CN117701685A - 一种基于环介导等温扩增的血型鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于环介导等温扩增的血型鉴定方法，属于生物医药技术领域，其包括以下步骤：包括以下步骤：S1：采集待测个体的血液样本；S2：提取血液样本中的DNA；S3：设计针对血型基因的LAMP引物；S4：利用LAMP引物对提取的DNA进行扩增；S5：通过检测扩增产物的荧光信号判断待测个体的血型；本发明构建了基于环介导等温扩增(LAMP)的血型检测方法；本发明检测效果达到临床检测极限需求。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种基于环介导等温扩增的血型鉴定方法。
背景技术
根据红细胞膜表面有无A抗原和B抗原，将红细胞ABO血型分为A型、B型、AB型及O型4种。血液凝集试验是指抗体和红细胞在液体介质中发生肉眼可见的凝集或溶血反应。通过红细胞凝集试验，进行正、反定型，从而准确鉴定ABO血型。正定型，是用抗-A和抗-B血型定型试剂来测定红细胞表面有无相应的A抗原或B抗原。反定型，是用A1型和B型红细胞试剂来测定血清中有无相应的抗-A或抗-B抗体。根据受检者红细胞表达的A、B抗原及血清(或血浆)中的抗-A、抗-B抗体情况判断ABO血型。常见检测方法包括:玻片法、试管法、微板法、微柱凝集法等。常用方法：1.玻片法利用商品化IgM抗-A、抗-B血型定型试剂鉴定红细胞表面ABO抗原即正定型。玻片法不适用于ABO反定型鉴定，只能用于ABO血型正定型初筛，不能出具正式检验报告。2.试管法利用商品化IgM抗-A、抗-B血型定型试剂鉴定红细胞表面ABO抗原即正定型，利用已知ABO血型的试剂红细胞鉴定同一标本血清(或血浆)中的抗-A和抗-B抗体即反定型。正、反定型结果一致方可确定受检标本ABO血型，若正、反定型结果不一致，需增加辅助试验以确定ABO血型。3.微柱凝集法微柱凝集免疫分析技术是利用微柱内介质的分子筛效应来区分凝集反应中游离红细胞和凝集红细胞的技术，ABO血型鉴定微柱中分别充填IgM类抗-A、抗-B单克隆抗体试剂，用于检测红细胞上A、B抗原。微柱内的介质起到分子筛作用，分子筛在一定离心力的作用下只允许游离红细胞通过，沉淀于底部，即为阴性反应；凝集的红细胞因体积大于分子筛孔径而被阻滞，不能通过微柱介质层，滞留于微柱介质的顶部或介质的中间，即为阳性反应。
在前述的三种测定方法中，血型的判定是以红细胞凝固为判断依据的，进行血型定型实验时，常常出现弱凝集，致使血型无法正确判断的现象。
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification method，LAMP)具有高特异性、高灵敏性、简单、快捷及成本低的特点。LAMP(环介导等温扩增)是由Notomi于2000年开发的一种新型核酸扩增技术，该技术利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，借助具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，在恒等温条件下进行靶序列高效扩增，可合成109-1010个数量级的靶标DNA。该技术避免了常规PCR对循环温度的特殊要求，并因其高效性、简易行、成本低廉且检测周期短等特点提升了它的应用价值。到目前为止，还没有将LAMP技术有效用于血型鉴定中。
为此我们提出一种基于环介导等温扩增的血型鉴定方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种基于环介导等温扩增的血型鉴定方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于环介导等温扩增的血型鉴定方法，包括以下步骤：
S1：采集待测个体的血液样本；
S2：提取血液样本中的DNA；
S3：设计针对血型基因的LAMP引物；
S4：利用LAMP引物对提取的DNA进行扩增；
S5：通过检测扩增产物的荧光信号判断待测个体的血型。
优选的，所述S2中，采用酚-氯仿法、柱式法提取血液样本中的DNA。
优选的，所述S4中，LAMP扩增反应在等温条件下进行，使用具有链置换活性的DNA聚合酶。
优选的，所述S5中，通过实时荧光检测仪器检测扩增产物的荧光信号，从而判断待测个体的血型，能够根据荧光信号的强度和出现时间来判断血型类型。
优选的，所述S3中，所述LAMP引物针对7种亚型SNP序列进行实验方案设计，针对同一靶基因，设计5套，进行筛选评价。
优选的，利用Oligo7软件优化引物参数，避免发夹结构，避免引物间相互配对。
优选的，利用核酸热动力学再优化引物设计，然后再实际评价。
