KR20220114630A - 복수의 생물학적 액체 샘플에서 관심 분석물을 검출 및/또는 정량하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 복수의 생물학적 액체 샘플에서 관심 분석물을 검출 및/또는 정량하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 복수의 샘플에서 관심 분석물을 검출 및/또는 정량하는 방법을 수행하기 위한 키트 및 카트리지에 관한 것이다.
Description
본 발명은 복수의 생물학적 액체 샘플에서 관심 분석물을 검출 및/또는 정량하는 방법에 관한 것이다.
진단 분야에서 샘플 풀링(pooling) 및 샘플 바 코딩(coding) 전략이 수립되었으며 많은 수의 생물학적 샘플 처리에 일반적으로 사용된다.
진단 분야의 샘플 풀링 전략은 일반적으로 서로 다른 샘플의 정의된 볼륨을 결합한 풀을 테스트하는 것을 기반으로 한다. 일반적으로 샘플은 중복(duplicates)으로 얻어지고, 하나의 부본(duplicate)은 저장을 위해 보관되고, 다른 부본은 결합된 풀에 추가된다. 이러한 결합된 풀이 양성으로 테스트되면, 동일한 풀에서 저장된 부본 샘플을 개별적으로 테스트하여 최종적으로 양성 샘플을 식별한다. 양성 결과를 제공한 결합된 풀에서 개별 부본 샘플을 테스트하는 과정을 "리플렉싱(re-flexing)"이라고도 한다. 특히, 일반적으로 각각의 테스트된 분석물에 대해 음성 결과를 제공할 것으로 예상되는 샘플에서, 이러한 풀링 전략은 저비용 접근 방식을 제공한다. 그러나 풀링의 정도는 테스트의 민감도에 직접적인 영향을 미치며, 리플렉싱을 수행하려면 단일 소스에서 최소한 부본 샘플을 확보해야 하고 이러한 부본 샘플의 신중하고 통제된 보관과 복잡한 테스트 실행 계획을 필요로 한다.
종종 샘플 인덱싱이라고도 언급되는 샘플 바코딩(barcoding)은 멀티플렉스 시퀀싱 및 멀티플렉스 분석을 위해 샘플에 표지하기(labelling) 위해 자주 사용되는 접근 방식이다. 샘플의 모든 핵산은 동일한 서열 태그로 표지되고, 결과 라이브러리는 다른 라이브러리와 풀되고(pooled) 단일 실행에서 병렬로 시퀀싱된다(sequenced). 그 후, 샘플-지정된(sample-specific) 인덱스를 통해 소프트웨어는 샘플-지정된 데이터 세트에서 다중화된(multiplexed) 시퀀스 데이터를 분리할 수 있다.
분자 바코딩은 샘플의 각 분자가 PCR 증폭 전에 서로 다른 고유한 서열로 표지된다는 점에서 샘플 인덱싱과 상이하다. 출발 물질(즉, 샘플 내)의 각 핵산이 고유한 서열로 표지된 경우, 즉 "분자 바코드"("MBC"), 서열 분석 소프트웨어는 중복 판독 및 PCR 오류를 필터링하여 고유 판독을 보고할 수 있다. 샘플 바코딩뿐만 아니라 분자 바코딩은 핵산이 특정 분자 서열 표지로 태그되는 점에서 공통된다.
다른 종류의 바코딩 기술은 고처리량 유세포 분석을 위한 세포 기반 다중화 기술인 형광 세포 바코딩(FCB)이다. 바코드된 샘플은 일괄적으로 염색 및 획득될 수 있어, 염색 변동성 및 항체 소비를 최소화하고, 필요한 샘플 부피를 줄일 수 있다 (Krutzik et al., 2011 "Fluorescent cell barcoding for multiplex flowcytometry", Curr. Protoc. Cytom., Chapter 6, Unit 6.31).
특히 카트리지 기반 테스트와 관련하여, 특히 1카트리지/1샘플 접근의 맥락에서, 카트리지의 크기와 비용으로 인해 처리량 측면에서 제한이 있다. 이러한 종류의 카트리지의 예로는 Cepheid의 GenExpert, Biocartis의 Idylla, Abbott의 m-Pima 등이 있다. 더 높은 처리량은 일반적으로 동일한 기기 리소스를 추가하고 한 번에 많은 카트리지를 실행함으로써 달성된다. 또한 단일 플랫폼에서 여러 샘플을 처리할 수 있는 카트리지도 있다. 그러나 이러한 카트리지는 일반적으로 예를 들어 다양한 분석 물질에 대한 샘플을 테스트하기 위해 각 개별 샘플에 대해 별도의 분석 공정을 수행하도록 설계되었으며, 이에 따라 이러한 카트리지는 개별 샘플에 대한 개별 분석 도구와 유사한 구성 요소의 구성일 뿐이다. 이러한 설정은 여러 샘플을 병렬로 처리해야 하는 경우, 예를 들어 다수의 샘플이 동일한 분석물에 대해 테스트되는 경우에도 유용하며, 이러한 설정은 각 기기의 처리량을 증가시키거나 단순히 분석 카트리지에 샘플을 로딩할 때 보다 적은 시간을 제공하는 데 도움된다. 그러한 도구의 한 예가 BDMax 시스템이다. 기존 카트리지 기반 진단 도구에 대한 포괄적인 검토는 Relich et al. 2018; "Syndromic and Point-of-Care Molecular Testing", Advances in Molecular Pathology 1(1): 97-113에 나와 있다.
더 높은 처리량 및 기기 활용도를 달성하는 동시에 폐기물을 덜 생산하고 비용도 덜 들게 하는 것이 당업계에 계속해서 요구되고 있다. 또한 하드웨어 및 시약 리소스를 최대한 활용할 수 있는 단일 공정으로 하나의 시스템 내에서 여러 샘플을 처리해야 할 필요성이 계속되고 있다. 또한, 당업계에서는 이러한 개별적으로 할당되고 식별 가능한 다수의 샘플에 대해 단일 검출 반응을 수행하는 것을 용이하게 하는 개별 동일성을 분석할 개별 샘플을 할당할 수 있는 공정을 제공할 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명은 상기 및 이와 관련된 요구들을 다룬다. 한 측면에서, 본 발명은 복수의 생물학적 액체 샘플에서 관심 분석물을 검출 및/또는 정량하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 2개의 하위 공정(sub-processes), 하나의 샘플 특이적 하위 공정 및 하나의 일반(generic) 하위 공정을 포함한다.
본 명세서에서 종종 "샘플 특이적 공정 부분", "특이적 공정 부분" 또는 "특이적 부분"이라고도 하는 "샘플 특이적 하위 공정"은, 나중에 식별되고 다른 샘플과 구별될 수 있도록, 각각의 샘플을 개별적으로 특이적으로 표지된(labelled)(본 명세서에서 또한 종종 "인코딩된(encoded)"으로 언급됨) 절차 또는 조건을 거치는 부분이다.
"일반 하위 공정" 또는 "일반 공정 부분" 또는 "일반 부분"은 모든 샘플이 분석물의 검출을 허용하는 동일한 조작을 거치는 부분이다. 이러한 일반 부분은 샘플 특이적 절차, 취급 또는 조작을 포함하지 않으며 일반적으로 샘플 식별에 관계없이 조사 중인 모든 샘플에 대해 수행된다.
일 실시예에서, 상기 샘플 특이적 공정 부분은 다음 단계를 포함한다:
- 관심 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 복수의 상이한 생물학적 액체 샘플 및 다공성 미세입자의 상이하게 표지된 복수의 하위세트(subset)를 임의의 순서로 개별적으로 제공하는 단계로서, 상기 다공성 미세입자의 복수의 하위세트에서, 상기 하위세트 각각은 다른 하위세트로부터 분리된 단계;
- 상기 미세입자의 개별 하위세트 각각을 각각 하나의 생물학적 액체 샘플에 각각 개별적으로 노출시켜 상기 상이한 생물학적 샘플 각각을 특이적으로 표지하여, 각각의 샘플이 수성 환경에서 다공성 미세입자의 하나의 특이적으로 표지된 하위세트에 의해 흡수되도록 하는 단계;
- 다공성 미세입자의 각 하위세트를 상기 수성 환경에서 비수성 환경으로 개별적으로 이동시키는 단계;
일 실시예에서, 상기 일반 공정 부분은 다음 단계를 포함한다:
- 상기 비수성 환경에서 다공성 미세입자의 상이하게 표지된 하위세트를 함께 혼합하고, 이에 따라 그 안에 다공성 미세입자의 상이하게 표지된 복수의 하위세트의 현탁액을 생성하는 단계;
- 상기 다공성 미세입자의 상이하게 표지된 복수의 하위세트의 상기 현탁액 상에서, 상기 관심 분석물을 검출하기 위한 검출 반응을 수행하는 단계; 및
- 상기 현탁된 미세입자의 상이하게 표지된 하위세트 중 임의의 것이 존재하는 경우, 상기 관심 분석물을 검출 및/또는 정량하는 단계.
"상기 복수의 하위세트에서, 상기 다공성 미세입자의 하위세트 각각은 다른 하위세트로부터 분리된"이라는 문구, 및 본원에 사용된 용어 "분리된 하위세트"라는 용어는 이러한 미세입자의 하위세트가 다른 하위세트와 물리적으로 분리된 시나리오를 의미하는 것이다. 일 실시예에서, 서로 "분리된" 2개의 하위세트는 상이한 위치에 있고 및/또는 거시적으로(macroscopically) 구별될 수 있고 및/또는 물리적 장벽에 의해 분리되어 있으며, 바람직하게 샘플 간에 혼합 또는 교차 오염이 발생할 수 없도록 한다. 따라서, 각 "분리된 하위세트"는 이러한 하위세트의 개별 처리를 허용하는 형태로 제공되는 것이 바람직하다. 상이한 하위세트의 물리적 분리는 예를 들어 그러한 하위세트를 둘러싸는 장벽에 의해 달성될 수 있다. 간단한 실시예에서, 이러한 분리된 하위세트는 자체 컨테이너 또는 구획에 위치할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 실시양태에 따르면, (분석물의) 검출 및/또는 정량화 반응이 수행되기 전에, 하위세트는 서로 분리된다. 사용 중, 예를 들어 검출 반응 동안, 보다 구체적으로 그러한 검출 반응의 일반 부분 동안, 미세입자 라이브러리의 일부 또는 전체 하위세트가 결국 결합될 수 있다. 놀랍게도, 본 발명자들은, 이러한 혼합물에서 그들이 비수성 상으로 이동됨으로써 서로 분리되는 경우, 결합/혼합되었을 때, 상이한 미세입자 간에 흘러넘침(spilling over) 또는 "크로스 토크(cross talk)"가 실제로 존재하지 않음을 발견하였다. 결과적으로 각각의 미세입자가 함께 혼합되었다는 사실에도 불구하고, 샘플 간의 교차 오염이 발생하지 않는다(분석 물질의 존재 여부를 테스트함). 본원에서 사용된 "다공성 미세입자의 상이하게 표지된 복수의 하위세트"라는 용어는 종종 "미세입자 라이브러리"로도 지칭된다.
본원에 사용된 "생물학적 액체 샘플"이라는 용어는 예를 들어 관심 분석물(들)에 접근 가능하거나 또는 추가 분석이 가능하도록 하기 위해, 추가 처리되거나 추가 처리되지 않았을 수 있는 유기체의 신체에서 얻은 액체 샘플을 의미한다. 바람직하게 이러한 "생물학적 액체 샘플"은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 땀, 눈물, 가래, 림프, 정액, 복수, 양수, 담즙, 모유, 활액, 복막액, 심낭액, 뇌척수액, 유미, 및 소변으로부터 선택되며, 더 바람직하게 상기 생물학적 액체 샘플은 혈장이다. 바람직하게는 이러한 생물학적 액체 샘플은 추가 처리되며, 이는 본 발명에 따른 방법에 적용되기 전에 용해되거나 소화되거나 달리 처리될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 액체 샘플이 혈장인 경우, 이러한 혈장은 후속 검출 반응을 방해할 수 있는 성분을 제거하기 위해 추가로 용해 및/또는 소화되었을 수 있다. 예를 들어, 관심 분석물이 특정 핵산인 경우, 생물학적 액체 샘플, 예를 들어 혈장은 본 발명에 따른 방법에 적용되기 전에, 먼저 프로테아제 및 기타 적합한 효소로 분해되어 임의의 원치 않는 단백질 또는 펩티드뿐만 아니라 지질 또는 기타 원치 않는 성분을 제거할 수 있다. 따라서 본 명세서에 사용된 "생물학적 액체 샘플"은 전술한 체액 중 임의의 것에서 얻은 추출물을 의미할 수도 있으며; 예를 들어, 적절한 추출을 통해, 예를 들어 세포 파괴(필요한 경우), 지질, 단백질 및 원치 않는 핵산의 제거(필요한 경우), 핵산의 정제 및/또는 특정 핵산의 농축을 사용하여, 전술한 임의의 체액으로부터 얻은 핵산 추출물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 추출물은 에탄올 또는 다른 적합한 알코올을 사용하여 생성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, (미세입자의) "라이브러리"라는 용어는 미세입자의 복수 또는 집합체를 의미하며, 여기서 이러한 미세입자의 복수 또는 집합체 또는 라이브러리에는 적어도 2개의 상이한 유형의 이러한 미세입자가 있으며, 또한 본원에서 종종 "하위 세트"라고도 한다. 바람직한 구체예에서, 조립식(prefabricated) 전구체-미세입자의 적어도 2개의 하위세트, 바람직하게는 조립식 전구체-미세입자의 3개 이상의 하위세트는, 각각의 하위세트는 부착된 별개의 표지 구성요소를 갖고, 상기 하위세트 내의 상기 미세입자 내에 포함되거나 그렇지 않으면 이와 연관되어, 상기 적어도 둘 이상의 미세입자의 하위세트가 그에 부착된 각각의 표지 구성요소에 의해 상이하도록, 각 하위세트 내에 포함되거나 또는 그렇지 않으면 연관된다. 이러한 상이한 하위세트의 라이브러리에서, 각각의 하위세트는 일반적으로 바람직하게는 서로 별도로, 예를 들어 다른 용기에 보관된다. 이는 본원에 사용된 "별도의 하위세트"라는 용어가 다른 하위세트와 물리적으로 분리된 미세입자의 집합체 또는 하위세트를 지칭함을 의미한다.
발명의 상세한 설명
한 측면에서, 본 발명은 복수의 생물학적 액체 샘플에서 관심 분석물을 검출 및/또는 정량화하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 샘플 특이적 공정 부분, 이후에 일반 공정 부분을 포함하며;
상기 샘플 특이적 공정 부분은 하기 단계를 포함하며:
- 관심 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 복수의 상이한 생물학적 액체 샘플 및 다공성 미세입자의 상이하게 표지된 복수의 하위세트를 임의의 순서로 개별적으로 제공하는 단계로서, 상기 복수의 하위세트에서, 상기 하위세트 각각은 다른 하위세트로부터 분리되는 단계;
- 상기 미세입자의 개별 하위세트 각각을 각각 하나의 생물학적 액체 샘플에 각각 개별적으로 노출시켜 상기 상이한 생물학적 샘플 각각을 특이적으로 표지하여, 각각의 샘플이 수성 환경에서 다공성 미세입자의 하나의 특이적으로 표지된 하위세트에 의해 흡수되도록 하는 단계;
- 다공성 미세입자의 각 하위세트를 상기 수성 환경에서 비수성 환경으로 개별적으로 이동시키는 단계;
상기 일반 공정 부분은 다음 단계를 포함한다:
- 상기 비수성 환경에서 상이하게 표지된 다공성 미세입자의 하위세트를 함께 혼합하고, 이에 따라 그 안에 다공성 미세입자의 상이하게 표지된 복수의 하위세트의 현탁액을 생성하는 단계;
- 다공성 미세입자의 상기 복수의 상이하게 표지된 하위세트의 상기 현탁액 상에서 상기 관심 분석물을 검출하기 위한 검출 반응을 수행하는 단계; 및
상기 현탁된 미세입자의 상이하게 표지된 하위세트 중 임의의 것이 존재하는 경우, 상기 관심 분석물을 검출 및/또는 정량하는 단계.
바람직하게는, 상기 미세입자의 개별 하위세트 각각을 하나의 생물학적 액체 샘플 각각에 개별적으로 노출시키는 단계에서, 상기 미세입자의 개별 하위세트 각각은 임의의 순서로 각각 하나의 생물학적 샘플 및 화학적 또는 생화학적 검출 반응을 수행하기 위한 검출 조성물에 노출되며, 이에 따라 미세입자의 각각의 하위세트는 각각의 생물학적 샘플 및 이것이 노출된 검출 조성물을 흡수한다(take up).
한 측면에서, 본 발명은 또한 특히 상기 단락에 개괄된 바와 같은 방법에 따라, 복수의 생물학적 액체 샘플에서 관심 분석물을 검출 및/또는 정량하는 방법에 관한 것으로, 여기서 샘플 특이적 공정은 다음을 수반한다
a. 관심 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 복수의 개별 생물학적 액체 샘플 및 복수의 다공성 미세입자를 임의의 순서로 별도로 제공하는 단계로서; 상기 각각의 다공성 미세입자는 다공성 기질(matrix)을 갖고 상기 다공성 기질에 일정 부피의 액체를 수용하고, 바람직하게는 존재하는 경우 분석물을 흡수하도록 구성되며; 여기서, 상기 복수의 다공성 미세입자에서, 미세입자의 상이한 하위세트가 제공되고, 미세입자의 각 하위세트는 각각의 하위세트에 부착되거나, 이에 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 특정 표지 구성요소를 특징으로 하며; 상기 제공 단계에서, 제공된 미세입자의 상이한 하위세트의 수는 적어도 제공된 개별 생물학적 액체 샘플의 수만큼 크고, 또한 상기 제공 단계에서, 미세입자의 상이한 하위세트가 서로 별개로 제공되며; 여기서, 선택적으로, 상기 미세입자의 상이한 개별 하위세트는 각각의 다공성 기질에 분석물의 화학적 또는 생화학적 검출 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 검출 조성물을 함유하는 단계;
b. 미세입자의 각각의 개별 하위세트를 정확히 하나의 개별 생물학적 액체 샘플에 노출시켜, 미세입자의 각각의 개별 하위세트가 정확히 하나의 개별 생물학적 액체 샘플의 부피와 함께 배양하고 이러한 샘플 또는 이의 일부를 흡수하도록 하며, 및 선택적으로 분석물이 상기 샘플에 존재하는 경우 미세입자(들)의 기질 내부 또는 위에 분석물을 축적하는 단계로서; 및, 추가로 선택적으로, 상기 미세입자의 상이한 별개의 하위세트의 경우, a) 단계에서 제공될 때, 분석물의 화학적 또는 생화학적 검출 반응을 수행하기 위한 시약을 아직 포함하지 않는 경우, 분석물의 화학적 또는 생화학적 검출 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 검출용 조성물에 별개의 미세입자 하위세트 각각을 노출시켜, 미세입자의 별개의 하위세트 각각이 상기 시약을 수용하도록 하는 단계;
c. 미세입자의 각 하위세트를 별도로 비수성 상으로 옮기고 상기 하위세트(들)의 개별 조립식 미세입자(들)를 둘러싸는 수상의 일부 또는 전부를 제거함으로써, 상기 분석물의 검출을 위한 절연된 반응 공간의 복수의 개별 하위세트를 생성하며, 상기 반응 공간은 샘플 및 분석물의 화학적 또는 생화학적 검출 반응을 수행하기 위한 상기 시약을 포함하는 수상을 포함하며, 상기 반응 공간은 상기 미세입자의 상기 공극(void) 부피(들)로 제한되는 단계;
한 실시양태에서, 상기 일반 공정은 다음을 포함한다
d. 상기 미세입자의 상이한 하위세트 모두가 상기 비수성 상에서 상이한 미세입자의 현탁액을 형성하도록, 상기 비수성 상에서 미세입자의 별개의 상이한 하위세트를 혼합하는 단계로서; 상기 미세입자의 혼합된 상이한 하위세트를 분석물의 화학적 또는 생화학적 검출 반응을 수행하는 데 필요한 조건에 적용하는 단계; 상기 관심 분석물의 이러한 검출 반응을 수행하는 단계; 상기 관심 분석물이 상기 각각의 하위세트의 임의의 구성원에 존재하는 경우, 각각의 미세입자의 하위세트에서 상기 검출 반응에서 발생된 신호 수단을 통해, 상기 미세입자의 상이한 하위세트의 임의의 것에서 존재하는 경우, 상기 관심 분석물을 검출 및/또는 정량하는 단계.
한 실시양태에서, 상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다
e) 단계 d)에서 관심 분석물이 검출되는 미세입자의 하위세트(들)의 실체(identity)를 결정함으로써 단계 a)에서 제공된 상기 복수의 샘플 중 어느 샘플(들)이 상기 관심 분석물을 함유하는지 결정하는 단계.
한 실시양태에서, 단계 e)에서 미세입자의 하위세트(들)의 실체는 미세입자(들)의 각각의 하위세트에 부착되거나, 이에 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 특정 표지 구성요소 수단에 의해 결정된다.
한 실시양태에서, 단계 b)는 미세입자의 개별 하위세트가 어느 샘플에 노출되거나 노출되었는지를 나타내는 상관관계의 제1 기록을 생성하는 하위단계를 추가로 포함하고, 단계 d)는 상기 검출 반응에서 신호가 생성된 미세입자의 하위세트를 나타내는 상관 관계의 제2 기록을 생성하는 하위 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 단계 e)는 상기 제1 및 제2 상관관계 기록을 참조하고 상기 기록을 연결함으로써 수행되며, 이에 따라 단계 a)에서 제공된 상기 복수의 샘플 중 어느 샘플(들)이 상기 관심 분석물을 포함하는지 결정할 수 있게 한다.
한 실시양태에서, 상기 다공성 미세입자 각각은 다음을 통해 관심 분석물을 축적하도록 하는 다공성 기질을 갖는다
(i) 상기 다공성 폴리머 기질을 형성하거나 또는 상기 다공성 기질인 폴리머 또는 폴리머 혼합물; 또는
(ii) 상기 다공성 폴리머 기질 상에 고정된 적어도 하나의 이온화 가능한 그룹, 또는 복수의 이온화 가능한 그룹, 상기 이온화 가능한 그룹(들)은 상기 전구체 미세입자를 둘러싸는 주변 조건에 따라 이들의 전하(들)를 변경할 수 있음; 또는
(iii) 상기 다공성 폴리머 기질 상에 고정된 적어도 하나의 전하를 띤 그룹, 또는 복수의 전하를 띤 그룹; 또는
(iv) (i) - (iii) 중 임의의 조합;
한 실시양태에서, 상기 다공성 미세입자 각각은 다공성 기질을 갖고, 상기 다공성 기질에 부착된, 바람직하게는 가역적으로 부착된 분석물 특이적 시약(ASR)을 포함하며, 이러한 분석물 특이적 시약은 관심 분석물의 농축(enrichment)을 허용하고 및/또는 상기 분석물과 관련된 특정 신호 또는 표적 증폭 반응을 허용하며; 여기서 상기 분석물 특이적 시약은 관심 분석물에 특이적으로 결합할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 분석물 특이적 시약은 특이적 표적 증폭 반응을 허용하고, 바람직하게는 특이적 신호 증폭 반응을 허용하지 않는다. 특히, 일부 실시양태에서, 분석물 특이적 시약은 예를 들어 bDNA 분석과 같은 결합 분석에서 허용 및/또는 사용되지 않는다.
본원에 사용된, "분석물 특이적 시약"("ASR")이라는 용어는 관심 분석물을 특이적으로 표적화하거나 인식할 수 있는 시약을 의미한다. 그러한 특이적 표적화 또는 그러한 특이적 인식은 이러한 관심 분석물에 특이적으로 결합하거나 또는 이와 특이적으로 반응하는 이러한 분석물 특이적 시약의 능력에서 그 자체로 나타난다. 한 실시양태에서, 분석물 특이적 시약은 압타머, 스피에겔머, 핵산 올리고머 및 핵산 프라이머를 포함하는 핵산; 항체 또는 항체 단편; 분석물 또는 분석물 복합체에 특이적으로 결합할 수 있는 비항체 단백질, 및 친화성 단백질로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 분석물-특이적 시약은 핵산, 특히 핵산 올리고머 및 핵산 프라이머로부터 선택된다. 핵산 프라이머는 핵산 증폭을 수행하는 데 특히 적합하다. 한 실시양태에서, 분석물-특이적 시약이 핵산 프라이머인 경우, 이러한 분석물-특이적 시약은 사실상, 후속적으로 증폭(및 검출)될 관심 분석물 내의 영역에 인접하는 한 쌍의 프라이머이다. 선택적으로, 이러한 실시예(한 쌍의 프라이머가 분석물 특이적 시약인 경우)에서, 이러한 분석물 특이적 시약은 프라이머(들)와 함께 제공되고 각각의 프라이머(들) 및 생성된 증폭 산물(들)의 검출을 가능하게 하는 검출 가능한 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 상기 다공성 미세입자 각각은 다공성 기질을 갖지만 선행 단락에서 정의된 바와 같은 분석물 특이적 시약(ASR)을 포함하지 않는다. 이 실시양태에서, 미세입자 내 분석물의 농축 또는 축적은 다공성 기질 단독에 의해 달성된다.
