：
－前記非水性環境中の異なって標識された多孔性微粒子サブセットを一緒に混合することで、異なって標識された複数の多孔性微粒子サブセットの懸濁液が生成される工程；
－前記異なって標識された複数の多孔性微粒子サブセットの前記懸濁液に対して、前記目的分析物を検出するための検出反応を行う工程；および
前記異なって標識された懸濁微粒子サブセットのいずれかに前記目的分析物が存在する場合、前記目的分析物を検出および／または定量化する工程
を含む。

好ましくは、前記別個の微粒子サブセットの各々をそれぞれ１つの生物学的液体サンプルに別々に曝露する前記工程において、前記別個の微粒子サブセットの各々が、それぞれ１つの生物学的サンプルおよび化学的または生化学的な検出反応を行うための検出組成物に任意の順序で曝露され、各微粒子サブセットが、曝露されたそれぞれの生物学的サンプルおよび検出組成物を吸い上げる。

１つの態様において、本発明はまた、特に先のパラグラフにおいて概説されたような方法に従って、複数の生物学的液体サンプル中の目的分析物を検出および／または定量化する方法に関し、そのサンプル特異的プロセスは、
ａ．目的分析物を含むと疑われる複数の別個の生物学的液体サンプルおよび複数の多孔性微粒子を任意の順序で別々に提供する工程であって；前記多孔性微粒子の各々は、多孔性マトリックスを有し、かつ所定体積の液体を前記多孔性マトリックスの中に受け取るように、好ましくは、分析物が存在する場合、分析物を吸い上げるように、構成されており；前記複数の多孔性微粒子には、提供される異なる微粒子サブセットがあり、各微粒子サブセットは、それぞれのサブセットに付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、特異的な標識成分を特徴とし；前記提供する工程において、提供される異なる微粒子サブセットの数は、少なくとも、提供される別個の生物学的液体サンプルの数と同じであり、さらに、前記提供する工程において、異なる微粒子サブセットは、互いとは別個に提供され；必要に応じて、前記異なる別個の微粒子サブセットは、それらのそれぞれの多孔性マトリックスに、分析物の化学的または生化学的な検出反応を行うための試薬を含む検出組成物を含む、工程；
ｂ．別個の各微粒子サブセットを厳密に１つの別個の生物学的液体サンプルに曝露し、それにより、別個の各微粒子サブセットが、所定体積の厳密に１つの別個の生物学的液体サンプルとインキュベートすることおよびそのようなサンプルまたはその一部を吸い上げること、ならびに必要に応じて、前記サンプル中に分析物が存在する場合、微粒子のマトリックス内またはマトリックス上に分析物を蓄積することが可能になる工程；およびさらに必要に応じて、前記異なる別個の微粒子サブセットが、工程ａ）において提供されるとき、分析物の化学的または生化学的な検出反応を行うための試薬をまだ含んでいない場合、別個の各微粒子サブセットを、分析物の化学的または生化学的な検出反応を行うための試薬を含む検出組成物に曝露し、それにより、別個の各微粒子サブセットが前記試薬を受け取ることが可能になる工程；
ｃ．各微粒子サブセットを別々に非水相に移し、前記サブセットの個々の製作済み微粒子のまわりの水相の一部または全部を除去することにより、前記分析物を検出するための複数の別個の隔離された反応空間サブセットを作る工程であって、その反応空間は、サンプルおよび分析物の化学的または生化学的な検出反応を行うための前記試薬を含む水相を含み、その反応空間は、前記微粒子の空隙体積に限定される、工程
を伴う。

１つの実施形態において、一般的プロセスは、
ｄ．前記非水相において別個の異なる微粒子サブセットを混合して、前記異なる微粒子サブセットのすべてが、前記非水相において異なる微粒子の懸濁液を形成し；前記混合された異なる微粒子サブセットを、分析物の化学的または生化学的な検出反応を行うために必要な条件に供し；前記目的分析物のそのような検出反応を行い；前記目的分析物が前記それぞれのサブセットの任意のメンバーに存在する場合、それぞれの微粒子サブセットにおける前記検出反応において生成されたシグナルを用いて、前記異なる微粒子サブセットのいずれかに前記目的分析物が存在する場合、前記目的分析物を検出および／または定量化する工程
を含む。

１つの実施形態において、前記方法は、以下の工程
ｅ）工程ｄ）において前記目的分析物が検出された微粒子サブセットを特定することによって、工程ａ）において提供された前記複数のサンプルのうちのどのサンプルが前記目的分析物を含んでいるかを判定する工程
をさらに含む。

１つの実施形態において、工程ｅ）における微粒子サブセットの特定は、それぞれの微粒子サブセットに付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、特異的な標識成分を用いて行われる。

１つの実施形態において、工程ｂ）は、どの別個の微粒子サブセットがどのサンプルに曝露されているかまたは曝露されたかを示す第１の相関関係の記録を生成するサブ工程をさらに含み、工程ｄ）は、前記検出反応においてどの微粒子サブセットでシグナルが生成されたかを示す第２の相関関係の記録を生成するサブ工程を含む。

１つの実施形態において、工程ｅ）は、前記第１および第２の相関関係の記録を参照すること、ならびに前記記録を連結することによって行われることで、工程ａ）において提供された前記複数のサンプルのうちのどのサンプルが前記目的分析物を含むのかの判定が可能になる。

１つの実施形態において、前記多孔性微粒子の各々は、
（ｉ）前記多孔性ポリマーマトリックスを形成するかまたは前記ポリマーマトリックスである、ポリマーまたはポリマー混合物；または
（ｉｉ）前記多孔性ポリマーマトリックス上に固定化された、少なくとも１つのイオン化可能基または複数のイオン化可能基であって、前記イオン化可能基は、前記前駆体微粒子のまわりの周囲条件に従って電荷を変更できる、イオン化可能基；または
（ｉｉｉ）前記多孔性ポリマーマトリックス上に固定化された少なくとも１つの荷電基または複数の荷電基；または
（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの組み合わせ
によって、目的分析物の蓄積を可能にする多孔性マトリックスを有する。

１つの実施形態において、前記多孔性微粒子の各々は、多孔性マトリックスを有し、前記多孔性マトリックスに付着された、好ましくは、可逆的に付着された、分析物特異的試薬（ＡＳＲ）を含み、そのような分析物特異的試薬は、目的分析物の濃縮および／または前記分析物が関わる特異的なシグナル増幅反応もしくは標的増幅反応を可能にし；前記分析物特異的試薬は、目的分析物に特異的に結合することができる。好ましい実施形態において、分析物特異的試薬は、特異的な標的増幅反応を可能にするが、好ましくは、特異的なシグナル増幅反応を可能にしない。特に、いくつかの実施形態において、分析物特異的試薬は、結合アッセイ、例えば、ｂＤＮＡアッセイを可能にせず、かつ／またはそれらのアッセイにおいて使用されない。

本明細書中で使用されるとき、用語「分析物特異的試薬」（「ＡＳＲ」）は、目的分析物を特異的に標的化または認識することができる試薬のことを指すと意味される。そのような特異的な標的化またはそのような特異的な認識は、そのような分析物特異的試薬がそのような目的分析物に特異的に結合する能力またはそれと特異的に反応する能力に現れる。１つの実施形態において、分析物特異的試薬は、アプタマー、シュピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒｓ）、核酸オリゴマーおよび核酸プライマーを含む核酸；抗体または抗体フラグメント；分析物または分析物複合体に特異的に結合することができる非抗体タンパク質、および親和性タンパク質から選択される。好ましい実施形態において、分析物特異的試薬は、核酸、特に、核酸オリゴマーおよび核酸プライマーから選択される。核酸プライマーは、特に、核酸増幅を行うのに適している。１つの実施形態において、分析物特異的試薬が、核酸プライマーであるとき、そのような分析物特異的試薬は、実際には、その後増幅される（および検出される）目的分析物内の領域に隣接するプライマー対である。必要に応じて、（分析物特異的試薬であるプライマー対の）そのような実施形態において、そのような分析物特異的試薬は、プライマーとともに提供される検出可能なプローブであって、それぞれのプライマーおよび生じる増幅産物の検出を可能にする検出可能なプローブをさらに含み得る。

別の実施形態において、前記多孔性微粒子の各々は、多孔性マトリックスを有するが、前述のパラグラフにおいて定義されたような分析物特異的試薬（ＡＳＲ）を含まない。この実施形態では、それらの微粒子における分析物の濃縮または蓄積は、多孔性マトリックスのみによって達成される。

本明細書中で使用される用語「シグナル増幅反応または標的増幅反応」とは、化学的または生化学的な検出反応のことを指し、その検出反応では、分析物の検出のために使用されるシグナルが増幅されるか、または検出および／もしくは定量化されるべき標的（すなわち分析物）がまず増幅され、続いて検出される。標的増幅反応の典型例は、核酸増幅反応、例えば、ＰＣＲである。シグナル増幅反応の典型例は、免疫化学反応、例えば、イムノアッセイである。本発明の好ましい実施形態において、本発明に係る化学的または生化学的な検出反応は、標的増幅反応であり、シグナル増幅反応ではない。特に、本発明に係る化学的または生化学的な検出反応は、ｂＤＮＡアッセイではない。

１つの実施形態において、分析物特異的試薬は、アプタマー、シュピーゲルマーを含む核酸；抗体または抗体フラグメント；分析物または分析物複合体に特異的に結合することができる非抗体タンパク質、例えば、レセプター、レセプターフラグメントおよび親和性タンパク質から選択され；好ましくは、前記分析物特異的試薬は、核酸、特に、核酸オリゴマーおよび核酸プライマーから選択される。

１つの実施形態において、前記多孔性微粒子の各々は、多孔性マトリックスに付着された、好ましくは、可逆的に付着された、同じ分析物特異的試薬を有する。１つのそのような実施形態において、そのような同じ分析物特異的試薬は、微粒子に付着された唯一の分析物特異的試薬である。

本明細書中で使用される用語「同じ分析物特異的試薬」は、すべてが単一の特定の分析物に対して同じ特異性を有する様々な分析物特異的試薬分子が存在するシナリオのことを指すと意味される。例として、分析物特異的試薬が、特定の分析物に特異的な抗体である場合、そのような分析物特異的試薬と「同じ」であるすべての分析物特異的試薬は、そのような分析物に対して同じ特異性を有する。通常、多くの場合において、これは、そのような「同じ」分析物特異的試薬が、その構造および／または配列に関して同一であること、または、同じ単一の特定の分析物に対する特異性がこれらのばらつきに影響されないままであるような程度にだけ構造および配列が異なることを意味する。

１つの実施形態において、前記複数の多孔性微粒子（または多孔性微粒子のライブラリー）には、異なる微粒子サブセットが存在し、
各サブセットは、
－前記サブセットの前記微粒子に付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、異なる標識成分を有し；
前記異なるサブセットのすべてが、
前記サブセットの前記微粒子に付着されたまたはそれに含まれる同じ分析物特異的試薬を有し、前記分析物特異的試薬は、１つの目的分析物に特異的であり；
前記異なる微粒子サブセットは、付着されたまたは含まれる分析物特異的試薬に関して同一であるが、
各サブセットの前記微粒子に付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、それぞれの標識成分が異なり；
各サブセットは、前記それぞれの標識成分によって明確に定義され、識別可能である。

前記異なるサブセットのすべてが、前記サブセットの前記微粒子に付着された同じ分析物特異的試薬を有し、前記分析物特異的試薬が、１つの目的分析物に特異的である、１つの実施形態において、前記方法は、複数の生物学的液体サンプル中の１つの目的分析物を検出および／または定量化する方法であり、提供される、好ましくは工程ａ）において提供される異なる微粒子サブセットの数は、提供される別個の生物学的液体サンプルの数と等しい。

別の実施形態において、前記複数の多孔性微粒子（または多孔性微粒子のライブラリー）には、前記微粒子に付着されたまたはそれに含まれるいくつかの異なる分析物特異的試薬が存在する。

そのような実施形態（すなわち、前記複数の多孔性微粒子において、前記微粒子に付着されたまたはそれに含まれるいくつかの異なる分析物特異的試薬が存在する実施形態）では、異なる微粒子サブセットが存在し、
各サブセットは、
－前記サブセットの前記微粒子に付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、異なる標識成分を有し；
さらに、前記複数の多孔性微粒子の中に、異なるクラスの微粒子サブセットが存在し、サブセットの各クラスは、
前記微粒子の多孔性マトリックスに付着されたまたは前記微粒子に含まれる異なる分析物特異的試薬を有し；好ましくは、少なくとも２つの異なるクラスの微粒子サブセット、より好ましくは、少なくとも３つまたはそれを超える異なるクラスの微粒子サブセットが存在し；
前記異なる微粒子サブセットは、各サブセットの前記微粒子に付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、それぞれの標識成分が異なり；各微粒子サブセットは、１クラスの微粒子サブセットの一部を形成し；各サブセットは、それぞれの標識成分およびそれぞれの分析物特異的試薬によって明確に定義され、識別可能であり；
前記異なるクラスの微粒子サブセットは、前記微粒子の多孔性マトリックスに付着されたそれぞれの分析物特異的試薬が異なり；前記異なるクラスの各々は、いくつかの微粒子サブセットを含み、そのサブセットのすべてが、付着されたまたは含まれる同じ分析物特異的試薬を有する。

そのような実施形態（すなわち、前記複数の多孔性微粒子において、前記微粒子に付着されたまたはそれに含まれるいくつかの異なる分析物特異的試薬が存在する実施形態）において、前記方法は、複数の生物学的液体サンプル中の１つより多い目的分析物を検出および／または定量化する方法であり、提供される、好ましくは工程ａ）において提供される異なる微粒子サブセットの数は、提供される別個の生物学的液体サンプルの数に、検出されるべき目的分析物の数を乗算した数と等しく、検出されるべき目的分析物の数と同じ数の微粒子サブセットのクラスが提供される、好ましくは工程ａ）において提供される。

微粒子が、多孔性マトリックスを有し、所定体積の液体を前記多孔性マトリックスの中に受け取るように構成されており、その微粒子に付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、特異的な標識成分を有し、その標識成分によって、そのような微粒子が特定の微粒子サブセットに属すると分類できる限り、数多くのタイプの微粒子が本発明に従って使用され得ることに注意されたい。好適な微粒子は、分析物特異的試薬（ＡＳＲ）を有してもよいし、有しなくてもよい。本出願人のＢｌｉｎｋ ＡＧによって並行して出願された“Ａ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｐｒｅｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｔｈｅｒｅｏｆ”というタイトルのＥＰ出願（代理人整理番号Ｂ３３０１６ＥＰ）に開示されているような微粒子も、本発明の実施形態、特に、１つより多い分析物が検出されるような実施形態において特に適していることが判明している。

１つの実施形態において、前記多孔性マトリックスは、ポリマーまたはポリマー混合物によって形成された多孔性ポリマーマトリックスであり、好ましくは、前記多孔性ポリマーマトリックスは、架橋されていないポリマーまたはポリマー混合物から構成され、より好ましくは、前記多孔性ポリマーマトリックスを形成する前記ポリマーまたはポリマー混合物は、アガロースまたはアガロースとゼラチンとの組み合わせから構成され、より好ましくは、アガロースとゼラチンとの前記組み合わせにおいて、前記アガロースは、０．１％（ｗ／ｖ）～４％（ｗ／ｖ）の範囲内で存在し、前記ゼラチンは、０．１％（ｗ／ｖ）～２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは、０．５％（ｗ／ｖ）～２０％（ｗ／ｖ）の範囲内で存在する。１つの特定の実施形態において、前記多孔性ポリマーマトリックスにおけるアガロースの濃度は、０．５％（ｗ／ｖ）であり、ゼラチンの濃度は、１％（ｗ／ｖ）～２％（ｗ／ｖ）の範囲内である。ポリマーまたはポリマー混合物が架橋されていない実施形態は、異なる状態間、例えば、ゲル状態とゾル状態との間の切り換えに特に優れ、汎用性がある。

１つの実施形態において、前記標識成分は、少なくとも２つの異なる色素の混合物、好ましくは、少なくとも２つの蛍光色素であり、前記少なくとも２つの異なる色素、好ましくは、前記少なくとも２つの蛍光色素は、前記少なくとも２つの異なる色素のそれぞれの規定の比および／または規定の量で前記前駆体微粒子の各サブセット上に存在し、前駆体微粒子の前記異なるサブセットは、前記少なくとも２つの異なる色素のそれぞれの比および／または量に関して互いと異なり、ゆえに、前駆体微粒子のそれぞれのサブセットに付着されたまたはそれに含まれる前記少なくとも２つの異なる色素のそれぞれの比および／または量によって前駆体微粒子の前記異なるサブセットの区別が可能になる。

分析物を検出および／または定量化する方法の１つの実施形態において、前記目的分析物は、核酸であり、前記検出反応は、核酸増幅であり、前記検出組成物は、緩衝液、モノヌクレオシド三リン酸、増幅酵素、例えば、好適な核酸ポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、および増幅産物、例えば、増幅された核酸を検出するための核酸色素、および必要に応じて、１対またはそれを超える増幅プライマー、およびさらに必要に応じて、そのようなプライマーおよび／またはプローブが、前記微粒子に付着されたまたはそれに含まれる分析物特異的試薬（ＡＳＲ）としてまだ提供されていない場合は、それぞれの分子プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ、分子ビーコンなど）を含む、核酸増幅を行うための組成物である。

