CN115151819A - 检测和/或定量多个生物液体样品中的感兴趣的分析物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测和/或定量多个生物液体样品中的感兴趣的分析物的方法。此外，本发明还涉及一种用于执行检测和/或定量多个样品中的感兴趣的分析物的方法的试剂盒和柱筒。

Description

检测和/或定量多个生物液体样品中的感兴趣的分析物的 方法
技术领域
本发明涉及一种检测和/或定量多个生物液体样品中的感兴趣的分析物的方法。
背景技术
在诊断学领域中，样品合并和样品条形码策略已被建立并常用于大量生物样品的处理中。
在诊断领域中，样品合并策略通常基于测试限定体积的不同样品的组合合并物。通常，样品被一式两份获得，一个副本被保留用于存储，而另一个副本被添加到组合合并物中。如果这种组合合并物被测试为阳性，则对来自同一合并物的存储的副本样品进行单独测试，以最终鉴定阳性样品。所述对来自于提供阳性结果的组合合并物的单个副本样品进行测试的过程有时也被称为“复用”(re-flexing)。具体来说，在通常预期会为相应的测试分析物提供阴性结果的样品中，这种合并策略提供了一种低成本的方法。然而，合并的程度对测试的灵敏度有直接影响，并且复用需要从单一来源获得至少两份副本样品，并仔细和受控地存储这些副本样品，还需要复杂的测试后勤。
样品条形码，有时也被称为样品索引，是一种常用的标记样品的方法，用于多重测序和多重分析。将样品中的所有核酸都用相同的序列标签标记，将得到的文库与其他文库合并，并在单次运行中并行测序。此后，所述样品特异性索引使软件能够将多路复用的序列数据分离成样品特异性数据集。
分子条形码与样品索引的不同之处在于样品中的每个分子在PCR扩增之前都用不同且独一无二的序列标记。由于起始材料中(即所述样品内)的每个核酸均用独一无二的序列即“分子条形码”(“MBC”)标记，序列分析软件可以过滤掉副本读出序列和PCR错误，以报告唯一的读出序列。样品条形码以及分子条形码的共同点在于核酸均带有特异性分子序列标记物的标签。
一种不同类型的条形码技术是荧光细胞条形码(FCB)，这是一种用于高通量流式细胞术的基于细胞的多路复用技术。带有条形码的样品可以被一起染色和捕获，最大限度地减少染色可变性和抗体消耗，并减少所需的样品体积(Krutzik等，2011，用于多路流式细胞术的荧光细胞条形码(Fluorescent cell barcoding for multiplex flowcytometry)，Curr.Protoc.Cytom.,Chapter 6,Unit 6.31)。
特别是在基于柱筒的测试的情形中，由于柱筒的尺寸和成本在通量方面存在限制，特别是在一个柱筒/一个样品的方法的情形中。此类柱筒的示例是来自于Cepheid的GenExpert、来自于Biocartis的Idylla、来自于Abbott的m-Pima等。通常通过增添相同的仪器资源并一次运行许多柱筒来实现更高的通量。也存在允许在单一平台上处理多个样品的柱筒。然而，此类柱筒通常被设计用于对每个单独的样品进行独立的分析过程，例如用于测试样品的不同分析物，因此此类柱筒仅仅是与用于相应样品的单个分析工具类似的组件的组合物。这种设置在需要并行处理多个样品，例如测试多个样品的同一分析物时也是有用的，并且这种设置有助于提高相应仪器上的通量，或者只是有助于减少在分析柱筒上加载样品的手动操作时间。这种工具的一个实例是BDMAx系统。对现有基于柱筒的诊断工具的全面综述被提供在Relich等，2018，综合征和护理点分子测试(Syndromic and Point-of-Care Molecular Testing)，Advances in Molecular Pathology 1(1):97-113中。
在本领域中对实现更高的通量和仪器利用率同时产生更少的浪费和更低的成本，继续存在着需求。对于在一个系统内在单一过程中处理多个样品以允许最大限度地利用硬件和试剂资源，也继续存在着需求。此外在本领域中，对提供一种允许为待分析的个体样品分配个体身份，以便于对多个这种单个分配的可识别的样品进行单一检测反应的过程，存在着需求。
发明内容
本发明致力于解决这些和相关的需求。一方面，本发明涉及一种检测和/或定量多个生物液体样品中的感兴趣的分析物的方法，所述方法包括两个子过程，一个样品特异性子过程和一个通用子过程。
所述“样品特异性子过程”在本文中有时也被称为“样品特异性过程部分”、“特异性过程部分”或“特异性部分”，是其中使每个所述样品独立地经历将其特异性标记(在本文中有时也被称为“编码”)的程序或条件，使得它在晚些时候可以与其他样品识别和区分的部分。
所述“通用子过程”或“通用过程部分”或“通用部分”是其中所有样品均经历允许分析物检测的相同操作的部分。这种通用部分不包含任何样品特异性程序、处置或操作，并且通常对所调查的所有样品执行，不论所述样品的身份如何。
在一个实施方式中，所述样品特异性过程部分包括下述步骤：
-以任何顺序独立地提供多个不同的怀疑含有感兴趣的分析物的生物液体样品和多个不同标记的多孔微粒子集，其中在所述多个子集中每个所述子集与其他子集分开；
-通过将每个所述独立的微粒子集独立地暴露于每一个生物液体样品，从而允许每个样品在水性环境中被一个特异性标记的多孔微粒子集吸收，将每个所述不同的生物样品特异性标记；
-将每个多孔微粒子集从所述水性环境独立地转移到非水性环境。
在一个实施方式中，所述通用过程部分包括下述步骤：
-将所述非水性环境中的不同标记的多孔微粒子集混合在一起，从而在其中产生多个不同标记的多孔微粒子集的悬液；