본 명세서에 사용된 "신호 또는 표적 증폭 반응"이라는 용어는 분석물의 검출에 사용되는 신호가 증폭되거나, 또는 검출 및/또는 정량되는 표적(즉 분석물)이 첫번째로 증폭되고 이후 검출되는 화학적 또는 생화학적 검출 반응을 의미한다. 표적 증폭 반응의 일반적인 예시는 PCR과 같은 핵산 증폭 반응이다. 신호 증폭 반응의 일반적인 예시는 예를 들어 면역분석과 같은 면역화학 반응이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 화학적 또는 생화학적 검출 반응은 표적 증폭 반응이며 신호 증폭 반응이 아니다. 특히, 본 발명에 따른 화학적 또는 생화학적 검출 반응은 bDNA 분석이 아니다.
한 실시양태에서, 분석물-특이적 시약은 압타머, 스피에겔머를 포함하는 핵산; 항체 또는 항체 단편; 수용체, 수용체 단편 및 친화성 단백질과 같은 분석물 또는 분석물 복합체에 특이적으로 결합할 수 있는 비항체 단백질로부터 선택되며; 여기서, 바람직하게는 상기 분석물 특이적 시약은 핵산, 특히 핵산 올리고머 및 핵산 프라이머로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 상기 다공성 미세입자 각각은 그의 다공성 기질에 부착된, 바람직하게는 가역적으로 부착된 동일한 분석물 특이적 시약을 갖는다. 하나의 그러한 실시양태에서, 이러한 동일한 분석물 특이적 시약은 미세입자에 부착되는 유일한 분석물 특이적 시약이다.
본원에 사용된 "동일한 분석물 특이적 시약"이라는 용어는 단일 특정 분석물에 대해 모두 동일한 특이성을 갖는 다양한 분석물 특이적 시약 분자가 있는 시나리오를 의미하는 것이다. 예를 들어, 분석물 특이적 시약이 특정 분석물에 대해 특이적인 항체인 경우 이러한 분석물 특이적 시약과 "동일한" 모든 분석물 특이적 시약은 이러한 분석물에 대해 동일한 특이성을 갖는다. 일반적으로, 및 많은 경우에, 이는 이러한 "동일한" 분석물 특이적 시약이 구조 및/또는 서열 면에서 동일하거나, 또는 이들은 동일한 단일 특정 분석물에 대한 이들의 특이성이 이들 변이에 의해 영향을 받지 않을 정도로만 구조 및 서열이 상이하다.
한 실시양태에서, 상기 다공성 미세입자의 복수(또는 라이브러리)에는, 미세입자의 상이한 하위세트들이 존재하고,
각 하위세트는
- 상기 하위세트의 상기 미세입자에 부착되거나, 이에 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 별개의 표지 구성요소를 가지며; 및
상기 상이한 하위세트들 모두는
- 상기 하위세트의 상기 미세입자에 부착되거나 또는 포함된 동일한 분석물 특이적 시약을 가지며, 상기 분석물 특이적 시약은 하나의 관심 분석물에 특이적이며;
이에 따라 상기 미세입자의 상이한 하위세트는 부착되거나 포함된 분석물 특이적 시약의 관점에서 동일하지만,
- 상기 각 하위세트의 미세입자에 부착되거나, 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 각각의 표지 구성요소와 상이하며;
각각의 하위세트는 상기 각각의 표지 구성요소에 의해 명확하게 정의되고 식별될 수 있다.
상기 상이한 하위세트 모두가 상기 하위세트의 상기 미세입자에 부착된 동일한 분석물 특이적 시약을 갖고, 상기 분석물 특이적 시약이 하나의 관심 분석물에 대해 특이적인 한 실시양태에서, 상기 방법은 복수의 생물학적 액체 샘플에서 하나의 관심 분석물을 검출 및/또는 정량하는 방법이며, 여기서 제공되는, 바람직하게 단계 a)에서 제공되는 미세입자의 상이한 하위세트의 수는 제공된 별개의 생물학적 액체 샘플의 수와 동일하다.
다른 실시양태에서, 상기 다공성 미세입자의 복수(또는 라이브러리)에서, 상기 미세입자에 부착되거나 함유된 여러 상이한 분석물 특이적 시약이 존재한다.
이러한 실시양태에서(즉, 상기 복수의 다공성 미세입자에서, 상기 미세입자에 부착되거나 함유된 여러 상이한 분석물 특이적 시약이 있는 경우), 미세입자의 상이한 하위세트가 존재하고,
각 하위세트는
- 상기 하위세트의 상기 미세입자에 부착되거나, 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 별개의 표지 구성요소를 가지며; 및
또한, 상기 복수의 다공성 미세입자에서,
- 상기 미세입자의 다공성 기질에 부착되거나 또는 상기 미세입자에 포함된 상이한 분석물 특이적 시약을 갖는 하위세트의 각 유형과 함께 미세입자의 하위세트의 상이한 유형이 존재하며; 여기서, 바람직하게, 미세입자의 하위세트의 적어도 2개 이상의 상이한 유형이 존재하며, 더욱 바람직하게 미세입자의 하위세트의 적어도 3개 이상의 상이한 유형이 존재하며;
이에 따라 상기 미세입자의 상이한 하위세트는 상기 각각의 하위세트의 미세입자에 부착되거나, 포함되거나, 또는 이와 달리 결합된 각각의 표지 구성요소에 의해 상이하며; 및 미세입자의 각 하위세트는 미세입자의 하위세트의 한 유형의 일부를 형성하고; 각 하위세트는 각각의 표지 구성요소 및 각각의 분석물 특이적 시약에 의해 명확하게 정의되고 식별 가능하며; 및
이에 따라 상기 미세입자의 하위세트의 상이한 유형은 상기 미세입자의 다공성 기질에 부착된 각각의 분석물 특이적 시약에 의해 상이하며; 및 상기 각각의 상이한 유형은 미세입자의 여러 하위세트를 포함하며, 이들 모두는 부착되거나 포함된 동일한 분석물 특이적 시약을 갖는다.
이러한 실시양태에서(즉, 상기 복수의 다공성 미세입자에서, 상기 미세입자에 부착되거나 또는 포함된 여러 상이한 분석물 특이적 시약이 있는 경우), 상기 방법은 복수의 생물학적 액체 샘플에서 하나 이상의 관심 분석물을 검출 및/또는 정량하는 방법이며, 여기서 상기 제공되는, 바람직하게 단계 a)에서 제공되는 미세입자의 상이한 하위세트의 수는 제공된 개별 생물학적 액체 샘플의 수에 검출하고자 하는 관심 분석물의 수를 곱한 것과 같고, 여기서 검출될 관심 분석물의 수만큼, 제공되는, 바람직하게 단계 a)에서 제공되는 미세입자의 하위세트의 많은 유형이 존재한다.
다공성 기질을 갖는 한, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다양한 유형의 미세입자는 상기 다공성 기질에 일정 부피의 액체를 수용하고, 미세입자에 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 그에 부착된 특정 표지 구성요소를 갖는 것으로 구성되며, 상기 표지 구성요소는 이러한 미세입자를 미세입자의 특정한 하위세트에 속하도록 분류한다. 적합한 미세입자는 분석물 특이적 시약(ASR)을 가질 수도 있고 없을 수도 있다. 본 출원인 Blink AG에 의해 "A library of prefabricated microparticles and precursors"(대리인 문서 B33016EP)라는 제목의 병행 EP 출원에 개시된 것과 같은 미세입자가 또한 본 발명의 실시양태에서, 특히 하나 이상의 분석물이 검출되어야 하는 이러한 실시양태에서 특히 적합하다는 것이 밝혀졌다.
일 실시양태에서, 상기 다공성 기질은 폴리머 또는 폴리머 혼합물로 형성된 다공성 폴리머 기질이며, 바람직하게 상기 다공성 폴리머 기질은 폴리머(또는 폴리머들) 또는 가교결합되지 않은 폴리머 혼합물로 구성되며, 보다 바람직하게 상기 다공성 폴리머 기질을 형성하는 상기 폴리머 또는 폴리머 혼합물은 아가로스 또는 아가로스 및 젤라틴의 조합으로 구성되며, 보다 바람직하게, 상기 아가로스 및 젤라틴의 조합에서, 상기 아가로스는 0.1%(w/v) 내지 4%(w/v)의 범위로 존재하며, 상기 젤라틴은 0.1%(w/v) 내지 20%(w/v), 바람직하게 0.5%(w/v) 내지 20%(w/v)의 범위로 존재한다. 하나의 특정한 실시양태에서, 상기 다공성 폴리머 기질 내 아가로스의 농도는 0.5%(w/v)이며, 상기 젤라틴의 농도는 1%(w/v) 내지 2%(w/v)의 범위이다. 상기 폴리머 또는 폴리머 혼합물(또는 폴리머들)이 가교결합되지 않은 실시양태는 특히 우수하며 상이한 상태, 예를 들어 겔 및 졸 상태 사이를 전환하는데 다능하다.
한 실시양태에서, 상기 표지 구성요소는 적어도 2개의 상이한 염료, 바람직하게 적어도 2개의 형광 염료의 혼합물이며, 상기 적어도 2개의 상이한 염료, 바람직하게 상기 적어도 2개의 형광 염료는 상기 적어도 2개의 상이한 염료의 각각 정의된 비율 및/또는 정의된 함량으로 상기 전구체-미세입자의 각각의 하위세트에 존재하며, 이에 의해 상기 전구체-미세입자의 상이한 하위세트는 상기 적어도 2개의 상이한 염료의 각각의 비율 및/또는 함량의 관점에서 서로 상이하며, 이에 따라 전구체-미세입자의 각각의 하위세트 내에 부착되거나 또는 포함된 상기 적어도 2개의 상이한 염료의 각각의 비율 및/또는 함량에 의해 상기 전구체-미세입자의 상이한 하위세트 사이에 차이를 만든다.
분석물을 검출 및/또는 정량하는 방법의 한 실시양태에서, 상기 관심 분석물은 핵산이며, 상기 검출 반응은 핵산 증폭이며, 상기 검출 조성물은 버퍼, 모노-뉴클레오시드-트리포스페이트, 적절한 핵산 폴리머라제, 예를 들어 Taq 폴리머라제와 같은 증폭 효소, 및 증폭된 핵산과 같은 증폭 산물의 검출을 위한 핵산 염료, 및 선택적으로 하나 이상의 증폭 프라이머 쌍, 및 추가로 선택적으로 만약 이러한 프라이머 및/또는 프로브가 상기 미세입자에 부착되거나 또는 포함된 분석물 특이적 시약(들)(ASR)로 이미 제공되지 않은 경우에 각각의 분자 프로브(예를 들어 TaqMan 프로브, 분자 비콘(beacons) 등)을 포함하는 핵산 증폭을 수행하기 위한 조성물이다.
본 발명에 따른 방법의 다른 실시양태에서, 상기 관심 분석물은 단백질 또는 기타 비핵산 분자이며, 상기 검출 반응은 면역화학 검출반응이며, 상기 검출 조성물은 이러한 면역화학 검출 반응을 수행하기 위한 조성물이며 2개의 별개의 구성요소로 상기 방법에 제공되며: 상기 검출 조성물의 제1 구성요소는 버퍼, 및 적절한 리포터 효소와 결합되고 상기 면역화학 검출 반응에서 분석물 특이적 시약(ASR)으로 사용된, 1차 항체, 항체 단편, 또는 비-항체 단백질과 동일한 분석물에 대해 특이적인 2차 항체 또는 2차 항체 단편과 같은 면역화학 검출반응을 수행하는데 필수적인 시약을 포함하며; 및, 선택적으로 이러한 1차 항체, 항체 단편, 또는 비항체 단백질이 상기 미세입자에 부착되거나 또는 포함된 분석물 특이적 시약(ASR)으로 이미 제공되지 않은 경우에, 상기 단백질 분석물 또는 기타 비핵산 분석물에 특이적으로 결합할 수 있는 1차 항체, 항체 단편, 또는 비항체 단백질을 포함하며; 상기 검출 조성물의 제2 구성요소는 검출 시약으로서, 상기 적절한 리포터 효소에 의해 반응된 기질을 검출 가능하게 하는, 바람직하게 광학적으로 검출 가능하게 하는, 더욱 바람직하게 형광에 의해 검출 가능하게 하는 상기 적절한 리포터 효소에 대한 적절한 기질을 포함한다.
이러한 실시양태에서, 즉 검출 조성물이 2개의 별개의 구성요소, 즉 제1 구성요소 및 제2 구성요소로 제공되는 경우, 미세입자의 하위세트들은 두 번의 노출이 차례대로 일어날 수 있도록 제1 구성요소에 노출된 이후에 이러한 제2 구성요소에 노출되는 것이 바람직하다. 상기 두 번의 노출은 적절한 세척 단계, 예를 들어 미세입자의 하위세트가 적절한 세척 버퍼로 세척되는 단계에 의해 추가로 서로 분리될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 다른 실시양태에서, 상기 관심 분석물은 효소 또는 기타 임상 화학 분석물이며, 상기 검출 반응은 화학적 또는 생화학적(예를 들어 효소적) 검출 반응이며, 상기 검출 조성물은 이러한 화학적 또는 생화학적 검출 반응을 수행하기 위한 조성물이며: 상기 샘플은 검출 시약과 접촉되며, 이들 모두는 본 발명에 따른 미세입자와 접촉되고, 상기 검출 조성물은 검출 시약으로 이러한 화학적 또는 효소적 생성에 적합한 기질을 포함하며, 상기 기질은 각각의 분석물과 반응할 때 검출 가능하고, 바람직하게 광학적으로 검출 가능하며, 더욱 바람직하게 형광에 의해 검출 가능하다.
한 실시양태에서, 상기 관심 분석물을 검출 및 정량하는 상기 단계에서, 상기 분석물의 정량은 하기로부터 선택된 방법을 통해 수행된다:
a)
디지털 핵산 증폭, 특히 디지털 중합효소연쇄반응(PCR);
b)
실시간 정량적 핵산 증폭, 특히 실시간 중합효소연쇄반응(PCR);
c)
면역화학 검출 방법, 특히 디지털 면역분석과 같은 디지털 면역화학 검출 방법, 예를 들어 디지털 효소 결합 면역흡착분석(ELISA);
d)
면역화학적 검출 방법, 특히 면역-중합효소연쇄반응과 같은 핵산 증폭과 조합된 디지털 면역화학적 검출 방법; 특히 디지털 면역-PCR; 및
e)
a)-d) 중 임의의 조합;
여기서 관심 분석물이 핵산인 경우 정량은 a) 또는 b) 방법, 또는 a) 및 b)의 조합 중 임의의 것을 사용하여 수행되며; 및 관심 분석물이 단백질, 펩타이드 또는 기타 비핵산 분석물인 경우 정량은 c) 또는 d) 방법 중 임의의 것을 사용하여 수행된다.
상기 이미 약술한 바와 같이, 본원에 사용된 "생물학적 액체 샘플"은 예를 들어 추가 분석을 위해 접근 가능하거나 또는 가능하게 하는 관심 분석물(들)을 만들기 위해, 추가로 처리되거나 처리되지 않았을 수 있는 유기물의 몸체로부터 수득된 액체 샘플일 수 있다. 바람직하게 이러한 "생물학적 액체 샘플"은 피, 혈장, 혈청, 소변, 땀, 눈물, 가래, 림프, 정액, 복수, 양수, 담즙, 모유, 활액, 복막액, 심낭액, 뇌척수액, 유미 및 소변으로부터 선택되며, 보다 바람직하게 상기 생물학적 샘플은 혈장이다. 바람직하게 이러한 생물학적 액체 샘플은 추가로 처리되며, 예를 들어 본 발명에 따른 방법에 적용되기 전에, 용해되거나, 소화되거나 또는 달리 처리될 수 있다. 예를 들어, 이러한 생물학적 액체 샘플이 혈장인 경우, 이러한 혈장은 후속 검출 반응을 방해할 수 있는 구성요소를 제거하기 위해 추가로 용해되거나 및/또는 소화될 수 있다. 예를 들어 관심 분석물이 특히 핵산인 경우, 생물학적 액체 샘플, 예를 들어 혈장은 본 발명에 따른 방법에 처리되기 전에, 먼저 임의의 원치 않는 단백질 또는 펩타이드뿐만 아니라 지질 또는 기타 원치 않는 구성요소들을 제거하기 위해 프로테아제 및 기타 적절한 효소로 소화될 수 있다. 따라서 본원에 사용된 "생물학적 액체 샘플"은 또한 상기 임의의 체액으로부터 얻은 추출물을 의미할 수도 있으며; 예를 들어 적절한 추출 방법, 예를 들어 세포 파괴(필요한 경우), 지질, 단백질 및 원치 않는 핵산의 제거(필요한 경우), 및 핵산의 정제 및/또는 특정한 핵산의 증폭을 통해 상기 임의의 체액으로부터 얻어진 핵산 추출물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 추출물은 에탄올 또는 다른 적절한 알코올을 사용하여 생성될 수 있다.
세포 파괴 또는 붕괴는 물리적 및/또는 화학적 방법에 의해 달성될 수 있으며, 이의 주요 목적은 세포벽 및/또는 세포막을 파괴하는 것이다. 파괴 방법은 주로 샘플의 특성에 기초하며, 이러한 목적을 위해 광범위한 도구 및 접근 방법이 조직/세포 파괴를 달성하기 위해 단독 또는 조합되어 사용된다. 용해 효소, 카오트로픽(chatropic) 제제, 및 다양한 유형의 세제가 화학적 용해의 주요 구성요소이며, 기계적 방법은 분쇄, 전단, 비드 비팅, 및 충격을 통해 세포를 파괴한다. 하나의 기술이 우수한 결과를 산출하지 못하는 경우 다른 기술이 성공할 수도 있다는 점에 유의해야 한다. 삼투 충격 방법은 어떤 경우에는 페놀-클로로폼 추출 및 비드 비팅과 같은 일반적인 핵산 정제 프로토콜보다 더 나은 결과를 산출했다. 세포 파괴에 대한 또 다른 접근 방식은 다양한 방법을 조합하여 사용하는 것이다. 좋은 예시는 많은 프로토콜이 프로테아제를 사용하여 보호 단백질 스캐폴드에서 NA를 제거하는 효소 용해의 경우이다. 또한 새로운 무-단백질 NA를 보호하기 위해 용액으로 자유로워지는 세포 뉴클레아제의 비활성화가 중요하다[13]. 단일 용액에서 세제와 카오트로픽 염의 조합을 사용하여 세포벽 및/또는 세포막을 가용화하고 세포내 뉴클레아제를 비활성화할 수 있다. 반면에 기계적 파괴는 힘을 사용하여 세포의 구성 요소를 추출한다. 그라인딩의 고전적인 예시는 막자사발(mortar and pestle)을 사용하는 것인데, 이는 오늘날 액체 질소를 사용하여 최적화된다(샘플에서 허용되는 경우). 세포벽은 초음파 처리 또는 캐비테이션(cavitation)에 의해 유발된 압력의 급격한 변화에 의해 생성된 충격파에 의해 파괴될 수도 있다. 세포 파괴에 사용할 수 있는 다른 기계적 도구는 접선력을 사용하여 세포에 구멍을 만드는 전단력과 다른 유리 또는 강철 비드를 사용하여 거친 세포벽을 파열시키는 비드 비팅이다.
추가적 측면에서, 본 발명은 특히 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한, 복수의 생물학적 액체 샘플에서 관심 분석물을 검출 및/또는 정량하기 위한 키트에 관한 것으로, 상기 키트는 다음을 포함한다:
- 복수의 미세입자를 포함하는 복수의 용기로서, 각각의 용기는 상기 복수의 다공성 미세입자의 하위세트를 포함하고, 각각의 하위세트 내에 상기 다공성 미세입자의 각각은 다공성 기질을 가지며 상기 다공성 기질 내에 일정한 부피의 액체를 수용하도록 구성되며; 각각의 미세입자의 하위세트는 각각의 하위세트에 부착되거나, 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 특이적 표지 구성요소를 특징으로 하며, 바람직하게 상기 미세입자는 상기 추가로 정의된 바와 같으며; 선택적으로 상기 미세입자를 세척하기 위한 수성 세척 시약을 포함하는 용기;
- 관심 분석물을 검출하기 위한 검출 조성물을 포함하는 용기로서; 상기 검출 용액은 분석물의 화학적 또는 생화학적 검출 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하며; 상기 검출 조성물은 핵산 증폭을 수행하기 위한 조성물 또는 면역화학 검출반응을 수행하기 위한 조성물이며;
- 각각의 하위세트가 생물학적 액체 샘플에 노출되면, 상기 미세입자의 상이한 하위세트들을 비수성 상으로 옮기고, 비수성 상에 미세입자의 하위세트의 별개의 상이한 현탁액을 생성하기 위한 비수성 상을 포함하는 용기;
- 상기 미세입자의 하위세트의 상이한 현탁액들 모두가 상기 비수성 상 내에서, 이후 검출 반응에 처리되는 상이한 미세입자의 단일 현탁액을 형성하도록, 상기 비수성 상 내에서 함께 미세입자의 하위세트의 별개의 상이한 현탁액을 혼합하기 위한 혼합 용기;
- 검출 반응을 수행하기 위한 용기.
한 실시양태에서, 상기 다공성 미세입자 각각은 이의 다공성 기질에 부착된, 바람직하게 가역적으로 부착된 분석물 특이적 시약(ASR)을 가지거나, 또는 분석물 특이적 시약(ASR)을 포함하며, 이러한 분석물 특이적 시약은 관심 분석물의 농축을 허용하며 및/또는 상기 분석물을 포함하는 특이적 신호 또는 표적 증폭 반응을 허용하며; 상기 분석물 특이적 시약은 관심 분석물에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 분석물 특이적 시약은 상기 분석물을 포함하는 특이적 표적 증폭 반응을 허용하며, 신호 증폭 반응은 허용하지 않는다. 특히, 일부 실시양태에서, 분석물 특이적 시약은 예를 들어 bDNA 분석과 같은 결합 분석을 허용하지 않거나 및/또는 그에 사용되지 않는다.
한 실시양태에서, 상기 분석물 특이적 시약은 압타머, 스피에겔머(Spiegelmers)를 포함하는 핵산; 항체 또는 항체 단편; 수용체, 수용체 단편, 및 친화성 단백질과 같은 분석물 또는 분석물 복합체에 특이적으로 결합할 수 있는 비항체 단백질로부터 선택되며; 바람직하게 상기 분석물 특이적 시약은 핵산, 특히 핵산 올리고머 및 핵산 프라이머로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 상기 관심 분석물은 핵산이며, 상기 검출 반응은 핵산 증폭이며, 상기 검출 조성물은 버퍼, 모노-뉴클레오시드-트리포스페이트, 증폭 효소, 예를 들어 적절한 핵산 폴리머라제, 예를 들어 Taq 폴리머라제, 및 증폭 산물, 예를 들어 증폭된 핵산의 검출을 위한 핵산 염료, 및 선택적으로 프라이머 쌍이 상기 미세입자에 부착되거나 또는 포함된 분석물 특이적 시약(들)(ASR)로 이미 제공되지 않은 경우 프라이머 쌍을 포함하는 핵산 증폭을 수행하기 위한 조성물이다.
한 실시양태에서, 상기 관심 분석물은 단백질 또는 기타 비핵산 분자이며, 상기 검출 반응은 면역화학 검출 반응이며, 상기 검출 조성물은 이러한 면역화학 검출반응을 수행하기 위한 조성물이며 2개의 별개의 구획 또는 용기에 상기 키트에 제공되며; 상기 검출 조성물은 제1 구획 또는 용기에, 버퍼, 및 적절한 리포터 효소와 결합되고 상기 면역화학 반응에서 분석물 특이적 시약(ASR)으로 사용되는 제1 항체, 항체 단편, 비항체 단백질과 동일한 분석물에 특이적인 제2 항체 또는 제2 항체 단편과 같은 면역화학 검출반응을 수행하기 위한 필수 시약; 및 선택적으로 1차 항체, 항체 단편, 또는 비항체 단백질이 상기 미세입자에 부착되거나 또는 포함된 분석물 특이적 시약(들)(ASR)로 이미 제공되지 않은 경우, 상기 단백질 분석물 또는 비핵산 분석물에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 항체, 항체 단편, 또는 비항체 단백질을 포함하며; 및 상기 검출 조성물은 제1 구획 또는 용기에서 검출 시약으로서, 리포터 효소에 의해 반응된 기질이 검출 가능, 바람직하게 광학적으로 검출 가능, 더욱 바람직하게 형광에 의해 검출 가능하게 되는 상기 적절한 리포터 효소에 적합한 기질을 포함한다.
일 실시양태에서, 상기 다공성 미세입자 각각은 이의 다공성 기질에 부착된 동일한 분석물 특이적 시약을 갖거나 동일한 분석물 특이적 시약을 포함한다.
일 실시양태에서, 상기 복수의 다공성 미세입자에서, 미세입자의 다양한 하위세트가 존재하며,
각 하위세트는
- 상기 하위세트의 상기 미세입자에 부착되거나, 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 이의 개별적 표지 구성요소를 가지며; 및
상기 다양한 하위세트 모두는
- 상기 하위세트의 상기 미세입자에 부착되거나 또는 포함된 동일한 분석물 특이적 시약을 가지며, 상기 분석물 특이적 시약은 하나의 관심 분석물에 특이적이며;
이에 따라 미세입자의 상기 상이한 하위세트는 부착되거나 포함된 분석물 특이적 시약의 관점에서 동일하며, 그러나
- 상기 각 하위세트의 미세입자에 부착되거나, 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 각각의 표지 구성요소가 상이하며;
각 하위세트는 상기 각각의 표지 구성요소에 의해 명확하게 정의되고 식별 가능하며 분리된 용기에 제공된다.