本発明に係る方法の別の実施形態において、前記目的分析物は、タンパク質または他の非核酸分子であり、前記検出反応は、免疫化学検出反応であり、前記検出組成物は、そのような免疫化学検出反応を行うための組成物であり、前記方法において２つの別個の成分として提供され：前記検出組成物の第１の成分は、免疫化学検出反応を行うために必要な試薬、例えば、緩衝液、および前記免疫化学検出反応において分析物特異的試薬（ＡＳＲ）として使用される一次抗体、抗体フラグメントまたは非抗体タンパク質と同じ分析物に特異的であって、好適なレポーター酵素に結合された、二次抗体または二次抗体フラグメント；および必要に応じて、前記タンパク質分析物または他の非核酸分析物に特異的に結合することができる一次抗体、抗体フラグメントまたは非抗体タンパク質が、前記微粒子に付着されたまたはそれに含まれる分析物特異的試薬（ＡＳＲ）としてまだ提供されていない場合は、そのような一次抗体、抗体フラグメントまたは非抗体タンパク質を含み；前記検出組成物の第２の成分は、前記好適なレポーター酵素に適した基質を検出試薬として含み、その基質は、前記レポーター酵素によって反応されると、検出可能になる、好ましくは、光学的に検出可能になる、より好ましくは、蛍光によって検出可能になる。

そのような実施形態、すなわち、検出組成物が２つの別個の成分として、すなわち第１の成分および第２の成分として提供される実施形態では、微粒子サブセットは、第１の成分に曝露された後、そのような第２の成分に曝露され、それら２つの曝露が順々に行われることが好ましい。それら２つの曝露は、中間の好適な洗浄工程、例えば、微粒子サブセットを好適な洗浄緩衝液で洗浄する工程によって互いからさらに隔てられていてもよい。

本発明に係る方法の別の実施形態において、前記目的分析物は、酵素または他の臨床化学分析物であり、前記検出反応は、化学的または生化学的な（例えば、酵素的な）検出反応であり、前記検出組成物は、そのような化学的または生化学的な検出反応を行うための組成物であり、そのサンプルは、検出試薬と接触され、両方が本発明に係る微粒子と接触され、前記検出組成物は、そのような化学的または酵素的な反応（ｃｒｅａｔｉｏｎ）に適した基質を検出試薬として含み、その基質は、それぞれの分析物と反応すると、検出可能になる、好ましくは、光学的に検出可能になる、より好ましくは、蛍光によって検出可能になる。

１つの実施形態では、前記目的分析物を検出および定量化する前記工程において、前記分析物の定量化は、
ａ）デジタル核酸増幅、特にデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；
ｂ）リアルタイム定量的核酸増幅、特にリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；
ｃ）免疫化学検出法、特にデジタル免疫化学検出法、例えば、デジタルイムノアッセイ、例えば、デジタル酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）；
ｄ）免疫化学検出法、特に、核酸増幅と組み合わされるデジタル免疫化学検出法、例えば、イムノポリメラーゼ連鎖反応；特にデジタル免疫－ＰＣＲ；および
ｅ）ａ）～ｄ）のいずれかの組み合わせ
から選択される方法によって行われ；
目的分析物が、核酸である場合、定量化は、方法ａ）もしくはｂ）のいずれかまたはａ）とｂ）との組み合わせを用いて行われ；分析物が、タンパク質、ペプチドまたは他の非核酸分析物である場合、定量化は、方法ｃ）またはｄ）のいずれかを用いて行われる。

すでに上記で概説したように、本明細書中で使用される「生物学的液体サンプル」は、例えば、目的分析物をさらなる分析に利用できるようにするためまたはさらなる分析の対象となるようにするために、さらに処理されていてもよいし、さらに処理されていなくてもよい、生物の身体から得られた液体サンプルであり得る。好ましくは、そのような「生物学的液体サンプル」は、血液、血漿、血清、尿、汗、涙、痰、リンパ液、精液、腹水、羊水、胆汁、母乳、滑液、腹水、心膜液、脳脊髄液、乳糜および尿から選択され、より好ましくは、前記生物学的液体サンプルは、血漿である。好ましくは、そのような生物学的液体サンプルは、さらに処理され、例えば、本発明に係る方法に供される前に溶解もしくは消化され得るか、またはその他の方法で処理され得る。例として、生物学的液体サンプルが血漿である場合、そのような血漿は、さもないとその後の検出反応を干渉し得る成分を除くためにさらに溶解および／または消化されていることがある。例えば、目的分析物が、特定の核酸である場合、生物学的液体サンプル、例えば、血漿は、本発明に係る方法に供される前に、まず、プロテアーゼおよび他の好適な酵素で消化されて、望まれない任意のタンパク質またはペプチド、ならびに脂質または他の望まれない成分が除去され得る。ゆえに、本明細書中で使用される「生物学的液体サンプル」は、上述の体液のいずれかから得られた抽出物のことも指すことがあり；それは、例えば、好適な抽出法によって、例えば、細胞の破壊（必要であれば）、脂質、タンパク質および望まれない核酸の除去（必要であれば）、ならびに核酸の精製および／または特定の核酸の濃縮を用いて上述の体液のいずれかから得られた核酸抽出物であり得る。いくつかの実施形態において、核酸抽出物は、エタノールまたは別の好適なアルコールを用いて生成されていることがある。

細胞の破壊または崩壊は、物理的および／または化学的な方法によって達成することができ、その主な目的は、細胞壁および／または細胞膜を破壊することである。破壊方法は、主にサンプルの特性に基づき、この目的のために、広範囲のツールおよびアプローチが単独で使用されるか、または組織／細胞の破壊を達成するために組み合わされる。溶解酵素、カオトロピック剤および種々のタイプの洗浄剤が、化学的溶解の主要な成分である一方で、機械的方法は、粉砕、剪断、ビーズビーティングおよび衝撃を与えることによって細胞を破壊する。１つの手法が良好な結果をもたらさなかったとしても、別の手法が成功すると判明する場合があることに注意されたい。ある特定の場合において、浸透圧ショック法が、一般的な核酸精製プロトコル、例えば、フェノール－クロロホルム抽出およびビーズビーティングよりも良好な結果をもたらした。細胞破壊のための別のアプローチは、異なる方法を組み合わせて使用することである。好例は、酵素的溶解に対する場合であり、多くのプロトコルが、保護性のタンパク質骨格からＮＡを遊離するためにプロテアーゼを使用する。また、新しいタンパク質不含ＮＡを保護するために溶液中に遊離してくる細胞ヌクレアーゼの不活性化が極めて重要である［１３］。細胞壁およびまたは細胞膜を可溶化するため、および細胞内のヌクレアーゼを不活性化するために、単一の溶液中で洗浄剤とカオトロピック塩との組み合わせを用いてもよい。他方で、機械的な破壊は、細胞の構成物を抽出するために力を利用する。粉砕の古典的な例は、乳鉢および乳棒の使用であり、それは、今日では、液体窒素の使用（サンプルが許容するとき）によって最適化されている。細胞壁は、超音波処理またはキャビテーションによって誘発される急激な圧力変化によって作り出される衝撃波によっても破壊され得る。細胞の破壊に利用可能な他の機械的ツールは、剪断であり、剪断は、細胞に穴を開ける接線力、および種々のガラスビーズまたは鋼ビーズを用いて堅い細胞壁を破裂させるビーズビーティングを使用する。

さらなる態様において、本発明は、複数の生物学的液体サンプル中の目的分析物を検出および／または定量化するため、特に、本発明に係る方法を行うためのキットに関し、前記キットは、
－複数の微粒子を含む複数の容器であって、各容器は、前記複数の多孔性微粒子サブセットを含み、各サブセット内の前記多孔性微粒子の各々は、多孔性マトリックスを有し、かつ所定体積の液体を前記多孔性マトリックスの中に受け取るように構成されており；各微粒子サブセットは、それぞれのサブセットに付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、特異的な標識成分を特徴とし、好ましくは、前記微粒子は、上記でさらに定義されたとおりであり；必要に応じて、前記微粒子を洗浄するための水性洗浄試薬を含む、容器；
－目的分析物を検出するための検出組成物を含む容器であって；前記検出組成物は、分析物の化学的または生化学的な検出反応を行うための試薬を含み；前記検出組成物は、核酸増幅を行うための組成物であるか、または免疫化学検出反応を行うための組成物である、容器；
－前記異なる微粒子サブセットの各々が生物学的液体サンプルに曝露された後、前記異なる微粒子サブセットを非水相に移すため、および非水相において別個の異なる微粒子サブセット懸濁液を生成するための、非水相を含む容器；
－別個の異なる微粒子サブセット懸濁液を前記非水相において一緒に混合するための混合容器であって、前記異なる微粒子サブセット懸濁液のすべてが、その後検出反応に供される、異なる微粒子の単一の懸濁液を前記非水相において形成する、混合容器；
－検出反応を行うための容器
を含む。

１つの実施形態において、前記多孔性微粒子の各々は、その多孔性マトリックスに付着された、好ましくは、可逆的に付着された、分析物特異的試薬（ＡＳＲ）を有するか、または分析物特異的試薬（ＡＳＲ）を含み、そのような分析物特異的試薬は、目的分析物の濃縮および／または前記分析物が関わる特異的なシグナル増幅反応もしくは標的増幅反応を可能にし；前記分析物特異的試薬は、目的分析物に特異的に結合することができる。本発明の好ましい実施形態において、分析物特異的試薬は、前記分析物が関わる特異的な標的増幅反応を可能にするが、シグナル増幅反応を可能にしない。特に、いくつかの実施形態において、分析物特異的試薬は、結合アッセイ、例えば、ｂＤＮＡアッセイを可能にせず、かつ／またはそれらのアッセイにおいて使用されない。

１つの実施形態において、前記分析物特異的試薬は、アプタマー、シュピーゲルマーを含む核酸；抗体または抗体フラグメント；分析物または分析物複合体に特異的に結合することができる非抗体タンパク質、例えば、レセプター、レセプターフラグメントおよび親和性タンパク質から選択され；好ましくは、前記分析物特異的試薬は、核酸、特に核酸オリゴマーおよび核酸プライマーから選択される。

１つの実施形態において、前記目的分析物は、核酸であり、前記検出反応は、核酸増幅であり、前記検出組成物は、緩衝液、モノヌクレオシド三リン酸、増幅酵素、例えば、好適な核酸ポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、および増幅産物、例えば、増幅された核酸を検出するための核酸色素、および必要に応じて、１対のプライマーが、前記微粒子に付着されたまたはそれに含まれる分析物特異的試薬（ＡＳＲ）としてまだ提供されていない場合、そのようなプライマーを含む、核酸増幅を行うための組成物である。

１つの実施形態において、前記目的分析物は、タンパク質または他の非核酸分子であり、前記検出反応は、免疫化学検出反応であり、前記検出組成物は、そのような免疫化学検出反応を行うための組成物であり、前記キットにおいて２つの別個のコンパートメントまたは容器に提供され；前記検出組成物は、免疫化学検出反応を行うために必要な試薬、例えば、緩衝液、および前記免疫化学反応において分析物特異的試薬（ＡＳＲ）として使用される一次抗体、抗体フラグメントまたは非抗体タンパク質と同じ分析物に特異的であって、好適なレポーター酵素に結合された、二次抗体または二次抗体フラグメントを第１のコンパートメントまたは容器に含み；必要に応じて、前記タンパク質分析物または他の非核酸分析物に特異的に結合することができる一次抗体、抗体フラグメントまたは非抗体タンパク質が、前記微粒子に付着されたまたはそれに含まれる分析物特異的試薬（ＡＳＲ）としてまだ提供されていない場合は、そのような一次抗体、抗体フラグメントまたは非抗体タンパク質を含み；前記検出組成物は、前記好適なレポーター酵素に適した基質を検出試薬として第２のコンパートメントまたは容器に含み、その基質は、前記レポーター酵素によって反応されると、検出可能になる、好ましくは、光学的に検出可能になる、より好ましくは、蛍光によって検出可能になる。

１つの実施形態において、前記多孔性微粒子の各々は、その多孔性マトリックスに付着された同じ分析物特異的試薬を有するか、または同じ分析物特異的試薬を含む。

１つの実施形態において、前記複数の多孔性微粒子の中に、異なる微粒子サブセットが存在し、
各サブセットは、
前記サブセットの前記微粒子に付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、異なる標識成分を有し；
前記異なるサブセットのすべてが、
前記サブセットの前記微粒子に付着されたまたはそれに含まれる同じ分析物特異的試薬を有し、前記分析物特異的試薬は、１つの目的分析物に特異的であり；
前記異なる微粒子サブセットは、付着されたまたは含まれる分析物特異的試薬に関して同一であるが、
各サブセットの前記微粒子に付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、それぞれの標識成分が異なり；
各サブセットは、前記それぞれの標識成分によって明確に定義され、識別可能であり、別個の容器に提供されている。

１つの実施形態において、前記キットは、複数の生物学的液体サンプル中の１つ（すなわち、多くとも１つ）の目的分析物を検出および／または定量化するためのキットであり、前記キットに提供される異なる微粒子サブセットの数は、提供される別個の生物学的液体サンプルの数と等しい（好ましくは、少なくとも等しい）（またはいくつかの実施形態では、前記キットに提供される異なる微粒子サブセットの数は、提供される別個の生物学的液体サンプルの数より多く、かついずれの場合でも、それより少なくない）。

別の実施形態では、前記複数の多孔性微粒子の中に、前記微粒子に付着されたまたはそれに含まれるいくつかの異なる分析物特異的試薬が存在する。

そのような実施形態では、異なる微粒子サブセットが存在し、
各サブセットは、
前記サブセットの前記微粒子に付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、異なる標識成分を有し；
さらに、前記複数の多孔性微粒子の中に、異なるクラスの微粒子サブセットが存在し、サブセットの各クラスは、
前記微粒子の多孔性マトリックスに付着されたまたは前記微粒子に含まれる異なる分析物特異的試薬を有し；好ましくは、少なくとも２つの異なるクラスの微粒子サブセット、より好ましくは、少なくとも３つまたはそれを超える異なるクラスの微粒子サブセットが存在し；
前記異なる微粒子サブセットは、各サブセットの前記微粒子に付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、それぞれの標識成分が異なり；各微粒子サブセットは、１クラスの微粒子サブセットの一部を形成し；各サブセットは、それぞれの標識成分およびそれぞれの分析物特異的試薬によって明確に定義され、識別可能であり、別個の容器に提供されており；
前記異なるクラスの微粒子サブセットは、前記微粒子の多孔性マトリックスに付着されたまたは前記微粒子に含まれるそれぞれの分析物特異的試薬が異なり；前記異なるクラスの各々は、いくつかの微粒子サブセットを含み、そのサブセットのすべてが、付着されたまたは含まれる同じ分析物特異的試薬を有する。

そのような実施形態において、前記キットは、複数の生物学的液体サンプル中の１つより多い目的分析物を検出するためのキットであり、前記キットに提供される異なる微粒子サブセットの数は、提供される別個の生物学的液体サンプルの数に、検出されるべき目的分析物の数を乗算した数と等しく（好ましくは、少なくとも等しく）、前記キットには、検出されるべき目的分析物の数と同じ数（好ましくは、少なくとも同じ数）の微粒子サブセットのクラスが提供される；（またはいくつかの実施形態では、前記キットに提供される異なる微粒子サブセットの数は、実際には、提供される別個の生物学的液体サンプルの数に、検出されるべき目的分析物の数を乗算した数より多いことさえあり、いずれの場合でも、それより少ないことはなく；そのようなキットの実施形態では、少なくとも、検出されるべき目的分析物の数と同じ数の微粒子サブセットのクラスが提供され、いずれの場合でも、そのような実施形態において提供される微粒子サブセットのクラスの数は、検出されるべき目的分析物の数より少なくない）。

さらなる態様において、本発明は、複数の生物学的液体サンプル中の目的分析物を検出および／または定量化する方法を行うためのカートリッジにも関し、前記方法は、上記でさらに定義されたとおりである。

１つの実施形態において、カートリッジは、複数のサンプル特異的モジュール、複数の保存チャンバー、非水相を保存するための少なくとも１つの非水相チャンバー、および一体化した単一の混合・検出チャンバーまたは別個の混合チャンバーと別個の検出チャンバーとの組み合わせを備え；
各サンプル特異的モジュールは、それ自体の別個のサンプル入口を有するサンプルコンパートメントを含み、各サンプル特異的モジュールは、厳密に１つの生物学的サンプルだけをそれぞれのサンプルコンパートメントの中に別々に受け取るように構成されており；各サンプル特異的モジュールは、微粒子を前記サンプルコンパートメントの中に受け取るようにさらに構成されており、前記微粒子は、上記でさらに定義されたとおりであり；各サンプル特異的モジュールは、水性環境から非水性環境への前記微粒子の相間移動を容易にするようにさらに構成されている。

用語「サンプル特異的モジュール」は、特定の（具体的な）サンプルとともに使用されるように明確に指定されたカートリッジ内の区画のことを指すと意味される。したがって、それは通常、サンプルコンパートメントを含み、厳密に１つの生物学的サンプルだけをそれぞれのサンプルコンパートメントの中に別々に受け取るように構成されている。「サンプル特異的モジュール」は、サンプル特異的モジュールにそれぞれのサンプルを加えることを可能にするそれ自体の特定のサンプル入口を有し、さらなるコンパートメントおよび／または接続チャネルをさらに含み得る。１つの実施形態において、前記複数のサンプル特異的モジュールは、それぞれのサンプルコンパートメントに複数の多孔性微粒子を含み；前記多孔性微粒子の各々は、多孔性マトリックスを有し、かつ所定体積の液体を前記多孔性マトリックスの中に受け取るように構成されており；そのサンプルコンパートメント内の各サンプル特異的モジュールは、前記複数の微粒子の異なるサブセットを含み、各微粒子サブセットは、それぞれのサブセットに付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、特異的な標識成分を特徴とし；かつ／または前記少なくとも１つの非水相チャンバーは、非水相、例えば、オイルを含む。