-对所述多个不同标记的多孔微粒子集的所述悬液执行用于检测所述感兴趣的分析物的检测反应；以及
-如果所述感兴趣的分析物存在于任何所述不同标记的悬浮微粒子集中的话，检测和/或定量所述感兴趣的分析物。
当在本文中使用时，短语“在所述多个子集中每个所述多孔微粒子集与其他子集分开”和术语“独立子集”意指其中这种微粒子集与其他子集在物理上分开的情形。在一个实施方式中，彼此“独立”的两个子集处于不同位置和/或可能在宏观上可区分和/或被物理屏障分开，优选地使得在样品之间不会发生混合或交叉污染。因此优选地，每个“独立子集”以允许这些子集的独立处置的形式提供。不同子集的物理分隔可以例如通过围绕这些子集的屏障来实现。在一个简单的实施方式中，这种独立子集可以位于它自己的容器或腔室中。通常，根据本发明的实施方式，在执行(分析物的)检测和/或定量反应之前，所述子集彼此独立。在使用期间，例如在检测反应期间，更具体来说在这种检测反应的通用部分期间，微粒文库的一些或所有子集最终可以被合并。令人吃惊的是，本发明人发现，当不同微粒被合并/混合时实际上在它们之间不存在溢出或“串扰”，只要在这种混合物中它们已通过被转移到非水性相中而变得彼此隔绝即可。因此，在(将要测试分析物的存在的)样品之间也不存在交叉污染，尽管事实上它们相应的微粒已被混合在一起。当在本文中使用时，术语“多个不同标记的多孔微粒子集”有时也被称为“微粒文库”。
当在本文中使用时，术语“生物液体样品”是指从生物体的身体获得的液体样品，其可能被或可能尚未被进一步加工以例如使感兴趣的分析物可及或可用于进一步分析。优选地，这种“生物液体样品”选自血液、血浆、血清、尿液、汗液、泪液、痰液、淋巴、精液、腹水、羊水、胆汁、乳汁、滑液、腹膜液、心包液、脑脊液、乳糜和尿液，其中更优选地，所述生物液体样品是血浆。优选地，这种生物液体样品被进一步加工，例如它在经历根据本发明的方法之前可以被裂解或消化或以其他方式处理。作为实例，如果所述生物液体样品是血浆，这种血浆可能已被进一步裂解和/或消化，以摆脱否则可能干扰后续检测反应的组分。例如，如果所述感兴趣的分析物是特定核酸，可能首先将所述生物液体样品例如血浆用蛋白酶或其他适合的酶消化以除去任何不想要的蛋白质或肽以及脂类或其他不想要的组分，然后再使它经历根据本发明的方法。因此当在本文中使用时，“生物液体样品”也可能是指从任何上述体液获得的提取物；它可能是例如利用适合的提取，例如使用细胞破碎(如有必要)、除去脂类、蛋白质和不想要的核酸(如有必要)和核酸纯化和/或特定核酸的富集，从任何上述体液获得的核酸提取物。在某些实施方式中，核酸提取物可以使用乙醇或另一种适合的醇产生。
当在本文中使用时，术语“(微粒)文库”意指多个微粒或微粒的集合，其中在此类多个微粒或微粒的集合或文库中存在着至少两种不同类型的此类微粒，在本文中有时被称为“子集”。在优选实施方式中，存在至少两个预制前体微粒子集，优选地三个以上预制前体微粒子集，并且每个子集具有附连到所述子集内的所述微粒、包含在其中或以其他方式与其结合的独特的标记物组分，使得所述至少两个以上微粒子集的区别在于附连到每个子集、包含在其中或以其他方式与其结合的相应标记物组分。在此类不同子集的文库中，相应的子集通常并且优选彼此独立地储存，例如在不同容器中。这意味着当在本文中使用时，这个术语“独立子集”意指在物理上与其他子集分开的微粒的集合或子集。
发明详述
一方面，本发明涉及一种检测和/或定量多个生物液体样品中的感兴趣的分析物的方法，所述方法包括样品特异性过程部分，然后是通用过程部分；
所述样品特异性过程部分包括下述步骤：
-以任何顺序独立地提供多个不同的怀疑含有感兴趣的分析物的生物液体样品和多个不同标记的多孔微粒子集，其中在所述多个子集中每个所述子集与其他子集分开；
-通过将每个所述独立的微粒子集独立地暴露于每一个生物液体样品，从而允许每个样品在水性环境中被一个特异性标记的多孔微粒子集吸收，将每个所述不同的生物样品特异性标记；
-将每个多孔微粒子集从所述水性环境独立地转移到非水性环境；
所述通用过程部分包括下述步骤：
-将所述非水性环境中的不同标记的多孔微粒子集混合在一起，从而在其中产生多个不同标记的多孔微粒子集的悬液；
-对所述多个不同标记的多孔微粒子集的所述悬液执行用于检测所述感兴趣的分析物的检测反应；以及
-如果所述感兴趣的分析物存在于任何所述不同标记的悬浮微粒子集中的话，检测和/或定量所述感兴趣的分析物。
优选地，在所述将每个所述独立的微粒子集独立地暴露于每一个生物液体样品的步骤中，将每个所述独立的微粒子集以任何顺序暴露于每一个生物样品和用于执行化学检测反应或生物化学检测反应的检测组合物，使得每个微粒子集吸收它所暴露到的相应生物样品和检测组合物。
一方面，本发明还涉及一种检测和/或定量多个生物液体样品中的感兴趣的分析物的方法，特别是根据在前述段落中概述的方法，其中所述样品特异性过程需要：
a.以任何顺序独立地提供多个独立的怀疑含有感兴趣的分析物的生物液体样品和多个多孔微粒的步骤；每个所述多孔微粒具有多孔基质并被配置以在所述多孔基质中容纳一定体积的液体并优选地吸收分析物(如果存在的话)；其中在所述多个多孔微粒中提供有不同的微粒子集，每个微粒子集的特征在于附连到相应的子集、包含在其中或以其他方式与其结合的特异性标记物组分；其中在所述提供的步骤中，提供的不同微粒子集的数目至少与提供的独立生物液体样品的数目一样大，并且其中此外在所述提供的步骤中，所述不同的微粒子集彼此独立地提供；其中可选地，所述不同的独立微粒子集在它们相应的多孔基质中含有检测组合物，其包含用于执行分析物的化学检测反应或生物化学检测反应的试剂；