일 실시양태에서, 상기 키트는 복수의 생물학적 액체 샘플에서 하나의(즉 1개 이하) 관심 분석물을 검출 및/또는 정량하기 위한 키트이며, 상기 키트에 제공된 미세입자의 상이한 하위세트의 수는 제공된 별개의 생물학적 액체 샘플의 수와 동일(바람직하게 적어도 동일)하다(또는 일부 실시예에서 상기 키트 내에 제공된 미세입자의 상이한 하위세트의 수는 제공된 별개의 생물학적 액체 샘플의 수보다 크고, 어떠한 경우에도 작지 않음).
다른 실시양태에서, 상기 복수의 다공성 미세입자에서, 상기 미세입자에 부착되거나 또는 포함된 여러 다양한 분석물 특이적 시약이 존재한다.
이러한 실시양태에서, 미세입자의 다양한 하위세트가 존재하며,
각 하위세트는
- 상기 하위세트의 상기 미세입자에 부착되거나, 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 이의 별개의 표지 구성요소를 가지며; 및
여기서 또한, 상기 복수의 다공성 미세입자에서,
- 상기 미세입자의 다공성 기질에 부착되거나 또는 상기 미세입자에 포함된 상이한 분석물 특이적 시약을 갖는 하위세트 각각의 유형과 함께 미세입자의 하위세트의 다양한 유형이 있으며; 바람직하게, 미세입자의 하위세트의 적어도 2개 상이한 유형이 존재하며, 보다 바람직하게 미세입자의 하위세트의 3개 이상의 상이한 유형이 존재하며;
이에 따라 상기 미세입자의 상이한 하위세트는 상기 각각의 하위세트의 미세입자에 부착되거나, 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 각각의 표지 구성요소가 상이하며; 미세입자의 각 하위세트는 미세입자의 하위세트의 하나의 유형의 일부를 형성하며; 각 하위세트는 각각의 표지 구성요소 및 각각의 분석물 특이적 시약에 의해 명확하게 정의되고 식별 가능하며 분리된 용기에 제공되며; 및
이에 따라 상기 미세입자의 하위세트의 상이한 유형들은 상기 미세입자의 다공성 기질에 부착되거나 상기 미세입자에 포함된 각각의 분석물 특이적 시약에 의해 상이하며; 상기 상이한 유형의 각각은 미세입자의 여러 하위세트를 포함하며, 하위세트 모두는 부착되거나 또는 포함된 동일한 분석물 특이적 시약을 갖는다.
이러한 실시양태에서, 상기 키트는 복수의 생물학적 액체 샘플 내에 하나 이상의 관심 분석물을 검출하기 위한 키트이며, 상기 키트에 제공된 미세입자의 상이한 하위세트의 수는 제공된 별개의 생물학적 액체 샘플의 수에 검출될 관심 분석물의 수를 곱한 것과 동일(바람직하게 적어도 동일)하며, 상기 키트에서, 검출될 관심 분석물의 수만큼 제공된 미세입자의 하위세트의 많은(바람직하게 적어도 많은) 유형이 있으며; (또는 일부 실시양태에서 상기 키트에 제공된 미세입자의 상이한 하위세트의 수는 실제로 제공된 별개의 생물학적 액체 샘플의 수에 검출될 관심 분석물의 수를 곱한 것보다 더 크고, 어떠한 경우에도 작지 않으며; 이러한 키트의 실시양태에서, 제공된 미세입자의 하위세트 유형은 적어도 검출될 관심 분석물의 수만큼 많이 존재하며, 어떠한 경우에도 이러한 실시양태에서 제공된 미세입자의 하위세트의 유형의 수는 검출될 관심 분석물의 수보다 작지 않다).
추가적 양태에서, 본 발명은 또한 복수의 생물학적 액체 샘플에서 관심 분석물을 검출 및/또는 정량하는 방법을 수행하기 위한 카트리지에 관한 것이며, 상기 방법은 상기에 추가로 정의된 바와 같다.
일 실시양태에서, 상기 카트리지는 복수의 샘플 특이적 모듈, 복수의 저장 챔버, 비수성 상을 저장하기 위한 적어도 하나의 비수성 상 챔버, 및 단일의 조합된 혼합 및 검출 챔버, 또는 별개의 혼합 챔버 및 별개의 검출 챔버의 조합을 포함하며;
각각의 샘플 특이적 모듈은 이의 고유의 별개의 샘플 입구를 갖는 샘플 구획을 포함하며, 각 샘플 특이적 모듈은 각각의 샘플 구획에서 정확하게 하나의 생물학적 샘플만을 별도로 수용하도록 구성되며; 각각의 샘플 특이적 모듈은 추가로 상기 샘플 구획에 미세입자를 수용하도록 구성되며, 상기 미세입자는 상기 추가로 정의된 바와 같으며; 각각의 샘플 특이적 모듈은 수성 환경에서 비수성 환경으로 상기 미세입자를 상 전이를 촉진하도록 추가로 구성된다.
"샘플 특이적 모듈"이라는 용어는 특정한(특이적) 샘플과 함께 사용하도록 특이적으로 지정된 카트리지 내의 섹션을 의미한다. 이와 같이 이는 통상적으로 샘플 구획을 포함하며, 각각의 샘플 구획 내에 정확히 하나의 생물학적 샘플만을 별도로 수용하도록 구성된다. "샘플 특이적 모듈"은 이의 고유의 특정한 샘플 입구를 가지며, 이는 각각의 샘플을 샘플 특이적 모듈로 첨가되도록 하며, 추가 구획 및/또는 연결 채널을 추가적으로 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 복수의 샘플 특이적 모듈은 각각의 샘플 구획 내에 복수의 다공성 미세입자를 포함하며; 상기 다공성 미세입자 각각은 다공성 기질을 가지며 상기 다공성 기질 내에 일정한 부피의 액체를 수용하도록 구성되며; 이의 샘플 구획 내에 각각의 샘플 특이적 모듈은 상기 복수의 미세입자의 상이한 하위세트를 포함하며, 각각의 미세입자의 하위세트는 각각의 하위세트에 부착되거나, 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 특이적 표지 구성요소를 특징으로 하며; 및/또는 상기 적어도 하나의 비수성 상 챔버는 비수성 상, 예를 들어 오일을 포함한다.
일 실시양태에서, 상기 샘플 특이적 모듈 각각은 액상, 바람직하게 액체 수성 상으로부터 미세입자의 기계적 분리를 위한 수단, 예를 들어 필터를 추가로 포함하며; 상기 수단은 수성 환경에서 비수성 환경으로 상기 미세입자의 상전이를 촉진하도록 구성된다.
일 실시양태에서, 상기 복수의 저장 챔버에서 분석물의 화학적 또는 생화학적 검출 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 저장 챔버의 제1 그룹, 및 별개로, 용해 버퍼, 분석물 특이적 시약에 분석물의 결합을 촉진하기 위한 버퍼, 및 미세입자를 세척하기 위한 세척 버퍼 중 하나 이상을 별개로 포함하는 저장 챔버의 하나 이상의 추가 그룹과 함께 다양한 그룹의 저장 챔버가 존재한다.
일 실시양태에서, 상기 키트리지는 밸브 매커니즘을 포함하며, 상기 밸브 메커니즘은 펌프에 부착되도록 구성되며, 상기 밸브 메커니즘은 d)와 함께 a) 내지 c) 중 어느 것을 연속적으로 또는 동시에 유체 연결로 가져올 수 있으며; 여기서 a)는 하나 이상의 저장 챔버이며; b)는 단일의 조합된 혼합 및 검출 챔버, 또는 별개의 혼합 챔버 및 별개의 검출 챔버의 조합이며; c)는 상기 적어도 하나의 비수성 상 챔버이며; 및 d)는 임의의 샘플 특이적 모듈이다.
본 발명자들은 복수의 생물학적 액체 샘플 내에 관심 분석물을 검출 및/또는 정량하는 방법을 제공한다. 임의의 이론에 구석되지 않고, 본 발명자들은 본 발명에 따른 신규 방법은 원칙적으로 2개의 근본적으로 다른 부분, 즉 샘플 특이적 부분 및 일반 부분(본원에서 또한 각각 "특이적 공정 부분" 또는 "특이적 부분", 및 "일반 공정 부분")을 포함하는 신규 분석에 기초한다고 생각한다.
상기 공정의 샘플 특이적 부분에서, 개별적인 샘플들은 인코드되고(encoded), 만약 분석물이 개별 샘플에 존재하는 경우, 분석물이 농축되며 동시에 원치 않는 물질은 샘플로부터 제거된다. 이후 이의 개별 코드/표지에 의해 식별 가능하게 된 인코딩된 샘플은 비수성 환경에서 미세입자에 의해 정의된 일종의 수성 액적으로 절연된다. 이러한 액적은 존재하는 경우 분석물의 검출이 수행되는 반응 공간의 역할을 수행한다.
일반적으로 말해서, 상기 목적은 각각의 특이적이고 개별적으로 표지된 미세입자의 유형 또는 하위세트와 함께 개별적으로 각각의 샘플을 조사(및 효과적으로 "표지" 또는 "인코딩")함으로써 달성되며, 본원에서 "미세입자"는 또한 종종 "비드(bead)"로 언급되며, 특이적이고 개별적으로 표지된 미세입자의 유형 또는 하위세트는 각각의 미세입자에 부착되거나, 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 정의된 특정한 표지를 수송한다. 본 발명의 실시양태에 따르면, 미세입자(또는 "비드")의 복수의 다양한 유형들이 존재할 수 있으며(본원에서 이러한 "미세입자의 유형"은 또한 "미세입자의 하위세트"로 종종 언급됨), 이는 이에 부착되거나 이에 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 특정한 표지를 특징으로 한다. 본 발명의 실시양태에서 따르면, 상기 미세입자는 일정한 부피의 액체 샘플을 수용할 수 있고, 이에 의해 만약 샘플 내에 존재하는 경우 분석물을 흡수하며(take up), 및 선택적으로 또한 이에 결합하고 이를 농축할 수 있다. 미세입자에 분석물의 결합은 결합 버퍼의 존재 하에 관심 분석물을 포함하는 것으로 의심되는 샘플로 미세입자의 노출에 의해 촉진될 수 있다. 이러한 결합 버퍼는 각각의 미세입자의 기질 및/또는 미세입자에 부착되거나 또는 포함된 임의의 분석물 특이적 시약(ASR)에 분석물의 결합을 촉진하는 조건을 설정하는 목적으로 사용된다.
또한, 본 발명의 실시양태에 따르면, 개별 미세입자들은 샘플 및 존재하는 경우 관심 분석물을 검출하기 위해 필요한 시약을 흡수할 수 있도록 하는 내부 부피를 갖는다. 샘플 내의 분석물이 선택적으로 적절한 결합 버퍼의 존재 하에 미세입자에 의해 흡수(또는 "흡수(absorbed)") 및 가능하면 결합 또는 농축(또는 "흡착(adsorbed)")되고, 필요한 경우 임의의 각각의 세척 단계가 수행되었을 때, 상기 미세입자는 미세입자에 의해 흡수될 적절한 검출 조성물에 후속적으로 노출된다. 본원에 사용된 "검출 조성물"이라는 용어는 분석물의 화학적 또는 생화학적 검출 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 조성물을 의미한다. 바람직한 실시양태에서, "화학적 또는 생화학적 검출 반응"은 핵산 증폭 또는 면역화학 검출 반응이다. 이러한 반응을 수행하기 위한 적절한 "검출 조성물"은 상기에 추가로 설명되어 있다. 이러한 검출 조성물이 미세입자에 의해 흡수되면, 이에 따라 생물학적 액체 샘플(또는 이러한 샘플의 일부) 및 적절한 검출 조성물을 포함하는 미세입자가 존재한다. 후속적으로, 미세입자 내에 포함되지 않으나, 미세입자의 외부에 위치한 임의의 잔여 액체는 예를 들어 여과, 원심분리, 진탕(shaking) 또는 다른 기계적 교반, 및 이의 조합에 의해 제거될 것이며, 이어서 각각의 미세입자는 이들을 비수성 액체로 배치함으로써 절연되며, 이러한 비수성 액체는 각각의 미세입자들을 절연시키고 서로 상호작용하는 것을 방지한다. 이러한 공정은 여러 샘플에서 반복되며, 각 샘플은 특정한 표지 구성요소에 의해 특이적으로 표지된 미세입자의 상이한 특정 하위세트에 의해 조사된다. 이러한 공정의 결과는 별개의 하위세트 미세입자 제조물(preparations), 즉 서로 분리된 각각의 하위세트 내에 개별 미세입자를 갖는, 및 이에 할당된 이들 각각의 개별 표지 구성요소를 갖는 개별 하위세트 미세입자의 제조물(microparticles' preparations)을 갖는 별개의 하위세트 제조물이며, 이에 따라 이러한 하위세트 미세입자 제조물을 특정한 샘플에 명확하게 할당할 수 있다.
이러한 단계에서, 즉 미세입자가 절연된 이후, 다양한 샘플에 상응하는 미세입자의 제조물의 다양한 유형, 즉 다양한 하위세트는 서로 혼합되고 함께 집합(pooled)될 수 있다. 또한, 이 단계에서, 각각의 미세입자들은 절연되기 때문에 더 이상 서로 상호작용할 수 없으며, 이들은 비수성 상에 포함된 개별 수성 액적이기 때문에, 이들이 노출된 다양한 샘플에 상응하는 다양한 유형의 미세입자의 제조물은 풀(pool)로 조합될 수 있으며, 이러한 풀은 이후 미세입자 내에 검출 반응을 수행하는데 필수적인 상태에 놓일 수 있다. 이러한 검출 반응은 예를 들어 핵산 증폭일 수 있거나, 또는 면역화학 반응일 수 있다. 이러한 검출 반응은 상기 방법의 일반적 부분을 나타낸다. 이는 이러한 미세입자가 분석물의 의심되는 샘플에 의해 조사되는 한, 임의의 미세입자, 즉 임의의 유형의 미세입자에서 수행되기 때문에 "일반적"이다. 다시 말해, 이러한 일반 부분은 이러한 미세입자가 노출되는 샘플의 유형과 무관하게, 모든 미세입자에서 수행되며, 바람직하게 하나의 공정으로 동시에 수행된다.
검출 반응의 결과로 각각의 미세입자 내에 생성된 신호는 검출되고 각각의 미세입자에 부착되거나, 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 각각의 특정한 표지 구성요소에 할당된다. 어떤 표지 구성요소가 어떤 샘플에 해당하는지 또한 알려져 있기 때문에, 생성된 각 신호는 각 샘플과 효과적으로 상호 연관될 수 있으며, 그 결과 관심 분석 대상인지 여부 또는 테스트되는 샘플에 존재하는지 여부를 결정할 수 있다.
효과적으로, 미세입자는 개별 샘플의 미량을 제한하고 개별적으로 분석할 수 있는 개별 반응 공간 또는 "반응기"를 나타낸다. 따라서, 분석물의 단일 입자가 단일 미세입자에 분포될 수 있는 방식으로 본 발명에 따른 방법의 실시양태를 효과적으로 수행하는 것이 가능하고, 이에 따라 제한된 희석을 제공하고 이에 따라 디지털 형식으로 수행되는 방법이 허용된다; 또한 Sykes et al., 1992, Biotechniques 13(3): pp. 444-449 참조. 이러한 형식을 사용하면 각 샘플에서 정교한 감도 및 분석물의 우수한 정량화가 가능하다.
본 발명의 실시양태에서 사용되는 통상적인 시약은 하기와 같다:
우선, 본원에서 종종 "비드"로 지칭되는 미세입자 자체가 있다. 이들은 다공성이 높고 다공성 기질을 가지고 있으며 다공성 기질에 일정 부피의 액체를 수용하도록 구성된다. 통상적으로, 이들은 액체 샘플을 취하여 다공성 기질에 수용할 때, 미세입자의 기계적 안정성 및 화학적 완전성을 제공하는 중합체 또는 중합체 혼합물로 구성된다. 바람직하게 기질 중합체(들)은 실온에서 안정한 입자를 제공하고 증가된 온도에서 액적을 제공하는 겔-졸 특성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 미세입자가 이들의 겔 상태인 경우, 즉 겔 또는 준-고체(quasi-solid) 상인 경우, 이들은 액상에서 현탁액을 형성한다. 그러나, 만약 이들이 이후에 졸 상태로 전환되는 경우, 즉 용해성 또는 반-액체 상인 경우, 이들은 액상에서 에멀전을 형성하고 현탁액은 에멀전으로 전환될 것이다. 폴리머 또는 폴리머 혼합물이 가교결합되지 않은 실시양태는 특히 우수하며, 상이한 상, 예를 들어 겔 및 졸 상태 사이의 전환에 다용성이다.
본원에 사용된 "미세입자"라는 용어는 마이크로미터 범위의 평균 치수(dimension)을 갖는 입자를 의미한다. 일 실시양태에서, 본 발명에 따른 미세입자는 약 1 μm - 200 μm, 바람직하게 5 μm - 150 μm, 더욱 바람직하게 10 μm - 100 μm의 평균 크기(size) 또는 평균 입경(dimension) 또는 평균 직경(diameter)을 갖는다. 일 실시양태에서, 본 발명에 따른 미세입자는 구형 또는 계란형(oval) 또는 타원형(ellipsoidal)이며, 바람직하게 구형이며, 상기 치수는 이러한 구형, 계란형 또는 타원형 미세입자의 평균 직경을 의미한다. 일 실시양태에서, 상기 미세입자는 (구형) 액적의 형태를 갖는다. 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 미세입자는 구형체 또는 준(quasi-)구형체이며, 즉 구형(또는 거의 이에 근접하는) 형태를 가지며, 이러한 구는 상기 치수의 평균 직경을 갖는다. 통상적으로, 본 발명에 따른 미세입자는 다공성이며 수성 샘플을 수용하고 분석물의 특정한 검출을 위한 반응 공간을 제공하는 공극(void) 부피를 갖는 다공성 중합체 기질을 갖는다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 미세입자는 다공성 기질 내에 샘플 내에 존재하는 임의의 분석물과 함께 액체 샘플의 흡수 및 동일한 것의 수용이 가능할뿐만 아니라, 만약 이들이 샘플 내에 존재하고, 이에 따라 미세입자 내에 이러한 분석물의 국소 농도를 증가시키는 경우, 관심 분석물 또는 분석물 부류(예를 들어 핵산)를 결합 또는 농축하는 필요한 기능성을 촉진 또는 제공하는 결합 멤버(예를 들어 상기 다공성 중합체 기질에 부착된 분석물 특이적 결합 분자, 예를 들어 분석물 특이적 시약(ASR); 이온화 가능한 그룹, 또는 복수의 이온화 가능한 그룹, 상기 다공성 중합체 기질에 고정된 것, 상기 전구체-미세입자를 둘러싸는 주변 상태에 따라 이(들)의 전하(들)를 변경할 수 있는 상기 이온화 가능한 그룹(들); 전하를 띤 그룹, 또는 상기 다공성 중합체 기질에 고정된 복수의 전하를 띤 그룹; 이들 중 임의의 조합)를 실제로 포함한다.
또한, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 미세입자는 추가로 각각의 (유형의) 미세입자에 부착되거나, 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 특정한 표지를 특징으로 한다.
본 출원인인 Blink AG에 의해 "A library of prefabricated microparticles and precursors thereof"라는 제목의 병행 EP 출원(대리인 문서 B33016EP)에서 개시된 것과 같은 미세입자가 또한 본 발명의 실시양태에서, 특히 하나 이상의 분석물이 각각의 샘플에서 검출되는 이러한 실시양태에서, 특히 적합하다는 것이 밝혀졌다.
일부 실시양태에서, 용해 버퍼는 샘플로부터 관심 분석물을 방출하거나 또는 샘플 내에서 이러한 관심 분석물을 이용 가능하게 만들기 위해 필요할 수 있다. 이러한 용해 버퍼는 세포, 특히 세포막의 용해, 또는 세포 소기관의 용해를 유발할 수 있는 제제를 포함할 수 있으며, 용해의 결과로, 관심 분석물만 이용 가능할 수 있다. 일부 실시양태에서, 용해 버퍼 단독 또는 추가 버퍼와 조합은 미세입자 내 관심 분석물의 농축 또는 결합을 촉진할 수 있다. 미세입자 내에서 관심 분석물의 농축 또는 결합을 촉진하는 이러한 추가 버퍼는 본원에서 또한 종종 "결합 버퍼"로 지칭된다. 만약 "결합 버퍼"가 분석물 또는 다른 구성요소의 농도를 적용하도록 사용된다면, 이러한 본원에서 이러한 "결합 버퍼"는 또한 종종 "희석 버퍼"로 지칭된다.
본원에서 사용된 "관심 분석물" 또는 "분석물"이라는 용어는 또한 본원에서 종종 "표적"으로 언급되며, 특히 핵산이 분석되는 경우에 그렇게 언급된다.
일부 실시양태에서, 또한 세척 버퍼는 그렇지 않으면 후속 검출 반응을 억제하거나 또는 그렇지 않으면 이러한 후속 검출 반응이 제대로 기능하는 것을 방해하는 임의의 원치 않는 구성요소를 미세입자(들)로부터 제거하기 위해 필요할 수 있다. 만약 예를 들어 검출 반응이 면역화학 반응이면, 일부 실시양태에서, 미세입자(들)은 관심 분석물에 특이적인 일차 항체인 분석물 특이적 시약을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 분석물 특이적 시약으로 1차 항체를 포함하는 미세입자(들)은 관심 분석물을 포함하는 것으로 의심되는 샘플에 노출되며, 이러한 미세입자는 후속적으로1차 항체에 결합하는 관심 분석물에 특이적인 2차 항체, 즉 적절한 리포터, 예를 들어 효소에 결합된 자체를 포함하는 제1 검출 조성물에 노출된다. 미세입자가 샘플 및 제1 검출 조성물에 노출되면, 그렇지 않으면 후속 검출 반응을 방해할 수 있는 임의의 비결합 2차 항체를 제거하기 위한 세척 단계를 수행하는 것이 필요할 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시양태는 후속적으로 발생하는 적절한 반응 검출 반응을 억제 또는 방지할 수 있는 임의의 원치 않는 구성요소를 미세입자로부터 제거하기 위해 세척 버퍼를 포함하는 세척 단계의 사용을 예상한다.
일 실시양태의 추가 단계에서, 미세입자(들)은 검출 시약으로 제2 항체에 결합된 리포터 효소에 대한 적절한 기질을 포함하는 제2 검출 조성물에 노출된다. 이러한 기질은 상기 리포터 효소에 의해 반응되면, 검출 가능하게 되며, 바람직하게 광학적으로 검출 가능하게 되며, 특히 형광에 의해 검출 가능하게 된다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 검출 반응은 핵산 증폭 반응일 수 있다. 이러한 실시양태에서, 미세입자(들)은 표적 특이적 증폭 및 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브를 포함할 수 있다. 이러한 분석물 특이적 시약(들)은 미세입자(들)에 가역적으로 결합되어 이미 제공될 수 있거나 또는 일반 검출 조성물의 기타 성분으로 이에 함께 첨가될 수 있다. 통상적으로, 이러한 일반 검출 조성물은 관심 핵산 분석물의 증폭 반응을 수행하는데 필요한 시약을 포함하며, 또한 프라이머 및/또는 프로브가 이미 미세입자(들)의 일부인지 또는 아닌지에 따라, 프라이머, 및 선택적으로 적절한 검출 프로브를 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 이러한 분석물 특이적 시약이 이미 미세입자(들)의 일부인 경우, 이들은 일반 검출 조성물에 포함되지 않을 것이다. 그러나, 이러한 일반 검출 조성물은 그렇지 않으면, 프라이머를 제외하고, 관심 핵산 분석물의 증폭 반응을 수행하기 위해 필요한 시약을 포함하며, 여기서 특히 일반 검출 조성물은 적절한 버퍼, 모노-뉴클레오티드, 증폭 효소, 예를 들어 적절한 핵산 중합효소, 예를 들어 Taq 중합효소, 및 (선택적으로) 증폭 산물, 예를 들어 증폭된 핵산의 검출을 위한 핵산 염료를 포함한다.
본 발명에 따르면, 상기 방법은 또한 개별 미세입자를 절연하는데 사용되는 비수성 상으로 미세입자(들)의 수송을 필요로 하며, 이에 따라 미세입자(들)의 부피에 이들의 내용물을 효과적으로 밀봉 및 제한한다. 이러한 비수성 상은 통상적으로 친유성 화합물, 예를 들어 친유성 오일, 예를 들어 플루오로카본 오일, 바람직하게 하나 이상의 적절한 유화제를 포함하는 것이다. 이러한 비수성 상은 미세입자(들)이 이에 수송될 때 요구되며, 이러한 비수성 상은 미세입자(들)에 의해 흡수되지 않는 임의의 수성 액체를 대체하는 것을 도와, 이러한 미세입자(들)이 서로 분리되어 여러 미세입자들 사이에 액체 교환이 더 이상 불가능하도록 한다. 결과적으로, 안정한 미세입자 현탁액이 형성되면, 두 개의 상이한 샘플의 혼합을 유도할 수 있는 한 미세입자에서 다른 것으로 임의의 샘플의 이송(carry-over)이 배제된다.