１つの実施形態において、前記サンプル特異的モジュールの各々は、液相、好ましくは、水性の液相から微粒子を機械的に分離するための手段、例えば、フィルターをさらに含み；前記手段は、水性環境から非水性環境への前記微粒子の相間移動を容易にするように構成されている。

１つの実施形態では、前記複数の保存チャンバーに、異なる群の保存チャンバーが存在し、第１の群の保存チャンバーは、分析物の化学的または生化学的な検出反応を行うための試薬を含み、また別個で、１つまたはいくつかのさらなる群の保存チャンバーが、溶解緩衝液、分析物特異的試薬への分析物の結合を容易にするための緩衝液、および微粒子を洗浄するための洗浄緩衝液のうちの１つまたはいくつかを別々に含む。

１つの実施形態において、上記カートリッジは、バルブ機構を含み、前記バルブ機構は、ポンプに取り付けられるように構成されており、前記バルブ機構は、ａ）～ｃ）のいずれかをｄ）と連続的にまたは同時に流体接続させ；ここで、ａ）は、上記保存チャンバーのうちの１つまたはいくつかであり；ｂ）は、一体化した単一の混合・検出チャンバー、または別個の混合チャンバーと別個の検出チャンバーとの組み合わせのいずれかであり；ｃ）は、前記少なくとも１つの非水相チャンバーであり；ｄ）は、上記サンプル特異的モジュールのいずれかである。

本発明者らは、複数の生物学的液体サンプル中の目的分析物を検出および／または定量化する方法を提供した。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、本発明に係る新規方法が、原則として、２つの根本的に異なる部分、すなわち、サンプル特異的部分および一般的部分（本明細書中でそれぞれ「特異的プロセス部分」または「特異的部分」および「一般的プロセス部分」とも呼ばれることがある）を含む新規アッセイに基づくと考えている。

上記プロセスのサンプル特異的部分では、個々のサンプルをコード化し、分析物が個々のサンプル中に存在する場合、その分析物を濃縮するのと同時に、望まれない材料をサンプルから除去する。その後、そのようにコード化され、個々のコード／標識によって識別可能にされたサンプルを、非水性環境における微粒子によって定義される一種の水性ドロップレットとして孤立させる。そのようなドロップレットは、分析物が存在する場合、分析物の検出を行う反応空間として働く。

一般的に言えば、上述の目的は、個別に標識された特定のタイプまたはサブセットの微粒子を用いて各サンプルをそれぞれインタロゲートする（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）（および事実上、「標識する」または「コード化する」）ことによって達成され、「微粒子」は、本明細書中で「ビーズ」とも呼ばれることがあり、その個別に標識された特定のタイプまたはサブセットの微粒子は、それぞれの微粒子に付着された、それに含まれるまたはその他の方法でそれと会合された規定の特定の標識を有する。本発明の実施形態によると、複数の異なるタイプの微粒子（または「ビーズ」）（本明細書中で「微粒子サブセット」とも呼ばれることがある、そのような「タイプの微粒子」）が存在することがあり、その微粒子は、それに付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された特定の標識を特徴とする。本発明の実施形態によると、その微粒子は、所定体積の液体サンプルを受け取ることにより、分析物がサンプル中に存在する場合、その分析物を吸い上げ、必要に応じてそれに結合し、濃縮することができる。微粒子への分析物の結合は、目的分析物を含むと疑われるサンプルに結合緩衝液の存在下において微粒子を曝露することによって促進され得る。そのような結合緩衝液は、それぞれの微粒子のマトリックスおよび／またはその微粒子に付着されたもしくはそれに含まれる任意の分析物特異的試薬（ＡＳＲ）への分析物の結合を促進する条件を確立する目的に適う。

さらに、本発明の実施形態によると、個々の微粒子は、サンプルを吸い上げられる内部体積、および目的分析物が存在する場合にその目的分析物を検出するために必要な試薬を有する。サンプル中の分析物が、吸い上げられ（または「吸収され」）、場合によっては、必要に応じて好適な結合緩衝液の存在下において、微粒子によって結合または濃縮（または「吸着」）され、必要であればそれぞれの洗浄工程が行われた後、続いてその微粒子を、その微粒子によって吸い上げられる適切な検出組成物に曝露する。本明細書中で使用される用語「検出組成物」とは、分析物の化学的または生化学的な検出反応を行うための試薬を含む組成物のことを指す。好ましい実施形態において、「化学的または生化学的な検出反応」は、核酸増幅または免疫化学検出反応である。そのような反応を行うための好適な「検出組成物」は、上記でさらに概説されている。そのような検出組成物が、その微粒子によって吸い上げられたら、生物学的液体サンプル（またはそのようなサンプルの一部）および好適な検出組成物を含む微粒子ができあがる。続いて、その微粒子内に含まれていないが微粒子の外側に位置する残留液体が、例えば、濾過、遠心分離、振盪または他の機械的撹拌およびそれらの組み合わせによって除去され、次いで、それぞれの微粒子を非水性液体中に入れることによって、それらの微粒子を孤立させる。その非水性液体は、それぞれの微粒子を孤立させ、互いと相互作用するのを防ぐ。そのようなプロセスは、複数のサンプルに対して繰り返され、各サンプルは、特定の標識成分によって特異的に標識された異なる特定の微粒子サブセットによってインタロゲートされる。このプロセスの結果は、別個のサブセット微粒子調製物、すなわち、互いから分離されている各サブセット内に個々の微粒子を含む別個のサブセット調製物であり、個々のサブセット微粒子の調製物には、それぞれの個々の標識成分が割り当てられているので、そのようなサブセット微粒子調製物が特定のサンプルに明確に割り当てられることが可能になる。

この段階において、すなわち、微粒子を孤立させた後、異なるタイプの微粒子の調製物、すなわち、異なるサンプルに対応する異なるサブセットが混合され、一緒にプールされ得る。また、この段階では、個々の微粒子は、孤立されており、もはや互いと相互作用できず、非水相に取り囲まれた個々の水性ドロップレットになっているので、曝露された異なるサンプルに対応する異なるタイプの微粒子の調製物を合わせてプールにし、続いてそのようなプールを、微粒子内で検出反応を行うために必要な条件に供し得る。そのような検出反応は、例えば核酸増幅であり得るか、または免疫化学反応であり得る。そのような検出反応は、上記方法の上述の一般的部分に相当する。そのような微粒子が、分析物と疑われるサンプルによってインタロゲートされている限り、そのような検出反応は、任意の微粒子、すなわち、任意のタイプの微粒子に対して行われるので、「一般的」である。換言すれば、そのような一般的部分は、そのような微粒子が曝露されるサンプルのタイプに関係なく、すべての微粒子に対して行われ、好ましくは、単一プロセスとして同時に行われる。

検出反応の結果として各微粒子内で生成されたシグナルが、検出され、それぞれの微粒子に付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、それぞれの特定の標識成分に割り当てられる。どの標識成分が、どのサンプルに対応するかは既知であるので、生成されたそれぞれのシグナルを効果的にそれぞれのサンプルと互いに関係づけることができ、その結果として、試験されるサンプル中に目的分析物が存在するかまたは存在したか否かを判定できる。

事実上、上記微粒子は、微量のそれぞれのサンプルが閉じ込められ、個別に分析され得る、個々の反応空間または「リアクター」となる。ゆえに、分析物の単一分子が単一の微粒子に分配され得るため、限界希釈が提供され、本発明に係る方法をデジタル形式で行うことが可能になるような様式で、本発明に係る方法の実施形態を行うことが事実上可能である。Ｓｙｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３（３）：ｐｐ．４４４－４４９も参照のこと。そのような形式により、絶妙な感度およびそれぞれのサンプル中の分析物の良好な定量化が可能になる。
本発明の実施形態において使用される通常の試薬は、以下のとおりである：

まず第１に、本明細書中で「ビーズ」とも呼ばれることがある微粒子自体である。これらは、高度に多孔性であり、多孔性マトリックスを有し、所定体積の液体をその多孔性マトリックス内に受け取るように構成されている。通常、それらは、液体サンプルが吸い上げられ、多孔性マトリックス内に収容されたとき微粒子の機械的安定性および化学的完全性を提供するポリマーまたはポリマー混合物から構成される。好ましくは、マトリックスポリマーは、室温で安定した粒子および高温でドロップレットを提供するゾル－ゲルの特色を示し得る。例として、微粒子が、ゲル状態、すなわち、ゲル相または準固相にある場合、液相に懸濁液を形成する。しかしながら、その後、その微粒子が、ゾル状態、すなわち、可溶性または準液体の状態に変換された場合、液相にエマルジョンを形成し、懸濁液がエマルジョンに変わる。ポリマーまたはポリマー混合物が架橋されていない実施形態は、異なる状態間、例えば、ゲル状態とゾル状態との間の切り換えに特に優れ、汎用性がある。

本明細書中で使用される用語「微粒子」は、平均寸法がマイクロメートルの範囲内である粒子のことを指すと意味される。１つの実施形態において、本発明に係る微粒子は、およそ１μｍ～２００μｍ、好ましくは、５μｍ～１５０μｍ、より好ましくは、１０μｍ～１００μｍという平均サイズまたは平均寸法または平均直径を有する。１つの実施形態において、本発明に係る微粒子は、球形または卵形または楕円形、好ましくは、球形であり、上述の寸法とは、そのような球形、卵形または楕円形の微粒子の平均直径のことを指す。１つの実施形態において、微粒子は、（球形の）ドロップレットの形状を有する。別の実施形態において、本発明に係る微粒子は、球体または準球体であり、すなわち、球の形状（またはそれにほぼ近い形状）を有し、そのような球は、上述の寸法の平均直径を有する。通常、本発明に係る微粒子は、多孔性であり、水性サンプルを受け取るための空隙体積、および分析物を特異的に検出するための反応空間を提供するための空隙体積を有する多孔性ポリマーマトリックスを有する。

好ましい実施形態において、本発明に係る微粒子は、液体サンプル中に存在する任意の分析物とともにそのようなサンプルを吸い上げ、それを多孔性マトリックス内に収容することができるだけでなく、目的分析物または分析物クラス（例えば、核酸）がサンプル中に存在する場合、それらに結合するかまたはそれらを濃縮するために必要な機能を促進するかまたは提供し、それにより、そのような分析物の微粒子内の局所濃度を高める結合メンバー（例えば、前記多孔性ポリマーマトリックスに付着された分析物特異的結合分子、例えば、分析物特異的試薬（ＡＳＲ）；前記多孔性ポリマーマトリックス上に固定化された１つのイオン化可能基または複数のイオン化可能基であって、前記イオン化可能基は、前記前駆体微粒子のまわりの周囲条件に従って電荷を変更できるイオン化可能基；前記多孔性ポリマーマトリックス上に固定化された１つの荷電基または複数の荷電基；それらのいずれかの組み合わせ）を実際に含む。

さらに、本発明の好ましい実施形態において、微粒子は、それぞれの（タイプの）微粒子に付着された、それに含まれるまたはその他の方法でそれと会合された特定の標識をさらに特徴とする。

本出願人のＢｌｉｎｋ ＡＧによって並行して出願された‘‘Ａ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｐｒｅｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｔｈｅｒｅｏｆ’’というタイトルのＥＰ出願（代理人整理番号Ｂ３３０１６ＥＰ）に開示されているような微粒子は、本発明の実施形態、特に、１つより多い分析物が各サンプル中で検出されるような実施形態においても特に適していることが判明している。

いくつかの実施形態において、溶解緩衝液は、目的分析物をサンプルから放出するためまたはそのような目的分析物をサンプル内で利用可能にするために必要であり得る。そのような溶解緩衝液は、細胞、特に細胞膜の溶解、または細胞小器官の溶解を引き起こし得る作用物質を含み得る。その溶解の結果として、目的分析物だけに接近可能になり得る。いくつかの実施形態において、溶解緩衝液は、単独でまたはさらなる緩衝液ととともに、微粒子における目的分析物の濃縮または結合を促進し得る。微粒子における目的分析物の濃縮または結合を促進するそのようなさらなる緩衝液は、本明細書中で「結合緩衝液」とも呼ばれることがある。そのような「結合緩衝液」が、分析物または他の成分の濃度を調整するために使用される場合、そのような「結合緩衝液」は、本明細書中で「希釈緩衝液」とも呼ばれることがある。

本明細書中で使用される用語「目的分析物」または「分析物」は、特に核酸が分析される場合、本明細書中で「標的」とも呼ばれることがある。

いくつかの実施形態では、さもないとその後の検出反応を阻害し得るかまたはそのようなその後の検出反応が適切に機能するのを妨げ得る望まれない成分を微粒子から除去するために洗浄緩衝液も必要であり得る。例えば、検出反応が免疫化学反応である場合、いくつかの実施形態において、微粒子は、目的分析物に特異的な一次抗体である分析物特異的試薬を含み得る。そのような実施形態において、分析物特異的試薬として一次抗体を含む微粒子は、目的分析物を含むと疑われるサンプルに曝露され、その後、そのような微粒子は、一次抗体に結合した目的分析物に特異的な二次抗体であって、それ自体が好適なレポーター、例えば酵素に結合している二次抗体を含む第１の検出組成物に曝露される。微粒子が、サンプルおよび第１の検出組成物に曝露されたら、その後の検出反応を干渉し得る未結合の二次抗体を除去するために、洗浄工程を行う必要がある場合がある。ゆえに、本発明の実施形態は、その後、適切な検出反応が起きるのを阻害し得るかまたは妨げ得る望まれない成分を微粒子から除去するために洗浄緩衝液が関わる洗浄工程を用いることを想定する。

１つの実施形態におけるさらなる工程では、微粒子は、二次抗体に付着されたレポーター酵素に好適な基質を検出試薬として含む第２の検出組成物に曝露される。この基質は、前記レポーター酵素によって反応されると、検出可能になる、好ましくは、光学的に検出可能になる、特に蛍光によって検出可能になる。

本発明の他の実施形態において、検出反応は、核酸増幅反応であり得る。そのような実施形態において、微粒子は、標的に特異的な増幅および検出のためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを含み得る。そのような分析物特異的試薬は、微粒子に可逆的に結合された状態ですでに提供されていてもよいし、一般的検出組成物の他の成分とともに加えられてもよい。通常、そのような一般的検出組成物は、目的の核酸分析物の増幅反応を行うために必要な試薬を含み、プライマーおよび／またはプローブがすでにその微粒子の一部であるか否かに応じて、プライマー、および必要に応じて好適な検出プローブも含んでもよいし、含まなくてもよい。そのような分析物特異的試薬が、すでに微粒子の一部である場合、それらは、一般的検出組成物中に含められない。しかしながら、そのような一般的検出組成物は、目的の核酸分析物（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｎａｌｙｔｅ）の増幅反応を行うために必要な、プライマー以外の試薬を別途含み、特に、一般的検出組成物は、好適な緩衝液、モノヌクレオチド、増幅酵素（例えば、好適な核酸ポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）、および（必要に応じて）増幅産物（例えば、増幅された核酸）を検出するための核酸色素を含む。

本発明によると、上記方法は、個々の微粒子を孤立させ、それにより、それらの内容物を微粒子の体積の中に効果的に封じ、閉じ込めるために使用される、非水相への微粒子の移動も必要とする。そのような非水相は、通常、親油性化合物、例えば、親油性オイル、例えば、フルオロカーボンオイルであり、それは、好ましくは１つまたはいくつかの好適な乳化剤を含む。そのような非水相は、微粒子が非水相に移されるとき必要とされ、そのような非水相は、微粒子によって吸い上げられなかった水性液体に取って代わることおよびそのような微粒子を互いから隔離することを助け、その結果、異なる微粒子間での液体の交換はもはやできなくなる。結果として、安定した微粒子懸濁液が形成された後は、２つの異なるサンプルの混合をもたらし得る１つの微粒子から別の微粒子への任意のサンプルの持ち越しは無くなる。

さらに、本発明に係る方法の実施形態は、定量的デジタル分析アプローチと定量的リアルタイム分析アプローチとをつなぐことによって、分析物を定量化するための見事なアプローチを可能にする。この主張は、微粒子に対して用いられる任意の種類のシグナル増幅アッセイまたは標的増幅アッセイに当てはまり、ＰＣＲ増幅が、本発明者らの方法によって標的を定量化するアプローチを説明する例として働き得る。標的分子の定量化は、好ましくは、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）によって行われる。なぜなら、この方法は、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）よりも高感度かつ正確な定量化が可能であるからである。デジタルＰＣＲの欠点は、その固有の計測範囲の限界が１つのサンプル／分析物に特異的な微粒子の数に依存する点である。この限界を克服するために、本発明は、デジタルＰＣＲの計測範囲を超える標的濃度に対して、デジタルＰＣＲの分析をリアルタイム定量的ＰＣＲで補完する。このアプローチの実行には、ＰＣＲの終わりおよびリアルタイムＰＣＲの全サイクル中に蛍光画像の取得が必要である。リアクターチャンバー内の各微粒子の蛍光レベルを定量化するために、取得されたすべての画像を画像分析アルゴリズムによって分析する。セグメント化アルゴリズムは、暗い背景から明るい円盤状の微粒子物体を切り離す。このセグメント化情報に基づいて、最後に、円を微粒子物体の輪郭にフィットさせることにより、微粒子の平均蛍光および微粒子の平均体積の推定が可能になる。リアルタイムＰＣＲの画像の分析には、連続した画像における微粒子の位置の追跡が含まれ、それにより、それぞれの各微粒子における反応の経過中に蛍光をモニタリングすることが可能になる。