b.将每个独立的微粒子集暴露于正好一个独立的生物液体样品的步骤，从而允许每个独立的微粒子集与一定体积的正好一个独立的生物液体样品孵育并吸收这种样品或其一部分，并可选地在所述微粒的基质中或其上积累分析物(如果它存在于所述样品中的话)；以及此外可选地，在所述不同的独立微粒子集当在步骤a)中提供时尚未包含用于执行分析物的化学检测反应或生物化学检测反应的试剂的情况下，将每个独立的微粒子集暴露于包含用于执行分析物的化学检测反应或生物化学检测反应的试剂的检测组合物的步骤，从而允许每个独立的微粒子集容纳所述试剂；
c.将每个微粒子集独立地转移到非水性相中并除去所述子集的各个预制微粒周围的一些或所有的水性相，从而产生多个独立的用于检测所述分析物的隔绝反应空间的子集，所述反应空间包含水性相，其包括样品和所述用于执行分析物的化学检测反应或生物化学检测反应的试剂，并且所述反应空间局限于所述微粒的所述空隙体积。
在一个实施方式中，所述通用过程包括：
d.将所述非水性相中的所述独立的不同微粒子集混合，使得所有所述不同的微粒子集形成不同微粒在所述非水性相中的悬液；使所述混合的不同微粒子集经历执行分析物的化学检测反应或生物化学检测反应所需的条件；进行所述感兴趣的分析物的这种检测反应；以及如果存在所述感兴趣的分析物，检测和/或定量任何所述不同的微粒子集中的所述感兴趣的分析物，这利用了相应微粒子集中在所述检测反应中产生的信号(如果所述感兴趣的分析物存在于所述相应子集的任何成员中的话)。
在一个实施方式中，所述方法还包括下述步骤
e)通过确定在步骤d)中在其中检测到所述感兴趣的分析物的微粒子集的身份，来确定在步骤a)中提供的所述多个样品中的哪个(哪些)样品含有所述感兴趣的分析物。
在一个实施方式中，在步骤e)中，所述微粒子集的身份利用附连到相应的微粒子集、包含在其中或以其他方式与其结合的特异性标记物组分来确定。
在一个实施方式中，步骤b)还包括产生指示哪个独立的微粒子集被或已被暴露到哪个样品的第一相关性记录的子步骤，并且步骤d)包括产生指示在所述检测反应中在哪个微粒子集中已产生信号的第二相关性记录的子步骤。
在一个实施方式中，步骤e)通过参考所述第一相关性记录和第二相关性记录并通过链接所述记录来进行，从而允许确定所述在步骤a)中提供的多个样品中的哪个(哪些)样品含有所述感兴趣的分析物。
在一个实施方式中，每个所述多孔微粒具有多孔基质，所述多孔基质允许通过下述物质来积累感兴趣的分析物：
(i)聚合物或聚合物混合物，其形成所述多孔聚合物基质或者是所述聚合物基质；或
(ii)固定在所述多孔聚合物基质上的至少一个可电离基团或多个可电离基团，所述可电离基团能够根据所述前体微粒周围的环境条件改变其电荷；或
(iii)固定在所述多孔聚合物基质上的至少一个带电荷基团或多个带电荷基团；或
(iv)(i)-(iii)的任何组合。
在一个实施方式中，每个所述多孔微粒具有多孔基质并包含附连、优选可逆地附连到所述多孔基质的分析物特异性试剂(ASR)，这种分析物特异性试剂允许感兴趣的分析物的富集和/或允许涉及所述分析物的特异性信号或靶扩增反应；其中所述分析物特异性试剂能够与感兴趣的分析物特异性结合。在优选实施方式中，所述分析物特异性试剂允许特异性靶扩增反应并且优选地不允许特异性信号放大反应。具体来说，在某些实施方式中，所述分析物特异性试剂不允许和/或不同于结合测定法例如bDNA分析。
当在本文中使用时，术语“分析物特异性试剂”(“ASR”)意指能够特异性靶向或识别感兴趣的分析物的试剂。此类特异性靶向或此类特异性识别本身体现在此类分析物特异性试剂与此类感兴趣的分析物特异性结合或与其特异性反应的能力上。在一个实施方式中，分析物特异性试剂选自：核酸，包括适体、spiegelmer、核酸寡聚体和核酸引物；抗体或抗体片段；能够特异性结合分析物或分析物复合体的非抗体蛋白，和亲和蛋白。在优选实施方式中，分析物特异性试剂选自核酸，特别是核酸寡聚体和核酸引物。核酸引物特别适合于执行核酸扩增。在一个实施方式中，当所述分析物特异性试剂是核酸引物时，此类分析物特异性试剂事实上是一对引物，其在感兴趣的分析物内随后将被扩增(和检测)的区域两侧。可选地，在此类(一对引物作为分析物特异性试剂的)实施方式中，此类分析物特异性试剂可能另外包含与所述引物一起提供，并允许检测所述相应的引物和得到的扩增产物的可检测探针。
在另一个实施方式中，每个所述多孔微粒具有多孔基质但不包含如前一段中所定义的分析物特异性试剂(ASR)。在这个实施方式中，分析物在所述微粒中的富集或积累由单独的多孔基质来实现。
当在本文中使用时，术语“信号或靶扩增反应”是指化学检测反应或生物化学检测反应，其中用于所述分析物的检测的信号被放大，或者所述待检测和/或定量的靶(即分析物)被首先扩增并随后检测。靶扩增反应的线性实例是核酸扩增反应例如PCR。信号放大反应的实例是免疫化学反应例如免疫测定法。在本发明的优选实施方式中，根据本发明的化学检测反应或生物化学检测反应是靶扩增反应而不是信号放大反应。具体来说，根据本发明的化学检测反应或生物化学检测反应不是bDNA分析。
在一个实施方式中，所述分析物特异性试剂选自：核酸，包括适体、spiegelmer，抗体或抗体片段，能够特异性结合分析物或分析物复合体的非抗体蛋白例如受体、受体片段，和亲和蛋白；其中优选地所述分析物特异性试剂选自核酸，特别是核酸寡聚体和核酸引物。
在一个实施方式中，每个所述多孔微粒具有附连到、优选可逆地附连到其多孔基质的相同的分析物特异性试剂。在一个这种实施方式中，这种相同的分析物特异性试剂是附连到所述微粒的唯一的分析物特异性试剂。