추가로, 본 발명에 따른 방법의 실시양태는 정량적 디지털 및 정량적 실시간 분석 접근 방법을 연결함으로써 분석물 정량을 위한 우아한 접근 방법을 가능하게 한다. 이러한 진술은 미세입자에 사용되는 임의의 종류의 신호 또는 표적 증폭 분석에 사실이지만, PCR 증폭은 우리의 방법으로 표적의 정량화하는 접근 방법을 설명하는 예시가 될 수 있다. 표적 분자의 정량화는, 이러한 방법이 실시간 정량 PCR(qPCR)에 비해 보다 민감하고 정확하게 정량하므로, 바람직하게 디지털 PCR(dPCR)을 통해 수행된다. 디지털 PCR의 단점은 하나의 샘플/분석물에 특이적인 미세입자의 수에 의존하는 측정 범위의 고유한 한계이다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 본 발명은 디지털 PCR 측정 범위 이상의 표적 농도에 대한 실시간 정량 PCR로 디지털 PCR 분석을 보완한다. 이러한 접근 방법을 구현하려면 PCR 종료 시 및 실시간 PCR의 모든 사이클 동안 형광 이미지를 수집해야 한다. 모든 수집된 이미지는 반응기 챔버 내에 각각의 미세입자의 형광 수준을 정량하기 위해 이미지 분석 알고리즘을 통해 분석된다. 분할 알고리즘은 밝은 디스크 모양의 미세입자 개체를 어두운 배경으로부터 분리한다. 이러한 분할 정보에 기초하여, 최종적으로 원이 미세입자 개체 윤곽에 맞춰져 평균 미세입자 형광 및 미세입자 부피를 추정할 수 있다. 실시간 PCR 이미지의 분석은 각각의 개별 미세입자의 반응 과정 동안 형광을 모니터링할 수 있도록 연속 이미지에서 미세입자 위치의 추적을 포함한다.
적용된 정량화 방법의 선택은 증폭 반응 후 음성으로 남아 있는 미세 입자의 수/비율을 기반으로 한다. 이 정보는 디지털 PCR 데이터에서 가져온다. 음의 미세 입자의 수/비율에 대해 미리 정의된 하한을 초과하면 종말점 푸아송(Poisson) 분석이 적용될 수 있다. 그렇지 않으면 모든 주기 동안 획득한 실시간 정량적 PCR 데이터를 사용하여 실시간 분석을 수행한다. 푸아송으로 여전히 강력한 정량화를 허용하는 음의 미립자 비율에 대한 합리적인 하한은 0.5%이다. 미립자당 표적의 해당 평균 수는 5.3이다. 형광 이미지에서 가능한 인공물을 고려하기 위해 추가 요구 사항은 예를 들어 50의 총 음의 미세 입자 수에 대한 하한이 될 수 있다.
종말점 푸아송 분석은 음성 미립자의 비율을 결정하고 양성 미립자가 하나 이상의 표적 분자를 포함할 수 있다는 사실을 설명하기 위해 푸아송 보정을 적용하여 수행된다. 양성 미세 입자와 음성 미세 입자를 구별하는 임계값은 음성으로 알려진 미세 입자의 형광 신호 강도에서 직접 추정된다. 가능한 미세 입자 부피 변화는 미세 입자 부피 특정 푸아송 보정을 수행하여 정량화에 고려된다. 측정 사이의 총 미세 입자 부피의 가능한 변화도 알고리즘에 의해 수정된다.
목표 농도가 디지털 PCR의 측정 범위를 초과하는 경우, 실시간 분석은 각 단일 미세입자의 형광 신호 과정에 비선형 함수를 맞춘다. 피팅된 비선형 모델은 시그모이드 구성 요소가 증폭 역학을 나타내고 선형 구성 요소가 신호의 기준선을 나타내는 선형 함수와 시그모이드를 결합한다. 사이클 임계값(Ct)은 시그모이드 함수의 정의 값에서 접선(tangent)과 최대 2차 미분 및 기준선의 교차점에서 계산된다. 미세입자당 각각의 표적 수는 보정(calibration) 데이터 세트를 사용하여 계산된다. 보정 곡선의 오프셋 항목은 미세입자 부피 변화의 영향을 설명하기 위해 미세입자 부피의 함수일 수 있다.
신호 또는 표적 증폭 반응이 미세 입자에 의해 생성된 반응 공간에서 수행된 후 음성(즉 "다크(dark)")으로 남아 있는 미세 입자의 수를 기반으로 하는 간단한 규칙을 적용하여 넓은 측정 범위에 걸쳐 정량적 결과를 달성하는 데 가장 적합한 접근 방식을 설정할 수 있다. 상기 규칙은 다음과 같이 공식화할 수 있다:
a. 본 발명에 따른 라이브러리를 사용한 주어진 검출/정량 측정의 경우, 주어진 분석물에 특이적인 미세입자의 0.5% 이상이 음성으로 남아 있는 경우(즉 다크(dark) 로 남아 있는 미세입자("비드")("PdarkBead" 또는 "Pnegative")의 확률이 >0.5%), 푸아송 분석을 적용하여 샘플 내에 표적 분석물의 농도를 측정할 수 있다.
b. 본 발명에 따른 라이브러리를 사용하여 주어진 검출/정량 측정에 대해, 주어진 분석물에 특이적인 미세입자의 5% 미만이 음성으로 남아 있는 경우(즉 다크(dark)로 남아있는 미세입자("비드")("PdarkBead" 또는 "Pnegative")의 확률이 <5%), 실시간 분석 알고리즘을 적용하여 샘플 내에 표적 분석물의 농도를 측정할 수 있다.
c. 본 발명에 따른 라이브러리를 사용하는 주어진 검출/정량 측정에 대해, "음성" 미세입자가 0.5%<Pnegative<5% 범위 내에서 발생하는 경우, 두 접근 방법 모두 상호교환적으로 적용될 수 있다.
이러한 정량화 원리는 도 14 및 15와 실시예 2에도 설명되어 있다.
본 발명의 방법은 복수의 생물학적 액체 샘플에서 관심 분석물을 검출 및/또는 정량할 수 있다.
또한, 본 발명을 제한하지 않고 설명하기 위해 제공된 도면을 참조한다. 보다 구체적으로,
도 1A는 본 발명의 실시양태에 따른 분석/방법의 기본 계획의 실시양태를 보여주며, 이러한 방법의 작업 흐름은 테스트되는 다양한 샘플이 있는 만큼 여러 번 수행되는 것이 바람직한 샘플 특이적 부분("특이적 공정 부분"으로 도면에 지칭됨), 및 어떤 샘플에 노출되었는지 관계 없이 모든 미세입자에 공통적인 일반 공정을 포함한다. 위쪽 박스는 기본 공정의 실시양태 및 공정의 샘플 특이적 부분의 가능한 구성요소를 나타낸다. 샘플은 용해 버퍼를 사용하여 용해되고, 그 결과 본원에 종종 "표적"으로 지칭되는 관심 분석물(들)이 방출된다. 선택적으로, 적절한 희석 버퍼(본원에서 또한 종종 "결합 버퍼"로 지칭됨)는 용해 버퍼의 특정한 시약 농도를 허용 가능한 범위로 조정하는데 사용될 수 있으며, 이에 따라 의심되는 관심 분석물을 포함하는 샘플은 관심 분석물을 포함하는 샘플이 각각의 샘플에 지금 할당된 특정한 표지를 수송하는 미세입자에 의해 흡수 또는 흡착될 수 있는 상태에 놓이며, 본원에서 이러한 표지된 미세입자는 또한 종종 "인코딩된 미세입자" 또는 "인코딩된 비드"로 지칭된다. 하나의 샘플에 노출된 이러한 "인코딩된 미세입자"는 본원에서 또한 종종 "미세입자의 하위세트"로 지칭된다. 각각의 이러한 "하위세트"는 각각의 하위세트에 부착되거나, 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 특정한 표지 구성요소를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 각각의 분석물은 또한 입자를 형성하는 기질에 친화성 결합을 통한 미세입자(들)에 결합될 수 있거나, 또는 이러한 목적을 위해 입자에 부착되거나 또는 포함된 분석물 특이적 시약(ASR)에 결합될 수 있다. 일단 관심 분석물(들)이 미세입자(들) 내에 포함/수용되면, 미세입자의 각각의 하위세트는 적절한 검출 조성물에 노출되며, 이의 특성 및 함량은 관심 분석물로 수행되는 검출 반응에 의존한다(즉 검출 반응은 검출되는 분석물의 유형에 의존함). 이러한 검출 반응은 관심 분석물의 검출 반응을 수행하는데 필요한 시약을 포함한다. 이러한 검출 조성물의 바람직한 실시예는 상기에 추가로 정의된다. 후속적으로, 각각 검출 조성물이 미세입자에 의해 흡수되면, 개별 미세입자(들)을 둘러싸는 임의의 수상을 제거하는 단계가 뒤따를 수 있다. 이러한 단계는 여과, 원심분리, 진탕 또는 기타 기계적 교반, 및 이들의 조합을 포함할 수 있으며, 이는 각각의 미세입자로 수행된다. 그 후, 바람직하게는 각각의 미세입자(들)를 둘러싸는 임의의 수상을 제거한 후, 각각의 미세입자(들)는 선택적으로 유화제를 포함하는 오일과 같은 비수성상으로 이동된다. 바람직한 실시양태에서, 유화제는 개별 마이크로입자를 분리하는 데 도움된다. 비수성 상으로의 이러한 이동의 결과로, 가능하게는 이러한 특정 샘플에서 관심 분석물(들)과 함께 분리된 미세 입자의 현탁액이 있을 것이다. 동일한 공정이 다른 유형("하위세트")의 미세입자로 반복되며, 다르게 인코딩되며, 즉 상이한 샘플에 노출된 이러한 상이하게 인코딩된 미세입자에 부착되거나, 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 상이한 표지 구성요소를 갖는다. 이 공정이 필요하거나 원하는 만큼 많은 다른 샘플에 대해 수행되면, 어떤 미세입자의 개별 하위세트가 어떤 샘플에 노출되었는지 나타내는 상관 관계의 첫 번째 기록이 생성될 수 있다. 이러한 상관 관계의 첫 번째 기록은 본원에서 "샘플/비드 코드 목록"이라고도 한다. 원하는 만큼 또는 필요한 만큼의 서로 다른 샘플에 대해 서로 다른 샘플에 대한 서로 다른 미세입자의 하위세트를 노출하는 과정이 수행되면, 각각의 분리된 미세입자 하위세트를 혼합하고 공정의 일반 부분에서 검출 반응에 적용할 수 있으며, 이러한 검출 반응은 핵산 증폭, 면역화학 반응의 수행, 또는 관심 분석물의 검출에 적합한 임의의 기타 생화학 반응일 수 있다. 각각의 샘플(및 미세입자의 하위세트)내에 분석물의 존재 또는 부재에 따라, 특정 미세입자의 하위세트에 대한 이러한 검출 반응에서 생성된 신호가 있을 수 있다. 따라서 신호가 검출되는 비드의 목록("비드/신호 코드 목록" 또는 "상관의 두 번째 기록")이 생성되어 검출 반응에서 신호가 생성된 미세입자의 하위 집합을 표시할 수 있다. 후속적으로, 그러한 검출 반응에서 생성된 각각의 신호(들)는 후속적으로 디코드될 수 있으며(예를 들어, 상관의 두 번째 기록(또는 "비드/신호 코드 목록")를 상관의 첫 번째 기록(또는 "샘플/비드 코드 목록”)과 정렬 또는 비교함으로써), 관심 분석물(들)이 각각의 미세입자(들)를 채우거나 적재하는 데 원래 사용되었던 샘플 중 하나 또는 여러 개에 존재(또는 부재)했다는 발견을 초래한다. 바람직하게는, 어떤 샘플에 관심 분석물이 포함되어 있는지, 즉 검출된 신호의 실제 할당은 상관 관계의 첫 번째 기록(즉, 어떤 하위세트가 어떤 샘플에 노출되었는지 나타내는 목록)를 상관 관계의 두 번째 기록(즉, 신호가 생성된 하위집합을 나타내는 목록)과 연결하여 수행된다.
본 발명에 따른 방법의 주요 이점은 다음과 같다는 점에 유의해야 한다: 샘플이 개별적으로 테스트되어야 하는 경우, 검출 반응은 각 샘플에 대해 개별적으로 및 분리되어 수행되어야 한다. 본 발명은 그렇지 않으면 각 샘플에 대해 개별적으로 및 분리되어 수행될 모든 검출 반응에 동일하고 공통적인 방법의 한 부분("일반 부분")이 분석되는 모든 샘플에 대해 한 번 수행되도록 허용한다.
도 1B는 본 발명의 실시양태에 따른 분석/방법의 기본 계획의 실시양태를 나타내며, 이는 이러한 방법의 작업 흐름이 또한 단일 샘플을 처리하는데 유리하게 적용될 수 있음을 보여준다. 사용된 비드는 표적 농축, 정화 및 개별 나노반응기에서 PCR과 같은 신호 생성 반응을 수행하기 위해 다공성 물질을 활용하는 린(lean) 공정을 제공하여, 광범위한 측정 범위에 걸쳐 샘플에 존재하는 표적의 정교한 정량을 제공한다.
도 2는 다공성 기질을 갖고 중합체로 구성된 본 발명에 따른 예시적인 미세입자의 실시양태를 도시하며, 이는 이 특정 경우에 외부 유발에 따라 상전이를 겪을 수도 있다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 다공성 기질을 갖는 미세입자는 이러한 다공성 중합체 기질을 구성하는 중합체가 예를 들어 온도 상승 시에 졸-겔 전이를 겪을 수 있는 다공성 중합체 매트릭스로 구성된다. 일단 각각의 미세입자가 비수성 상에서 절연되면, 온도는 미세입자가 이러한 상전이를 겪는 수준까지 상승될 수 있고, 그 결과 검출 반응이 일어날 수 있는 수성 액적의 형성이 효과적으로 초래된다. 도 2에 도시된 이 실시양태에 따르면, 미세입자(들)는 또한 특정 관심 분석물에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는다. 이것은 중합체 기질 자체의 특징이거나, 또는 예를 들어 기질에 부착된 분석물 특이적 결합 분자(결합제) 시약에 의해 달성될 수 있다. 이러한 결합제는 일부 예에서, 예를 들어 위에서 추가로 정의된 바와 같은 분석물 특이적 시약(ASR)일 수 있다. 분석물-특이적 결합제는 핵산 쌍, 특히 프라이머 쌍을 포함하는 핵산; 압타머, 스피겔머(Spiegelmers); 항체 또는 항체 단편; 수용체, 수용체 단편 및 친화성 단백질과 같은 분석물 또는 분석물 복합체에 특이적으로 결합할 수 있는 비항체 단백질로부터 선택될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 분석물-특이적 시약은 핵산, 특히 핵산 올리고머 및 핵산 프라이머로부터 선택된다. 더욱이, 미세입자(들)는 부착되거나 또는 포함되거나 또는 이와 달리 결합되는 표지 구성요소를 갖는다.
더욱이, 그러한 미세입자는 (선택적으로) 미세입자가 제공된 공간 내에서 수행될 신호 발생 검출 반응을 위한 가역적으로 부착된 시약을 포함할 수 있다. 본 발명의 실시양태에 따르면, 특정 핵산 서열("분석물" 또는 "표적")을 증폭하기에 적합한 한 쌍의 프라이머는 본 명세서에서 이러한 프라이머 쌍이 두 개의 다른 프라이머를 포함한다는 사실에도 불구하고 단일 분석물 특이적 시약(ASR)으로 자격을 얻고 이로 여겨진다. 그러나 그것들은 그러한 핵산 서열의 동일한 영역에 인접하고 따라서 동일한 핵산 분석물에 대해 특이적이라는 점에서 단일 핵산 서열에 대해 특이적이다.
바람직한 실시양태에서, 표지 구성요소는 형광 염료, 보다 바람직하게는 2개의 상이한 형광 염료의 혼합물이다.
본 발명의 실시양태에 따른 미세입자(들)는 이들의 다공성 기질에서 관심 분석물을 수용, 바람직하게는 결합 또는 농축하는 능력을 가지며, 각각의 미세입자(들)에 부착되거나 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 각각의 표지 구성요소의 수단에 의해 식별되고 다른 미세입자와 구별될 수 있다. 본 발명에 따른 미세입자(들)은 다공성 성질이기 때문에, 이들은 임의의 관심 분석물을 포함하는 샘플을 취하기에(또는 "흡수"하기에) 충분한 접근 가능한 내부 부피를 제공하며, 또는, 만약 존재하는 경우, 예를 들어 상기 다공성 중합체 기질; 이온화 가능한 그룹, 또는 복수의 이온화 가능한 그룹, 상기 다공성 중합체 기질에 고정된, 상기 전구체-미세입자를 둘러싸는 주변 환경에 따라 이의 전하를 변경할 수 있는 상기 이온화 가능한 그룹(들); 전하를 띤 그룹, 또는 상기 다공성 중합체 기질에 고정된 복수의 전하를 띤 그룹; 또는 이들의 임의의 조합에 결합된 분석물 특이적 결합 분자에 의해 미세입자의 기질에 분석물이 결합("흡착")하기에, 충분한 접근 가능한 내부 부피를 제공한다.
바람직하게는, 이러한 미세입자는 또한 외부 트리거의 적용시 상전이를 겪을 수 있어서, 예를 들어 온도를 특정 임계값 이상으로 상승시키면 실온의 겔 상태에서 상승된 온도에서 가용성 상태로 변형될 수 있다. 입자가 동시에 액체에 있을 때, 실온에서 이들의 현탁액은 따라서 상승된 온도에서 에멀젼으로 변형된다.
이러한 방식으로 작용하는 바람직한 중합체는 단독으로 또는 젤라틴과 결합하여 사용되는 아가로스 중합체이다.
도 3은 본 발명의 실시양태에 따른 미세입자("반응기 비드")의 기본 기능을 나타낸다. 상기 도면은 3가지 상이한 유형의 미세입자를 나타내며, 각각은 그러한 개별 유형과 관련된 개별 표지 구성요소에 의해 서로 구별된다. 도 3의 현재 표현에서, 상이한 표지 구성요소는 미세입자/비드의 원형 표현 내에서 다르게 해칭된(hatched) 영역에 의해 상징적으로 표현된다; 이와 같이 상이하게 해칭된 영역은 다른 미세입자를 구별할 수 있는 한 임의의 적절한 표지 구성요소를 나타낼 수 있다. 예를 들어 그들은 단일 염료의 다른 농도, 두 가지 다른 염료의 다른 비율, 다른 감지 가능한 물리적 레이블 등을 나타낼 수 있다. 공정의 "샘플 특이적 부분"인 공정의 첫 번째 부분에서, 세 가지 유형의 미세입자가 세 가지 다른 샘플 1 - 3에 별도로 노출되어, 효과적으로, 이러한 샘플에 노출된 미세입자의 각각의 유형("하위세트")의 표지 구성요소에 의해 각각의 샘플이 인코딩된다. 바람직한 실시양태에서, 표지 구성요소 및 이와 연관된 각각의 샘플 사이의 이러한 상관관계는, 본원에서 때때로 "상관관계의 제1 기록"으로도 지칭되는 상응하는 연관된 샘플과 함께 (미세입자의 상응하는 하위세트의) 표지 구성요소의 목록을 생성함으로써 달성된다. 그러한 목록은 또한 본원에서 때때로 "샘플/미세입자 코드 목록" 또는 "샘플/비드 코드 목록"으로 언급될 수 있으며, 이는 어떤 미세입자가 어떤 샘플에 노출되었는지를 나타낸다. 이 실시양태에서, 일련의 공정 단계 후에, 미세입자는 검출 시약으로 로딩되고 미세입자의 절연을 제공하고 미세입자 사이의 임의의 크로스토크(cross talk)을 방지하는 비수성 환경에서 수집된다. 공정의 "일반 부분"인 공정의 제2 부분에서는 비수성 상의 상이한 샘플을 인코딩하고 해당하는 미세입자의 상이한 현탁액을 혼합하고, 필요한 검출 반응, 예를 들어 온도 순환을 포함하는 PCR과 같은 핵산 증폭을 수행하는데 필요한 조건에 동시에 처리한다("한 번에", 즉, 더 이상 서로 분리되지 않음). 이러한 "일반 부분"은 많은 수의 샘플을 처리할 수 있기 때문에, 큰 크기의 전체 환자 코호트 샘플을 사용하여, 예를 들어 임상 시험에서, 단일 검출 공정의 수행을 용이하게 한다. 이러한 검출 반응에서 생성된 신호(들)가 기록되고, 미세입자(의 하위세트)의 각 표지 구성요소가 결정/판독된다. 신호가 생성된 미립자의 하위세트를 나타내는 상관 관계의 제2 기록이 생성된다. 이러한 상관 관계의 제2 기록은 본원에서 "비드/신호 코드 목록"이라고도 한다. "비드/신호 코드 목록"(즉, 상관 관계의 제2 기록)에서 결과 검출 신호/미세 입자 조합은 "샘플/미세입자 코드 목록"("즉, 상관 관계의 제1 기록)과 비교되며, 그 결과 (복수의 실험된 샘플 중) 어떤 샘플이 각각의 관심 분석물을 포함하거나 포함하지 않았는지 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 실시양태에 특히 적합한 미세입자는 샘플에서 관심 분석물의 특이적 검출을 수행하기 위해 사전 제작된 미세입자 라이브러리에 포함된 미세입자이며, 이는 본원과 함께 출원된 조립된 미세입자의 라이브러리라는 명칭의 공동 계류중인 유럽 특허출원(대리인 문서 B33016EP)에 설명된 바와 같다.
도 4는 본 발명에 따른 방법의 실시양태를 수행하는데 적합할 수 있는 신규한 유체 카트리지의 예시적인 레이아웃의 개략도를 나타낸다. 카트리지의 고유한 기능은 분석할 개별 샘플을 위한 별도의 다중 주입구이다. 각 주입구는 해당하는 샘플 챔버 또는 샘플 특정 모듈과 별도로 연결되며 카트리지에 제공되는 많은 수의 다양한 샘플 챔버 또는 샘플 특정 모듈이 있으며, 각각 별도의 샘플에 사용하도록 의도되고 구성되어 있다. "샘플 챔버", "샘플 챔버 모듈" 및 "샘플-특정 모듈"이라는 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며 특정 샘플을 수용하도록 특별히 의도되고 구성된 챔버를 지칭한다. 샘플을 포함하도록 구성된(및 이 특정 샘플에 대한 미세입자의 특정 하위세트를 포함하도록 구성된) 각 샘플 특이적 모듈 내의 실제 공간은 본원에서 종종 "샘플 구획"이라고도 지칭된다. 이러한 특정 챔버 모듈은 안전한 인코딩 공정을 보장하기 위해 제공되며, 즉 상기 공정은 미세입자의 특정한 개별 유형("하위세트")를 이러한 샘플에 노출시켜 각 샘플이 인코딩/표지되고, 이에 따라 미세입자의 상기 상이한 하위세트 각각에 상이한 샘플이 각각 "로딩(loaded)"된다. 상이한 샘플 특이적 챔버 모듈은 상이한 모듈과 이에 따라 상이한 샘플 간의 임의의 교차 오염을 방지한다. 각각의 개별 주입구는 샘플 챔버(또는 샘플별 모듈)의 삼각형 들여쓰기(indentations)로 도면에 표시되며, 샘플 챔버는 이들의 작은 면(들)에 서 있는(standing) 직사각형 상자로 표시된다.
이 도면의 예시적인 카트리지 레이아웃은 예시적인 밸브 및 펌프 메커니즘을 포함한다. 카트리지 레이아웃에는 세 개의 개별 챔버 그룹(또는 모듈)이 제공된다:
1. 샘플 특이적 공정을 촉진하는 모듈 및 다른 부품(parts) 중에서 미세입자를 인코딩하는 샘플을 포함하는 모듈
2. 특정(샘플 특이적 모듈 내에 제공되지 않는 경우) 및 일반 공정을 수행하는 데 필요한 시약을 저장하기 위한 챔버; 또한 비수성 상("비수성 상 챔버")을 포함하기 위해 특별히 지정된 저장 챔버가 표시됨
3. 일반 공정을 촉진하는 챔버 또는 모듈(예를 들어 혼합(선택) 및 검출(강제) 챔버, 또는 혼합 및 검출이 조합된 챔버, 즉 두 기능이 조합된 챔버(미도시))
모든 시약은 인코딩 공정이 완료되기 전, 및 미세입자가 절연되기 전에, 즉 비수성 상에서 확보되기 전에, 단방향 방식으로 각 모듈에 전달된다. 최종적으로 각 샘플 모듈에서 미세입자 현탁액을 수집하고, 그 다음 상이한 현탁액을 함께 혼합하여 단일 현탁액을 형성한다. 이렇게 혼합된 미세입자는 검출챔버로 이송되어 검출반응을 수행하기 위해 필요한 조건을 거친다. 적응(adapted)될 수 있고 변형시 본 발명의 실시양태에 따라 사용될 수 있는 카트리지는 2019년 7월 18일에 출원된 유럽특허출원 EP No. 19 187 064.1에 설명된 카트리지이며, 이는 적응(adapted)이 필요하지만, 본 발명에 따른 카트리지가 복수의 샘플 챔버를 갖고, 이러한 샘플 챔버의 각각이 자체의 샘플 주입구를 갖는다는 점에서 변형이 필요한 한도에서 적응이 필요하다. 이것은 본 발명에 따라 각각 개별적으로 표지되는 복수의 샘플의 개별적인 조작을 허용한다.