適用される定量化アプローチの選択は、増幅反応後に陰性のままの微粒子の数／比率に基づく。この情報は、デジタルＰＣＲのデータから得られる。陰性微粒子の数／比率に対する予め定義された下限を超えた場合、エンドポイントポアソン分析を適用できる。そうでない場合は、全サイクル中に取得したリアルタイム定量的ＰＣＲデータを用いてリアルタイム分析を行う。ポアソンでの頑健な定量化を可能にする陰性微粒子の比率に対する合理的な下限は、０．５％である。対応する微粒子１つあたりの標的の平均数は、５．３である。蛍光画像に存在し得るアーチファクトを考慮するために、さらなる要件は、陰性微粒子の総数に対する下限、例えば５０であり得る。

エンドポイントポアソン分析は、陰性微粒子の比率を測定し、陽性微粒子が１つより多い標的分子を含み得るという事実を説明するためにポアソン補正を適用することによって、行われる。陽性微粒子と陰性微粒子とを区別する閾値は、陰性であることが分かっている微粒子の蛍光シグナル強度から直接推定される。考えられる微粒子体積のばらつきは、微粒子体積に特異的なポアソン補正を行うことによって定量化に織り込まれる。測定間で起き得る微粒子の総体積のばらつきも、上記アルゴリズムによって補正される。

標的濃度がデジタルＰＣＲの計測範囲を超えた場合、リアルタイム分析が、非線形関数を各単一微粒子の蛍光シグナルの経過に当てはめる。その当てはめられた非線形モデルは、シグモイド関数と線形関数とが組み合わさったものであり、シグモイド成分は、増幅動態を明らかにし、線形成分は、シグナルのベースラインを表す。サイクル閾値（Ｃｔ）は、二次導関数が最大となるシグモイド関数の定義値における接線とベースラインとの交点から計算される。微粒子１つあたりのそれぞれの標的数を、較正用データセットを用いて計算する。検量線のオフセット項は、微粒子体積のばらつきの影響を説明する微粒子体積の関数であり得る。

微粒子によって作り出された反応空間においてシグナル増幅反応または標的増幅反応を行った後、陰性のまま（すなわち「暗い」まま）である微粒子の数に基づく単純なルールを適用することにより、広い計測範囲にわたって定量結果を得るのにどのアプローチが最も相応しいかを確立することができる。そのルールは、以下のように公式化できる：
ａ．本発明に係るライブラリーを用いた所与の検出／定量化の測定において、所与の分析物に特異的な微粒子の０．５％超が陰性のままである場合（すなわち、暗いままの微粒子（「ビーズ」）の確率（「ＰｄａｒｋＢｅａｄ」または「Ｐｎｅｇａｔｉｖｅ」）が＞０．５％である場合）、サンプル中の標的分析物の濃度を測定するためにポアソン分析を適用することができる。
ｂ．本発明に係るライブラリーを用いた所与の検出／定量化の測定において、所与の分析物に特異的な微粒子の５％未満が陰性のままである場合（すなわち、暗いままの微粒子（「ビーズ」）の確率（「ＰｄａｒｋＢｅａｄ」または「Ｐｎｅｇａｔｉｖｅ」）が＜５％である場合）、サンプル中の標的分析物の濃度を測定するためにリアルタイム分析アルゴリズムを適用することができる。
ｃ．本発明に係るライブラリーを用いた所与の検出／定量化の測定において、「陰性」微粒子が０．５％＜Ｐｎｅｇａｔｉｖｅ＜５％の範囲内で生じる場合、両方のアプローチを交換可能に適用することができる。

この定量化の原則を、図１４および１５ならびに実施例２でも説明する。

さらに、本発明を限定するのではなく説明するために与えられる図面を参照する。より詳細には、

図１Ａは、本発明の実施形態に係るアッセイ／方法の基本スキームの実施形態を示しており、それは、そのような方法のワークフローが、好ましくは、試験される異なるサンプルの数だけ行われるサンプル特異的部分（この図面において「特異的プロセス部分」と呼ばれる）および曝露されるサンプルに関係なく全微粒子に共通の一般的プロセス部分を含むことを示している。上の四角形は、本プロセスのサンプル特異的部分の基本プロセスの実施形態および存在し得る成分を表している。溶解緩衝液を用いてサンプルを溶解する。その結果として、本明細書中で「標的」とも呼ばれることがある目的分析物が放出される。必要に応じて、好適な希釈緩衝液（本明細書中で「結合緩衝液」とも呼ばれることがある）を、溶解緩衝液中のある特定の試薬の濃度を許容され得る範囲に調整するために使用してよく、その上で、目的分析物を含むサンプルが、それぞれのサンプルに割り当てられているある特定の標識を有する微粒子によって吸収または吸着され得る条件に、疑われる目的分析物を含むサンプルを供する。そのような標識された微粒子は、本明細書中で「コード化された微粒子」または「コード化されたビーズ」とも呼ばれることがある。１つのサンプルに曝露されたそのような「コード化された微粒子」は、本明細書中で「微粒子サブセット」とも呼ばれることがある。そのような各「サブセット」は、そのそれぞれのサブセットに付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された特定の標識成分を特徴とする。いくつかの実施形態において、それぞれの分析物は、その粒子を形成しているマトリックスへの親和性結合、またはこの目的のためにその粒子に付着されたもしくはそれに含まれる分析物特異的試薬（ＡＳＲ）への親和性結合によって微粒子に結合していることもある。目的分析物が微粒子内に組み込まれたら／収容されたら、それぞれの微粒子サブセットを好適な検出組成物に曝露する。その検出組成物の性質および含有量は、目的分析物を用いて行われる検出反応に依存する（そしてその検出反応は、検出される分析物のタイプに依存する）。そのような検出反応は、目的分析物の検出反応を行うために必要な試薬を含む。そのような検出組成物の好ましい例は、上記でさらに定義されている。続いて、それぞれの検出組成物が微粒子に吸い上げられたら、その後に、それぞれの微粒子のまわりの水相を除去する工程が続くことがある。そのような工程は、それぞれの微粒子を用いて行われる、濾過、遠心分離、振盪または他の機械的撹拌およびそれらの組み合わせを含み得る。その後、好ましくは、それぞれの微粒子のまわりの水相を除去した後、それぞれの微粒子を、必要に応じて乳化剤を含む、非水相、例えばオイルに移す。好ましい実施形態において、乳化剤は、個々の微粒子を隔離する際に役立つ。非水相へのそのような移動の結果として、この特定のサンプル由来の目的分析物をおそらく含む、隔離された微粒子の懸濁液ができる。異なってコード化された、すなわち、異なる標識成分が付着された、含まれるまたはその他の方法で会合された、異なるタイプ（「サブセット」）の微粒子を用いて、同じプロセスを繰り返す。異なってコード化されたそのような微粒子は、異なるサンプルに曝露される。このプロセスを、必要な数または所望の数の異なるサンプルに対して行ったら、どの別個の微粒子サブセットがどのサンプルに曝露されたかを示す相関関係の第１の記録が生成され得る。そのような相関関係の第１の記録は、本明細書中で「サンプル／ビーズコードリスト」とも呼ばれることがある。異なる微粒子サブセットを異なるサンプルに曝露するプロセスを、所望の数または必要な数の異なるサンプルに対して行ったら、それぞれの隔離された異なる微粒子サブセットを混合し、そのプロセスの一般的部分において、核酸増幅であり得る検出反応、または免疫化学反応の実施、または目的分析物の検出に適した他の任意の生化学反応に供し得る。それぞれのサンプル（および微粒子サブセット）における分析物の有無に応じて、特定の微粒子サブセットに対するそのような検出反応においてシグナルが生成され得る。このようにして、どのビーズでシグナルが検出されたかのリスト（「ビーズ／シグナルコードリスト」または「相関関係の第２の記録」）が生成され得、そのリストは、検出反応においてどの微粒子サブセットでシグナルが生成されたかを示している。続いて、そのような検出反応において生成されたそれぞれのシグナルをデコードすることにより（例えば、相関関係の第２の記録（または「ビーズ／シグナルコードリスト」）を相関関係の第１の記録（または「サンプル／ビーズコードリスト」）と整列させるまたは比較することによって）、目的分析物が、それぞれの微粒子を満たすため／微粒子にロードするために当初使用されていたサンプルのうちの１つまたはいくつかに存在する（または存在しない）という知見がもたらされ得る。好ましくは、どのサンプルが目的分析物を含むかという判定、すなわち検出されたシグナルの実際の割り当ては、相関関係の第１の記録（すなわち、どのサブセットがどのサンプルに曝露されたかを示すリスト）を相関関係の第２の記録（すなわち、どのサブセットにおいてシグナルが生成されたかを示すリスト）と結びつけることによって行われる。

本発明に係る方法の主な利点は、以下であることに注意されたい：サンプルを個別に試験する場合、検出反応は、各サンプルに対して個別かつ別々に行われなければならない。本発明では、各サンプルに対して個別かつ別々に行われ得るすべての検出反応に対して同一かつ共通の本方法の一部分（「一般的部分」）を、分析される全サンプルに対して一度に行うことが可能である。

図１Ｂは、本発明の実施形態に係るアッセイ／方法の基本スキームの実施形態を示しており、それは、そのような方法のワークフローが単一サンプルを処理するためにも有利に適用できることを示している。使用されたビーズは、標的の濃縮のため、クリーンアップのため、およびシグナル生成反応、例えばＰＣＲを個々のナノリアクターにおいて行うために多孔性材料を使用するむだのないプロセスを提供し、広い計測範囲にわたってサンプル中に存在する標的の精緻な定量化を提供する。

図２は、多孔性マトリックスを有し、この特定の場合では、外部トリガーによって相転移を起こすこともできるポリマーで構成された、本発明に係る例示的な微粒子の実施形態を示している。例えば、好ましい実施形態において、多孔性マトリックスを有する微粒子は、多孔性ポリマーマトリックスから構成され、そのような多孔性ポリマーマトリックスを構成しているポリマーは、例えば温度を上げると、ゾルゲル転移を起こすことができる。それぞれの微粒子が非水相において孤立されたら、微粒子がそのような相転移を起こすレベルにまで温度を上げることで、検出反応が行われ得る水性ドロップレットが効果的に形成され得る。図２に示されたこの実施形態によると、微粒子は、特定の目的分析物に対して高い結合親和性も有する。これは、ポリマーマトリックス自体の特徴であり得るか、または例えば、マトリックスに付着された分析物特異的結合分子（結合剤）試薬によって達成され得る。そのような結合剤は、いくつかの場合、例えば、上記でさらに定義されたような分析物特異的試薬（ＡＳＲ）であり得る。分析物特異的結合剤は、核酸対、特にプライマー対を含む核酸；アプタマー、シュピーゲルマー；抗体または抗体フラグメント；分析物または分析物複合体に特異的に結合することができる非抗体タンパク質、例えば、レセプター、レセプターフラグメントおよび親和性タンパク質から選択され得る。好ましい実施形態において、分析物特異的試薬は、核酸、特に核酸オリゴマーおよび核酸プライマーから選択される。さらに、微粒子は、その微粒子に付着されたまたはその微粒子内に含まれるまたはその他の方法でその微粒子と会合された標識成分を有する。

さらに、そのような微粒子は、微粒子に提供された空間内で行われるシグナル生成検出反応用の可逆的に付着された試薬を（必要に応じて）含んでもよい。本発明の実施形態によると、特定の核酸配列（「分析物」または「標的」である）を増幅するのに適したプライマー対は、そのようなプライマー対が２つの異なるプライマーを含むという事実にもかかわらず、本明細書中で単一の分析物特異的試薬（ＡＳＲ）として適格であり得、そのように見なされ得ることに注意されたい。しかしながら、それらは、そのような核酸配列の同じ領域に隣接するので、同じ核酸分析物に特異的であるという点で、単一の核酸配列に特異的である。

好ましい実施形態において、標識成分は、蛍光色素、より好ましくは、２つの異なる蛍光色素の混合物である。

本発明の実施形態に係る微粒子は、その多孔性マトリックスに目的分析物を収容する、好ましくは、目的分析物に結合するかまたは目的分析物を濃縮する能力を有し、それぞれの微粒子に付着された、それに含まれるまたはその他の方法でそれと会合されたそれぞれの標識成分を用いて他の微粒子に対して識別および区別され得る。本発明に係る微粒子は、多孔性の性質であるので、例えば、前記多孔性ポリマーマトリックスに付着された分析物特異的結合分子；前記多孔性ポリマーマトリックス上に固定化された、イオン化可能基または複数のイオン化可能基であって、前記イオン化可能基は、前記前駆体微粒子のまわりの周囲条件に従って電荷を変更できる、イオン化可能基；前記多孔性ポリマーマトリックス上に固定化された１つの荷電基または複数の荷電基；またはそれらのいずれかの組み合わせによって、任意の目的分析物を含むサンプルを吸い上げる（または「吸収する」）、または分析物が存在する場合はその分析物を微粒子のマトリックスに結合（「吸着」）させるのに十分かつ接近可能な内部体積を提供する。

好ましくは、そのような微粒子はさらに、外部トリガーが適用されたとき、相転移を起こすことができ、例えば温度をある特定の閾値より高く上昇させたとき、室温でのゲル状態から高温での可溶性の状態に変わることがある。ゆえに、同時にそれらの粒子が液体中に存在するとき、室温での懸濁液は、高温ではエマルジョンに変わる。

このように機能する好ましいポリマーは、単独のまたはゼラチンと組み合わされる、アガロースポリマーである。

図３は、本発明の実施形態に係る微粒子（「リアクタービーズ」）の基本機能を示している。この図は、３つの異なるタイプの微粒子を示しており、その各微粒子は、そのようなそれぞれのタイプと会合したそれぞれの標識成分によって互いと区別される。図３の描写において、異なる標識成分は、微粒子／ビーズの円形の描写の中に異なって斜線がつけられた領域によって記号的に表されており；そのような異なって斜線がつけられた領域は、異なる微粒子を区別することが可能である限り、任意の好適な標識成分を表し得る。例えば、それらは、単一の色素の異なる濃度、２つの異なる色素の異なる比、異なる検出可能な物理的標識などを表し得る。上記プロセスの「サンプル特異的部分」である本プロセスの第１の部分では、３つの異なるタイプの微粒子を３つの異なるサンプル１～３に別々に曝露し、効果的に各サンプルを、そのようなサンプルに曝露される微粒子のそれぞれのタイプ（「サブセット」）の標識成分によってコード化する。好ましい実施形態において、標識成分と、それと会合したそれぞれのサンプルとのそのような相関関係は、本明細書中で「相関関係の第１の記録」とも呼ばれることがある、対応する関連サンプルを含む（対応する微粒子サブセットの）標識成分のリストを作成することによって得られる。そのようなリストは、本明細書中で「サンプル／微粒子コードリスト」または「サンプル／ビーズコードリスト」とも呼ばれることがあり、それは、どの微粒子サブセットがどのサンプルに曝露されたかを示している。この実施形態において、一連のプロセス工程の後、微粒子に検出試薬をロードし、その微粒子を、微粒子を孤立させ、微粒子間のクロストークを妨げる非水性環境において収集する。上記プロセスの「一般的部分」である本プロセスの第２の部分では、異なるサンプルをコード化し、それに対応する異なる微粒子懸濁液を非水相中で混合し、必要な検出反応、例えば、温度サイクルを含むＰＣＲなどの核酸増幅を行うために必要な条件に同時に（「一度に」、すなわちもはや互いに別々にではない）供する。そのような「一般的部分」は、多数のサンプルを処理できるので、これにより、例えば臨床試験におけるサイズの大きな患者コホート全体のサンプルを用いて、単一の検出処理を行うことが容易になる。そのような検出反応において生成されたシグナルを記録し、微粒子（サブセット）のそれぞれの標識成分を測定する／読み出す。どの微粒子サブセットでシグナルが生成されたかを示している相関関係の第２の記録を生成する。そのような相関関係の第２の記録は、本明細書中で「ビーズ／シグナルコードリスト」）とも呼ばれることがある。結果として生じた、「ビーズ／シグナルコードリスト」（すなわち、相関関係の第２の記録）における検出シグナル／微粒子の組み合わせを「サンプル／微粒子コードリスト」（「すなわち、相関関係の第１の記録）と比較し、その結果として、（試験された複数のサンプルのうちの）どのサンプルがそれぞれの目的分析物を含んだかまたは含まなかったかを判定することができる。

本発明に係る実施形態に特に適した微粒子は、本明細書と同時に出願された、製作済み微粒子のライブラリー（ａ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｐｒｅｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）というタイトルの同時係属中の欧州特許出願（代理人整理番号Ｂ３３０１６ＥＰ）に記載されているような、サンプル中の目的分析物の特異的検出を行うための製作済み微粒子のライブラリーに含まれるような微粒子である。