当在本文中使用时，术语“相同的分析物特异性试剂”意指其中存在各种不同的分析物特异性试剂分子，它们全都对单一特定分析物具有相同特异性的情形。作为实例，如果所述分析物特异性试剂是对特定分析物特异的抗体，则与这种分析物特异性试剂“相同”的所有分析物特异性试剂对这种分析物具有相同的特异性。通常并且在许多情况下，这意味着这些“相同的”分析物特异性试剂在它们的结构和/或序列方面相同，或者它们在结构和序列上的差异仅达到使它们对同一种特定分析物的特异性保持不受这些变动影响的程度。
在一个实施方式中，在所述多个多孔微粒(或文库)中存在不同的微粒子集，
其中每个子集
-具有附连到所述子集的所述微粒、包含在其中或以其他方式与其结合的独特的标记物组分；并且
所有所述不同子集具有
-附连到所述子集的所述微粒或包含在其中的相同的分析物特异性试剂，所述分析物特异性试剂对一种感兴趣的分析物特异；
使得所述不同微粒子集在附连或包含的分析物特异性试剂方面相同，但区别在于
-附连到每个子集的所述微粒、包含在其中或以其他方式与其结合的相应的标记物组分；
并且每个子集由所述相应标记物组分明确定义并且可以通过它识别。
在其中所有所述不同子集具有附连到所述子集的所述微粒的相同的分析物特异性试剂，并且其中所述分析物特异性试剂对一种感兴趣的分析物特异的一个实施方式中，所述方法是检测和/或定量多个生物液体样品中的一种感兴趣的分析物的方法，其中提供的、优选地在步骤a)中提供的不同微粒子集的数量等于提供的独立生物液体样品的数量。
在另一个实施方式中，在所述多个多孔微粒(或文库)中存在附连到所述微粒或包含在其中的几种不同的分析物特异性试剂。
在这种实施方式中(即其中在所述多个多孔微粒中存在附连到所述微粒或包含在其中的几种不同的分析物特异性试剂)，存在不同的微粒子集，
并且每个子集
-具有附连到所述子集的所述微粒、包含在其中或以其他方式与其结合的独特标记物组分；并且
其中此外在所述多个多孔微粒中存在不同类别的微粒子集，并且每个类别的子集
-具有附连到所述微粒的多孔基质或包含在所述微粒中的不同分析物特异性试剂；其中优选地存在至少两种不同类别的微粒子集，更优选地至少三个以上不同类别的微粒子集；
使得所述不同微粒子集的区别在于附连到每个子集的所述微粒、包含在其中或以其他方式与其结合的相应标记物组分；并且每个微粒子集构成一类微粒子集的一部分；并且每个子集由所述相应标记物组分和所述相应分析物特异性试剂明确定义并可以通过它们来识别；并且
使得所述不同类别的微粒子集的区别在于附连到所述微粒的多孔基质的相应分析物特异性试剂；并且每个所述不同类别包含几个微粒子集，所有所述子集都附连或包含有相同的分析物特异性试剂。
在这种实施方式中(即其中在所述多个多孔微粒中存在附连到所述微粒或包含在其中的几种不同,的分析物特异性试剂)，所述方法是检测和/或定量多个生物液体样品中的超过一种感兴趣的分析物的方法，其中提供的、优选在步骤a)中提供的不同微粒子集的数目等于提供的独立生物液体样品的数目乘以待检测的感兴趣的分析物的数目，并且其中存在与待检测的感兴趣的分析物的数目同样多的提供的、优选在步骤a)中提供的微粒子集的类别。
应该注意的是，存在大量类型的可以根据本发明使用的微粒，只要它们具有多孔基质，被配置以在所述多孔基质中容纳一定体积的液体，并具有附连到所述微粒、包含在其中或以其他方式与其结合的特异性标记物组分并且所述标记物组分允许将这些微粒分类成属于特定微粒子集即可。适合的微粒可以具有也可以不具有分析物特异性试剂(ASR)。已证明微粒例如在本申请人Blink AG的题为“预制微粒及其前体的文库”(A library ofprefabricated microparticles and precursors thereof)的平行EP申请(律师案号B33016EP)中所公开的微粒，在本发明的实施方式中也特别适合，特别是在这种将要检测超过一种分析物的实施方式中。
在一个实施方式中，所述多孔基质是由聚合物或聚合物混合物形成的多孔聚合物基质，其中优选地所述多孔聚合物基质由未交联的一种聚合物(或多种聚合物)或聚合物混合物组成，其中更优选地，形成所述多孔聚合物基质的所述聚合物或聚合物混合物由琼脂糖或琼脂糖与明胶的组合组成，其中更优选地，在所述琼脂糖与明胶的组合中，所述琼脂糖以0.1％(w/v)至4％(w/v)的范围存在，并且所述明胶以0.1％(w/v)至20％(w/v)、优选地0.5％(w/v)至20％(w/v)的范围存在。在一个特定实施方式中，所述多孔聚合物基质中的琼脂糖浓度为0.5％(w/v)，并且明胶的浓度在1％(w/v)至2％(w/v)的范围内。其中所述聚合物或聚合物混合物(或多种聚合物)不被交联的实施方式在不同状态例如凝胶状态和溶胶状态之间的切换方面是特别好且通用的。
在一个实施方式中，所述标记物组分是至少两种不同染料、优选为至少两种荧光染料的混合物，其中所述至少两种不同染料、优选地所述至少两种荧光染料以所述至少两种不同染料的相应的确定比率和/或以确定量存在于所述前体微粒的每个子集上，使得所述前体微粒的不同子集彼此之间的区别在于所述至少两种不同染料的相应比率和/或量，从而允许通过附连到前体微粒的相应子集或包含在其中的所述至少两种不同染料的相应的比率和/或量来区分所述前体微粒的不同子集。
在所述检测和/或定量分析物的方法的一个实施方式中，所述感兴趣的分析物是核酸，所述检测反应是核酸扩增，并且所述检测组合物是用于执行核酸扩增的组合物，其包含缓冲液、三磷酸单核苷、扩增酶例如适合的核酸聚合酶如Taq聚合酶和用于检测扩增产物例如扩增的核酸的核酸染料，和可选的如果这种引物和/或探针尚未作为附连到所述微粒或包含在其中的分析物特异性试剂(ASR)提供，则还包括一对或多对扩增引物以及进一步可选的相应的分子探针(例如TaqMan探针、分子诱饵等)。