도 5는 본 발명에 따른 방법의 일 실시예를 나타낸다. 보다 구체적으로, 미세입자의 상이한 하위세트(도면에서 각각 "비드 1", "비드 2", "비드 3" 및 "비드 4"로 나타냄)에는 부착된 상이한 표지 구성요소가 있지만, 분석물 특이적 시약을 전혀 포함하지 않거나, 또는 정확히 하나의 특정한 관심 분석물에 대해 특이적인 한 가지 유형의 분석물 특이적 시약을 포함한다. 미세입자의 서로 다른 하위세트는 이들의 상이한 표지 구성요소로 식별될 수 있으며, 예를 들어 상기에 추가로 설명된 대로 카트리지 내의 상이한 샘플 챔버 또는 샘플 특이적 모듈과 같은 상이한 용기에 별도로 제공되며, 각각은 개별적으로 상이한 샘플에 노출된다. 효과적으로, 테스트할 샘플만큼 많은 미세입자의 하위세트가 사용된다. 그 후, 필요한 (일반) 검출 시약/시약 조성물이 각 하위세트에 첨가된다(분석물 특이적 시약이 출발점에서 미세입자 내에 포함되지 않은 경우, 이러한 검출 조성물과 함께 선택적으로 추가로 또한 추가로 위에서 정의된 바와 같은 분석물 특이적 시약을 포함함). 이후, 미세입자의 각 하위세트는 여전히 개별적으로 비수성 상(오일일 수 있으며 선택적으로 유화제를 포함함)으로 이동되어, 서로 절연되어 "크로스토크(cross talk)"가 발생하지 않으며, 즉 더 이상 각 미세입자가 제공하는 공간 사이에 시료가 혼합되지 않으며, 이후 (일반) 검출 반응이 수행된다("원-포트(pot) 검출 반응"). 이러한 (일반) 검출 반응의 결과는 어떤 샘플에 하나의 관심 분석물이 존재했는지에 대한 결론을 내릴 수 있게 한다. 놀랍게도, 본 발명자들은 일단 비수성 상으로 이동됨으로써 서로 분리된 상이한 미세입자들 사이에 유출(spilling over) 또는 "크로스토크"가 실제로 존재하지 않는다는 것을 발견하였다. 결과적으로 각각의 미세 입자가 함께 혼합되었다는 사실에도 불구하고 샘플(분석물의 존재 여부를 테스트할 샘플) 간에 교차 오염이 또한 발생하지 않는다.
도 6은 다수의 샘플이 다수의 분석물에 대해 시험되는 본 발명에 따른 방법의 실시양태를 나타낸다. 원칙적으로 이 방식은 테스트할 샘플의 수만큼 많은 미세입자의 하위세트를 사용하고, 검출할 다양한 분석 물질의 수를 곱한 것을 제외하고, 도 5에 표시된 것과 유사하다. 예를 들어, 도 6의 첫 번째 샘플은 이와 관련된 표지 구성요소의 측면에서뿐만 아니라 그러한 유형에 부착된 분석물 특이적 시약 측면에서도 상이한 2개의 상이한 미세입자 하위세트를 사용하여 시험/분석된다. 두 번째 샘플("샘플 2")에 대해서도 동일하게 수행된다. 따라서 본 실시예에는 모두 4개의 상이한 미세입자 하위세트가 있으며, 각각은 표지 구성요소와 분석물 특이적 시약의 고유한 조합을 갖는다. 그 후, 각각의 필요한 (일반) 검출 시약/검출 조성물이 추가되지만, 여전히 상이한 샘플 사이의 교차 오염을 피하기 위해 샘플 단위로 추가된다. 그 후, 각각의 미세입자는 다시 샘플 단위로 비수성 상으로 이동하고, 이러한 각각의 미세입자가 이러한 방식으로 절연되고 더 이상 서로 간섭 및 교차 오염될 수 없는 후에야, 필요한 검출 반응이 수행된다. 최종 결과는 시험된 각 샘플에 검출할 분석물이 없거나, 하나 또는 두 개 있는지 여부를 찾는 것이다. 다시, 위에서 지적한 바와 같이, 놀랍게도, 본 발명자들은 일단 비수성 상으로 이동됨으로써 서로로부터 분리된 상이한 미세입자들 사이에 유출 또는 "크로스토크"가 실제로 존재하지 않는다는 것을 발견하였다. 결과적으로 각각의 미세입자(각각은 테스트할 개별 샘플의 작은 부피를 포함함)는 함께 혼합됨에도 불구하고, 샘플(분석물 또는 여러 분석물의 존재에 대해 테스트할 샘플) 사이에 교차 오염도 없다.
도 7은 본 발명에 따른 미세입자를 생성하기 위해 사용된 장치의 미세유체 교차 접합의 현미경 사진을 나타낸다. 미세액적은 오일에서 형성되고 수성 하이드로겔 용액을 형성한다(왼쪽). 이어서 액적이 냉각되고 미세입자가 형성된다.
도 8은 디지털 카메라가 장착된 Zeiss Axioscope에서 Cy3 필터 세트로 획득한 형광 현미경 사진을 나타낸다. 세 가지 다른 형광 수준(밝음, 중간, 낮음)은 세 가지 다른 표지 구성요소에 효과적으로 해당하는 세 가지 농도의 표지 구성요소(Cy3 염료)를 나타낸다.
도 9는 비드의 표지를 인코딩하는 형광 채널을 나타내는 검출 챔버의 스티치(stitched) 이미지를 나타낸다. 각각의 표지 구성요소에 의해 구별 가능한(및 이에 따라 인코딩된) 세 가지 상이한 유형의 미세입자(또는 "비드")가 오른쪽 하단의 확대된 이미지 삽입에서 명확하게 인식될 수 있다(밝음, 중간 및 낮음 신호). 이들의 상이한 표지 구성요소로 인해, 이들 비드는 상이한 샘플을 표지하거나 "인코딩"하는 데 사용될 수 있다(그리고 이에 따라 본원에서 때때로 "샘플 인코딩 비드"로도 지칭됨). 비드는 육각형의 밀착 패킹으로 공간적으로 분포되어 있다. 이 PCR 챔버 내에서 사용된 소프트웨어 알고리즘에 의해 인식되는 모든 샘플 인코딩 비드(평균 직경 d=105μm)의 총 수는 N=17.698로 측정되었다.
도 10A는 PCR 증폭 후 색상-표지된 아가로스-젤라틴 하이브리드 미세입자의 형광 이미지를 나타낸다. 이들의 채널 1의 형광 강도로 3개의 표지를 인식할 수 있다. 채널 2는 내부 공정 제어(MS2 파지)에 대한 형광 신호를 나타내고, 채널 3은 HCV 표적의 PCR 증폭에 특정한 형광을 나타낸다. 각 표지는 처리 및 분석된 다른 샘플에 해당한다. 도 10B(상단 그래프)는 채널 1(도 10A의 상단 이미지)에서 상이한 비드에 대해 측정된 형광 강도에 대한 히스토그램을 나타낸다. 세 가지 별도의 표지 종들을 찾을 수 있다. 채널 2(MS2) 및 채널(3)에 대한 각 비드 종에서 발견된 신호 분포를 나타내는 바이올린 플롯이 중간 및 하단 그래프에 표시된다. 푸아송 분석을 적용하면 발견된 숫자가 비드에 적용된 샘플 부피당 특정 카피 수로 번역된다.
도 11은 RNA에 대한 상이한 미세입자 제형의 결합 효율에 대한 실시예 3의 데이터를 요약한 것이다. 데이터는 미세입자의 조성을 조정하면 결합 특성을 최적화할 수 있음을 나타낸다.
도 12는 실시예 3에서 제조된 미세입자에 RNA 결합을 나타내는 시간 경과에 따른 형광 이미지를 나타낸다.
도 13은 미세입자의 사용에 의해 달성된 농축 효과를 예시한다. 그래프는 두 가지 상이한 미세입자 조성에 대한 데이터를 보여준다. 검은 점은 디지털 RT-PCR에 의해 측정된 미세입자와 함께 배양하기 전 샘플 내에서의 목표 농도를 나타낸다. 흰색 칼럼은 상등액에서 배양 후 검출된 목표 농도를 나타내고, 회색 칼럼은 미세입자의 목표 농도를 나타낸다. 농축 효과는 명확하게 볼 수 있으며, 각 상청액(들)의 고갈을 나타낸다.
도 14는 미세입자의 표적 정량을 위해 결합된 디지털 및 실시간 정량 PCR 분석 방법의 정밀도를 나타낸다. 두 방법 모두에 대한 신뢰 구간이 표시된다. λ=5 cp/미세입자(cp=copies)의 수직선은 방법을 상호 교환하여 사용할 수 있는 대략적인 값을 나타낸다("CI"= 신뢰 구간).
도 15는 PCR 증폭 동안 오일 내의 미세입자에 대해 수집된 이미지 시리즈로부터 얻은 실시간 형광 데이터를 나타낸다. 증폭에 특정한 하나의 형광 채널에서 검출된 종말점 형광 신호가 있는 검출 챔버의 스티치 이미지가 왼쪽에 표시된다. 중앙의 그래프는 시간에 따른 왼쪽의 형광 이미지에서 선택된 12개의 대표적인 개별 미세입자에 대한 예시적인 형광 강도를 나타낸다. 형광 이미지에서 검출된 각 미세 입자에 대해 계산된 ct 값의 분포가 오른쪽 히스토그램에 표시된다.
도 1A는 본 발명의 실시양태에 따른 분석/방법의 기본 계획의 실시양태를 보여주며, 이러한 방법의 작업 흐름은 테스트되는 다양한 샘플이 있는 만큼 여러 번 수행되는 것이 바람직한 샘플 특이적 부분("특이적 공정 부분"으로 도면에 지칭됨), 및 어떤 샘플에 노출되었는지 관계 없이 모든 미세입자에 공통적인 일반 공정을 포함한다. 위쪽 박스는 기본 공정의 실시양태 및 공정의 샘플 특이적 부분의 가능한 구성요소를 나타낸다. 샘플은 용해 버퍼를 사용하여 용해되고, 그 결과 본원에 종종 "표적"으로 지칭되는 관심 분석물(들)이 방출된다. 선택적으로, 적절한 희석 버퍼(본원에서 또한 종종 "결합 버퍼"로 지칭됨)는 용해 버퍼의 특정한 시약 농도를 허용 가능한 범위로 조정하는데 사용될 수 있으며, 이에 따라 의심되는 관심 분석물을 포함하는 샘플은 관심 분석물을 포함하는 샘플이 각각의 샘플에 지금 할당된 특정한 표지를 수송하는 미세입자에 의해 흡수 또는 흡착될 수 있는 상태에 놓이며, 본원에서 이러한 표지된 미세입자는 또한 종종 "인코딩된 미세입자" 또는 "인코딩된 비드"로 지칭된다. 하나의 샘플에 노출된 이러한 "인코딩된 미세입자"는 본원에서 또한 종종 "미세입자의 하위세트"로 지칭된다. 각각의 이러한 "하위세트"는 각각의 하위세트에 부착되거나, 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 특정한 표지 구성요소를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 각각의 분석물은 또한 입자를 형성하는 기질에 친화성 결합을 통한 미세입자(들)에 결합될 수 있거나, 또는 이러한 목적을 위해 입자에 부착되거나 또는 포함된 분석물 특이적 시약(ASR)에 결합될 수 있다. 일단 관심 분석물(들)이 미세입자(들) 내에 포함/수용되면, 미세입자의 각각의 하위세트는 적절한 검출 조성물에 노출되며, 이의 특성 및 함량은 관심 분석물로 수행되는 검출 반응에 의존한다(즉 검출 반응은 검출되는 분석물의 유형에 의존함). 이러한 검출 반응은 관심 분석물의 검출 반응을 수행하는데 필요한 시약을 포함한다. 이러한 검출 조성물의 바람직한 실시예는 상기에 추가로 정의된다. 후속적으로, 각각 검출 조성물이 미세입자에 의해 흡수되면, 개별 미세입자(들)을 둘러싸는 임의의 수상을 제거하는 단계가 뒤따를 수 있다. 이러한 단계는 여과, 원심분리, 진탕 또는 기타 기계적 교반, 및 이들의 조합을 포함할 수 있으며, 이는 각각의 미세입자로 수행된다. 그 후, 바람직하게는 각각의 미세입자(들)를 둘러싸는 임의의 수상을 제거한 후, 각각의 미세입자(들)는 선택적으로 유화제를 포함하는 오일과 같은 비수성상으로 이동된다. 바람직한 실시양태에서, 유화제는 개별 마이크로입자를 분리하는 데 도움된다. 비수성 상으로의 이러한 이동의 결과로, 가능하게는 이러한 특정 샘플에서 관심 분석물(들)과 함께 분리된 미세 입자의 현탁액이 있을 것이다. 동일한 공정이 다른 유형("하위세트")의 미세입자로 반복되며, 다르게 인코딩되며, 즉 상이한 샘플에 노출된 이러한 상이하게 인코딩된 미세입자에 부착되거나, 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 상이한 표지 구성요소를 갖는다. 이 공정이 필요하거나 원하는 만큼 많은 다른 샘플에 대해 수행되면, 어떤 미세입자의 개별 하위세트가 어떤 샘플에 노출되었는지 나타내는 상관 관계의 첫 번째 기록이 생성될 수 있다. 이러한 상관 관계의 첫 번째 기록은 본원에서 "샘플/비드 코드 목록"이라고도 한다. 원하는 만큼 또는 필요한 만큼의 서로 다른 샘플에 대해 서로 다른 샘플에 대한 서로 다른 미세입자의 하위세트를 노출하는 과정이 수행되면, 각각의 분리된 미세입자 하위세트를 혼합하고 공정의 일반 부분에서 검출 반응에 적용할 수 있으며, 이러한 검출 반응은 핵산 증폭, 면역화학 반응의 수행, 또는 관심 분석물의 검출에 적합한 임의의 기타 생화학 반응일 수 있다. 각각의 샘플(및 미세입자의 하위세트)내에 분석물의 존재 또는 부재에 따라, 특정 미세입자의 하위세트에 대한 이러한 검출 반응에서 생성된 신호가 있을 수 있다. 따라서 신호가 검출되는 비드의 목록("비드/신호 코드 목록" 또는 "상관의 두 번째 기록")이 생성되어 검출 반응에서 신호가 생성된 미세입자의 하위 집합을 표시할 수 있다. 후속적으로, 그러한 검출 반응에서 생성된 각각의 신호(들)는 후속적으로 디코드될 수 있으며(예를 들어, 상관의 두 번째 기록(또는 "비드/신호 코드 목록")를 상관의 첫 번째 기록(또는 "샘플/비드 코드 목록”)과 정렬 또는 비교함으로써), 관심 분석물(들)이 각각의 미세입자(들)를 채우거나 적재하는 데 원래 사용되었던 샘플 중 하나 또는 여러 개에 존재(또는 부재)했다는 발견을 초래한다. 바람직하게는, 어떤 샘플에 관심 분석물이 포함되어 있는지, 즉 검출된 신호의 실제 할당은 상관 관계의 첫 번째 기록(즉, 어떤 하위세트가 어떤 샘플에 노출되었는지 나타내는 목록)를 상관 관계의 두 번째 기록(즉, 신호가 생성된 하위집합을 나타내는 목록)과 연결하여 수행된다.
본 발명에 따른 방법의 주요 이점은 다음과 같다는 점에 유의해야 한다: 샘플이 개별적으로 테스트되어야 하는 경우, 검출 반응은 각 샘플에 대해 개별적으로 및 분리되어 수행되어야 한다. 본 발명은 그렇지 않으면 각 샘플에 대해 개별적으로 및 분리되어 수행될 모든 검출 반응에 동일하고 공통적인 방법의 한 부분("일반 부분")이 분석되는 모든 샘플에 대해 한 번 수행되도록 허용한다.
도 1B는 본 발명의 실시양태에 따른 분석/방법의 기본 계획의 실시양태를 나타내며, 이는 이러한 방법의 작업 흐름이 또한 단일 샘플을 처리하는데 유리하게 적용될 수 있음을 보여준다. 사용된 비드는 표적 농축, 정화 및 개별 나노반응기에서 PCR과 같은 신호 생성 반응을 수행하기 위해 다공성 물질을 활용하는 린(lean) 공정을 제공하여, 광범위한 측정 범위에 걸쳐 샘플에 존재하는 표적의 정교한 정량을 제공한다.
도 2는 다공성 기질을 갖고 중합체로 구성된 본 발명에 따른 예시적인 미세입자의 실시양태를 도시하며, 이는 이 특정 경우에 외부 유발에 따라 상전이를 겪을 수도 있다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 다공성 기질을 갖는 미세입자는 이러한 다공성 중합체 기질을 구성하는 중합체가 예를 들어 온도 상승 시에 졸-겔 전이를 겪을 수 있는 다공성 중합체 매트릭스로 구성된다. 일단 각각의 미세입자가 비수성 상에서 절연되면, 온도는 미세입자가 이러한 상전이를 겪는 수준까지 상승될 수 있고, 그 결과 검출 반응이 일어날 수 있는 수성 액적의 형성이 효과적으로 초래된다. 도 2에 도시된 이 실시양태에 따르면, 미세입자(들)는 또한 특정 관심 분석물에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는다. 이것은 중합체 기질 자체의 특징이거나, 또는 예를 들어 기질에 부착된 분석물 특이적 결합 분자(결합제) 시약에 의해 달성될 수 있다. 이러한 결합제는 일부 예에서, 예를 들어 위에서 추가로 정의된 바와 같은 분석물 특이적 시약(ASR)일 수 있다. 분석물-특이적 결합제는 핵산 쌍, 특히 프라이머 쌍을 포함하는 핵산; 압타머, 스피겔머(Spiegelmers); 항체 또는 항체 단편; 수용체, 수용체 단편 및 친화성 단백질과 같은 분석물 또는 분석물 복합체에 특이적으로 결합할 수 있는 비항체 단백질로부터 선택될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 분석물-특이적 시약은 핵산, 특히 핵산 올리고머 및 핵산 프라이머로부터 선택된다. 더욱이, 미세입자(들)는 부착되거나 또는 포함되거나 또는 이와 달리 결합되는 표지 구성요소를 갖는다.
더욱이, 그러한 미세입자는 (선택적으로) 미세입자가 제공된 공간 내에서 수행될 신호 발생 검출 반응을 위한 가역적으로 부착된 시약을 포함할 수 있다. 본 발명의 실시양태에 따르면, 특정 핵산 서열("분석물" 또는 "표적")을 증폭하기에 적합한 한 쌍의 프라이머는 본 명세서에서 이러한 프라이머 쌍이 두 개의 다른 프라이머를 포함한다는 사실에도 불구하고 단일 분석물 특이적 시약(ASR)으로 자격을 얻고 이로 여겨진다. 그러나 그것들은 그러한 핵산 서열의 동일한 영역에 인접하고 따라서 동일한 핵산 분석물에 대해 특이적이라는 점에서 단일 핵산 서열에 대해 특이적이다.
바람직한 실시양태에서, 표지 구성요소는 형광 염료, 보다 바람직하게는 2개의 상이한 형광 염료의 혼합물이다.
본 발명의 실시양태에 따른 미세입자(들)는 이들의 다공성 기질에서 관심 분석물을 수용, 바람직하게는 결합 또는 농축하는 능력을 가지며, 각각의 미세입자(들)에 부착되거나 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 각각의 표지 구성요소의 수단에 의해 식별되고 다른 미세입자와 구별될 수 있다. 본 발명에 따른 미세입자(들)은 다공성 성질이기 때문에, 이들은 임의의 관심 분석물을 포함하는 샘플을 취하기에(또는 "흡수"하기에) 충분한 접근 가능한 내부 부피를 제공하며, 또는, 만약 존재하는 경우, 예를 들어 상기 다공성 중합체 기질; 이온화 가능한 그룹, 또는 복수의 이온화 가능한 그룹, 상기 다공성 중합체 기질에 고정된, 상기 전구체-미세입자를 둘러싸는 주변 환경에 따라 이의 전하를 변경할 수 있는 상기 이온화 가능한 그룹(들); 전하를 띤 그룹, 또는 상기 다공성 중합체 기질에 고정된 복수의 전하를 띤 그룹; 또는 이들의 임의의 조합에 결합된 분석물 특이적 결합 분자에 의해 미세입자의 기질에 분석물이 결합("흡착")하기에, 충분한 접근 가능한 내부 부피를 제공한다.
바람직하게는, 이러한 미세입자는 또한 외부 트리거의 적용시 상전이를 겪을 수 있어서, 예를 들어 온도를 특정 임계값 이상으로 상승시키면 실온의 겔 상태에서 상승된 온도에서 가용성 상태로 변형될 수 있다. 입자가 동시에 액체에 있을 때, 실온에서 이들의 현탁액은 따라서 상승된 온도에서 에멀젼으로 변형된다.
이러한 방식으로 작용하는 바람직한 중합체는 단독으로 또는 젤라틴과 결합하여 사용되는 아가로스 중합체이다.
도 3은 본 발명의 실시양태에 따른 미세입자("반응기 비드")의 기본 기능을 나타낸다. 상기 도면은 3가지 상이한 유형의 미세입자를 나타내며, 각각은 그러한 개별 유형과 관련된 개별 표지 구성요소에 의해 서로 구별된다. 도 3의 현재 표현에서, 상이한 표지 구성요소는 미세입자/비드의 원형 표현 내에서 다르게 해칭된(hatched) 영역에 의해 상징적으로 표현된다; 이와 같이 상이하게 해칭된 영역은 다른 미세입자를 구별할 수 있는 한 임의의 적절한 표지 구성요소를 나타낼 수 있다. 예를 들어 그들은 단일 염료의 다른 농도, 두 가지 다른 염료의 다른 비율, 다른 감지 가능한 물리적 레이블 등을 나타낼 수 있다. 공정의 "샘플 특이적 부분"인 공정의 첫 번째 부분에서, 세 가지 유형의 미세입자가 세 가지 다른 샘플 1 - 3에 별도로 노출되어, 효과적으로, 이러한 샘플에 노출된 미세입자의 각각의 유형("하위세트")의 표지 구성요소에 의해 각각의 샘플이 인코딩된다. 바람직한 실시양태에서, 표지 구성요소 및 이와 연관된 각각의 샘플 사이의 이러한 상관관계는, 본원에서 때때로 "상관관계의 제1 기록"으로도 지칭되는 상응하는 연관된 샘플과 함께 (미세입자의 상응하는 하위세트의) 표지 구성요소의 목록을 생성함으로써 달성된다. 그러한 목록은 또한 본원에서 때때로 "샘플/미세입자 코드 목록" 또는 "샘플/비드 코드 목록"으로 언급될 수 있으며, 이는 어떤 미세입자가 어떤 샘플에 노출되었는지를 나타낸다. 이 실시양태에서, 일련의 공정 단계 후에, 미세입자는 검출 시약으로 로딩되고 미세입자의 절연을 제공하고 미세입자 사이의 임의의 크로스토크(cross talk)을 방지하는 비수성 환경에서 수집된다. 공정의 "일반 부분"인 공정의 제2 부분에서는 비수성 상의 상이한 샘플을 인코딩하고 해당하는 미세입자의 상이한 현탁액을 혼합하고, 필요한 검출 반응, 예를 들어 온도 순환을 포함하는 PCR과 같은 핵산 증폭을 수행하는데 필요한 조건에 동시에 처리한다("한 번에", 즉, 더 이상 서로 분리되지 않음). 이러한 "일반 부분"은 많은 수의 샘플을 처리할 수 있기 때문에, 큰 크기의 전체 환자 코호트 샘플을 사용하여, 예를 들어 임상 시험에서, 단일 검출 공정의 수행을 용이하게 한다. 이러한 검출 반응에서 생성된 신호(들)가 기록되고, 미세입자(의 하위세트)의 각 표지 구성요소가 결정/판독된다. 신호가 생성된 미립자의 하위세트를 나타내는 상관 관계의 제2 기록이 생성된다. 이러한 상관 관계의 제2 기록은 본원에서 "비드/신호 코드 목록"이라고도 한다. "비드/신호 코드 목록"(즉, 상관 관계의 제2 기록)에서 결과 검출 신호/미세 입자 조합은 "샘플/미세입자 코드 목록"("즉, 상관 관계의 제1 기록)과 비교되며, 그 결과 (복수의 실험된 샘플 중) 어떤 샘플이 각각의 관심 분석물을 포함하거나 포함하지 않았는지 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 실시양태에 특히 적합한 미세입자는 샘플에서 관심 분석물의 특이적 검출을 수행하기 위해 사전 제작된 미세입자 라이브러리에 포함된 미세입자이며, 이는 본원과 함께 출원된 조립된 미세입자의 라이브러리라는 명칭의 공동 계류중인 유럽 특허출원(대리인 문서 B33016EP)에 설명된 바와 같다.