図４は、本発明に係る方法の実施形態を行うのに好適であり得る新規の流体カートリッジの例示的な配置の模式図を示している。このカートリッジのユニークな特徴は、分析される個々のサンプルに対する別個の複数の入口である。各入口は、それ自体の対応するサンプルチャンバーまたはサンプル特異的モジュールと別々に接続され、いくつかの異なるサンプルチャンバーまたはサンプル特異的モジュールがカートリッジに提供され、それらの各々が、別個のサンプルに対して使用されるように意図され、構成されている。用語「サンプルチャンバー」、「サンプルチャンバーモジュール」および「サンプル特異的モジュール」は、本明細書中で交換可能に使用され、特定のサンプルを受け取るように明確に意図され、構成されているチャンバーのことを指す。サンプルを含む（およびこの特定のサンプルに対して特定の微粒子サブセットを含む）ように構成されているそれぞれのサンプル特異的モジュール内の実際の空間は、本明細書中で「サンプルコンパートメント」とも呼ばれることがある。これらの特定のチャンバーモジュールは、安全なコード化プロセス、すなわち、特定の別個のタイプ（「サブセット」）の微粒子をそのようなサンプルに曝露することで、前記異なる微粒子サブセットの各々にそれぞれ異なるサンプルが「ロード」されることによって、各サンプルがコード化／標識されるようになるプロセスを確保するために提供される。異なるサンプル特異的チャンバーモジュールは、異なるモジュール間およびゆえに異なるサンプル間の相互汚染を防ぐ。それぞれの別個の入口は、長方形によって表されているサンプルチャンバー（またはサンプル特異的モジュール）における短いほうの辺にある三角形のくぼみによってこの図に示されている。

この図における例示的なカートリッジの配置は、例示的なバルブおよびポンプ機構を含む。３つの別個のチャンバー（またはモジュール）群が、そのカートリッジの配置に提供されている：
１．サンプル特異的プロセスを容易にし、他の成分の中でもサンプルコード化微粒子を含む、モジュール
２．特異的プロセス（サンプル特異的モジュール内に提供されていない場合）および一般的プロセスを行うために必要な試薬を保存するためのチャンバー；非水相を含めるための特に指定された保存チャンバー（「非水相チャンバー」）も示されている）
３．一般的プロセスを容易にするためのチャンバーまたはモジュール（例えば、混合（自由選択）および検出（必須）チャンバー、または一体化した混合・検出チャンバー、すなわち、両方の機能が組み合わされたチャンバー（図示せず））

コード化プロセスが完了する前、かつ微粒子が孤立される前、すなわち、非水相に確保される前に、すべての試薬が、それぞれのモジュールに一方向で送達される。最終的には、微粒子の懸濁液を各サンプルモジュールから収集し、次いで、それらの異なる懸濁液を一緒に混合して、単一の懸濁液を形成する。次いで、そのように混合された微粒子を検出チャンバーに移し、検出反応を行うために必要な必要条件に供する。本発明の実施形態に従って適合され、かつ改変されたとき使用され得るカートリッジは、２０１９年７月１８日出願の欧州特許出願ＥＰ Ｎｏ．１９１８７０６４．１に記載されているようなカートリッジであるが、しかしながら、それは、本発明に係るカートリッジが複数のサンプルチャンバーを有し、そのようなサンプルチャンバーの各々がそれ自体のサンプル入口を有するという点において修正を必要とする限り、適合させる必要がある。これにより、複数のサンプルを別個に操作することが可能になり、それらのサンプルの各々は、本発明に従って別々に標識されるようになる。

図５は、本発明に係る方法の実施形態を示している。より詳細には、異なる微粒子サブセット（この図ではそれぞれ「ビーズ１」、「ビーズ２」、「ビーズ３」および「ビーズ４」と呼ばれる）には、異なる標識成分が付着されているが、それらのサブセットは、分析物特異的試薬を全く含まないか、または１つの特定の目的分析物に特異的な厳密に１つのタイプの分析物特異的試薬を含む。これらの異なる微粒子サブセットは、その異なる標識成分によって識別可能であり、例えば上記でさらに記載されたような異なる容器、例えば、カートリッジ内の異なるサンプルチャンバーまたはサンプル特異的モジュールに別々に提供され、それらの各々は、異なるサンプルに別々に曝露される。試験されるサンプルと同じ数の微粒子サブセットが効果的に使用される。その後、必要な（一般的な）検出試薬／試薬組成物が、各サブセットに加えられる（そのような分析物特異的試薬が開始時から微粒子内に含まれていなかった場合は、必要に応じて、上記でさらに定義されたような分析物特異的試薬もさらに含む、そのような検出組成物とともに加えられる）。次いで、それぞれの微粒子サブセットをなおも別々に非水相（必要に応じて乳化剤を含むオイルであり得る）に移し、それにより、互いから孤立するようになり、その結果として、「クロストーク」、すなわち、それぞれの微粒子によって提供される空間の間でのサンプルの混合がもはや起きなくなり、その後、（一般的な）検出反応が行われる（「ワンポット検出反応」）。そのような（一般的な）検出反応の結果から、１つの目的分析物がどのサンプルに存在したかという結論を導き出すことができる。驚くべきことに、本発明者らは、異なる微粒子が、非水相に移されたことによって互いから隔離されるようになった後は、溢出またはそれらの異なる微粒子間の「クロストーク」が実際に生じないことを見出した。結果として、それぞれの微粒子が混合されるようになったという事実にもかかわらず、（分析物の存在について試験される）サンプル間の相互汚染も生じない。

図６は、複数のサンプルが複数の分析物について試験される本発明に係る方法の実施形態を示している。基本的には、このスキームは、試験されるサンプルの数に、検出される異なる分析物の数を乗算した数と同じ数の微粒子サブセットを使用すること以外は図５に示されているものと類似である。例として、図６における第１のサンプルは、会合されている標識成分に関して異なるだけでなく、そのようなタイプに付着された分析物特異的試薬に関しても異なる２つの異なる微粒子サブセットを用いて試験／分析される。第２のサンプル（「サンプル２」）についても同様である。ゆえに、この例では、全部で４つの異なる微粒子サブセットが存在し、それらの各々が、標識成分と分析物特異的試薬とのユニークな組み合わせを有する。その後、それぞれの必要な（一般的な）検出試薬／検出組成物を加えるが、異なるサンプル間の相互汚染を回避するために、なおもサンプル１つごとに加える。その後、それぞれの微粒子を再度、サンプル１つごとに非水相に移し、これらのそれぞれの微粒子をそのように孤立させ、互いに干渉および相互汚染できなくしてから、必要な検出反応を行う。最終結果は、試験された各サンプルに検出されるべき分析物が全くないか、１つまたは２つあるかという知見であり得る。再度、上で指摘したように、驚くべきことに、本発明者らは、異なる微粒子が、非水相に移されたことによって互いから隔離されるようになった後は、溢出またはそれらの異なる微粒子間の「クロストーク」が実際に生じないことを見出した。結果として、それぞれの微粒子（その各々が、試験される小さい体積のそれぞれのサンプルを含む）が混合されるようになったという事実にもかかわらず、（１つの分析物またはいくつかの分析物の存在について試験される）サンプル間の相互汚染も生じない。

図７は、本発明に係る微粒子を作製するために使用されるセットアップのマイクロ流体クロスジャンクションの顕微鏡写真を示している。マイクロドロップレットがオイル中に形成され、水性のヒドロゲル溶液を形成する（左側）。続いて、ドロップレットを冷却すると微粒子が形成される。

図８は、デジタルカメラが備え付けられたＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏｓｃｏｐｅにおいてＣｙ３ Ｆｉｌｔｅｒ Ｓｅｔを用いて取得された蛍光顕微鏡写真を示している。３つの異なる標識成分に事実上対応する、標識成分（Ｃｙ３色素）の３つの濃度に相当する３つの異なる蛍光レベルが見られる（明るい、中程度、低い）。

図９は、ビーズの標識をコード化する蛍光チャネルに相当する検出チャンバーのスティッチ画像を示している。右下の拡大像インサートにおいて、それぞれの標識成分によって識別可能な（ゆえにコード化された）３つの異なるタイプの微粒子（または「ビーズ」）をはっきりと認識できる（明るい、中程度および低いシグナル）。異なる標識成分があるので、これらのビーズを用いることにより、異なるサンプルを標識するまたは「コード化する」ことができる（ゆえに、これらのビーズは、本明細書中で「サンプルコード化ビーズ」とも呼ばれることがある）。それらのビーズは、六角形の最密充填で空間的に分布している。使用したソフトウェアアルゴリズムによって認識される、このＰＣＲチャンバー内のすべてのサンプルコード化ビーズ（平均直径ｄ＝１０５μｍ）の総数は、Ｎ＝１７．６９８であると明らかになった。

図１０Ａは、ＰＣＲ増幅後の、色で標識されたアガロース－ゼラチンハイブリッド微粒子の蛍光画像を示している。３つの標識は、チャネル１においてその蛍光強度によって認識され得る。チャネル２は、内部プロセスコントロール（ＭＳ２ファージ）に対する蛍光シグナルを表し、チャネル３は、ＨＣＶ標的のＰＣＲ増幅に特異的な蛍光を表す。各標識は、処理および分析された異なるサンプルに対応する。図１０Ｂ（上のグラフ）は、チャネル１（図１０Ａの上の画像）からの、異なるビーズに対して測定された蛍光強度のヒストグラムを示している。３つの別個の標識種が見られる。チャネル２（ＭＳ２）およびチャネル（３）についてそれぞれのビーズ種にわたって見られたシグナル分布を表しているバイオリンプロットが、中央および下のグラフに示されている。ポアソン分析を適用することによって、実測値が、ビーズに適用されたサンプル体積あたりの具体的なコピー数に換算される。

図１１は、ＲＮＡに対する異なる微粒子製剤の結合効率に対する実施例３のデータを要約している。このデータは、微粒子の組成を調整することにより、結合の特色を最適化することが可能であることを示している。

図１２は、実施例３における、調製された微粒子へのＲＮＡの結合を示している蛍光画像の時間経過を示している。

図１３は、微粒子を使用することによって達成される濃縮効果を示している。このグラフは、２つの異なる組成の微粒子に対するデータを示している。黒点は、デジタルＲＴ－ＰＣＲによって測定された微粒子とのインキュベーション前のサンプル中の標的濃度を示している。白色の棒は、インキュベーション後に検出された上清中の標的濃度を表しており、灰色の棒は、微粒子上の標的濃度を表している。濃縮効果が明らかに見られることから、それぞれの上清が枯渇されたことが示された。

図１４は、微粒子における標的を定量化するための、デジタルＰＣＲとリアルタイム定量的ＰＣＲとを組み合わせた分析アプローチの精度を示している。両方の方法に対する信頼区間が示されている。λ＝５ｃｐ／微粒子（ｃｐ＝コピー）における縦線は、それらの方法を交換可能に使用できる近似値を示している（「ＣＩ」＝信頼区間）。

図１５は、ＰＣＲ増幅の間、オイル中の微粒子上で収集された一連の画像から得られたリアルタイム蛍光データを示している。増幅に特異的な１つの蛍光チャネルにおいて検出されたエンドポイント蛍光シグナルを含む検出チャンバーのスティッチ画像を左側に示す。中央のグラフは、左側の蛍光画像から選択された１２個の代表的な個々の微粒子に対する経時的な蛍光強度を例示として示している。蛍光画像において検出された各微粒子に対するｃｔ値の計算値の分布を右側のヒストグラムに示す。 図１５は、ＰＣＲ増幅の間、オイル中の微粒子上で収集された一連の画像から得られたリアルタイム蛍光データを示している。増幅に特異的な１つの蛍光チャネルにおいて検出されたエンドポイント蛍光シグナルを含む検出チャンバーのスティッチ画像を左側に示す。中央のグラフは、左側の蛍光画像から選択された１２個の代表的な個々の微粒子に対する経時的な蛍光強度を例示として示している。蛍光画像において検出された各微粒子に対するｃｔ値の計算値の分布を右側のヒストグラムに示す。

さらに、具体的な説明、特に、以下の実施例に言及するが、これは、本発明を限定するのではなく説明するために与えられる。

実施例１：ＲＮＡ検出アッセイ用の「サンプルコード化ビーズ」の作製
ゼラチンおよびアガロースを含むマトリックスを有する異なって標識された微粒子を作製し、それにより、その組成物のゼラチン画分は、マトリックスの色素運搬部分として機能し、その組成物のおかげで標的結合および濃縮がもたらされた。
粒子コードを作り出すための蛍光色素によるゼラチンの標識を以下のとおり行った：

ウシ皮膚のタイプＡ由来のゼラチンのアセトン不溶性画分を、ＮＨＳカップリング化学を利用して、蛍光色素で標識する。Ｃｙ（登録商標）３ Ｍｏｎｏ ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＤＭＦに溶解して、１０％（ｗ／ｖ）の最終溶液を生成した。成分１を７０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０～８．３、濾過滅菌済み）に溶解して、０．２５％（ｗ／ｖ）という最終濃度を得る。遊離ゼラチンアミノ基より１０倍小さい分子量のそれぞれの色素を使用して、２５ｍＬのいずれかのゼラチンタイプを標識する。それらの標識溶液を、Ｍｕｌｔｉ－Ｒｏｔａｔｏｒ ＰＴＲ－６０（Ｇｒａｎｔ－ｂｉｏ）を垂直モードで使用して４℃で一晩インキュベートする。蛍光標識されたゼラチンの精製およびその濃縮を、飽和（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４溶液を用いる硫安塩析を繰り返すことによって行う。あるいは、ゼラチンは、カップリングのために、ゲル化された粒子サイズの形式であることができ、単に洗浄および外界温度での遠心分離によって硫安塩析なしで精製することができる。また、限外濾過、イソプロパノール、アセトンもしくはメタノールを用いた溶媒抽出、セファロースカラムを用いたゲル濾過、または透析を行うことにより、ゼラチンを精製することもできる。

いずれの場合でも、精製は、溶出物が透明になり、蛍光を示さなくなるまで繰り返される。最後に、ペレットをｄＨ_２Ｏで４回洗浄した後、精製された蛍光標識ゼラチンサンプルを真空乾燥することにより、成分３が得られる。
ゼラチン／アガロースハイブリッド溶液の調製：

３つの成分からなるハイブリッドヒドロゲル溶液を、ナノリアクターを製作するために調製する。
成分１：ウシ皮膚タイプＡ Ｇ１８９０（Ｓｉｇｍａ）由来のアセトン不溶性ゼラチン
成分２：低ゲル化２－ヒドロキシエチルアガロース（Ａ４０１８，Ｓｉｇｍａ）
成分３：Ｃｙ３標識ゼラチン（タイプＡ）

成分１の均一な４％（ｗ／ｖ）溶液を生成するために、４０ｍｇの成分１を１ｍＬのヌクレアーゼフリー水（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）に溶解し、静かに撹拌しながら（７５０ｒｐｍ）５０℃でインキュベートする。同様に、２０ｍｇの成分２を１ｍＬのヌクレアーゼフリー水に溶解および融解し、静かに撹拌しながら８０℃でインキュベートして、均一な２％（ｗ／ｖ）アガロース溶液を調製する。標識ゼラチンの４％（ｗ／ｖ）溶液を調製するために、成分３の乾燥ペレットを、それぞれの体積のヌクレアーゼフリー水に溶かし、ゼラチンが融解するまで、５５℃でインキュベートする。３つすべての成分を混合し、ヌクレアーゼフリー水で満たして、それぞれゼラチンが１．５％（ｗ／ｖ）およびアガロースＡ４０１８が０．５％（ｗ／ｖ）という最終濃度を有するハイブリッドヒドロゲル溶液を生成する。様々な体積の成分３および成分１を混合して、ｎ個の異なる色の微粒子セットを得る。この実施形態では、再懸濁された成分３および成分１を、１：１０００、１：５００、１：２５０の比で混合して、３つの異なるサンプルの識別および分析を可能にする３つの個々の標識成分を得る。すべての溶液をさらに使用するまで５５℃で維持した。
非架橋ゼラチン／アガロース微粒子の生成

色分けされた単分散のアガロース－ゼラチンハイブリッド微粒子を、マイクロ流体粒子生成システム（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ，ＵＫ）を用いて製作した。単分散のハイブリッド微粒子を、簡易フローフォーカスデバイスを用いたエマルジョン形成の１工程プロセスで製作する。詳細には、フッ素親和性（ｆｌｕｏｒｏｐｈｉｌｉｃ）の性質の標準的なドロップレットジャンクションチップ（１００μｍ）を４ウェイリニアコネクターおよびチップインターフェースＨとともに用いて、管材料とチップとの流体接続を仲介する。２つのＭｉｔｏｓ Ｐ－Ｐｕｍｐが、ヒドロゲル溶液およびキャリアオイルを送達する。このシステムを、ゼラチン／アガロースハイブリッド溶液を液体の状態で維持することおよび駆動流体を加熱することを可能にする、ホットプレートの上に置かれた加熱装置を組み込むことで改変すると、オイルとゼラチン／アガロースハイブリッド溶液とがチップジャンクションにおいて接触するとき、一定した温度が確保される。Ｐｉｃｏｓｕｒｆ ２（Ｓｐｈｅｒｅｆｌｕｉｄｉｃｓ，ＵＫ）とハイブリッドヒドロゲル溶液の両方を０．２２μｍフィルターで予め濾過した後、それらをそれぞれドロップレットシステムの加熱装置内のＰ－Ｐｕｍｐ（Ｍｉｔｏｓ）およびヒドロゲルレザバーに入れる。加熱装置の温度を５５℃に設定する。流体ラインを、Ｆｌｏｗ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて２０００ｍｂａｒで１分間、準備する。安定したドロップレット形成のために、１５～２０μｌ／分という流速に調整する。Ｄｏｌｏｍｉｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてパラメータをモニターする。