在根据本发明的方法的另一个实施方式中，所述感兴趣的分析物是蛋白质或其他非核酸分子，所述检测反应是免疫化学检测反应，并且所述检测组合物是用于执行这种免疫化学检测反应的组合物，并在所述方法中作为两个独立的组分提供：其中所述检测组合物的第一组分包含用于执行免疫化学检测反应的必需试剂，例如缓冲液和偶联到适合的报告酶并且对与在所述免疫化学检测反应中用作分析物特异性试剂(ASR)的第一抗体、抗体片段或非抗体蛋白相同的分析物特异的第二抗体或第二抗体片段，以及可选的如果这种第一抗体、抗体片段或非抗体蛋白质尚未作为附连到所述微粒或包含在其中的分析物特异性试剂(ASR)提供，还包括能够特异性结合所述蛋白质分析物或其他非核酸分析物的第一抗体、抗体片段或非抗体蛋白质；并且其中所述检测组合物的第二组分包含所述适合的报告酶的适合的底物作为检测试剂，所述底物在被所述报告酶反应后变得可检测，优选地可光学检测，更优选地可通过荧光检测。
在这种实施方式中，即其中所述检测组合物作为两种独立组分即第一组分和第二组分提供的实施方式中，优选地将所述微粒子集在已暴露到所述第一组分之后暴露到这种第二组分，使得所述两次暴露相继发生。所述两次暴露也可以在中间用适合的清洗步骤彼此隔开，例如将所述微粒子集用适合的清洗缓冲液清洗的步骤。
在根据本发明的方法的另一个实施方式中，所述感兴趣的分析物是酶或其他临床化学分析物，所述检测反应是化学检测反应或生物化学(例如酶)检测反应，并且所述检测组合物是用于执行这种化学检测反应或生物化学检测反应的组合物：其中使所述样品与所述检测试剂发生接触，并将两者与根据本发明的微粒接触，并且其中所述检测组合物包含用于这种化学或酶反应的适合的底物作为检测试剂，所述底物在与所述相应的分析物反应后变得可检测，优选地可光学检测，更优选地可通过荧光检测。
在一个实施方式中，在所述检测和定量所述感兴趣的分析物的步骤中，所述分析物的定量通过选自下述的方法来进行：
a)数字核酸扩增，特别是数字聚合酶链反应(PCR)；
b)实时定量核酸扩增，特别是实时聚合酶链反应(PCR)；
c)免疫化学检测方法，特别是数字免疫化学检测方法，例如数字免疫测定法如数字酶联免疫吸附测定法(ELISA)；
d)免疫化学检测方法，特别是与核酸扩增组合的数字免疫化学检测方法，例如免疫-聚合酶链反应，特别是数字免疫-PCR；和
e)a)-d)的任何组合，
其中如果所述感兴趣的分析物是核酸，则定量使用方法a)或b)中的任一者或a)与b)的组合来进行；并且其中如果所述分析物是蛋白质、肽或其他非核酸分析物，则定量使用方法c)或d)中的任一者来进行。
正如已在上文概述的，当在本文中使用时，“生物液体样品”可以是从生物体的身体获得的液体样品，其可能被或可能尚未被进一步加工以例如使感兴趣的分析物可及或可用于进一步分析。优选地，这种“生物液体样品”选自血液、血浆、血清、尿液、汗液、泪液、痰液、淋巴、精液、腹水、羊水、胆汁、乳汁、滑液、腹膜液、心包液、脑脊液、乳糜和尿液，其中更优选地，所述生物液体样品是血浆。优选地，这种生物液体样品被进一步加工，例如它在经历根据本发明的方法之前可以被裂解或消化或以其他方式处理。作为实例，如果所述生物液体样品是血浆，这种血浆可能已被进一步裂解和/或消化，以摆脱否则可能干扰后续检测反应的组分。例如，如果所述感兴趣的分析物是特定核酸，可能首先将所述生物液体样品例如血浆用蛋白酶或其他适合的酶消化以除去任何不想要的蛋白质或肽以及脂类或其他不想要的组分，然后再使它经历根据本发明的方法。因此当在本文中使用时，“生物液体样品”也可能是指从任何上述体液获得的提取物；它可能是例如利用适合的提取，例如使用细胞破碎(如有必要)、除去脂类、蛋白质和不想要的核酸(如有必要)和核酸纯化和/或特定核酸的富集，从任何上述体液获得的核酸提取物。在某些实施方式中，核酸提取物可以使用乙醇或另一种适合的醇产生。
细胞破碎或裂解可以通过主要目的是破坏细胞壁和/或细胞膜的物理和/或化学方法来实现。破碎方法主要是基于样品的性质，因此将广泛的工具和方法单独或组合地用于实现组织/细胞破碎。裂解酶、离液剂和不同类型的去污剂是化学裂解的主要组分，而机械方法通过研磨、剪切、珠击和冲击来破碎细胞。应该注意的是，如果一种技术不能产生良好结果，另一种可能被证明是成功的。在某些情况下，渗透冲击方法与普通的核酸纯化方案例如苯酚-氯仿提取和珠击相比产生更好的结果。细胞破碎的另一种方法是组合使用不同的方法。一个很好的实例是酶裂解的情况，其中许多方案使用蛋白酶将NA从其保护性蛋白质支架中释放出来。此外，为了保护所述新的无蛋白质的NA，使游离到溶液中的细胞核酸酶失活至关重要[13]。去污剂和离液盐在单一溶液中的组合可用于溶解细胞壁和/或细胞膜并使细胞内核酸酶失活。另一方面，机械破碎利用力来提取出细胞的组成成分。研磨的一个经典实例是使用研钵和研杵，现在通过使用液氮(在样品允许的情况下)进行了优化。由超声或空化引起的快速压力变化所产生的冲击波也可以破坏细胞壁。其他可用于细胞破碎的机械工具是剪切，它使用切向力在细胞中打孔，以及珠击，它使用不同的玻璃或钢珠来破坏坚韧的细胞壁。
另一方面，本发明涉及一种用于在多个生物液体样品中检测感兴趣的分析物、特别是用于执行根据本发明的方法的试剂盒，所述试剂盒包含：
-包含多个微粒的多个容器，每个容器包含所述多个多孔微粒子集，每个子集中的每个所述多孔微粒具有多孔基质并被配置以在所述多孔基质中容纳一定体积的液体；每个微粒子集的特征在于附连到相应子集、包含在其中或以其他方式与其结合的特异性标记物组分，其中优选地所述微粒如上文进一步定义；可选的包含用于清洗所述微粒的水性清洗试剂的容器；