도 4는 본 발명에 따른 방법의 실시양태를 수행하는데 적합할 수 있는 신규한 유체 카트리지의 예시적인 레이아웃의 개략도를 나타낸다. 카트리지의 고유한 기능은 분석할 개별 샘플을 위한 별도의 다중 주입구이다. 각 주입구는 해당하는 샘플 챔버 또는 샘플 특정 모듈과 별도로 연결되며 카트리지에 제공되는 많은 수의 다양한 샘플 챔버 또는 샘플 특정 모듈이 있으며, 각각 별도의 샘플에 사용하도록 의도되고 구성되어 있다. "샘플 챔버", "샘플 챔버 모듈" 및 "샘플-특정 모듈"이라는 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며 특정 샘플을 수용하도록 특별히 의도되고 구성된 챔버를 지칭한다. 샘플을 포함하도록 구성된(및 이 특정 샘플에 대한 미세입자의 특정 하위세트를 포함하도록 구성된) 각 샘플 특이적 모듈 내의 실제 공간은 본원에서 종종 "샘플 구획"이라고도 지칭된다. 이러한 특정 챔버 모듈은 안전한 인코딩 공정을 보장하기 위해 제공되며, 즉 상기 공정은 미세입자의 특정한 개별 유형("하위세트")를 이러한 샘플에 노출시켜 각 샘플이 인코딩/표지되고, 이에 따라 미세입자의 상기 상이한 하위세트 각각에 상이한 샘플이 각각 "로딩(loaded)"된다. 상이한 샘플 특이적 챔버 모듈은 상이한 모듈과 이에 따라 상이한 샘플 간의 임의의 교차 오염을 방지한다. 각각의 개별 주입구는 샘플 챔버(또는 샘플별 모듈)의 삼각형 들여쓰기(indentations)로 도면에 표시되며, 샘플 챔버는 이들의 작은 면(들)에 서 있는(standing) 직사각형 상자로 표시된다.
이 도면의 예시적인 카트리지 레이아웃은 예시적인 밸브 및 펌프 메커니즘을 포함한다. 카트리지 레이아웃에는 세 개의 개별 챔버 그룹(또는 모듈)이 제공된다:
1. 샘플 특이적 공정을 촉진하는 모듈 및 다른 부품(parts) 중에서 미세입자를 인코딩하는 샘플을 포함하는 모듈
2. 특정(샘플 특이적 모듈 내에 제공되지 않는 경우) 및 일반 공정을 수행하는 데 필요한 시약을 저장하기 위한 챔버; 또한 비수성 상("비수성 상 챔버")을 포함하기 위해 특별히 지정된 저장 챔버가 표시됨
3. 일반 공정을 촉진하는 챔버 또는 모듈(예를 들어 혼합(선택) 및 검출(강제) 챔버, 또는 혼합 및 검출이 조합된 챔버, 즉 두 기능이 조합된 챔버(미도시))
모든 시약은 인코딩 공정이 완료되기 전, 및 미세입자가 절연되기 전에, 즉 비수성 상에서 확보되기 전에, 단방향 방식으로 각 모듈에 전달된다. 최종적으로 각 샘플 모듈에서 미세입자 현탁액을 수집하고, 그 다음 상이한 현탁액을 함께 혼합하여 단일 현탁액을 형성한다. 이렇게 혼합된 미세입자는 검출챔버로 이송되어 검출반응을 수행하기 위해 필요한 조건을 거친다. 적응(adapted)될 수 있고 변형시 본 발명의 실시양태에 따라 사용될 수 있는 카트리지는 2019년 7월 18일에 출원된 유럽특허출원 EP No. 19 187 064.1에 설명된 카트리지이며, 이는 적응(adapted)이 필요하지만, 본 발명에 따른 카트리지가 복수의 샘플 챔버를 갖고, 이러한 샘플 챔버의 각각이 자체의 샘플 주입구를 갖는다는 점에서 변형이 필요한 한도에서 적응이 필요하다. 이것은 본 발명에 따라 각각 개별적으로 표지되는 복수의 샘플의 개별적인 조작을 허용한다.
도 5는 본 발명에 따른 방법의 일 실시예를 나타낸다. 보다 구체적으로, 미세입자의 상이한 하위세트(도면에서 각각 "비드 1", "비드 2", "비드 3" 및 "비드 4"로 나타냄)에는 부착된 상이한 표지 구성요소가 있지만, 분석물 특이적 시약을 전혀 포함하지 않거나, 또는 정확히 하나의 특정한 관심 분석물에 대해 특이적인 한 가지 유형의 분석물 특이적 시약을 포함한다. 미세입자의 서로 다른 하위세트는 이들의 상이한 표지 구성요소로 식별될 수 있으며, 예를 들어 상기에 추가로 설명된 대로 카트리지 내의 상이한 샘플 챔버 또는 샘플 특이적 모듈과 같은 상이한 용기에 별도로 제공되며, 각각은 개별적으로 상이한 샘플에 노출된다. 효과적으로, 테스트할 샘플만큼 많은 미세입자의 하위세트가 사용된다. 그 후, 필요한 (일반) 검출 시약/시약 조성물이 각 하위세트에 첨가된다(분석물 특이적 시약이 출발점에서 미세입자 내에 포함되지 않은 경우, 이러한 검출 조성물과 함께 선택적으로 추가로 또한 추가로 위에서 정의된 바와 같은 분석물 특이적 시약을 포함함). 이후, 미세입자의 각 하위세트는 여전히 개별적으로 비수성 상(오일일 수 있으며 선택적으로 유화제를 포함함)으로 이동되어, 서로 절연되어 "크로스토크(cross talk)"가 발생하지 않으며, 즉 더 이상 각 미세입자가 제공하는 공간 사이에 시료가 혼합되지 않으며, 이후 (일반) 검출 반응이 수행된다("원-포트(pot) 검출 반응"). 이러한 (일반) 검출 반응의 결과는 어떤 샘플에 하나의 관심 분석물이 존재했는지에 대한 결론을 내릴 수 있게 한다. 놀랍게도, 본 발명자들은 일단 비수성 상으로 이동됨으로써 서로 분리된 상이한 미세입자들 사이에 유출(spilling over) 또는 "크로스토크"가 실제로 존재하지 않는다는 것을 발견하였다. 결과적으로 각각의 미세 입자가 함께 혼합되었다는 사실에도 불구하고 샘플(분석물의 존재 여부를 테스트할 샘플) 간에 교차 오염이 또한 발생하지 않는다.
도 6은 다수의 샘플이 다수의 분석물에 대해 시험되는 본 발명에 따른 방법의 실시양태를 나타낸다. 원칙적으로 이 방식은 테스트할 샘플의 수만큼 많은 미세입자의 하위세트를 사용하고, 검출할 다양한 분석 물질의 수를 곱한 것을 제외하고, 도 5에 표시된 것과 유사하다. 예를 들어, 도 6의 첫 번째 샘플은 이와 관련된 표지 구성요소의 측면에서뿐만 아니라 그러한 유형에 부착된 분석물 특이적 시약 측면에서도 상이한 2개의 상이한 미세입자 하위세트를 사용하여 시험/분석된다. 두 번째 샘플("샘플 2")에 대해서도 동일하게 수행된다. 따라서 본 실시예에는 모두 4개의 상이한 미세입자 하위세트가 있으며, 각각은 표지 구성요소와 분석물 특이적 시약의 고유한 조합을 갖는다. 그 후, 각각의 필요한 (일반) 검출 시약/검출 조성물이 추가되지만, 여전히 상이한 샘플 사이의 교차 오염을 피하기 위해 샘플 단위로 추가된다. 그 후, 각각의 미세입자는 다시 샘플 단위로 비수성 상으로 이동하고, 이러한 각각의 미세입자가 이러한 방식으로 절연되고 더 이상 서로 간섭 및 교차 오염될 수 없는 후에야, 필요한 검출 반응이 수행된다. 최종 결과는 시험된 각 샘플에 검출할 분석물이 없거나, 하나 또는 두 개 있는지 여부를 찾는 것이다. 다시, 위에서 지적한 바와 같이, 놀랍게도, 본 발명자들은 일단 비수성 상으로 이동됨으로써 서로로부터 분리된 상이한 미세입자들 사이에 유출 또는 "크로스토크"가 실제로 존재하지 않는다는 것을 발견하였다. 결과적으로 각각의 미세입자(각각은 테스트할 개별 샘플의 작은 부피를 포함함)는 함께 혼합됨에도 불구하고, 샘플(분석물 또는 여러 분석물의 존재에 대해 테스트할 샘플) 사이에 교차 오염도 없다.
도 7은 본 발명에 따른 미세입자를 생성하기 위해 사용된 장치의 미세유체 교차 접합의 현미경 사진을 나타낸다. 미세액적은 오일에서 형성되고 수성 하이드로겔 용액을 형성한다(왼쪽). 이어서 액적이 냉각되고 미세입자가 형성된다.
도 8은 디지털 카메라가 장착된 Zeiss Axioscope에서 Cy3 필터 세트로 획득한 형광 현미경 사진을 나타낸다. 세 가지 다른 형광 수준(밝음, 중간, 낮음)은 세 가지 다른 표지 구성요소에 효과적으로 해당하는 세 가지 농도의 표지 구성요소(Cy3 염료)를 나타낸다.
도 9는 비드의 표지를 인코딩하는 형광 채널을 나타내는 검출 챔버의 스티치(stitched) 이미지를 나타낸다. 각각의 표지 구성요소에 의해 구별 가능한(및 이에 따라 인코딩된) 세 가지 상이한 유형의 미세입자(또는 "비드")가 오른쪽 하단의 확대된 이미지 삽입에서 명확하게 인식될 수 있다(밝음, 중간 및 낮음 신호). 이들의 상이한 표지 구성요소로 인해, 이들 비드는 상이한 샘플을 표지하거나 "인코딩"하는 데 사용될 수 있다(그리고 이에 따라 본원에서 때때로 "샘플 인코딩 비드"로도 지칭됨). 비드는 육각형의 밀착 패킹으로 공간적으로 분포되어 있다. 이 PCR 챔버 내에서 사용된 소프트웨어 알고리즘에 의해 인식되는 모든 샘플 인코딩 비드(평균 직경 d=105μm)의 총 수는 N=17.698로 측정되었다.
도 10A는 PCR 증폭 후 색상-표지된 아가로스-젤라틴 하이브리드 미세입자의 형광 이미지를 나타낸다. 이들의 채널 1의 형광 강도로 3개의 표지를 인식할 수 있다. 채널 2는 내부 공정 제어(MS2 파지)에 대한 형광 신호를 나타내고, 채널 3은 HCV 표적의 PCR 증폭에 특정한 형광을 나타낸다. 각 표지는 처리 및 분석된 다른 샘플에 해당한다. 도 10B(상단 그래프)는 채널 1(도 10A의 상단 이미지)에서 상이한 비드에 대해 측정된 형광 강도에 대한 히스토그램을 나타낸다. 세 가지 별도의 표지 종들을 찾을 수 있다. 채널 2(MS2) 및 채널(3)에 대한 각 비드 종에서 발견된 신호 분포를 나타내는 바이올린 플롯이 중간 및 하단 그래프에 표시된다. 푸아송 분석을 적용하면 발견된 숫자가 비드에 적용된 샘플 부피당 특정 카피 수로 번역된다.
도 11은 RNA에 대한 상이한 미세입자 제형의 결합 효율에 대한 실시예 3의 데이터를 요약한 것이다. 데이터는 미세입자의 조성을 조정하면 결합 특성을 최적화할 수 있음을 나타낸다.
도 12는 실시예 3에서 제조된 미세입자에 RNA 결합을 나타내는 시간 경과에 따른 형광 이미지를 나타낸다.
도 13은 미세입자의 사용에 의해 달성된 농축 효과를 예시한다. 그래프는 두 가지 상이한 미세입자 조성에 대한 데이터를 보여준다. 검은 점은 디지털 RT-PCR에 의해 측정된 미세입자와 함께 배양하기 전 샘플 내에서의 목표 농도를 나타낸다. 흰색 칼럼은 상등액에서 배양 후 검출된 목표 농도를 나타내고, 회색 칼럼은 미세입자의 목표 농도를 나타낸다. 농축 효과는 명확하게 볼 수 있으며, 각 상청액(들)의 고갈을 나타낸다.
도 14는 미세입자의 표적 정량을 위해 결합된 디지털 및 실시간 정량 PCR 분석 방법의 정밀도를 나타낸다. 두 방법 모두에 대한 신뢰 구간이 표시된다. λ=5 cp/미세입자(cp=copies)의 수직선은 방법을 상호 교환하여 사용할 수 있는 대략적인 값을 나타낸다("CI"= 신뢰 구간).
도 15는 PCR 증폭 동안 오일 내의 미세입자에 대해 수집된 이미지 시리즈로부터 얻은 실시간 형광 데이터를 나타낸다. 증폭에 특정한 하나의 형광 채널에서 검출된 종말점 형광 신호가 있는 검출 챔버의 스티치 이미지가 왼쪽에 표시된다. 중앙의 그래프는 시간에 따른 왼쪽의 형광 이미지에서 선택된 12개의 대표적인 개별 미세입자에 대한 예시적인 형광 강도를 나타낸다. 형광 이미지에서 검출된 각 미세 입자에 대해 계산된 ct 값의 분포가 오른쪽 히스토그램에 표시된다.
또한, 본 발명을 제한하지 않고 예시하기 위해 제공되는 구체적인 설명, 특히 하기 실시예를 참조한다.
실시예
실시예 1: RNA 검출 분석을 위한 "샘플 인코딩 비드"의 생성
젤라틴과 아가로오스로 구성된 기질로 다르게 표지된 미세입자가 생성되었으며, 이에 의해 조성물의 젤라틴 분획은 기질의 염료 운반 부분으로 작용했으며, 그 조성으로 인해 표적 결합 및 농축을 위해 제공되었다.
입자 코드 생성을 위한 형광 염료로 젤라틴의 라벨링은 다음과 같이 수행되었다:
소(bovine) 피부 A형 젤라틴의 아세톤 불용성 분획은 NHS 커플링 화학을 이용하여 형광 염료로 표지된다. Cy®3 Mono NHS Ester(GE Healthcare)를 DMF에 용해시켜 10%(w/v)의 최종 용액을 만들었다. 구성요소 1을 70mM 인산나트륨 버퍼 (pH 8.0-8.3, 멸균 여과)에 용해시켜 최종 농도가 0.25%(w/v)가 되도록 하였다. 유리 젤라틴 아미노 그룹에 비해 10배 더 낮은 분자 양의 각 염료를 사용하여 두 젤라틴 유형의 25mL를 표지했다. 표지 용액은 수직(vertical) 모드에서 Multi-Rotator PTR-60(Grant-bio)을 사용하여 4°C에서 밤새 배양되었다. 형광 표지된 젤라틴 정제 및 이의 농축물은 포화 (NH4)2SO4 용액을 사용하여 황산 암모늄 침전을 반복하여 달성되었다. 그렇지 않으면, 젤라틴은 커플링을 위한 겔화된 입자-크기 형식일 수 있고 단순히 주위 온도에서 세척 및 원심분리하여 황산암모늄 침전 없이 정제될 수 있다. 또한, 한외여과, 이소프로판올, 아세톤 또는 메탄올을 사용한 용매 추출, 세파로스 컬럼을 사용한 겔 여과 또는 투석을 수행하여 젤라틴을 정제할 수 있다.
두 경우 모두 유출물이 투명해지고 형광이 나타나지 않을 때까지 정제를 반복하였다. 정제된 형광 표지 젤라틴 샘플은 최종적으로 펠렛을 dH2O로 4회 세척한 후 진공 건조하여 구성요소 3을 생성한다.
젤라틴/아가로스 하이브리드 용액의 제조:
나노 반응기 제작을 위해 세 가지 구성요소로 구성된 하이브리드 하이드로겔 용액을 준비한다.
구성요소 1: 소 피부의 아세톤 불용성 젤라틴 A형 G1890(Sigma)
구성요소 2: 저겔화(low-gelling) 2-히드록시에틸 아가로스(A4018, Sigma)
구성요소 3: Cy3-표지된 젤라틴 (A형)
구성요소 1의 균질한 4%(w/v) 용액을 생성하기 위해, 구성요소 1 40mg을 1mL 뉴클레아제가 없는 물(Carl Roth)에 용해시키고 부드러운 교반(750rpm) 하에 50°C에서 배양하였다. 마찬가지로, 20mg의 구성요소 2를 1mL의 뉴클레아제가 없는 물에 용해 및 녹이고 부드럽게 교반하면서 80°C에서 배양하여 균질한 2%(w/v) 아가로스 용액을 제조하였다. 표지된 젤라틴의 4%(w/v) 용액을 제조하기 위해, 구성요소 3의 건조된 펠릿을 각각의 부피의 뉴클레아제가 없는 물에 넣고 젤라틴이 녹을 때까지 55°C에서 배양했다. 세 가지 구성요소를 모두 혼합하고 뉴클레아제가 없는 물로 채워 각각 젤라틴의 경우 최종 농도가 1.5%(w/v)이고 아가로스 A4018의 경우 0.5%(w/v)인 하이브리드 하이드로겔 용액을 생성했다. 다양한 부피의 구성요소 3과 구성요소 1이 혼합되어 n개의 뚜렷하게 착색된 미세입자 세트가 생성된다. 이 실시양태에서 재현탁된 구성요소 3 및 구성요소 1은 1:1000, 1:500, 1:250의 비율로 혼합되어 3개의 상이한 샘플의 식별 및 분석을 허용하는 3개의 개별 표지 구성요소를 달성한다. 모든 용액은 더 사용할 때까지 55°C에서 유지되었다.
가교되지 않은 젤라틴/아가로스 미세입자의 생성
단분산 색상 코딩된 아가로스-젤라틴 하이브리드 미세입자는 미세유체 입자 생성 시스템(Dolomite, UK)을 사용하여 제작된다. 단분산 하이브리드 미세입자는 간단한 흐름 초점 장치를 사용하여 에멀젼 형성의 한 단계 공정으로 제조된다. 구체적으로, 4-way 선형 커넥터 및 칩 인터페이스 H와 함께 불소성 성질의 표준 액적 접합 칩(100μm)을 사용하여 튜브와 칩 사이의 유체 연결을 접속한다(interface). 두 개의 Mitos P-Pumps가 하이드로겔 용액과 캐리어 오일을 전달한다. 상기 시스템은 핫 플레이트 상단에 배치된 가열 장치의 통합으로 변형되었으며, 젤라틴/아가로스 하이브리드 용액을 액체 상태로 유지하고 구동 유체를 가열하여 오일과 젤라틴/아가로스 하이브리드 용액을 칩 접합부에 접촉할 때 일관된 온도를 보장한다. Picosurf 2(Spherefluidics, UK)와 하이브리드 하이드로겔 용액은 모두 0.22μm 필터로 사전 여과된 후 P-Pump(Mitos)와 액적 시스템의 가열 장치 내의 하이드로겔 저장소에 각각 배치된다. 가열 장치의 온도는 55°C로 설정된다. 유체 라인은 흐름 제어 소프트웨어를 사용하여 1분 동안 2000mbar에서 프라이밍된다. 안정적인 액적 형성을 위해 15-20μl/min의 유속이 조정된다. 매개변수는 Dolomite Flow Control Advanced Software로 모니터링된다.
도 7은 오일 상의 왼쪽에 형성되는 미세액적이 있는 미세유체 교차 접합의 현미경 사진을 보여준다. 결과적으로 하이드로겔 액적은 응고되어 미세입자가 된다.
두 경우 모두, 색상으로 코드된 아가로즈-젤라틴 하이브리드 미세입자는 2mL 미세원심분리기 튜브 또는 15mL 팔콘 튜브에서 얼음 위에 수집되어, 하이브리드 하이드로겔의 응고를 시작한다. 오일-공기 경계에서 미세입자의 수상 손실을 방지하기 위해, 미세입자를 포함하는 에멀젼 오일 500μL에 뉴클레아제가 없는 물 500μL를 중첩했다. 미세입자는 이후에 안정한 하이브리드 스캐폴드를 형성하기 위해 적어도 24시간(바람직하게는 48시간) 동안 4°C로 냉각되었다.
연속상에서 하이브리드 미세입자의 회수
응고된 하이브리드 비드가 에멀젼 오일 위에 축적된다. 에멀젼 오일은 입자가 제거되지 않도록 주의하면서 피펫으로 조심스럽게 제거된다. 이후, 500μL의 1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥탄올(PFO; Sigma)을 튜브에 첨가하여 에멀젼을 분해한다. 하이브리드 하이드로겔 입자를 오일 상으로 옮기기 위해, 튜브를 5초 동안 볼텍싱시키고 5초 동안 2,500 x g에서 원심분리한다. 하이브리드 하이드로겔 미세입자를 새로운 1.5mL 미세원심분리 튜브로 옮긴다.
선택 사항: 이 절차를 반복하여 잔류 탄화불소 오일과 계면활성제를 제거할 수 있다. PFO 세척 후, 회수된 미립자를 1mL 뉴클레아제가 없는 물로 두 번 세척한다. 현미경을 사용하여 미세입자 품질과 크기를 육안으로 검사한다. 설명된 절차의 최종 결과는 다공성 중합체성 기질 및 샘플 인코딩 용량을 가진 나노반응기 미세입자(직경 d=100μm) 세트를 생성한다.
도 8은 디지털 카메라가 장착된 Zeiss Axioscope에서 Cy3 필터 세트로 얻은 형광 현미경 사진을 보여준다. 세 가지 상이한 형광 수준(밝음, 중간, 낮음)이 세 가지 농도의 염료(Cy3 염료)를 나타내는 것으로 볼 수 있으며, 따라서 효과적으로 세 가지 다른 표지 구성요소를 사용하여 이에 표지된 각 미세입자간을 구별할 수 있다.
미세입자 세트의 동결건조
선택적으로, 미소구체(microsphere) 세트는 동결건조되어 장기 보관을 위한 미세입자 펠렛을 제공할 수 있다. 따라서, 원하는 미소구체 세트 및 농도는 600mg/mL 트레할로스 용액의 동일한 부피로 보충되어 미세입자 라이브러리 슬러리를 포함하는 30%(w/v) 트레할로스를 생성한다. 그 후, 100μl의 라이브러리 분취량이 동결건조 준비가 된 RNase/DNase가 없는 PCR 스트립 튜브에서 준비된다. 부형제의 유형(예를 들어 트레할로스) 및 동결건조 제제에서의 이의 농도는 공정 후반부에 용출액에 노출될 때 동결 건조된 미소구체의 팽창 정도에 영향을 미친다. 미세소구 세트는 드라이아이스에서 2시간 동안 동결한 후 Alpha 2-4 LSCplus 동결 건조기(Christ)를 사용하여 진공(-25°C 및 0.1mbar)에서 동결 건조되었다. 샘플을 총 200분 동안 동결 건조기에 두었다. 주요 건조 단계는 온도가 -25°C에서 25°C로 단계적으로 증가하면서 3시간 동안 0.01mbar에서 유지되었다. 최종 건조 단계는 25°C 및 0.05mbar에서 20분 동안 수행되었다.
실시예 2: "샘플 인코딩 비드"를 사용한 샘플 인코딩
하이브리드 비드를 사용한 샘플 제조
겔여과 수지의 제조
Dry P-2 Bio-Gel Media Extra fine <45 μm(BIO-RAD 150-4118)은 뉴클레아제가 없는 탈이온 H2O에서 수화된다. 이후 겔을 빈 스핀 컬럼(즉, SigmaPrep™ 스핀 컬럼, Sigma-Aldrich SC1000-KT)에 채워 최종 베드 부피가 400μl가 되도록 한다. 컬럼은 이동상을 제거하기 위해 1000rcf에서 1분의 짧은 원심분리 단계를 거친다. 컬럼은 버퍼를 첨가하여 400㎕의 50mM Tris HCl 완충액 pH 8.4로 2회 세척한 후 위에서 설명한 대로 컬럼을 회전시킨다.
샘플 용해
건강한 기증자(Jena 대학병원 수혈의학연구소)로부터 수득한 30 μl 의 전체 혈액의 3개 샘플은 300cp/μL의 MS2 바이러스로 스파이크되었고(spiked)(샘플 1, 2 및 3), 3개 샘플 중 하나(샘플 1)는 Basematrix Negative Diluent (SeraCare 1805-0075)에 희석된 AccuPlex HCV 재조합 Sindbis 바이러스 (SeraCare 0505-0036)로 스파이크되어, 5.500cp/μL 샘플의 명목상(nominal) 역가를 얻었다.
모든 샘플은 4.5M 구아니듐 HCl, 9% Triton X100, 18mM EDTA 및 100mM Tris HCl pH 8.0을 포함하는 각각 195μl의 용해 버퍼와 별도로 혼합되었다. 각 용해 혼합물은 65°C에서 5분 동안 배양되었다.
구아니듐 HCL을 제거하기 위한 겔 여과
용해 직후 각 혼합물을 P-2 컬럼에 적용했다. 통과/여과물(flow through/filtrat)은 1.000 rcf에서 1분 원심분리 후 200U의 RNase 억제제(biotechrabbit, DE)를 포함하는 새로운 반응 튜브로 회수되었다.
샘플 인코딩 비드에 대한 분석물의 결합
샘플은 하기 표에 나타난 바와 같이 형광 표지된 미세입자에 할당되었다.