図７は、左側の油相中に形成しているマイクロドロップレットを含んでいるマイクロ流体クロスジャンクションの顕微鏡写真を示している。その後、ヒドロゲルドロップレットは、凝固し、微粒子になる。

両方の場合において、色分けされたアガロース－ゼラチンハイブリッド微粒子を氷上の２ｍＬ微量遠心管または１５ｍＬファルコンチューブに収集して、ハイブリッドヒドロゲルの凝固を開始する。油と空気の境界において微粒子の水相が失われるのを防ぐために、微粒子を含む５００μＬのエマルジョンオイルを５００μＬのヌクレアーゼフリー水で覆う。その後、微粒子を少なくとも２４時間（優先的には４８時間）４℃に冷却して、安定したハイブリッド骨格を形成する。
連続相からのハイブリッド微粒子の回収

凝固したハイブリッドビーズは、エマルジョンオイルの上に蓄積する。粒子を除去しないように注意しながらピペットで慎重にエマルジョンオイルを除去する。その後、５００μＬの１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロオクタノール（ＰＦＯ；Ｓｉｇｍａ）をチューブに加えて、エマルジョンを破壊する。ハイブリッドヒドロゲル粒子を油相に移すために、チューブを５秒間ボルテックスし、２，５００×ｇで５秒間遠心する。ハイブリッドヒドロゲル微粒子を新しい１．５ｍＬ微量遠心管に移す。

自由選択：この手順は、残留フルオロカーボンオイルおよび界面活性剤を除去するために繰り返すことができる。ＰＦＯの洗浄の後、回収された微粒子を１ｍＬのヌクレアーゼフリー水で２回洗浄する。微粒子の品質およびサイズを、顕微鏡を用いて視覚的に検査する。記載の手順の最終結果により、多孔性ポリマーマトリックスを有し、サンプルをコード化できるナノリアクター微粒子（直径ｄ＝１００μｍ）セットが得られる。

図８は、デジタルカメラが備え付けられたＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏｓｃｏｐｅにおいてＣｙ３ Ｆｉｌｔｅｒ Ｓｅｔを用いて取得された蛍光顕微鏡写真を示している。色素（Ｃｙ３色素）の３つの濃度に相当する３つの異なる蛍光レベルが見られる（明るい、中程度、低い）ので、事実上、３つの異なる標識成分により、それらで標識されたそれぞれの微粒子を区別することが可能になる。
微粒子セットの凍結乾燥

必要に応じて、長期保存に向けて微粒子ペレットを得るためにミクロスフェアセットを凍結乾燥することができる。ゆえに、所望のミクロスフェアセットおよび濃縮物に等体積の６００ｍｇ／ｍＬトレハロース溶液を補充することにより、３０％（ｗ／ｖ）トレハロースを含む微粒子ライブラリースラリーが得られる。続いて、凍結乾燥の準備が整ったＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリーＰＣＲストリップチューブに１００μｌのライブラリーアリコートを調製する。賦形剤のタイプ（例えば、トレハロース）および凍結乾燥製剤中のその濃度は、当該プロセスの後半で溶出液に曝露されるとき、フリーズドライされたミクロスフェアの膨張の程度に影響する。ミクロスフェアセットを、ドライアイス上で２時間凍結した後、Ａｌｐｈａ ２－４ ＬＳＣｐｌｕｓフリーズドライヤー（Ｃｈｒｉｓｔ）を用いて真空下（－２５℃かつ０．１ｍｂａｒ）でフリーズドライした。サンプルを合計２００分間、フリーズドライヤーに放置した。主な乾燥段階を、温度を－２５℃から２５℃まで段階的に上昇させながら０．０１ｍｂａｒで３時間保持した。最終的な乾燥工程を２５℃かつ０．０５ｍｂａｒで２０分間行った。
実施例２：「サンプルコード化ビーズ」によるサンプルのコード化
ハイブリッドビーズを用いたサンプル調製
ゲル濾過樹脂の調製

乾燥したＰ－２ Ｂｉｏ－Ｇｅｌ Ｍｅｄｉａ Ｅｘｔｒａ ｆｉｎｅ＜４５μｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ １５０－４１１８）をヌクレアーゼフリーの脱イオンＨ_２Ｏで水和させる。続いて、そのゲルを空のスピンカラム（すなわち、ＳｉｇｍａＰｒｅｐ^ＴＭスピンカラム，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＳＣ１０００－ＫＴ）に充填して、４００μｌという最終ベッド体積を得る。そのカラムを１０００ｒｃｆで１分という短い遠心分離工程に供して、移動相を除去する。４００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．４を加えた後、そのカラムを上に記載されたように回転させることによって、その緩衝液でカラムを２回洗浄する。
サンプルの溶解

健康ドナー（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｊｅｎａ）から得られた３０μｌの全血という３つのサンプルに３００ｃｐ／μＬのＭＳ２ウイルスを加え（サンプル１、２および３）、その３つのサンプルのうちの１つ（サンプル１）に、Ｂａｓｅｍａｔｒｉｘ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＳｅｒａＣａｒｅ １８０５－００７５）で希釈されたＡｃｃｕＰｌｅｘ ＨＣＶ組換えシンドビスウイルス（ＳｅｒａＣａｒｅ ０５０５－００３６）を加えることにより、５．５００ｃｐ／μＬサンプルという名目上の力価がもたらされた。

すべてのサンプルを、４．５ＭグアニジニウムＨＣｌ、９％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、１８ｍＭ ＥＤＴＡおよび１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．０を含む１９５μｌの溶解緩衝液と別々に混合した。各溶解混合物を６５℃で５分間インキュベートした。
グアニジニウムＨＣｌを除去するためのゲル濾過

溶解の直後に、各混合物をＰ－２カラムに適用した。１．０００ｒｃｆでの１分間の遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕａｔｉｏｎ）の後、フロースルー／濾液（ｆｉｌｔｒａｔ）を、２００ＵのＲＮａｓｅ阻害剤（ｂｉｏｔｅｃｈｒａｂｂｉｔ，ＤＥ）を含む新しい反応チューブに回収した。
サンプルコード化ビーズへの分析物の結合

以下の表に示されているように、サンプルを蛍光標識微粒子に割り当てる。
サンプルコード化ビーズへのサンプルの割り当て

凍結乾燥された微粒子のペレットを７０μＬのＲＮＡ含有結合緩衝液（成分４）に再懸濁する。各セットは、デジタルＰＣＲ分析に利用可能なおおよそ１０．０００個のナノリアクターからなる。これらに緩衝液を吸収させ、直ちに膨潤させることにより、核酸の効率的な非特異的結合およびデジタルＰＣＲ互換性のために開発された機能的な多孔性３Ｄゼラチン－アガロースマトリックスが提供される。個々のサンプルを、別個のチューブにおいて１５℃で５分間、１０００ｒｐｍにて、対応するビーズとインキュベートすることにより、ＨＣＶおよびＭＳ２ ＲＮＡを完全に捕捉して、ナノリアクターにおいて核酸を濃縮する。
微粒子の洗浄

２００μｌの洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．４、１Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ阻害剤）を各サンプルに加えた。１２．０００～１６．０００ｒｐｍで１秒間の短いボルテックス工程の後、３００ｒｃｆで３０秒間の遠心分離によって微粒子を沈降させ、上清を除去する。この洗浄工程を３回繰り返す。
１．「サンプルコード化ビーズ」を用いた、異なるサンプル中の分子標的の検出および定量化
微粒子上への試薬のローディング

ナノリアクター内の分析物を検出するための試薬は、フリーズドライされたペレットとして供給されており、それを、１００μＬの１×ＰＣＲ緩衝液（成分７）で再懸濁することにより、２×試薬混合物（成分８）を得る。短いボルテックス工程によって、それらの試薬を慎重に再懸濁する。ビーズスラリーに対して等体積の試薬混合物を、ＲＮＡを捕捉した個々のサンプルコード化ビーズセットを含む個々の容器に分配する。１０００ｒｐｍで振盪しながら１５℃で５分間、手短にインキュベーションすることによって、増幅試薬および検出試薬をヒドロゲルマトリックス内に拡散させる（およびヒドロゲルマトリックスに結合させる）。
成分７：ＰＣＲ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、２２ｍＭ ＫＣｌ、２２ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２，ｐＨ８．５）
成分８：試薬混合物（２×）
－リボヌクレアーゼ阻害剤を含む２×耐熱性逆転写酵素（ｂｉｏｔｅｃｈｒａｂｂｉｔ ＧｍｂＨ）
－０．４Ｕ／μｌ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ｂｉｏｔｅｃｈｒａｂｂｉｔ ＧｍｂＨ）
－０．８ｍＭ ｄＮＴＰ（ｂｉｏｔｅｃｈｒａｂｂｉｔ ＧｍｂＨ）
－０．２％（ｗ／ｖ）低バイオバーデンでプロテアーゼフリーの分子生物学用ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）
分析物特異的試薬（ＨＣＶ）
－０．８μＭ ＨＣＶ－Ｂｒｕｎセンスプライマー（５’－ＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡ－３’）配列番号１
－０．８μＭ ＨＣＶ－Ｂｒｕｎアンチセンスプライマー（５’－ＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴ－３’）配列番号２
－０．８μＭ ＨＣＶ－Ｂｒｕｎ ＴａｑＭａｎプローブ（５’－Ａｔｔｏ６４７－ＣＣＧＡＧＴＡＧＹＧＴＴＧＧＧＴＹＧＣＧＡＡＡＧＧ－ＢＨＱ－２－３’）配列番号３
内部プロセスコントロール特異的試薬（ＭＳ２）
－０．８μＭ ＭＳ２－Ｎｉｎｏセンスプライマー（５’－ＣＴＣＴＧＡＧＡＧＣＧＧＣＴＣＴＡＴＴＧＧＴ－３’）配列番号４
－０．８μＭ ＭＳ２－Ｎｉｎｏセンスプライマー（５’－ＧＧＴＣＣＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＣＴＡＡＡＴＴＣ－３’）配列番号５
－０．８μＭ ＭＳ２－Ｎｉｎｏ ＴａｑＭａｎプローブ（５’－ＦＡＭ－ＴＣＡＧＡＣＡＣＧＣＧＧＴＣＣＧＣＴＡＴＡＡＣＧＡ－ＢＨＱ－１－３’）配列番号６
微粒子の乳化

サンプルコード化ビーズ間のクロストークを防ぐために、微粒子を成分９に分散させることによって個々のナノリアクターセットを別々に非水相に移す。ビーズを５００ｒｃｆで３０秒間遠心し、上清を廃棄する。１．５ｍＬ微量遠心管を用いてビーズベッドを過剰量の成分９（２００μＬ）と接触させる。水性微粒子を脱凝集し、フルオロカーボンオイルに乳化して単一のナノリアクターとするために高剪断力を適用する必要がある。Ｓｏｎｉｆｉｅｒ^ＴＭＳ－４５０およびＵｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ^ＴＭ Ｃｕｐ Ｈｏｒｎ（Ｂｒａｎｓｏｎ）を用いる超音波の適用、またはチューブをラック表面に押し付けながらおよそ２０／秒の頻度で２０回、微量遠心管ラックの穴の上でチューブを単にスライドさせることによって、混合物を撹拌する。これに機械的応力を適用して、水性微粒子間の引力を破壊し、表面張力をもたらすことにより、懸濁液／エマルジョンが形成される。ヒドロゲル微粒子と過剰な水相の両方が、油相において乳化される。軽く遠心分離（５００ｒｃｆ）することでそのエマルジョンを３回洗浄することによって、副産物として生成するサブミクロンスケールのドロップレットを除去する。同じオイル（成分１２）で繰り返し洗浄することにより、本質的にすべての望ましくない液体ドロップレットが除去される。成分１２は、その後のデジタルエマルジョンＰＣＲに向けてエマルジョンの効率的な熱安定性ももたらす。ここで、３つの乳化済みサンプルコード化ビーズセットを、コード化されたサンプルの平行したデジタルシグナル増幅および検出のために準備された１つの容器（チューブ）内で単に合わせることができる。
成分９：相間移動およびシグナル増幅用のオイル
－ＨＦＥ－７５００ フルオロカーボンオイル（３Ｍ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ）に
－２～５％（ｖ／ｖ）ＰｉｃｏＳｕｒｆ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）または２～５％（ｖ／ｖ）ＦｌｕｏＳｕｒｆ（Ｅｍｕｌｓｅｏ）または２～５％（ｖ／ｖ）００８－フッ素系界面活性剤（ＲＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が補充されたもの
サンプルコード化ビーズにおける平行したデジタルＰＣＲ増幅反応

被包されたサンプル１、サンプル２およびサンプル３を含む単分散エマルジョンを、およそ２．５ｃｍ^２という面積および１００μｍという層の厚さを有する検出チャンバーに移す。チャンバーの検出窓は、０．８ｍｍポリカーボネート（Ｍａｋｒｏｌｏｎ ６５５５；Ｃｏｖｅｓｔｒｏ ＡＧ）でできており、チャンバーの反対側は、個々のナノリットル反応に必要な効率的な熱伝達を容易にする、研磨された無修飾の透明な１２５ミクロンポリカーボネート（Ｌｅｘａｎ ８０１０）フィルム（Ｋｏｅｎｉｇ Ｋｕｎｓｔｓｔｏｆｆｅ ＧｍｂＨ）から構成されている。フルオロカーボンオイルに懸濁されたナノリアクターは、反応チャンバーの寸法のせいで単層を形成せざるを得ない。このように、ミクロスフェアは、その後の平行したシグナル増幅反応に向けて、およそ２０．０００～３０．０００個のナノリアクター（約７．０００～１０．０００／サンプル）が等間隔で配置されたアレイを提供する。

改変されたペルチェ素子３０×３０×４．７ｍｍ，１９．３Ｗ（Ｑｕｉｃｋ－Ｏｈｍ，Ｋｕｐｐｅｒ ＆ Ｃｏ．ＧｍｂＨ，＃ＱＣ－７１－１．４－３．７Ｍ）および確立されたチャンバー特異的ＰＣＲ制御モードを用いて、微粒子を超高速の温度サイクリングに供する。適用されるＲＴ－ＰＣＲの温度条件は、５０℃で１０分間の逆転写、９５℃で３０秒間の初回の変性の後、９５℃で２秒間の変性および６５℃で５秒間のアニーリング／伸長からなる２工程ＰＣＲの３０～４５サイクルである。その懸濁液は、ゾルゲル切り替え能力に起因して、個々の液状のナノリットルドロップレットを含むエマルジョンになる。異なるサンプルからのＨＣＶおよびＭＳ２（コントロール）の複数の二重増幅が、標識されたナノ反応コンパートメントにおいて生じる。

自動化された画像取得を、ＢＬＩＮＫツールボックスソフトウェアによって起動し、５×対物レンズ（視野４．４１６ｍｍ×２．７７４ｍｍ）およびｐＥ－４０００（ＣｏｏｌＬＥＤ Ｌｔｄ．）光源が備え付けられた蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ）を用いて行う。この顕微鏡には、３つの蛍光フィルターセット（Ｃｙ５ ＥＴ、Ｃｙ３ ＥＴ、ＦＩＴＣ／ＦＡＭ ＨＣ，ＡＨＦ Ａｎａｌｙｓｅｎｔｅｃｈｎｉｋ）、および反応チャンバーを有するサーモサイクラーが搭載された自動ｘ－ｙステージがさらに備え付けられていた。

画像取得の設定は、以下のとおりである：１００～１０００ｍｓおよび１～１０×のゲイン。１つの画像が、標識の識別のために必要であり（λｅｘｃ１＝５８０ｎｍ）、１つの画像が、内部標準ＰＣＲシグナルのために必要であり（λｅｘｃ２＝４７０ｎｍ）、１つの画像が、特異的ＰＣＲシグナルのために必要である（λｅｘｃ３＝６３５ｎｍ）。自由選択のナノリアクター特異的リアルタイム分析のために、３つの蛍光チャネルに対応する３つの画像が、チャンバーの好適な位置において、各サイクルにおいて撮影され得る。

温度プロトコルが完了したら、同じ機器を上で述べた設定で用いて検出チャンバー領域全体をスキャンする。増幅／検出チャンバーの寸法を網羅するためには、合計４８～５６個の画像が必要である。

ビーズの標識をコード化する蛍光チャネルに相当する検出チャンバーのスティッチ画像を図９に示す。右下の拡大像インサートにおいて、３つの異なるサンプルコード化ビーズをはっきりと認識できる（明るい、中程度および低いシグナル）。それらのビーズは、六角形の最密充填で空間的に分布している。使用したソフトウェアアルゴリズムによって認識される、このＰＣＲチャンバー内のすべてのサンプルコード化ビーズ（平均直径ｄ＝１０５μｍ）の総数は、Ｎ＝１７．６９８であると明らかになった。
サンプルのデコードおよびエンドポイント分析

取得したすべての画像を、自動化された多面的画像処理アルゴリズムに供する。その方法は、Ｍａｘｉｍａｌｌｙ Ｓｔａｂｌｅ Ｅｘｔｒｅｍａｌ Ｒｅｇｉｏｎｓ（ＭＳＥＲ）を利用した画像のセグメント化を用いて、ＭＳＥＲに基づく画像のセグメント化の結果から隣接するドロップレットを検出する。詳細には、画像をまず、メジアンフィルターを含む前処理に供する。次に、ＭＳＥＲアルゴリズムを画像の背景に適用して、背景の輪郭の凸状の転換点を判定し、ドロネー三角分割法を適用して、ドロップレット／微粒子間の適切なカットを特定する。さらに、ドロップレット／微粒子を、ＭＳＥＲアルゴリズムを用いてセグメント化する。最後に、ドロップレット／微粒子の輪郭に対するもっともらしさの確認を行う（コントラスト、形状、凸性）。続いて、セグメント化されたすべてのドロップレット／微粒子の、各チャネルにおける蛍光シグナル、位置、直径／体積などを含む特徴を収集する。実験データを、個々の標識（結合したＣｙ３色素の濃淡（ｇｒａｄｕａｔｉｏｎ））およびそれらのそれぞれの特異的増幅を特定するＪｕｐｙｔｅｒスクリプトに適用する。