-包含用于检测感兴趣的分析物的检测组合物的容器；所述检测组合物包含用于执行分析物的化学检测反应或生物化学检测反应的试剂，其中所述检测组合物是用于执行核酸扩增的组合物，或者是用于执行免疫化学检测反应的组合物；
-包含非水性相的容器，用于在每个子集已被暴露到生物液体样品后将所述不同微粒子集转移到非水性相中，并用于产生微粒子集在非水性相中的独立的不同悬液；
-混合容器，用于将所述微粒子集在非水性相中的独立的不同悬液混合在一起，使得所有所述微粒子集的不同悬液形成不同微粒在所述非水性相中的单一悬液，然后对其进行检测反应；
-用于执行检测反应的容器。
在一个实施方式中，每个所述多孔微粒具有附连、优选可逆地附连到其多孔基质的分析物特异性试剂(ASR)或含有分析物特异性试剂(ASR)，这种分析物特异性试剂允许感兴趣的分析物的富集和/或允许涉及所述分析物的特异性信号或扩增反应；其中所述分析物特异性试剂能够与感兴趣的分析物特异性结合。在本发明的优选实施方式中，分析物特异性试剂允许涉及所述分析物的特异性靶扩增反应，但不允许信号放大反应。具体来说，在某些实施方式中，所述分析物特异性试剂不允许和/或不用于结合测定法例如bDNA分析。
在一个实施方式中，所述分析物特异性试剂选自：核酸，包括适体、Spiegelmers；抗体或抗体片段；能够特异性结合分析物或分析物复合体的非抗体蛋白，例如受体、受体片段和亲和蛋白；其中优选地所述分析物特异性试剂选自核酸，特别是核酸寡聚体和核酸引物。
在一个实施方式中，所述感兴趣的分析物是核酸，所述检测反应是核酸扩增，并且所述检测组合物是用于执行核酸扩增的组合物，其包含缓冲液、三磷酸单核苷、扩增酶例如适合的核酸聚合酶如Taq聚合酶和用于检测扩增产物例如扩增的核酸的核酸染料，以及可选的一对引物(如果这对引物尚未作为附连到所述微粒或包含在其中的分析物特异性试剂(ASR)提供的话)。
在一个实施方式中，所述感兴趣的分析物是蛋白质或其他非核酸分子，所述检测反应是免疫化学检测反应，并且所述检测组合物是用于执行这种免疫化学检测反应的组合物并在所述试剂盒中提供在两个独立的腔室或容器中；其中所述检测组合物在第一腔室或容器中包含执行免疫化学检测反应必需的试剂，例如缓冲液和偶联到适合的报告酶并且对与在所述免疫化学反应中用作分析物特异性试剂(ASR)的第一抗体、抗体片段或非抗体蛋白质相同的分析物特异的第二抗体或第二抗体片段，以及可选的如果这种第一抗体、抗体片段或非抗体蛋白质尚未作为附连到所述微粒或包含在其中的分析物特异性试剂(ASR)提供，还包含能够特异性结合所述蛋白质分析物或其他非核酸分析物的第一抗体、抗体片段或非抗体蛋白质；并且其中所述检测组合物在第二腔室或容器中包含作为检测试剂的用于所述适合的报告酶的适合的底物，所述底物在被所述报告酶反应后变得可检测，优选地可光学检测，更优选地可通过荧光检测。
在一个实施方式中，每个所述多孔微粒具有附连到其多孔基质的相同的分析物特异性试剂或含有所述相同的分析物特异性试剂。
在一个实施方式中，在所述多个多孔微粒中存在不同的微粒子集，并且每个子集
-具有附连到所述子集的所述微粒、包含在其中或以其他方式与其结合的独特的标记物组分；并且
所有所述不同子集具有
-附连到所述子集的所述微粒或包含在其中的相同的分析物特异性试剂，所述分析物特异性试剂对一种感兴趣的分析物特异；
使得所述不同微粒子集在附连或包含的分析物特异性试剂方面相同，但区别在于
-附连到每个子集的所述微粒、包含在其中或以其他方式与其结合的相应的标记物组分；
并且每个子集由所述相应标记物组分明确定义并且可以通过它识别，并被提供在独立容器中。
在一个实施方式中，所述试剂盒是用于检测和/或定量多个生物液体样品中的一种(即不超过一种)感兴趣的分析物的试剂盒，其中所述试剂盒中提供的不同微粒子集的数目等于(优选地至少等于)提供的独立生物液体样品的数目(或在某些实施方式中，所述试剂盒中提供的不同微粒子集的数目大于且在任何情况下不小于提供的独立生物液体样品的数目)。
在另一个实施方式中，在所述多个多孔微粒中存在附连到所述微粒或包含在其中的几种不同的分析物特异性试剂。
在这种实施方式中存在不同的微粒子集，
并且每个子集
-具有附连到所述子集的所述微粒、包含在其中或以其他方式与其结合的独特的标记物组分；并且
其中此外，在所述多个多孔微粒中存在不同类别的微粒子集，每个类别的子集
-具有附连到所述微粒的多孔基质或包含在所述微粒中的不同的分析物特异性试剂；其中优选地存在至少两个不同类别的微粒子集，更优选地至少三个以上不同类别的微粒子集；
使得所述不同微粒子集的区别在于附连到每个子集的所述微粒、包含在其中或以其他方式与其结合的相应标记物组分；并且每个微粒子集构成一类微粒子集的一部分；并且每个子集由所述相应标记物组分和所述相应分析物特异性试剂明确定义并且可以通过它们来识别，并被提供在独立容器中；并且
使得所述不同类别的微粒子集的区别在于附连到所述微粒的多孔基质或包含在所述微粒中的相应的分析物特异性试剂；并且每个所述不同类别包含几个微粒子集，所述子集全都附连有或包含有相同的分析物特异性试剂。
在这种实施方式中，所述试剂盒是用于在多个生物液体样品中检测超过一种感兴趣的分析物的试剂盒，其中所述试剂盒中提供的不同微粒子集的数目等于(优选地至少等于)提供的独立生物液体样品的数目乘以待检测的感兴趣的分析物的数目，并且其中在所述试剂盒中提供有与待检测的感兴趣的分析物的数目同样多的微粒子集的类别；(或者在某些实施方式中，所述试剂盒中提供的不同微粒子集的数目事实上可以甚至大于并且在任何情况下不小于提供的独立生物液体样品的数目乘以待检测的感兴趣的分析物的数目，并且其中在试剂盒的这种实施方式中，提供有与待检测的感兴趣的分析物的数目至少同样多的微粒子集的类别，并且在任何情况下在这种实施方式中提供的微粒子集的类别的数目不小于待检测的感兴趣的分析物的数目)。