샘플 인코딩 비드에 샘플 할당
| 샘플 인코딩 서브타입 | HCV | MS2 | |
| 샘플 1 | 0 | + | + |
| 샘플 2 | 1 | - | + |
| 샘플 3 | 2 | - | + |
+ = 양성; -= 음성
동결건조된 미세입자의 펠렛은 70μL RNA 함유 결합 버퍼(구성요소 4)에 재현탁되며, 각 세트는 디지털 PCR 분석에 사용할 수 있는 대략 10,000개의 나노반응기로 구성된다. 이들은 버퍼를 흡수하고 핵산의 효율적이고 비특이적 결합 및 디지털 PCR 호환성을 위해 개발된 기능성 다공성 3D 젤라틴-아가로스 기질을 제공하기 위해 즉시 팽창하도록 한다. 개별 샘플은 HCV 및 MS2 RNA를 완전히 캡처하기 위해 별도의 튜브에서 1000rpm에서 5분 동안 15°C에서 이들의 해당 비드와 함께 배양되어 나노반응기에서 핵산이 농축된다.
미세입자 세척
200μl의 세척 버퍼(50 mM Tris HCl pH 8.4, 1U/μl RNaseInhibitor)를 각 샘플에 첨가했다. 1초 동안 12.000 내지 16.000 rpm에서 짧은 볼텍싱 단계 후, 미세입자는 300 rcf에서 30초 동안 원심분리에 의해 침강되고 상청액이 제거됩니다. 세척 단계를 3회 반복했다.
1. "샘플 인코딩 비드"를 사용하여 다양한 샘플에서 분자 표적의 검출 및 정량
미세입자에 시약 로딩
나노 반응기 내 분석물 검출용 시약은 100μL의 1x PCR 버퍼(구성요소 7)로 재현탁된 동결 건조 펠릿으로 공급되어 2x 시약 혼합물(구성요소 8)을 만든다. 시약은 짧은 볼텍싱 단계로 조심스럽게 재현탁된다. 비드 슬러리와 관련하여 동일한 부피의 시약 혼합물이 RNA를 캡처한 비드 세트를 인코딩하는 개별 샘플과 함께 개별 용기에 분배된다. 증폭 및 검출 시약은 1000rpm에서 진탕하면서 15°C에서 5분의 짧은 배양에 의해 하이드로겔 기질로 확산(및 결합)되도록 한다.
구성요소 7: PCR 버퍼 (20mM Tris HCl, 22mM KCl, 22mM NH4Cl, 3mM MgCl2, pH 8.5)
구성요소 8: 시약 혼합물 (2x)
-
리보뉴클레아제 억제제와 함께 2x 열안정성 역전사효소 (biotechrabbit GmbH)
-
0.4 U/μl Hot Start Taq DNA 중합효소 (biotechrabbit GmbH)
-
0.8 mM dNTPs (biotechrabbit GmbH)
-
0.2% (w/v) 낮은 바이오버든(bioburden), 무-프로테아제(protease free), 분자생물학 BSA (Sigma) 용도
분석물 특이적 시약 (HCV)
-
0.8μM HCV-Brun 센스 프라이머 (5'-GTGGTCTGCGGAACCGGTGA-3') 서열번호:1
-
0.8μM HCV-Brun 안티센스 프라이머 (5'-CGCAAGCACCCTATCAGGCAGT-3') 서열번호:2
-
0.8μM HCV-Brun TaqMan 프로브 (5'-Atto647-CCGAGTAGYGTTGGGTYGCGAAAGG-BHQ-2-3') 서열번호:3
내부 프로세스 조절 특이적 시약 (MS2)
-
0.8μM MS2-Nino 센스 프라이머 (5'-CTCTGAGAGCGGCTCTATTGGT-3') 서열번호:4
-
0.8μM MS2-Nino 센스 프라이머 (5'-GGTCCCTACAACGAGCCTAAATTC-3') 서열번호:5
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0.8μM MS2-Nino TaqMan 프로브 (5'-FAM-TCAGACACGCGGTCCGCTATAACGA-BHQ-1-3') 서열번호:6
미세입자의 유화
개별 나노 반응기 세트는 샘플 인코딩 비드 사이의 크로스토크를 방지하기 위해 구성요소 9에 미세입자를 분산시켜 비수성 상으로 별도로 전송된다. 상기 비드를 500rcf에서 30초 동안 원심분리하고 상층액을 버린다. 비드 베드는 1.5mL 미세원심분리 튜브를 사용하여 과량의 구성요소 9(200μL)와 접촉한다. 단일 나노 반응기로 불화탄소 오일의 수성 미세입자를 탈응집 및 유화시키기 위해서는 높은 전단력을 가해야 한다. Sonifier™ S-450 및 Ultrasonics Sonifier™ Cup Horn(Branson)을 사용하여 초음파를 적용하거나, 랙 표면에 대해 튜브를 누르는 동안 약 20/s의 빈도로 미세원심분리기 튜브 랙의 구멍 위로 튜브를 20회 단순히 밀어(sliding) 혼합물을 교반한다. 이것은 기계적 응력을 가하고 수성 미세입자 사이의 인력을 파괴하고 표면 장력을 생성하여 현탁액/에멀젼을 형성한다. 하이드로겔 미세입자 및 과량의 수상은 모두 오일상에서 유화된다. 부산물로 생성되는 서브마이크론 크기의 액적은 온화한 원심분리(500rcf)로 에멀젼을 3회 세척하여 제거된다. 동일한 오일(구성요소 12)로 반복적인 세척은 본질적으로 모든 바람직하지 않은 액체 액적을 제거한다. 구성요소 12는 또한 후속 디지털 에멀젼 PCR을 위한 에멀젼의 효율적인 열안정성을 제공한다. 3개의 유화된 샘플 인코딩 비드 세트는 이제 병렬 디지털 신호 증폭 및 인코딩된 샘플의 검출을 위해 준비된 하나의 용기(튜브)로 간단하게 결합될 수 있다.
구성요소 9: 상 전이 & 신호 증폭 오일
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HFE-7500 불화탄소 오일 (3M Deutschland GmbH)
하기로 보충됨
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2-5% (v/v) PicoSurf (Dolomite Microfluidics) OR 2-5% (v/v) FluoSurf (Emulseo) OR 2-5% (v/v) 008-FluoroSurfactant (RAN Biotechnologies)
샘플 인코딩 비드에서 병렬 디지털 PCR 증폭 반응
캡슐화된 샘플 1, 샘플 2 및 샘플 3이 있는 단분산 에멀젼을 약 2.5cm2의 면적과 100μm의 층 두께를 갖는 검출 챔버로 옮겼다. 챔버 검출 창은 0.8mm 폴리카보네이트(Makrolon 6555, Covestro AG)로 만들어지고 챔버의 반대쪽은 광택 처리되고 변형되지 않은 투명 125미크론 폴리카보네이트(Lexan 8010) 필름(Koenig Kunststoffe GmbH)으로 구성되어 개별 나노리터 반응에 필요한 효율적인 열 전달을 촉진한다. 불화탄소 오일에 현탁된 나노반응기는 반응 챔버의 크기로 인해 단층을 형성하게 한다. 따라서, 미소구체는 후속 병렬 신호 증폭 반응을 위해 약 20.000-30.000 나노 반응기(≒7.000-10.000/샘플)의 균일한 간격 배열을 제공한다.
미세입자는 수정된 PELTIER 요소 30x30x4.7mm, 19.3W(Quick-Ohm, Kupper & Co. GmbH, #QC-71-1.4-3.7M) 및 확립된 챔버 특이적 PCR 제어 모드를 사용하여 초고속 온도 사이클링을 받는다. 적용되는 열적 RT-PCR 조건은 다음과 같다: 50°C에서 10분 동안 역전사, 95°C에서 30초 동안 초기 변성 후, 95°C에서 2초 동안 변성 및 65°C에서 5초 동안 어닐링/신장으로 구성된 2단계 PCR의 30-45 주기. 그들의 졸-겔 전환 기능으로 인해, 현탁액은 개별 액체 나노리터 액적이 있는 에멀젼이 된다. 상이한 샘플의 HCV 및 MS2(대조군)의 다중 이중 증폭은 표지된 나노 반응 구획에서 발생한다.
자동 이미지 수집은 BLINK 도구 상자 소프트웨어에 의해 트리거되며, 5x 대물렌즈(시야 4.416mm x 2.774mm) 및 pE-4000(CoolLED Ltd.) 광원이 장착된 형광 현미경(Zeiss AxioObserver)으로 수행된다. 현미경에는 3개의 형광 필터 세트(Cy5 ET, Cy3 ET, FITC/FAM HC, AHF Analysentechnik) 및 반응 챔버가 고정된 열순환기가 장착된 자동화된 x-y 스테이지가 추가로 장착되었다.
이미지 획득 설정은 다음과 같다: 100-1000ms 및 1-10x의 이득. 라벨 식별을 위해 하나의 이미지(λexc 1 = 580nm), 내부 제어 PCR 신호용으로 하나의 이미지(λexc 2 = 470nm) 및 특정 PCR 신호용으로 하나의 이미지(λexc 3 = 635nm)가 필요하다. 선택적 나노반응기 특정 실시간 분석의 경우, 챔버의 적절한 위치에서 각 주기마다 3개의 형광 채널에 해당하는 3개의 이미지를 촬영할 수 있다.
열 프로토콜이 완료되면 위에서 언급한 설정에서 동일한 장비를 사용하여 전체 감지 챔버 필드를 스캔한다. 증폭/검출 챔버의 크기를 커버하려면 총 48-56개의 이미지가 필요하다.
비드의 표지를 인코딩하는 형광 채널을 나타내는 검출 챔버의 스티치 이미지가 도 9에 나와 있다. 오른쪽 하단의 확대된 이미지 삽입에서 세 가지 다른 샘플 인코딩 비즈(밝음, 중간 및 낮은 신호)를 명확하게 인식할 수 있다. 비드는 육각형의 밀착 패킹으로 공간적으로 분포되어 있다. 이 PCR 챔버 내에서 사용된 소프트웨어 알고리즘에 의해 인식되는 모든 샘플 인코딩 비드(평균 직경 d=105μm)의 총 수는 N=17.698로 측정되었다.
샘플 디코딩 및 종말점 분석
획득한 모든 이미지는 자동화된 다면적 이미지 처리 알고리즘을 따른다. 이 방법은 MSER(Maximally Stable Extremal Regions)을 활용하는 이미지 분할을 사용하여 MSER 기반 이미지 분할 결과에서 인접 액적을 감지한다. 구체적으로, 이미지는 먼저 중앙값 필터를 포함하는 전처리를 거친다. 두 번째로, MSER 알고리즘은 이미지 배경에 적용되어 배경 윤곽선의 볼록한 전환점을 측정하고, Delaunay 삼각 측량을 통해 액적/미세입자 사이의 적절한 절단을 식별한다. 또한, 액적/미세입자는 MSER 알고리즘을 사용하여 분할된다. 마지막으로 액적/미세입자 윤곽에 대한 타당성 검사가 수행된다(대비, 형태, 볼록함). 모든 분할된 액적/미세입자의 각 채널, 위치, 직경/부피 등의 형광 신호를 포함하는 특징들이 후속적으로 수집된다. 실험 데이터는 개별 표지(커플링된 Cy3 염료의 단계적 차이(graduation)) 및 각각의 특정 증폭을 식별하는 Jupyter 스크립트에 적용된다.
PCR은 종말점까지 증폭되고 이에 따라 각 개별 표지에 대해 형광 양성 및 음성 액적의 총 수가 측정된다. 양성 액적은 특정 표적의 최소 1개 사본을 포함하므로 정의된 강도 임계값을 초과하는 증가 형광 신호를 보여준다. 임계값은 템플릿 없이 이전에 수행된 증폭 반응에서 파생되거나 통계를 사용하여 각 실험에서 결정된다. 각 나노반응기 유형에 대한 음수 및 양수 분획은 클러스터링되고 양수 액적의 분율은 푸아송 알고리즘에 맞춰 카피/μL(카피/mL) 입력 단위로 대상 RNA 분자의 초기 농도를 결정한다. 상기 설명된 분석은 3개의 다른 샘플에서 HCV의 동시 검출을 제공하기 때문에 반응기는 6개의 그룹으로 클러스터링 된다:
디지털 PCR 종말점 데이터 클러스터.
| 클러스터 | 샘플 | 샘플 인코딩 비드 타입(표지) | HCV RNA | MS2 파지 RNA |
| 1 | 샘플 1 | 0 | 양성(Positive) | Pass |
| 2 | 음성(Negative) | |||
| 3 | 샘플 2 | 1 | 양성 | Pass |
| 4 | 음성 | |||
| 5 | 샘플 3 | 2 | 양성 | Pass |
| 6 | 음성 |
색상 표지된 아가로스-젤라틴 하이브리드 미세입자의 형광 이미지는 PCR 증폭 후 도 10A에 나와 있다. 채널 1의 이들의 형광 강도로 3개의 표지를 인식할 수 있다. 채널 2는 내부 공정 제어(MS2 파지)에 대한 형광 신호를 나타내고 채널 3은 HCV 표적의 PCR 증폭에 특이적인 형광을 나타낸다. 각 표지는 처리 및 분석된 상이한 샘플에 해당한다. 도 10B(상단 그래프)는 상이한 비드에 대해 측정된 형광 강도에 대한 히스토그램을 보여준다. 세 가지 별도의 표지 종(species)을 찾을 수 있다. 채널 2(MS2) 및 채널(3)에 대한 각 비드 종에서 발견된 신호 분포를 나타내는 바이올린 플롯이 중간 및 하단 그래프에 표시된다. 푸아송 분석을 적용하면 발견된 숫자가 비드에 적용된 샘플 부피당 특정 카피 수(cp/μl)로 번역된다.
실시예 3: 아가로스-젤라틴 하이브리드비드의 RNA 결합 능력
다양한 농도의 다양한 젤라틴과 아가로스 A4018로 구성된 다양한 하이브리드 비드에 대해 RNA의 결합을 시험했다. 미세입자에 결합된 RNA는 RNA 염료 분석을 사용하여 정성적으로 측정하거나 상기 설명된 디지털 PCR 포맷을 사용하여 정량적으로 측정했다.
비드의 제조
미세입자는 다음과 같은 편차와 함께 이전에 설명된 바와 같이 생성되었다:
·
젤라틴의 표지 부분이 생략되어 표지되지 않은 미세입자가 생성됨
·
미세입자 생성을 위한 하이브리드 하이드로겔 용액은 다양한 농도의 아가로스 및 젤라틴으로 구성됨, 즉:
a)
1.3% 젤라틴, 1.0% 아가로스
b)
0.5% 젤라틴, 0.5% 아가로스
c)
1.3% 젤라틴, 0.5% 아가로스
d)
2.0% 젤라틴, 0.5% 아가로스
e)
4.0% 젤라틴, 0.5% 아가로스
·
두 생산자의 각각 두 가지 상이한 젤라틴 유형이 미세입자의 제조에 사용되었다, 즉:
o
GELITA Imagel AP (typeA)
o
GELITA Imagel SI (typeB)
o
G1890의 아세톤 불용성 분획 (Sigma, type A)
o
G9391의 아세톤 불용성 분획 (Sigma type B)
RiboGreen RNA 결합 분석
UV-Star 미세역가 플레이트(Greiner)의 웰은 1x 결합 버퍼(구성요소 4)에 3μL의 50% 비드 슬러리로 채워진다. 다양한 준비로부터, 즉 RNA-스페이서(Metabion), 맥주 효모(brewer's yeast)의 tRNA(Roche Diagnostic) 및 혈액에서 추출한 총 RNA로부터 얻은 1ng/μL의 RNA 최종 농도를 15°C에서 5~10분 동안 배양하여, RNA가 다공성 하이드로겔 기질로 침투하여 결합하도록 했다. 결합이 빠르게 발생하기 때문에 비드에 RNA를 첨가한 직후 혼합하는 것은 비드 전체에 걸쳐 RNA를 균일하게 분포시키는 데 중요하다.
하이브리드 미세입자에 결합된 RNA를 시각화하기 위해 1:2로 희석된 Quant-iT™ RiboGreen® RNA 시약 분취량 0.5μL를 마이크로타이터 웰에 피펫으로 넣고 혼합했다. 비드를 200μL의 TE 버퍼로 두 번 세척한 후 형광 현미경(Zeiss AxioObserver) 및 pE-4000(CoolLED Ltd.) 광원을 사용하여 형광 신호를 측정했다.
도 11은 미세입자의 조성에 대한 조정이 결합 특성의 최적화를 허용한다는 것을 예시한다. GELITA Imagel A 젤라틴을 A4018과 함께 사용하면 Sigma의 G1890 A형 젤라틴의 아세톤 불용성 분획과 비교하여 비드에서 상대적으로 낮은 RiboGreen 신호를 유도한다. 총 RNA, tRNA 및 짧은 RNA 단편은 0.5% 아가로스와 함께 >1.3% 젤라틴으로 만들어진 하이브리드 비드로 더 많은 정도로 결합될 수 있다. 1% 아가로스와 함께 테스트한 RNA에 대해 더 나은 신호도 얻을 수 있다(총 RNA 샘플 결과가 누락됨). 젤라틴 B형은 비드의 RNA 농축과 관련하여 A형에 비해 다르게 행동한다. 임의의 RNA에 대한 임의의 GELITA SI 젤라틴 비드에 대해 신호가 거의 보이지 않는 반면(입자로의 확산만 하고 농축은 없음을 의미함), G9391 젤라틴 B형의 아세톤 불용성 분획으로 만들어진 비드가 비록 RNA 스페이서 및 tRNA에 대해 약하지만 RiboGreen 신호를 나타낸다. 전체 RNA, tRNA 및 짧은 RNA 단편은 0.5% 아가로스와 함께 >1.3% 젤라틴으로 만들어진 하이브리드 비드로 더 많은 정도로 결합될 수 있다.
도 12는 시간이 지남에 따라 Quant-iT™ RiboGreen® RNA 시약으로 시각화된 미세 입자에 대한 효모의 총 RNA 결합을 나타낸다. 분석 형식은 또한 미세입자에 결합하는 RNA를 직접 모니터링할 수 있다. 이미지는 6초마다 획득되며 RiboGreen 신호의 증가를 직접 측정할 수 있다.
디지털 PCR에 의한 RNA 결합 정량화
본 발명에 따른 미세입자의 RNA 결합 능력의 정량적 평가를 위해 나노반응기 내 디지털 PCR을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 응고된 입자에서 액체 액적으로 전이하는 미세입자의 능력은 결합 및 디지털 PCR 검출 매트릭스를 모두 제공할 수 있게 한다. 따라서 결합된 HCV RNA 분자는 비드에서 직접 측정될 수 있다. 그렇지 않으면, 상청액은 액적 생성을 위해 DG8 카트리지(Bio-Rad)를 사용하여 디지털 포맷으로 측정될 수 있다.
정제된(QIAamp Viral RNA Mini Kit) Accuplex HCV RNA(Seracare Life Sciences Inc.)를 포함하는 40μL의 결합 버퍼(구성요소 4)을 40μL의 비드 베드에 첨가하고 1000rpm에서 5분 동안 15°C에서 배양하여 RNA를 결합했다. 비드를 후속적으로 300xg에서 30초 동안 원심분리하고 상청액을 후속 분석을 위해 얼음에 보관한다. 40μL의 2x 시약 혼합물(구성요소 X)을 비드 베드(40μL)에 추가하고 증폭 및 검출 시약은 1000rpm에서 흔들면서 15°C에서 5분의 짧은 배양에 의해 하이드로겔 기질로 확산된다.
구성요소 X: 시약 혼합물 (2x)
-
리보뉴클레아제 억제제와 함께 2x 열안정성 역전사효소(biotechrabbit GmbH)
-
0.4 U/μl Hot Start Taq DNA 중합효소 (biotechrabbit GmbH)
-
0.8 mM dNTPs (biotechrabbit GmbH)
-
0.2% (w/v) 낮은 바이오버든(bioburden), 무-프로테아제(protease free), 분자 생물학용 BSA (Sigma) 분석물 특이적 시약(HCV)
-
0.8μM HCV-Brun 센스 프라이머 (5'-GTGGTCTGCGGAACCGGTGA-3') 서열번호:1
-
0.8μM HCV-Brun 안티센스 프라이머 (5'-CGCAAGCACCCTATCAGGCAGT-3') 서열번호:2
-
0.8μM HCV-Brun TaqMan 프로브 (5'-Atto647-CCGAGTAGYGTTGGGTYGCGAAAGG-BHQ-2-3') 서열번호:3
비드 상 전이, 증폭 반응 및 분석은 앞에서 설명한 대로 수행된다. 상청액(40μL)에 PCR 시약(2x 시약 혼합물 40μL)을 보충한 다음 DG8 카트리지(Bio-Rad)를 사용하여 유화했다. 2-5% Picosurf 2(Sphere Fluidics) 및 40μL를 포함하는 에멀젼 시약 HFE-7500 100μL를 카트리지의 하단 웰에 적용한다. 웰에 연결된 주사기를 부드럽게 당겨 수집 웰에 진공을 적용한다. 액적을 수집하고 디지털 분석을 위해 별도의 감지 챔버로 옮긴다. 액적의 증폭 반응 및 분석에 대한 설정은 비드에 대한 설정과 동일하다. 또한 동일한 부피의 2x 시약 혼합물과 PCR 버퍼로 구성된 참조 샘플도 마찬가지로 유화 및 분석한다.
도 13은 두 가지 상이한 미세입자 조성의 농축 능력을 평가하도록 설계된 이러한 실험에 대한 요약 데이터를 보여준다. 검은 점은 미세입자와 함께 배양하기 전 샘플의 목표 농도를 나타낸다. 흰색 칼럼은 상청액에서 배양 후 검출된 목표 농도를 나타내고, 회색 칼럼은 미세입자에서 표적 농도를 나타낸다. 농축 효과가 뚜렷하게 나타난다.
도 14는 미세입자의 표적 정량화를 위해 위에서 추가로 설명된 조합된 디지털 및 실시간 정량적 PCR 분석 접근 방식의 정밀도를 보여준다. 두 방법 모두에 대한 신뢰 구간이 표시된다. λ=5 cp/미세입자(cp=copies)에 수직선은 방법을 상호교환적으로 사용할 수 있는 대략적인 값을 나타낸다("CI"= 신뢰 구간).
도 15는 PCR 증폭 동안 오일 내의 미세입자에 대해 수집된 이미지 시리즈로부터 얻은 실시간 형광 데이터를 나타낸다. 증폭에 특이적인 하나의 형광 채널에서 검출된 종말점 형광 신호가 있는 검출 챔버의 스티치 이미지가 왼쪽에 표시된다. 중앙의 그래프는 시간에 따른 왼쪽의 형광 이미지에서 선택된 12개의 대표적인 개별 미세입자에 대한 예시적인 형광 강도를 보여준다. 형광 이미지에서 검출된 각 미세입자에 대해 계산된 ct 값의 분포가 오른쪽 히스토그램에 표시된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Blink AG
<120> A method of detecting and/or quantitating an analyte of interest in a plurality of biological liquid samples
<130> B33074WO / IMP223991DE
<150> EP19216592.6
<151> 2019-12-16
<160> 6
<170> BiSSAP 1.3.2
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> "HCV-Brun sense primer"
<220>
<223> HCV-Brun sense primer
<400> 1
gtggtctgcg gaaccggtga 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> "HCV-Brun antisense primer"
<220>
<223> HCV-Brun antisense primer
<400> 2
cgcaagcacc ctatcaggca gt 22
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> "HCV-Brun TaqMan probe "
<220>
<223> HCV-Brun TaqMan probe
<400> 3
ccgagtagyg ttgggtygcg aaagg 25
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> "MS2-Nino sense Primer"
<220>
<223> MS2-Nino sense Primer
<400> 4
ctctgagagc ggctctattg gt 22
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> "MS2-Nino sense Primer "
<220>
<223> MS2-Nino sense Primer
<400> 5
ggtccctaca acgagcctaa attc 24
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> "MS2-Nino TaqMan probe "
<220>
<223> MS2-Nino TaqMan probe
<400> 6
tcagacacgc ggtccgctat aacga 25
Claims (27)
- 복수의 생물학적 액체 샘플에서 관심 분석물을 검출 및/또는 정량하는 방법에 있어서, 상기 방법은 샘플 특이적 공정 부분에 이어 일반 공정 부분을 포함하며;
상기 샘플 특이적 공정 부분은
- 관심 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 복수의 상이한 생물학적 액체 샘플 및 다공성 미세입자의 상이하게 표지된 복수의 하위세트(subset)를 임의의 순서로 개별적으로 제공하는 단계로서, 상기 복수의 하위세트에서, 상기 하위세트 각각은 다른 하위세트로부터 분리된 단계;
- 상기 미세입자의 개별 하위세트 각각을 각각 하나의 생물학적 액체 샘플에 각각 개별적으로 노출시켜 상기 상이한 생물학적 샘플 각각을 특이적으로 표지하여, 각각의 샘플이 수성 환경에서 다공성 미세입자의 하나의 특이적으로 표지된 하위세트에 의해 흡수되도록 하는 단계;
- 다공성 미세입자의 각 하위세트를 상기 수성 환경에서 비수성 환경으로 개별적으로 이동시키는 단계;
를 포함하며,
상기 일반 공정 부분은
- 상기 비수성 환경에서 다공성 미세입자의 상이하게 표지된 하위세트를 함께 혼합하고, 이에 따라 그 안에 다공성 미세입자의 상이하게 표지된 복수의 하위세트의 현탁액을 생성하는 단계;
- 상기 다공성 미세입자의 상이하게 표지된 복수의 하위세트의 상기 현탁액 상에서, 상기 관심 분석물을 검출하기 위한 검출 반응을 수행하는 단계; 및
- 상기 현탁된 미세입자의 상이하게 표지된 하위세트 중 임의의 것이 존재하는 경우, 상기 관심 분석물을 검출 및/또는 정량하는 단계
를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 미세입자의 개별 하위세트 각각을 하나의 생물학적 액체 샘플 각각에 개별적으로 노출시키는 단계에서, 상기 미세입자의 개별 하위세트 각각은 임의의 순서로 각각 하나의 생물학적 샘플 및 화학적 또는 생화학적 검출 반응을 수행하기 위한 검출 조성물에 노출되며, 이에 따라 미세입자의 각각의 하위세트는 각각의 생물학적 샘플 및 이것이 노출된 검출 조성물을 흡수하는 방법.