このＰＣＲは、終点まで増幅されるので、蛍光が陽性および陰性のドロップレットの総数が、個々の各標識について測定される。陽性ドロップレットは、少なくとも１コピーの特定の標的を含むので、規定の強度閾値を超える蛍光シグナルの増加を示す。その閾値は、以前に行われた鋳型なしの増幅反応から導かれるか、または統計を用いて各実験において決定される。各ナノリアクタータイプに対する陰性および陽性画分をクラスター化し、陽性ドロップレットの画分をポアソンアルゴリズムに当てはめて、標的ＲＮＡ分子の開始濃度を、コピー／μＬ（コピー／ｍＬ）投入量を単位として求める。上に記載されたアッセイは、３つの異なるサンプルにおけるＨＣＶの同時検出をもたらすので、それらのリアクターは、６つの群にクラスター化される：

デジタルＰＣＲのエンドポイントデータクラスター

ＰＣＲ増幅後の、色で標識されたアガロース－ゼラチンハイブリッド微粒子の蛍光画像を図１０Ａに示す。３つの標識は、チャネル１においてその蛍光強度によって認識できる。チャネル２は、内部プロセスコントロール（ＭＳ２ファージ）に対する蛍光シグナルを表し、チャネル３は、ＨＣＶ標的のＰＣＲ増幅に特異的な蛍光を表す。各標識は、処理および分析された異なるサンプルに対応する。図１０Ｂ（上のグラフ）は、異なるビーズに対して測定された蛍光強度のヒストグラムを示している。３つの別個の標識種が見られる。チャネル２（ＭＳ２）およびチャネル（３）についてそれぞれのビーズ種にわたって見られたシグナル分布を表しているバイオリンプロットが、中央および下のグラフに示されている。ポアソン分析を適用することによって、実測値が、ビーズに適用されたサンプル体積あたりの具体的なコピー数（ｃｐ／μｌ）に換算される。
実施例３：アガロース－ゼラチンハイブリッドビーズのＲＮＡ結合能

様々な濃度の異なるゼラチンおよびアガロースＡ４０１８からなる様々なハイブリッドビーズについて、ＲＮＡの結合を調べる。微粒子上の結合したＲＮＡを、ＲＮＡ色素アッセイを用いて定性的に計測するか、または上に記載されたデジタルＰＣＲの形式を用いて定量的に計測した。

ビーズの調製
以下の変更を加えて、先に記載したように微粒子を作製した：
・ゼラチンの標識画分を取り除くことにより、未標識の微粒子を得た
・微粒子を作製するためのハイブリッドヒドロゲル溶液は、異なる濃度のアガロースおよびゼラチン、すなわち：
ａ）１．３％ゼラチン、１．０％アガロース
ｂ）０．５％ゼラチン、０．５％アガロース
ｃ）１．３％ゼラチン、０．５％アガロース
ｄ）２．０％ゼラチン、０．５％アガロース
ｅ）４．０％ゼラチン、０．５％アガロース
からなった
・２つの各製造業者の２つの異なるゼラチンタイプ、すなわち：
・ＧＥＬＩＴＡ Ｉｍａｇｅｌ ＡＰ（タイプＡ）
・ＧＥＬＩＴＡ Ｉｍａｇｅｌ ＳＩ（タイプＢ）
・Ｇ１８９０のアセトン不溶性画分（Ｓｉｇｍａ，タイプＡ）
・Ｇ９３９１のアセトン不溶性画分（ＳｉｇｍａタイプＢ）
を微粒子製作のために使用した
ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ結合アッセイ

ＵＶ－Ｓｔａｒマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）のウェルを、１×結合緩衝液（成分４）中の３μＬの５０％ビーズスラリーで満たす。異なる調製物由来の１ｎｇ／μＬという最終濃度のＲＮＡ、すなわち、ＲＮＡ－スペーサー（Ｍｅｔａｂｉｏｎ）、ビール酵母由来のｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）および血液から抽出された全ＲＮＡを、１５℃で５～１０分間インキュベートして、多孔性ヒドロゲルマトリックス内／上に浸透させ、結合させる。結合が急速に起きるので、ＲＮＡをビーズに加えた後すぐの混合が、ビーズ全体にわたるＲＮＡの均一な分布にとって極めて重要である。

ハイブリッド微粒子に結合したＲＮＡを可視化するために、０．５μＬの１：２希釈されたＱｕａｎｔ－ｉＴ^ＴＭＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ＲＮＡ試薬アリコートをマイクロタイターウェルにピペットで移し、混合する。ビーズを２００μＬのＴＥ緩衝液で２回洗浄し、続いて、蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ）およびｐＥ－４０００（ＣｏｏｌＬＥＤ Ｌｔｄ．）光源を用いて蛍光シグナルを計測した。

図１１は、微粒子の組成を調整することにより、結合の特色を最適化することができることを示している。Ａ４０１８と組み合わせたとき、ＧＥＬＩＴＡ Ｉｍａｇｅｌ Ａゼラチンは、ＳｉｇｍａのＧ１８９０タイプＡゼラチンのアセトン不溶性画分と比べて、比較的弱いＲｉｂｏＧｒｅｅｎシグナルをビーズ上にもたらす。０．５％アガロースと組み合わされた＞１．３％ゼラチンから作製されたハイブリッドビーズを用いると、全ＲＮＡ、ｔＲＮＡおよび短ＲＮＡフラグメントがより多く結合され得る。１％アガロースとの組み合わせでも、試験されたＲＮＡについてより良いシグナルが得られる（全ＲＮＡサンプルの結果は欠測している）。ゼラチンタイプＢは、ビーズ上でのＲＮＡ濃縮に関してタイプＡと異なって作用する。上記ＲＮＡのいずれに対しても、ＧＥＬＩＴＡ ＳＩゼラチンビーズについてシグナルはほぼ見えないが（粒子への拡散だけで濃縮されていないことを意味する）、Ｇ９３９１ゼラチンタイプＢのアセトン不溶性画分から作製されたビーズは、ＲＮＡスペーサー１およびｔＲＮＡに対しては弱いが、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎシグナルを示す。全体的に見て、全ＲＮＡ、ｔＲＮＡおよび短ＲＮＡフラグメントは、＞１．３％ゼラチンと０．５％アガロースとを組み合わせて作製されたハイブリッドビーズに、より多く結合され得る。

図１２は、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ^ＴＭＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ＲＮＡ試薬で可視化された微粒子への酵母由来の全ＲＮＡの結合を経時的に示している。このアッセイ形式では、微粒子へのＲＮＡの結合を直接モニタリングすることも可能である。画像を６秒ごとに取得し、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎシグナルの増大を直接計測することができる。
デジタルＰＣＲによるＲＮＡ結合の定量化

本発明に係る微粒子のＲＮＡ結合能の定量的評価のために、ナノリアクター内でのデジタルＰＣＲを上に記載されたように行った。本微粒子は、凝固した粒子から液状のドロップレットに移行できるので、結合とデジタルＰＣＲ検出マトリックスとの両方を提供することが可能である。したがって、結合したＨＣＶ ＲＮＡ分子をビーズ上で直接計測できる。あるいは、ドロップレットを生成するためのＤＧ８カートリッジ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、上清をデジタル形式で計測することもできる。

精製された（ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）Ａｃｃｕｐｌｅｘ ＨＣＶ ＲＮＡ（Ｓｅｒａｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を含む４０μＬの結合緩衝液（成分４）を４０μＬのビーズベッドに加え、１５℃で５分間、１０００ｒｐｍにてインキュベートして、ＲＮＡを結合させる。その後、ビーズを３００×ｇで３０秒間遠心し、上清をその後の分析のために氷上で維持する。４０μＬの２×試薬混合物（成分Ｘ）をビーズベッド（４０μＬ）に加えると、１０００ｒｐｍで振盪しながらの１５℃における５分間という短いインキュベーションによって、増幅試薬および検出試薬がヒドロゲルマトリックスに拡散する。
成分Ｘ：試薬混合物（２×）
－リボヌクレアーゼ阻害剤を含む２×耐熱性逆転写酵素（ｂｉｏｔｅｃｈｒａｂｂｉｔ ＧｍｂＨ）
－０．４Ｕ／μｌ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ｂｉｏｔｅｃｈｒａｂｂｉｔ ＧｍｂＨ）
－０．８ｍＭ ｄＮＴＰ（ｂｉｏｔｅｃｈｒａｂｂｉｔ ＧｍｂＨ）
－０．２％（ｗ／ｖ）低バイオバーデンでプロテアーゼフリーの分子生物学用ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）
分析物特異的試薬（ＨＣＶ）
－０．８μＭ ＨＣＶ－Ｂｒｕｎセンスプライマー（５’－ＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡ－３’）配列番号１
－０．８μＭ ＨＣＶ－Ｂｒｕｎアンチセンスプライマー（５’－ＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴ－３’）配列番号２
－０．８μＭ ＨＣＶ－Ｂｒｕｎ ＴａｑＭａｎプローブ（５’－Ａｔｔｏ６４７－ＣＣＧＡＧＴＡＧＹＧＴＴＧＧＧＴＹＧＣＧＡＡＡＧＧ－ＢＨＱ－２－３’）配列番号３

ビーズの相間移動、増幅反応および分析を先に記載したように行う。上清（４０μＬ）にＰＣＲ試薬（４０μＬの２×試薬混合物）を補充し、続いて、ＤＧ８カートリッジ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて乳化する。２～５％Ｐｉｃｏｓｕｒｆ２（Ｓｐｈｅｒｅ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ）を含む１００μＬのエマルジョン試薬ＨＦＥ－７５００および４０μＬをカートリッジの下のウェルに適用する。収集ウェルに接続されたシリンジを軽く引くことによって、そのウェルに真空を適用する。ドロップレットを収集し、デジタル分析に向けて別個の検出チャンバーに移す。ドロップレットの増幅反応および分析の設定は、ビーズに対する設定と同一である。また、等体積の２×試薬混合物およびＰＣＲ緩衝液からなる参照サンプルも同様に乳化し、分析する。

図１３は、２つの異なる組成の微粒子の濃縮能力を評価するようにデザインされたこれらの実験の要約データを示している。黒点は、微粒子とのインキュベーション前のサンプル中の標的濃度を示している。白色の棒は、インキュベーション後に検出された上清中の標的濃度を表しており、灰色の棒は、微粒子上の標的濃度を表している。濃縮効果が明らかに見られる。

図１４は、微粒子における標的を定量化するための上記でさらに概説された、デジタルＰＣＲとリアルタイム定量的ＰＣＲとを組み合わせた分析アプローチの精度を示している。両方の方法に対する信頼区間が示されている。λ＝５ｃｐ／微粒子（ｃｐ＝コピー）における縦線は、それらの方法を交換可能に使用できる近似値を示している（「ＣＩ」＝信頼区間）。

図１５は、ＰＣＲ増幅の間、オイル中の微粒子上で収集された一連の画像から得られたリアルタイム蛍光データを示している。増幅に特異的な１つの蛍光チャネルにおいて検出されたエンドポイント蛍光シグナルを含む検出チャンバーのスティッチ画像を左側に示す。中央のグラフは、左側の蛍光画像から選択された１２個の代表的な個々の微粒子に対する経時的な蛍光強度を例示として示している。蛍光画像において検出された各微粒子に対するｃｔ値の計算値の分布が右側のヒストグラムに示されている。

Claims (27)