优选的，所述S5中，如果荧光信号出现在A型血特异性基因对应的扩增产物中，则待测个体为A型血；如果荧光信号出现在B型血特异性基因对应的扩增产物中，则待测个体为B型血；如果荧光信号同时出现在A型血和B型血特异性基因对应的扩增产物中，则待测个体为AB型血；如果没有荧光信号出现，则待测个体为O型血。
本发明的有益效果：
1、本发明构建了基于环介导等温扩增(LAMP)的血型检测方法；
2、本发明检测效果达到临床检测极限需求。
附图说明
图1为本发明中7种亚型SNP序列实验方案设计示意图；
图2为本发明中261引物的设计示意图；
图3为本发明中261位点的实时荧光检测结果图；
图4为本发明中297引物的设计示意图；
图5为本发明中297位点的实时荧光检测结果图；
图6为本发明中467引物的设计示意图；
图7为本发明中467位点的实时荧光检测结果图；
图8为本发明中930引物的设计示意图；
图9为本发明中930位点的实时荧光检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
结合图1-图9所示，一种基于环介导等温扩增的血型鉴定方法，包括以下步骤：
S1：采集待测个体的血液样本；
S2：提取血液样本中的DNA；
S3：设计针对血型基因的LAMP引物；
S4：利用LAMP引物对提取的DNA进行扩增；
S5：通过检测扩增产物的荧光信号判断待测个体的血型。
在本发明的具体实施方式中，所述S2中，采用酚-氯仿法、柱式法提取血液样本中的DNA。
在本发明的具体实施方式中，所述S4中，LAMP扩增反应在等温条件下进行，使用具有链置换活性的DNA聚合酶。
在本发明的具体实施方式中，所述S5中，通过实时荧光检测仪器检测扩增产物的荧光信号，从而判断待测个体的血型，能够根据荧光信号的强度和出现时间来判断血型类型。
在本发明的具体实施方式中，所述S3中，所述LAMP引物针对7种亚型SNP序列进行实验方案设计，针对同一靶基因，设计5套，进行筛选评价。
在本发明的具体实施方式中，利用Oligo7软件优化引物参数，避免发夹结构，避免引物间相互配对。
在本发明的具体实施方式中，利用核酸热动力学再优化引物设计，然后再实际评价。
在本发明的具体实施方式中，所述S5中，如果荧光信号出现在A型血特异性基因对应的扩增产物中，则待测个体为A型血；如果荧光信号出现在B型血特异性基因对应的扩增产物中，则待测个体为B型血；如果荧光信号同时出现在A型血和B型血特异性基因对应的扩增产物中，则待测个体为AB型血；如果没有荧光信号出现，则待测个体为O型血。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (8)
1.一种基于环介导等温扩增的血型鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：采集待测个体的血液样本；
S2：提取血液样本中的DNA；
S3：设计针对血型基因的LAMP引物；
S4：利用LAMP引物对提取的DNA进行扩增；
S5：通过检测扩增产物的荧光信号判断待测个体的血型。
2.根据权利要求1所述的一种基于环介导等温扩增的血型鉴定方法，其特征在于，所述S2中，采用酚-氯仿法、柱式法提取血液样本中的DNA。
3.根据权利要求1所述的一种基于环介导等温扩增的血型鉴定方法，其特征在于，所述S4中，LAMP扩增反应在等温条件下进行，使用具有链置换活性的DNA聚合酶。
4.根据权利要求1所述的一种基于环介导等温扩增的血型鉴定方法，其特征在于，所述S5中，通过实时荧光检测仪器检测扩增产物的荧光信号，从而判断待测个体的血型，能够根据荧光信号的强度和出现时间来判断血型类型。
5.根据权利要求1所述的一种基于环介导等温扩增的血型鉴定方法，其特征在于，所述S3中，所述LAMP引物针对7种亚型SNP序列进行实验方案设计，针对同一靶基因，设计5套，进行筛选评价。
6.根据权利要求5所述的一种基于环介导等温扩增的血型鉴定方法，其特征在于，利用Oligo7软件优化引物参数，避免发夹结构，避免引物间相互配对。
7.根据权利要求6所述的一种基于环介导等温扩增的血型鉴定方法，其特征在于，利用核酸热动力学再优化引物设计，然后再实际评价。
8.根据权利要求1所述的一种基于环介导等温扩增的血型鉴定方法，其特征在于，所述S5中，如果荧光信号出现在A型血特异性基因对应的扩增产物中，则待测个体为A型血；如果荧光信号出现在B型血特异性基因对应的扩增产物中，则待测个体为B型血；如果荧光信号同时出现在A型血和B型血特异性基因对应的扩增产物中，则待测个体为AB型血；如果没有荧光信号出现，则待测个体为O型血。
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