- 복수의 생물학적 액체 샘플에서 관심 분석물을 검출 및/또는 정량하는 방법, 특히 제1항 또는 제2항에 따른 방법에 있어서, 상기 방법은 하기 단계들을 포함하는 방법:
a. 관심 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 복수의 개별 생물학적 액체 샘플 및 복수의 다공성 미세입자를 임의의 순서로 별도로 제공하는 단계로서; 상기 각각의 다공성 미세입자는 다공성 기질(matrix)을 갖고 상기 다공성 기질에 일정 부피의 액체를 수용하도록 구성되며; 여기서, 상기 복수의 다공성 미세입자에서, 미세입자의 상이한 하위세트가 제공되고, 미세입자의 각 하위세트는 각각의 하위세트에 부착되거나, 이에 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 특정 표지 구성요소를 특징으로 하며; 상기 제공 단계에서, 제공된 미세입자의 상이한 하위세트의 수는 적어도 제공된 개별 생물학적 액체 샘플의 수만큼 크고, 또한 상기 제공 단계에서, 미세입자의 상이한 하위세트가 서로 별개로 제공되며; 여기서, 선택적으로, 상기 미세입자의 상이한 개별 하위세트는 이들의 각각의 다공성 기질에 분석물의 화학적 또는 생화학적 검출 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 검출 조성물을 함유하는 단계;
b. 미세입자의 각각의 개별 하위세트를 정확히 하나의 개별 생물학적 액체 샘플에 노출시켜, 미세입자의 각각의 개별 하위세트가 정확히 하나의 개별 생물학적 액체 샘플의 부피와 함께 배양하고 이러한 샘플 또는 이의 일부를 흡수하도록 하며, 및 선택적으로 분석물이 상기 샘플에 존재하는 경우 미세입자(들)의 기질 내부 또는 위에 분석물을 축적하는 단계로서; 및, 추가로 선택적으로, 상기 미세입자의 상이한 별개의 하위세트의 경우, a) 단계에서 제공될 때, 분석물의 화학적 또는 생화학적 검출 반응을 수행하기 위한 시약을 아직 포함하지 않는 경우, 분석물의 화학적 또는 생화학적 검출 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 검출용 조성물에 별개의 미세입자 하위세트 각각을 노출시켜, 미세입자의 별개의 하위세트 각각이 상기 시약을 수용하도록 하는 단계;
c. 미세입자의 각 하위세트를 별도로 비수성 상으로 옮기고 상기 하위세트(들)의 개별 조립식 미세입자(들)를 둘러싸는 수상의 일부 또는 전부를 제거함으로써, 상기 분석물의 검출을 위한 절연된 반응 공간의 복수의 개별 하위세트를 생성하며, 상기 반응 공간은 샘플 및 분석물의 화학적 또는 생화학적 검출 반응을 수행하기 위한 상기 시약을 포함하는 수상을 포함하며, 상기 반응 공간은 상기 미세입자의 상기 공극(void) 부피(들)로 제한되는 단계;
d. 상기 미세입자의 상이한 하위세트 모두가 상기 비수성 상에서 상이한 미세입자의 현탁액을 형성하도록, 상기 비수성 상에서 미세입자의 별개의 상이한 하위세트를 혼합하는 단계로서; 상기 미세입자의 혼합된 상이한 하위세트를 분석물의 화학적 또는 생화학적 검출 반응을 수행하는 데 필요한 조건에 적용하는 단계; 상기 관심 분석물의 이러한 검출 반응을 수행하는 단계; 및 상기 관심 분석물이 상기 각각의 하위세트에 존재하는 경우, 미세입자의 각각의 하위세트에서 상기 검출 반응에서 발생된 신호 수단을 통해, 상기 미세입자의 상이한 하위세트의 임의의 것에서 존재하는 경우, 상기 관심 분석물을 검출 및/또는 정량하는 단계. - 제3항에 있어서, 상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함하는 방법
e) 단계 d)에서 상기 관심 분석물이 검출되는 미세입자의 하위세트(들)의 실체(identity)를 결정함으로써 단계 a)에서 제공된 상기 복수의 샘플 중 어느 샘플(들)이 상기 관심 분석물을 함유하는지 결정하는 단계에 있어서, 바람직하게 단계 e)에서 미세입자의 하위세트(들)의 실체는 미세입자(들)의 각각의 하위세트에 부착되거나, 이에 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 특정 표지 구성요소 수단에 의해 결정되는 단계. - 제3항 또는 제4항에 있어서, 단계 b)는 미세입자의 개별 하위세트가 어느 샘플에 노출되거나 노출되었는지를 나타내는 상관관계의 제1 기록을 생성하는 하위단계를 추가로 포함하고, 단계 d)는 상기 검출 반응에서 신호가 생성된 미세입자의 하위세트를 나타내는 상관 관계의 제2 기록을 생성하는 하위 단계를 포함하는 방법.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 단계 e)는 상기 제1 및 제2 상관관계 기록을 참조하고 상기 기록을 연결함으로써 수행되며, 이에 따라 단계 a)에서 제공된 상기 복수의 샘플 중 어느 샘플(들)이 상기 관심 분석물을 포함하는지 결정할 수 있게 하는 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다공성 미세입자 각각은 다음을 통해 분석물에 결합함으로써 관심 분석물을 축적하도록 하는 다공성 기질을 갖는 방법:
(i) 상기 다공성 기질을 형성하거나 또는 상기 다공성 기질인 폴리머 또는 폴리머 혼합물; 또는
(ii) 상기 다공성 기질 상에 고정된 적어도 하나의 이온화 가능한 그룹, 또는 복수의 이온화 가능한 그룹, 상기 이온화 가능한 그룹(들)은 상기 미세입자(들)을 둘러싸는 주변 조건에 따라 이들의 전하(들)를 변경할 수 있음; 또는
(iii) 상기 다공성 기질 상에 고정된 적어도 하나의 전하를 띤 그룹, 또는 복수의 전하를 띤 그룹; 또는
(iv) (i) - (iii) 중 임의의 조합. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다공성 미세입자 각각은 다공성 기질을 갖고, 상기 다공성 기질에 부착되거나 또는 상기 미세입자에 의해 포함된 분석물 특이적 시약(ASR)을 포함하며, 이러한 분석물 특이적 시약은 관심 분석물의 농축(enrichment)을 허용하고 및/또는 상기 분석물과 관련된 특정 신호 또는 표적 증폭 반응을 허용하며; 여기서 상기 분석물 특이적 시약은 관심 분석물에 특이적으로 결합할 수 있으며, 바람직하게, 분석물 특이적 시약은 압타머, 스피에겔머(Spiegelmers)를 포함하는 핵산; 항체 또는 항체 단편; 수용체, 수용체 단편, 및 친화성 단백질과 같이 분석물 또는 분석물 복합체에 특이적으로 결합할 수 있는 비항체 단백질로부터 선택되며; 바람직하게 상기 분석물 특이적 시약은 핵산, 특히 핵산 올리고머 및 핵산 프라이머로부터 선택되는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 각각의 다공성 미세입자는 이의 다공성 기질에 부착된 동일한 분석물 특이적 시약을 포함하거나 갖는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 복수의 다공성 미세입자에서 미세입자의 상이한 하위세트가 존재하며,
각 하위세트는
- 상기 하위세트의 상기 미세입자에 부착되거나, 이에 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 별개의 표지 구성요소를 가지며; 및
상기 상이한 하위세트들 모두는
- 상기 하위세트의 상기 미세입자에 부착되거나 또는 포함된 동일한 분석물 특이적 시약을 가지며, 상기 분석물 특이적 시약은 하나의 관심 분석물에 특이적이며;
이에 따라 상기 미세입자의 상이한 하위세트는 부착되거나 포함된 분석물 특이적 시약의 관점에서 동일하지만,
- 상기 각 하위세트의 미세입자에 부착되거나, 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 각각의 표지 구성요소와 상이하며;
각각의 하위세트는 상기 각각의 표지 구성요소에 의해 명확하게 정의되고 식별될 수 있는 방법. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 복수의 생물학적 액체 샘플에서 하나의 관심 분석물을 검출 및/또는 정량하는 방법이며, 여기서 제공되는, 바람직하게 단계 a)에서 제공되는 미세입자의 상이한 하위세트의 수는 제공된 별개의 생물학적 액체 샘플의 수와 동일한 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 복수의 다공성 미세입자에서, 상기 미세입자에 부착되거나 함유된 여러 상이한 분석물 특이적 시약이 존재하는 방법.
- 제12항에 있어서, 미세입자의 상이한 하위세트가 존재하며,
각 하위세트는
- 상기 하위세트의 상기 미세입자에 부착되거나, 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 별개의 표지 구성요소를 가지며; 및
또한, 상기 복수의 다공성 미세입자에서,
- 상기 미세입자의 다공성 기질에 부착되거나 또는 상기 미세입자에 포함된 상이한 분석물 특이적 시약을 갖는 하위세트의 각 유형과 함께 미세입자의 하위세트의 상이한 유형이 존재하며; 여기서, 바람직하게, 미세입자의 하위세트의 적어도 2개 이상의 상이한 유형이 존재하며, 더욱 바람직하게 미세입자의 하위세트의 적어도 3개 이상의 상이한 유형이 존재하며;
이에 따라 상기 미세입자의 상이한 하위세트는 상기 각각의 하위세트의 미세입자에 부착되거나, 포함되거나, 또는 이와 달리 결합된 각각의 표지 구성요소에 의해 상이하며; 및 미세입자의 각 하위세트는 미세입자의 하위세트의 한 유형의 일부를 형성하고; 각 하위세트는 각각의 표지 구성요소 및 각각의 분석물 특이적 시약에 의해 명확하게 정의되고 식별 가능하며; 및
이에 따라 상기 미세입자의 하위세트의 상이한 유형은 부착되거나 포함된 각각의 분석물 특이적 시약에 의해 상이하며; 및 상기 각각의 상이한 유형은 미세입자의 여러 하위세트를 포함하며, 이들 하위세트 모두는 부착되거나 포함된 동일한 분석물 특이적 시약을 갖는 방법. - 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 방법은 복수의 생물학적 액체 샘플에서 하나 이상의 관심 분석물을 검출 및/또는 정량하는 방법이며, 여기서 제공되는, 바람직하게 단계 a)에서 제공되는 미세입자의 상이한 하위세트의 수는 제공된 개별 생물학적 액체 샘플의 수에 검출하고자 하는 관심 분석물의 수를 곱한 것과 같고, 여기서 제공되는, 바람직하게 단계 a)에서 제공되는 미세입자의 하위세트의 많은 유형이 검출될 관심 분석물의 수만큼 존재하는 방법.
- 제3항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다공성 기질은 폴리머 또는 폴리머 혼합물로 형성된 다공성 폴리머 기질이며, 바람직하게 상기 다공성 폴리머 기질은 가교되지 않은 폴리머(또는 폴리머들)로 구성되며, 보다 바람직하게 상기 다공성 폴리머 기질을 형성하는 상기 폴리머 또는 폴리머 혼합물은 아가로스 또는 아가로스 및 젤라틴의 조합으로 구성되며, 보다 바람직하게, 상기 아가로스 및 젤라틴의 조합에서, 상기 아가로스는 0.1%(w/v) 내지 4%(w/v)의 범위로 존재하며, 상기 젤라틴은 0.1%(w/v) 내지 20%(w/v), 바람직하게 0.5%(w/v) 내지 20%(w/v)의 범위로 존재하는 방법.
- 제3항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 분석물은 핵산이며, 상기 검출 반응은 핵산 증폭이며, 상기 검출 조성물은 버퍼, 모노-뉴클레오시드-트리포스페이트, 적절한 핵산 폴리머라제, 예를 들어 Taq 폴리머라제와 같은 증폭 효소, 및 증폭된 핵산과 같은 증폭 산물의 검출을 위한 핵산 염료, 및 선택적으로 하나 이상의 증폭 프라이머 쌍, 및 추가로 선택적으로 만약 이러한 프라이머 및/또는 프로브가 상기 미세입자에 부착되거나 또는 포함된 분석물 특이적 시약(들)(ASR)로 이미 제공되지 않은 경우에 각각의 분자 프로브(예를 들어 TaqMan 프로브, 분자 비콘(beacons) 등)를 포함하는 핵산 증폭을 수행하기 위한 조성물이며; 및/또는
상기 관심 분석물은 단백질 또는 기타 비핵산 분자이며, 상기 검출 반응은 면역화학 검출반응이며, 상기 검출 조성물은 이러한 면역화학 검출 반응을 수행하기 위한 조성물이며 2개의 별개의 구성요소로 상기 방법에 제공되며: 상기 검출 조성물의 제1 구성요소는 버퍼, 및 적절한 리포터 효소와 결합되고 상기 면역화학 검출 반응에서 분석물 특이적 시약(ASR)으로 사용된, 1차 항체, 항체 단편, 또는 비-항체 단백질과 동일한 분석물에 대해 특이적인 2차 항체 또는 2차 항체 단편과 같은 면역화학 검출반응을 수행하는데 필수적인 시약을 포함하며; 및, 선택적으로 이러한 1차 항체, 항체 단편, 또는 비항체 단백질이 상기 미세입자에 부착되거나 또는 포함된 분석물 특이적 시약(ASR)으로 이미 제공되지 않은 경우에, 상기 단백질 분석물 또는 기타 비핵산 분석물에 특이적으로 결합할 수 있는 1차 항체, 항체 단편, 또는 비항체 단백질을 포함하며; 상기 검출 조성물의 제2 구성요소는 검출 시약으로서, 상기 리포터 효소에 의해 반응된 기질을 검출 가능하게 하는, 바람직하게 광학적으로 검출 가능하게 하는, 더욱 바람직하게 형광에 의해 검출 가능하게 하는 상기 적절한 리포터 효소에 대한 적절한 기질을 포함하는 방법. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 분석물을 검출 및 정량하는 상기 단계에서, 상기 분석물의 정량은 하기로부터 선택된 방법을 통해 수행되며:
a) 디지털 핵산 증폭, 특히 디지털 중합효소연쇄반응(PCR);
b) 실시간 정량적 핵산 증폭, 특히 실시간 중합효소연쇄반응(PCR);
c) 면역화학 검출 방법, 특히 디지털 면역분석과 같은 디지털 면역화학 검출 방법, 예를 들어 디지털 효소 결합 면역흡착분석(ELISA);
d) 면역화학적 검출 방법, 특히 면역-중합효소연쇄반응과 같은 핵산 증폭과 조합된 디지털 면역화학적 검출 방법; 특히 디지털 면역-PCR; 및
e) a) - d) 중 임의의 조합;
여기서 관심 분석물이 핵산인 경우 정량은 a) 또는 b) 방법, 또는 a) 및 b)의 조합 중 임의의 것을 사용하여 수행되며; 및 관심 분석물이 단백질, 펩타이드 또는 기타 비핵산 분석물인 경우 정량은 c) 또는 d) 방법 중 임의의 것을 사용하여 수행되는 방법. - 복수의 생물학적 액체 샘플에서 관심 분석물 검출하기 위한 키트, 특히 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기 위한 키트에 있어서, 상기 키트는
- 복수의 미세입자를 포함하는 복수의 용기로서, 각각의 용기는 상기 복수의 다공성 미세입자의 하위세트를 포함하고, 각각의 하위세트 내에 상기 다공성 미세입자의 각각은 다공성 기질을 가지며 상기 다공성 기질 내에 일정한 부피의 액체를 수용하도록 구성되며; 미세입자의 각각의 하위세트는 각각의 하위세트에 부착되거나, 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 특이적 표지 구성요소를 특징으로 하며, 바람직하게 상기 미세입자는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같으며; 선택적으로 상기 미세입자를 세척하기 위한 수성 세척 시약을 포함하는 용기;
- 관심 분석물을 검출하기 위한 검출 조성물을 포함하는 용기로서; 상기 검출 조성물은 분석물의 화학적 또는 생화학적 검출 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하며; 상기 검출 조성물은 핵산 증폭을 수행하기 위한 조성물 또는 면역화학 검출반응을 수행하기 위한 조성물이며;
- 각각의 하위세트가 생물학적 액체 샘플에 노출되면, 상기 미세입자의 상이한 하위세트들을 비수성상으로 옮기고, 비수성 상에서 미세입자의 하위세트의 별개의 상이한 현탁액을 생성하기 위한 비수성 상을 포함하는 용기;
- 상기 미세입자의 하위세트의 상이한 현탁액들 모두가 상기 비수성 상 내에서, 이후 검출 반응에 처리되는 상이한 미세입자의 단일 현탁액을 형성하도록, 상기 비수성 상 내에서 함께 미세입자의 하위세트의 별개의 상이한 현탁액을 혼합하기 위한 혼합 용기;
- 검출 반응을 수행하기 위한 용기
를 포함하는 키트. - 제18항에 있어서, 상기 다공성 미세입자 각각은 이의 다공성 기질에 부착된 분석물 특이적 시약(ASR)을 가지거나, 또는 분석물 특이적 시약(ASR)을 포함하며, 이러한 분석물 특이적 시약은 관심 분석물의 농축을 허용하며 및/또는 상기 분석물을 포함하는 특이적 신호 또는 증폭 반응을 허용하며; 상기 분석물 특이적 시약은 관심 분석물에 특이적으로 결합할 수 있으며, 바람직하게 상기 분석물 특이적 시약은 압타머, 스피에겔머를 포함하는 핵산; 항체 또는 항체 단편; 수용체, 수용체 단편, 및 친화성 단백질과 같은 분석물 또는 분석물 복합체에 특이적으로 결합할 수 있는 비항체 단백질로부터 선택되며; 바람직하게 상기 분석물 특이적 시약은 핵산, 특히 핵산 올리고머 및 핵산 프라이머로부터 선택되는 키트.
- 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 관심 분석물은 핵산이며, 상기 검출 반응은 핵산 증폭이며, 상기 검출 조성물은 버퍼, 모노-뉴클레오시드-트리포스페이트, 적절한 핵산 폴리머라제, 예를 들어 Taq 폴리머라제와 같은 증폭 효소, 및 증폭된 핵산과 같은 증폭 산물의 검출을 위한 핵산 염료, 및 선택적으로 프라이머 쌍이 상기 미세입자에 부착되거나 또는 포함된 분석물 특이적 시약(들)(ASR)로 이미 제공되지 않은 경우 이러한 프라이머 쌍을 포함하는 핵산 증폭을 수행하기 위한 조성물이며; 또는
상기 관심 분석물은 단백질 또는 기타 비핵산 분자이며, 상기 검출 반응은 면역화학 검출 반응이며, 상기 검출 조성물은 이러한 면역화학 검출반응을 수행하기 위한 조성물이며 2개의 별개의 구획 또는 용기에 상기 키트에 제공되며; 상기 검출 조성물은 제1 구획 또는 용기에, 버퍼, 및 적절한 리포터 효소와 결합되고 상기 면역화학 반응에서 분석물 특이적 시약(ASR)으로 사용되는 제1 항체, 항체 단편, 비항체 단백질과 동일한 분석물에 특이적인 2차 항체 또는 2차 항체 단편과 같은 면역화학 검출반응을 수행하기 위한 필수 시약; 및 선택적으로 1차 항체, 항체 단편, 또는 비항체 단백질이 상기 미세입자에 부착되거나 또는 포함된 분석물 특이적 시약(들)(ASR)로 이미 제공되지 않은 경우, 상기 단백질 분석물 또는 비핵산 분석물에 특이적으로 결합할 수 있는 1차 항체, 항체 단편, 또는 비항체 단백질을 포함하며; 및 상기 검출 조성물은 제2 구획 또는 용기에 검출 시약으로서, 상기 리포터 효소에 의해 반응된 기질이 검출 가능, 바람직하게 광학적으로 검출 가능, 더욱 바람직하게 형광에 의해 검출 가능하게 되는 상기 적절한 리포터 효소에 적합한 기질을 포함하는 키트. - 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 다공성 미세입자는 이의 다공성 기질에 부착된 동일한 분석물 특이적 시약을 갖거나 또는 동일한 분석물 특이적 시약을 포함하는 키트.
- 제21항에 있어서, 상기 복수의 다공성 미세입자에서 미세입자의 상이한 하위세트가 존재하며,
각 하위세트는
- 상기 하위세트의 상기 미세입자에 부착되거나, 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 이의 개별 표지 구성요소를 가지며; 및
상기 상이한 하위세트 모두는
- 상기 하위세트의 상기 미세입자에 부착되거나 또는 포함된 동일한 분석물 특이적 시약을 가지며, 상기 분석물 특이적 시약은 하나의 관심 분석물에 특이적이며;
이에 따라 상기 미세입자의 상이한 하위세트는 부착되거나 포함된 분석물 특이적 시약의 관점에서 동일하며, 그러나
- 상기 각 하위세트의 미세입자에 부착되거나, 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 각각의 표지 구성요소가 상이하며;
각 하위세트는 상기 각각의 표지 구성요소에 의해 명확하게 정의되고 식별 가능하며 분리된 용기에 제공되는 키트. - 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 키트는 복수의 생물학적 액체 샘플에서 하나의 관심 분석물을 검출하기 위한 키트이며, 상기 키트에 제공된 미세입자의 상이한 하위세트의 수는 제공된 별개의 생물학적 액체 샘플의 수와 동일한 키트.
- 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 다공성 미세입자에서, 상기 미세입자에 부착되거나 포함된 여러 상이한 분석물 특이적 시약이 존재하는 키트.
- 제24항에 있어서, 미세입자의 상이한 하위세트가 존재하며,
각 하위세트는
- 상기 하위세트의 상기 미세입자에 부착되거나, 포함되거나 또는 달리 결합된 이의 별개의 표지 구성요소를 가지며; 및
또한, 상기 복수의 다공성 미세입자에서, 각 하위세트의 유형과 함께 미세입자의 하위세트의 상이한 유형들은
- 상기 미세입자의 다공성 기질에 부착되거나 또는 상기 미세입자에 포함된 상이한 분석물 특이적 시약을 가지며, 바람직하게 미세입자의 적어도 2개의 상이한 하위세트의 유형이 존재하며, 더욱 바람직하게 미세입자의 적어도 3개 또는 그 이상의 상이한 하위세트의 유형이 존재하며;
이에 따라 상기 미세입자의 상이한 하위세트는 상기 각각의 하위세트의 미세입자에 부착되거나, 포함되거나 또는 이와 달리 결합된 각각의 표지 구성요소가 상이하며; 미세입자의 각 하위세트는 미세입자의 하위세트의 하나의 유형의 일부를 형성하며; 각 하위세트는 각각의 표지 구성요소 및 각각의 분석물 특이적 시약에 의해 명확하게 정의되고 식별 가능하며 분리된 용기에 제공되며; 및
이에 따라 상기 미세입자의 하위세트의 상이한 유형들은 상기 미세입자의 다공성 기질에 부착되거나 상기 미세입자에 포함된 각각의 분석물 특이적 시약에 의해 상이하며; 상기 상이한 유형의 각각은 미세입자의 여러 하위세트를 포함하며, 하위세트 모두는 부착되거나 또는 포함된 동일한 분석물 특이적 시약을 갖는 키트. - 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 키트는 복수의 생물학적 액체 샘플 내에 하나 이상의 관심 분석물을 검출하기 위한 키트이며, 상기 키트에 제공된 미세입자의 상이한 하위세트의 수는 제공된 별개의 생물학적 액체 샘플의 수에 검출될 관심 분석물의 수를 곱한 것과 동일하며, 상기 키트에서, 제공된 미세입자의 하위세트의 많은 유형이 검출될 관심 분석물의 수만큼 존재하는 키트.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 복수의 생물학적 액체 샘플에서 관심 분석물을 검출 및/또는 정량하는 방법을 수행하기 위한 카트리지에 있어서, 바람직하게, 상기 카트리지는 복수의 샘플 특이적 모듈, 복수의 저장 챔버, 비수성 상을 저장하기 위한 적어도 하나의 비수성 상 챔버, 및 단일의 조합된 혼합 및 검출 챔버, 또는 별개의 혼합 챔버 및 별개의 검출 챔버의 조합을 포함하며;
각각의 샘플 특이적 모듈은 이의 고유의 별개의 샘플 입구를 갖는 샘플 구획을 포함하며, 각 샘플 특이적 모듈은 각각의 샘플 구획에서 정확하게 하나의 생물학적 샘플만을 별도로 수용하도록 구성되며; 각각의 샘플 특이적 모듈은 추가로 상기 샘플 구획에 미세입자를 수용하도록 구성되며, 상기 미세입자는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따라 정의된 바와 같으며; 각각의 샘플 특이적 모듈은 수성 환경에서 비수성 환경으로 상기 미세입자를 상 전이를 촉진하도록 추가로 구성되는 카트리지.
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