另一方面，本发明还涉及一种柱筒，其用于执行检测和/或定量多个生物液体样品中的感兴趣的分析物的方法，所述方法如上文进一步定义。
在一个实施方式中，所述柱筒包含多个样品特异性模块、多个储存区室、至少一个用于储存非水性相的非水性相区室和单个合并的混合和检测区室或独立的混合区室和独立的检测区室的组合；
其中每个样品特异性模块包含具有其自己的独立样品入口的样品腔室，每个样品特异性模块被配置以在相应的样品腔室中仅容纳正好一种生物样品；每个样品特异性模块被进一步配置以在所述样品腔室中容纳微粒，所述微粒如上文进一步定义；每个样品特异性模块被进一步配置以促进所述微粒从水性环境向非水性环境的相转移。
术语“样品特异性模块”意指所述柱筒内被特别设计以与特定(特异性)样品相结合使用的区段。因此，它通常包含样品腔室并被配置以在相应的样品腔室中仅独立地容纳正好一种生物样品。“样品特异性模块”具有它自己的特异性样品入口，允许将相应的样品添加到所述样品特异性模块；可以另外包含其他腔室和/或连接通道。在一个实施方式中，所述多个样品特异性模块在相应的样品腔室中包含多个多孔微粒；每个所述多孔微粒具有多孔基质并被配置以在所述多孔基质中容纳一定体积的液体，其中每个样品特异性模块在其样品腔室中包含所述多个微粒的不同子集，每个微粒子集的特征在于附连到相应子集、包含在其中或以其他方式与其结合的特异性标记物组分；和/或其中所述至少一个非水性相区室包含非水性相例如油。
在一个实施方式中，每个所述样品特异性模块还包含用于将微粒与液体相、优选为液体水性相机械分离的手段，例如过滤器；所述手段被配置以便于所述微粒从水性环境向非水性环境的相转移。
在一个实施方式中，在所述多个储存区室中存在不同组的储存区室，其中第一组储存区室含有用于执行分析物的化学检测反应或生物化学检测反应的试剂，并且独立地，其他的一组或几组储存区室独立地包含下述一者或几者：裂解缓冲液，用于促进分析物与分析物特异性试剂的结合的缓冲液，和用于清洗微粒的清洗缓冲液。
在一个实施方式中，所述柱筒包含阀机构，所述阀机构被配置以附连到泵，所述阀机构允许将a)至c)中的任一者连续或同时地与d)发生流体连接；其中a)是一个或几个储存区室；b)是单个合并的混合和检测区室或独立的区室与独立的检测区室的组合；c)是所述至少一个非水性相区室；并且d)是任何样品特异性模块。
本发明提供了一种检测和/或定量多个生物液体样品中的感兴趣的分析物的方法。不希望受到任何理论限制，本发明人相信根据本发明的新方法是基于一种新的测定法，其在原则上包括两个根本上不同的部分，即样品特异性部分和通用部分(在本文中有时也分别被称为“特异性过程部分”或“特异性部分”和“通用过程部分”)。
在所述过程的样品特异性部分中，将单个样品编码并对分析物(如果存在于单个样品中的话)进行富集，同时从样品中除去不想要的材料。然后，将由此编码的已被制备成可以通过它的个体密码/标记物识别的样品隔绝成一种被非水性环境中的微粒限定的水性液滴。这种液滴充当反应空间，在其中执行所述分析物(如果存在的话)的检测。
通常地，上述目的通过分别用特定且单独标记的微粒类型或子集单独地质询(并有效地“标记”或“编码”)每个样品来实现，“微粒”在本文中有时也被称为“珠子”，所述特定且单独标记的微粒类型或子集带有附连到相应微粒、包含在其中或以其他方式与其结合的限定的特异性标记物。根据本发明的实施方式，可能存在多种不同类型的微粒(或“珠子”)(这种“微粒类型”在本文中有时也被称为“微粒子集”)，其特征在于与其附连、包含在其中或以其他方式与其结合的特异性标记物。根据本发明的实施方式，所述微粒能够容纳一定体积的液体样品并因此吸收分析物(如果存在于所述样品中的话)，并且可选地还结合和浓缩它。分析物与微粒的结合可以通过在结合缓冲液存在下将微粒暴露到怀疑含有感兴趣的分析物的样品来促进。这种结合缓冲液的目的在于建立促进所述分析物与相应微粒的基质和/或附连到微粒或包含在其中的任何分析物特异性试剂(ASR)的结合的条件。
此外，根据本发明的实施方式，各个微粒具有内部体积，允许它们吸纳样品和用于检测感兴趣的分析物(如果存在的话)的必需试剂。在样品中的分析物已被吸纳(或“吸收”)并可选地在适合的结合缓冲液存在下可能被所述微粒结合或富集(或“吸收”)后，并且如有必要在已进行任何相应的清洗步骤后，随后将所述微粒暴露到适合的检测组合物，其也将被所述微粒吸纳。当在本文中使用时，术语“检测组合物”是指包含用于执行分析物的化学检测反应或生物化学检测反应的试剂的组合物。在优选实施方式中，所述“化学检测反应或生物化学检测反应”是核酸扩增或免疫化学检测反应。用于执行这些反应的适合的“检测组合物”在上文进一步概述。因此，在这种检测组合物已被所述微粒吸纳后，存在着含有生物液体样品(或这种样品的一部分)和适合的检测组合物的微粒。随后，未被包含在所述微粒内而是位于所述微粒外部的任何剩余液体，将例如通过过滤、离心、振摇或其他机械搅动及其组合来除去，然后通过将相应的微粒放置在非水性液体中将它们隔绝，所述非水性液体隔绝所述相应的微粒并防止它们彼此相互作用。在多个样品上重复这个过程，其中将每个样品用不同的用特异性标记物组分特异性标记的微粒的特定子集质询。这个过程的结果是独立的子集微粒制备物，即独立的子集制备物，其中每个子集中的各个微粒彼此分开，并且其中单个子集微粒的制备物具有指派到它们的相应的单个标记物组分，从而允许这种子集微粒制备物被明确指派到特定样品。