1. 複数の生物学的液体サンプル中の目的分析物を検出および／または定量化する方法であって、前記方法は、サンプル特異的プロセス部分の後に一般的プロセス部分を含み；
   前記サンプル特異的プロセス部分は、以下の工程：
   －目的分析物を含むと疑われる複数の異なる生物学的液体サンプル、および異なって標識された複数の多孔性微粒子サブセットを任意の順序で別々に提供する工程であって、前記複数のサブセットにおいて、前記サブセットの各々は、他のサブセットから分離している、工程；
   －前記別個の微粒子サブセットの各々をそれぞれ１つの生物学的液体サンプルに別々に曝露することで、各サンプルが、水性環境において、特異的に標識された１つの多孔性微粒子サブセットによって吸い上げられることが可能になることによって、前記異なる生物学的サンプルの各々を特異的に標識する工程；
   －多孔性微粒子の各サブセットを前記水性環境から非水性環境に別々に移す工程
   を含み；
   前記一般的プロセス部分は、以下の工程：
   －前記非水性環境中の前記異なって標識された多孔性微粒子サブセットを一緒に混合することで、異なって標識された複数の多孔性微粒子サブセットの懸濁液が生成される工程；
   －前記異なって標識された複数の多孔性微粒子サブセットの前記懸濁液に対して、前記目的分析物を検出するための検出反応を行う工程；および
   －前記異なって標識された懸濁微粒子サブセットのいずれかに前記目的分析物が存在する場合、前記目的分析物を検出および／または定量化する工程
   を含む、方法。
2. 前記別個の微粒子サブセットの各々をそれぞれ１つの生物学的液体サンプルに別々に曝露する前記工程において、前記別個の微粒子サブセットの各々が、それぞれ１つの生物学的サンプルおよび化学的または生化学的な検出反応を行うための検出組成物に任意の順序で曝露され、各微粒子サブセットが、曝露された前記それぞれの生物学的サンプルおよび前記検出組成物を吸い上げる、請求項１に記載の方法。
3. 前記方法が、以下の工程：
   ａ．目的分析物を含むと疑われる複数の別個の生物学的液体サンプルおよび複数の多孔性微粒子を任意の順序で別々に提供する工程であって；前記多孔性微粒子の各々は、多孔性マトリックスを有し、かつ所定体積の液体を前記多孔性マトリックスの中に受け取るように構成されており；前記複数の多孔性微粒子には、提供される異なる微粒子サブセットがあり、各微粒子サブセットは、それぞれの前記サブセットに付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、特異的な標識成分を特徴とし；前記提供する工程において、提供される異なる微粒子サブセットの数は、少なくとも、提供される別個の生物学的液体サンプルの数と同じであり、さらに、前記提供する工程において、前記異なる微粒子サブセットが、互いとは別個に提供され；必要に応じて、前記異なる別個の微粒子サブセットは、それらのそれぞれの多孔性マトリックスに、分析物の化学的または生化学的な検出反応を行うための試薬を含む検出組成物を含む、工程；
   ｂ．別個の各微粒子サブセットを厳密に１つの別個の生物学的液体サンプルに曝露し、それにより、別個の各微粒子サブセットが、所定体積の厳密に１つの別個の生物学的液体サンプルとインキュベートすることおよびそのようなサンプルまたはその一部を吸い上げること、ならびに必要に応じて、前記サンプル中に分析物が存在する場合、前記微粒子のマトリックス内またはマトリックス上に分析物を蓄積することが可能になる工程；およびさらに必要に応じて、前記異なる別個の微粒子サブセットが、工程ａ）において提供されるとき、分析物の化学的または生化学的な検出反応を行うための試薬をまだ含んでいない場合、別個の各微粒子サブセットを、分析物の化学的または生化学的な検出反応を行うための試薬を含む検出組成物に曝露し、それにより、別個の各微粒子サブセットが前記試薬を受け取ることが可能になる工程；
   ｃ．各微粒子サブセットを別々に非水相に移し、前記サブセットの個々の製作済み微粒子のまわりの水相の一部または全部を除去することにより、前記分析物を検出するための複数の別個の隔離された反応空間サブセットを作る工程であって、その反応空間は、サンプルおよび分析物の化学的または生化学的な検出反応を行うための前記試薬を含む水相を含み、その反応空間は、前記微粒子の空隙体積に限定される、工程；
   ｄ．前記非水相において前記別個の異なる微粒子サブセットを混合して、前記異なる微粒子サブセットのすべてが、前記非水相において異なる微粒子の懸濁液を形成し；前記混合された異なる微粒子サブセットを、分析物の化学的または生化学的な検出反応を行うために必要な条件に供し；前記目的分析物のそのような検出反応を行い；前記目的分析物が前記それぞれのサブセットに存在する場合、それぞれの微粒子サブセットにおける前記検出反応において生成されたシグナルを用いて、前記異なる微粒子サブセットのいずれかに前記目的分析物が存在する場合、前記目的分析物を検出および／または定量化する工程
   を含む、特に請求項１および２のいずれかに記載の複数の生物学的液体サンプル中の目的分析物を検出および／または定量化する方法。
4. 前記方法が、工程ｄ）において前記目的分析物が検出された微粒子サブセットを特定することによって、工程ａ）において提供された前記複数のサンプルのうちのどのサンプルが前記目的分析物を含んでいるかを判定する工程ｅ）であって、好ましくは、工程ｅ）における微粒子サブセットの前記特定は、それぞれの前記微粒子サブセットに付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、前記特異的な標識成分を用いて行われる、工程ｅ）をさらに含む、請求項３に記載の方法。
5. 工程ｂ）が、どの別個の微粒子サブセットがどのサンプルに曝露されているかまたは曝露されたかを示す第１の相関関係の記録を生成するサブ工程をさらに含み、工程ｄ）が、前記検出反応においてどの微粒子サブセットでシグナルが生成されたかを示す第２の相関関係の記録を生成するサブ工程を含む、請求項３～４のいずれかに記載の方法。
6. 工程ｅ）が、前記第１および第２の相関関係の記録を参照すること、ならびに前記記録を連結することによって行われることで、工程ａ）において提供された前記複数のサンプルのうちのどのサンプルが前記目的分析物を含むのかの判定が可能になる、請求項４～５に記載の方法。
7. 前記多孔性微粒子の各々が、
   （ｉ）前記多孔性マトリックスを形成するかまたは前記多孔性マトリックスである、ポリマーまたはポリマー混合物；または
   （ｉｉ）前記多孔性マトリックス上に固定化された、少なくとも１つのイオン化可能基または複数のイオン化可能基であって、前記イオン化可能基は、前記微粒子のまわりの周囲条件に従って電荷を変更できる、イオン化可能基；または
   （ｉｉｉ）前記多孔性マトリックス上に固定化された少なくとも１つの荷電基または複数の荷電基；または
   （ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの組み合わせ
   によって分析物に結合することによって、目的分析物の蓄積を可能にする多孔性マトリックスを有する、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
8. 前記多孔性微粒子の各々が、多孔性マトリックスを有し、前記多孔性マトリックスに付着されたまたは前記微粒子によって含められる分析物特異的試薬（ＡＳＲ）を含み、そのような分析物特異的試薬は、目的分析物の濃縮および／または前記分析物が関わる特異的なシグナル増幅反応もしくは標的増幅反応を可能にし；前記分析物特異的試薬は、目的分析物に特異的に結合することができ、好ましくは、前記分析物特異的試薬は、アプタマー、シュピーゲルマーを含む核酸；抗体または抗体フラグメント；分析物または分析物複合体に特異的に結合することができる非抗体タンパク質、例えば、レセプター、レセプターフラグメントおよび親和性タンパク質から選択され；好ましくは、前記分析物特異的試薬は、核酸、特に核酸オリゴマーおよび核酸プライマーから選択される、請求項１～６または７のいずれかに記載の方法。
9. 前記多孔性微粒子の各々が、その多孔性マトリックスに付着された同じ分析物特異的試薬を含むかまたは有する、請求項８に記載の方法。
10. 前記複数の多孔性微粒子の中に、異なる微粒子サブセットが存在し、
    各サブセットは、
    前記サブセットの前記微粒子に付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、異なる標識成分を有し；
    前記異なるサブセットのすべてが、
    前記サブセットの前記微粒子に付着されたまたはそれに含まれる同じ分析物特異的試薬を有し、前記分析物特異的試薬は、１つの目的分析物に特異的であり；
    前記異なる微粒子サブセットは、付着されたまたは含まれる前記分析物特異的試薬に関して同一であるが、
    各サブセットの前記微粒子に付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、それぞれの標識成分が異なり；
    各サブセットは、前記それぞれの標識成分によって明確に定義され、識別可能である、
    請求項９に記載の方法。
11. 前記方法が、複数の生物学的液体サンプル中の１つの目的分析物を検出および／または定量化する方法であり、提供される、好ましくは工程ａ）において提供される、異なる微粒子サブセットの数は、提供される別個の生物学的液体サンプルの数と等しい、請求項１～７のいずれかまたは請求項８～１０のいずれかに記載の方法。
12. 前記複数の多孔性微粒子の中に、前記微粒子に付着されたまたはそれに含まれるいくつかの異なる分析物特異的試薬が存在する、請求項８に記載の方法。
13. 異なる微粒子サブセットが存在し、各サブセットは、
    前記サブセットの前記微粒子に付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、異なる標識成分を有し；
    さらに、前記複数の多孔性微粒子の中に、異なるクラスの微粒子サブセットが存在し、サブセットの各クラスは、
    前記微粒子の多孔性マトリックスに付着されたまたは前記微粒子に含まれる異なる分析物特異的試薬を有し；好ましくは、少なくとも２つの異なるクラスの微粒子サブセット、より好ましくは、少なくとも３つまたはそれを超える異なるクラスの微粒子サブセットが存在し；
    前記異なる微粒子サブセットは、各サブセットの前記微粒子に付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、それぞれの標識成分が異なり；各微粒子サブセットは、１クラスの微粒子サブセットの一部を形成し；各サブセットは、それぞれの標識成分およびそれぞれの分析物特異的試薬によって明確に定義され、識別可能であり；
    前記異なるクラスの微粒子サブセットは、付着されたまたは含まれるそれぞれの分析物特異的試薬が異なり；前記異なるクラスの各々は、いくつかの微粒子サブセットを含み、そのサブセットのすべてが、付着されたまたは含まれる同じ分析物特異的試薬を有する、
    請求項１２に記載の方法。
14. 前記方法が、複数の生物学的液体サンプル中の１つより多い目的分析物を検出および／または定量化する方法であり、提供される、好ましくは工程ａ）において提供される異なる微粒子サブセットの数は、提供される別個の生物学的液体サンプルの数に、検出されるべき目的分析物の数を乗算した数と等しく、検出されるべき目的分析物の数と同じ数の微粒子サブセットのクラスが、提供される、好ましくは工程ａ）において提供される、請求項１２～１３のいずれかに記載の方法。
15. 前記多孔性マトリックスが、ポリマーまたはポリマー混合物によって形成された多孔性ポリマーマトリックスであり、好ましくは、前記多孔性ポリマーマトリックスは、架橋されていないポリマーから構成され、より好ましくは、前記多孔性ポリマーマトリックスを形成する前記ポリマーまたはポリマー混合物は、アガロースまたはアガロースとゼラチンとの組み合わせから構成され、より好ましくは、アガロースとゼラチンとの前記組み合わせにおいて、前記アガロースは、０．１％（ｗ／ｖ）～４％（ｗ／ｖ）の範囲内で存在し、前記ゼラチンは、０．１％（ｗ／ｖ）～２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは、０．５％（ｗ／ｖ）～２０％（ｗ／ｖ）の範囲内で存在する、請求項３～１４のいずれかに記載の方法。
16. 前記目的分析物が、核酸であり、前記検出反応が、核酸増幅であり、前記検出組成物が、緩衝液、モノヌクレオシド三リン酸、増幅酵素、例えば、好適な核酸ポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、および増幅産物、例えば、増幅された核酸を検出するための核酸色素、および必要に応じて、１対またはそれを超える増幅プライマー、およびさらに必要に応じて、そのようなプライマーおよび／またはプローブが、前記微粒子に付着されたまたはそれに含まれる分析物特異的試薬（ＡＳＲ）としてまだ提供されていない場合は、それぞれの分子プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ、分子ビーコンなど）を含む、核酸増幅を行うための組成物であり；かつ／または
    前記目的分析物が、タンパク質または他の非核酸分子であり、前記検出反応が、免疫化学検出反応であり、前記検出組成物が、そのような免疫化学検出反応を行うための組成物であり、前記方法において２つの別個の成分として提供され：前記検出組成物の第１の成分は、免疫化学検出反応を行うために必要な試薬、例えば、緩衝液、および前記免疫化学検出反応において分析物特異的試薬（ＡＳＲ）として使用される一次抗体、抗体フラグメントまたは非抗体タンパク質と同じ分析物に特異的であって、好適なレポーター酵素に結合された、二次抗体または二次抗体フラグメント；および必要に応じて、前記タンパク質分析物または他の非核酸分析物に特異的に結合することができる一次抗体、抗体フラグメントまたは非抗体タンパク質が、前記微粒子に付着されたまたはそれに含まれる分析物特異的試薬（ＡＳＲ）としてまだ提供されていない場合は、そのような一次抗体、抗体フラグメントまたは非抗体タンパク質を含み；前記検出組成物の第２の成分は、前記好適なレポーター酵素に適した基質を検出試薬として含み、その基質は、前記レポーター酵素によって反応されると、検出可能になる、好ましくは、光学的に検出可能になる、より好ましくは、蛍光によって検出可能になる、請求項３～１５のいずれかに記載の方法。
17. 前記目的分析物を検出および定量化する前記工程において、前記分析物の定量化は、
    ａ）デジタル核酸増幅、特にデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；
    ｂ）リアルタイム定量的核酸増幅、特にリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；
    ｃ）免疫化学検出法、特にデジタル免疫化学検出法、例えば、デジタルイムノアッセイ、例えば、デジタル酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）；
    ｄ）免疫化学検出法、特に、核酸増幅と組み合わされるデジタル免疫化学検出法、例えば、イムノポリメラーゼ連鎖反応；特にデジタル免疫－ＰＣＲ；および
    ｅ）ａ）～ｄ）のいずれかの組み合わせ
    から選択される方法によって行われ；
    前記目的分析物が、核酸である場合、定量化は、方法ａ）もしくはｂ）のいずれかまたはａ）とｂ）との組み合わせを用いて行われ；前記分析物が、タンパク質、ペプチドまたは他の非核酸分析物である場合、定量化は、方法ｃ）またはｄ）のいずれかを用いて行われる、
    前述の請求項のいずれかに記載の方法。
18. 複数の生物学的液体サンプル中の目的分析物を検出するため、特に、請求項１～１７のいずれかに記載の方法を行うためのキットであって、前記キットは、
    －複数の微粒子を含む複数の容器であって、各容器は、前記複数の多孔性微粒子サブセットを含み、各サブセット内の前記多孔性微粒子の各々は、多孔性マトリックスを有し、かつ所定体積の液体を前記多孔性マトリックスの中に受け取るように構成されており；各微粒子サブセットは、それぞれのサブセットに付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、特異的な標識成分を特徴とし、好ましくは、前記微粒子は、請求項１～１７のいずれかにおいて定義されたとおりであり；必要に応じて、前記微粒子を洗浄するための水性洗浄試薬を含む、容器；
    －目的分析物を検出するための検出組成物を含む容器であって；前記検出組成物は、分析物の化学的または生化学的な検出反応を行うための試薬を含み；前記検出組成物は、核酸増幅を行うための組成物であるか、または免疫化学検出反応を行うための組成物である、容器；
    －前記異なる微粒子サブセットの各々が生物学的液体サンプルに曝露された後、前記異なる微粒子サブセットを非水相に移すため、および非水相において別個の異なる微粒子サブセット懸濁液を生成するための、非水相を含む容器；
    －前記別個の異なる微粒子サブセット懸濁液を前記非水相において一緒に混合するための混合容器であって、前記異なる微粒子サブセット懸濁液のすべてが、その後検出反応に供される、異なる微粒子の単一の懸濁液を前記非水相において形成する、混合容器；
    －検出反応を行うための容器
    を含む、キット。
19. 前記多孔性微粒子の各々が、その多孔性マトリックスに付着された分析物特異的試薬（ＡＳＲ）を有するか、または分析物特異的試薬（ＡＳＲ）を含み、そのような分析物特異的試薬は、目的分析物の濃縮および／または前記分析物が関わる特異的なシグナル増幅反応もしくは増幅反応を可能にし；前記分析物特異的試薬は、目的分析物に特異的に結合することができ、好ましくは、前記分析物特異的試薬は、アプタマー、シュピーゲルマーを含む核酸；抗体または抗体フラグメント；分析物または分析物複合体に特異的に結合することができる非抗体タンパク質、例えば、レセプター、レセプターフラグメントおよび親和性タンパク質から選択され；好ましくは、前記分析物特異的試薬は、核酸、特に核酸オリゴマーおよび核酸プライマーから選択される、請求項１８に記載のキット。
20. 前記目的分析物が、核酸であり、前記検出反応が、核酸増幅であり、前記検出組成物が、緩衝液、モノヌクレオシド三リン酸、増幅酵素、例えば、好適な核酸ポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、および増幅産物、例えば、増幅された核酸を検出するための核酸色素、および必要に応じて、１対のプライマーが、前記微粒子に付着されたまたはそれに含まれる分析物特異的試薬（ＡＳＲ）としてまだ提供されていない場合、そのようなプライマーを含む、核酸増幅を行うための組成物であるか；または
    前記目的分析物が、タンパク質または他の非核酸分子であり、前記検出反応が、免疫化学検出反応であり、前記検出組成物が、そのような免疫化学検出反応を行うための組成物であり、前記キットにおいて２つの別個のコンパートメントまたは容器に提供され；前記検出組成物は、免疫化学検出反応を行うために必要な試薬、例えば、緩衝液、および前記免疫化学反応において分析物特異的試薬（ＡＳＲ）として使用される一次抗体、抗体フラグメントまたは非抗体タンパク質と同じ分析物に特異的であって、好適なレポーター酵素に結合された、二次抗体または二次抗体フラグメントを第１のコンパートメントまたは容器に含み；必要に応じて、前記タンパク質分析物または他の非核酸分析物に特異的に結合することができる一次抗体、抗体フラグメントまたは非抗体タンパク質が、前記微粒子に付着されたまたはそれに含まれる分析物特異的試薬（ＡＳＲ）としてまだ提供されていない場合は、そのような一次抗体、抗体フラグメントまたは非抗体タンパク質を含み；前記検出組成物は、前記好適なレポーター酵素に適した基質を検出試薬として第２のコンパートメントまたは容器に含み、その基質は、前記レポーター酵素によって反応されると、検出可能になる、好ましくは、光学的に検出可能になる、より好ましくは、蛍光によって検出可能になる、請求項１８～１９のいずれかに記載のキット。
21. 前記多孔性微粒子の各々が、その多孔性マトリックスに付着された同じ分析物特異的試薬を有するか、または同じ分析物特異的試薬を含む、請求項１８～２０のいずれかに記載のキット。
22. 前記複数の多孔性微粒子の中に、異なる微粒子サブセットが存在し、
    各サブセットは、
    前記サブセットの前記微粒子に付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、異なる標識成分を有し；
    前記異なるサブセットのすべてが、
    前記サブセットの前記微粒子に付着されたまたはそれに含まれる同じ分析物特異的試薬を有し、前記分析物特異的試薬は、１つの目的分析物に特異的であり；
    前記異なる微粒子サブセットは、付着されたまたは含まれる前記分析物特異的試薬に関して同一であるが、
    各サブセットの前記微粒子に付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、それぞれの標識成分が異なり；
    各サブセットは、前記それぞれの標識成分によって明確に定義され、識別可能であり、別個の容器に提供されている、
    請求項２１に記載のキット。
23. 前記キットが、複数の生物学的液体サンプル中の１つの目的分析物を検出するためのキットであり、前記キットに提供される異なる微粒子サブセットの数は、提供される別個の生物学的液体サンプルの数と等しい、請求項２１～２２のいずれかに記載のキット。
24. 前記複数の多孔性微粒子の中に、前記微粒子に付着されたまたはそれに含まれるいくつかの異なる分析物特異的試薬が存在する、請求項１８～２０のいずれかに記載のキット。
25. 異なる微粒子サブセットが存在し、
    各サブセットは、
    前記サブセットの前記微粒子に付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、異なる標識成分を有し；
    さらに、前記複数の多孔性微粒子の中に、異なるクラスの微粒子サブセットが存在し、サブセットの各クラスは、
    前記微粒子の多孔性マトリックスに付着されたまたは前記微粒子に含まれる異なる分析物特異的試薬を有し；好ましくは、少なくとも２つの異なるクラスの微粒子サブセット、より好ましくは、少なくとも３つまたはそれを超える異なるクラスの微粒子サブセットが存在し；
    前記異なる微粒子サブセットは、各サブセットの前記微粒子に付着された、それに含まれる、またはその他の方法でそれと会合された、それぞれの標識成分が異なり；各微粒子サブセットは、１クラスの微粒子サブセットの一部を形成し；各サブセットは、それぞれの標識成分およびそれぞれの分析物特異的試薬によって明確に定義され、識別可能であり、別個の容器に提供されており；
    前記異なるクラスの微粒子サブセットは、前記微粒子の多孔性マトリックスに付着されたまたは前記微粒子に含まれるそれぞれの分析物特異的試薬が異なり；前記異なるクラスの各々は、いくつかの微粒子サブセットを含み、そのサブセットのすべてが、付着されたまたは含まれる同じ分析物特異的試薬を有する、
    請求項２４に記載のキット。
26. 前記キットが、複数の生物学的液体サンプル中の１つより多い目的分析物を検出するためのキットであり、前記キットに提供される異なる微粒子サブセットの数は、提供される別個の生物学的液体サンプルの数に、検出されるべき目的分析物の数を乗算した数と等しく、前記キットには、検出されるべき目的分析物の数と同じ数の微粒子サブセットのクラスが提供される、請求項２４～２５のいずれかに記載のキット。
27. 請求項１～１７のいずれかに記載の複数の生物学的液体サンプル中の目的分析物を検出および／または定量化する方法を行うためのカートリッジであって、好ましくは、前記カートリッジは、複数のサンプル特異的モジュール、複数の保存チャンバー、非水相を保存するための少なくとも１つの非水相チャンバー、および一体化した単一の混合・検出チャンバーまたは別個の混合チャンバーと別個の検出チャンバーとの組み合わせを備え；
    各サンプル特異的モジュールは、それ自体の別個のサンプル入口を有するサンプルコンパートメントを含み、各サンプル特異的モジュールは、厳密に１つの生物学的サンプルだけをそれぞれのサンプルコンパートメントの中に別々に受け取るように構成されており；各サンプル特異的モジュールは、微粒子を前記サンプルコンパートメントの中に受け取るようにさらに構成されており、前記微粒子は、請求項１～１７のいずれかに定義されているとおりであり；各サンプル特異的モジュールは、水性環境から非水性環境への前記微粒子の相間移動を容易にするようにさらに構成されている、カートリッジ。

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