在这个阶段，即在微粒已被隔绝后，可以将对应于不同样品的不同类型的微粒制备物即不同子集混合并合并在一起。也在这个阶段，由于各个微粒已被隔绝并且因为它们是被非水性相包围的单个水性液滴而不再能够彼此相互作用，因此可以将对应于它们暴露到的不同样品的不同类型的微粒制备物合并成合并物，并且这种合并物随后可以经历在微粒内执行检测反应所必需的条件。这种检测反应可以例如是核酸扩增，或者它可以是免疫化学反应。这种检测反应代表了所述方法的上述通用部分。它是“通用的”，因为它在任何微粒、即任何类型的微粒上进行，只要这种微粒已用怀疑具有分析物的样品质询即可。换句话说，这个通用部分在所有微粒上进行，优选地作为单一过程同时进行，不论这些微粒已暴露到的样品类型如何。
检测作为检测反应的结果在每个微粒内产生的信号，并将其指派到附连到相应微粒、包含在其中或以其他方式与其结合的相应的特异性标记物组分。由于哪个标记物组分对应于哪个样品也是已知的，因此可以将已产生的相应信号与相应的样品有效地关联，作为其结果可以确定所述感兴趣的分析物是否存在于所测试的样品中。
有效情况下，微粒代表单个反应空间或“反应器”，少量相应样品被局限在其中并且可以被单独分析。因此，有效情况下有可能以某种方式执行根据本发明的方法的实施方式，使得分析物的单分子可以在单个微粒中分布，从而提供有限稀释，并因此允许所述方法以数字格式执行；也参见Sykes等，1992,Biotechniques 13(3):pp.444-449。这种格式允许在相应样品中获得精细的灵敏度和良好的分析物定量。
在本发明的实施方式中使用的典型试剂如下：
首先，存在微粒本身，在本文中有时也被称为“珠子”。它们是高度多孔的，具有多孔基质并被配置以在所述多孔基质中容纳一定体积的液体。通常，它们由聚合物或聚合物混合物构成，当液体样品被吸收并容纳在所述多孔基质中时提供了微粒的机械稳定性和化学完整性。优选地，基质聚合物可以表现出凝胶-溶胶特性，在室温下提供稳定的粒子并在高温下提供液滴。作为实例，如果所述微粒处于它们的凝胶状态、即凝胶或准固相，它们会在液相中形成悬液。然而，如果随后将它们转变成溶胶状态、即可溶或准液态，它们将在液相中形成乳液，并且所述悬液将转化成乳液。其中所述聚合物或聚合物混合物未交联的实施方式，在不同状态例如凝胶与溶胶状态之间的切换方面是特别良好和通用的。
当在本文中使用时，术语“微粒”意指平均维度在微米范围内的粒子。在一个实施方式中，根据本发明的微粒具有约1μm–200μm、优选地5μm–150μm、更优选地10μm–100μm的平均尺寸或平均维度或平均直径。在一个实施方式中，根据本发明的微粒是球形或卵形或椭圆形的，优选为球形的，并且上述维度是指这种球形、卵形或椭圆形微粒的平均直径。在一个实施方式中，所述微粒具有(球形)液滴的形状。在另一个实施方式中，根据本发明的微粒是球形体或准球形体，即具有球体(或接近于球体)的形状，这种球体具有上述维度的平均直径。通常，根据本发明的微粒是多孔的并具有多孔聚合物基质，所述基质具有用于容纳水性样品并为分析物的特异性检测提供反应空间的空隙体积。
在优选实施方式中，根据本发明的微粒不仅能够在多孔基质中吸收液体样品并容纳它以及这种样品中存在的任何分析物，而且事实上包含结合元件(例如附连到所述多孔聚合物基质的分析物特异性结合分子例如分析物特异性试剂(ASR)；固定在所述多孔聚合物基质上的可电离基团或多个可电离基团，所述可电离基团能够根据所述前体微粒周围的环境条件改变其电荷；固定在所述多孔聚合物基质上的带电荷基团或多个带电荷基团；这些元件的任何组合)，其促进或提供结合或富集感兴趣的分析物或分析物类别(例如核酸)(如果存在于样品中的话)所需的功能，从而在所述微粒中提高这些分析物的局部浓度。
此外，在本发明的优选实施方式中，微粒的另一个特征在于附连到相应微粒(微粒类型)、包含在其中或以其他方式与其结合的特异性标记物。
现已证明，微粒例如在本申请人Blink AG的题为“预制微粒及其前体的文库”(Alibrary of prefabricated microparticles and precursors thereof)的平行EP申请(律师案号B33016EP)中所公开的微粒，在本发明的实施方式中也特别适合，特别是在这种将要在每个样品中检测超过一种分析物的实施方式中。
在某些实施方式中，可能需要裂解缓冲液将所述感兴趣的分析物从所述样品中释放或使所述样品中的这些感兴趣的分析物可用。这种裂解缓冲液可以含有可引起细胞特别是细胞膜的裂解或细胞器的裂解的试剂，作为所述裂解的结果，感兴趣的分析物可能只是变得可接近。在某些实施方式中，单独或与其他缓冲液组合的裂解缓冲液可以促进感兴趣的分析物在微粒中的富集或结合。这种促进感兴趣的分析物在微粒中的富集或结合的其他缓冲液在本文中有时也被称为“结合缓冲液”。如果这种“结合缓冲液”被用于修改分析物或其他组分的浓度，则这种“结合缓冲液”在本文中有时也被称为“稀释缓冲液”。
当在本文中使用时，术语“感兴趣的分析物”或“分析物”在本文中有时也被称为“靶”(特别是如果正在分析核酸的话)。
在某些实施方式中，也可能需要清洗缓冲液以从所述微粒中除去任何不想要的组分，这些组分否则会抑制后续检测反应或否则会阻止这种后续检测反应正常工作。如果例如所述检测反应是免疫化学反应，则在某些实施方式中，所述微粒可以包含分析物特异性试剂，其是特异性针对所述感兴趣的分析物的第一抗体。在这种实施方式中，将所述包含作为分析物特异性试剂的第一抗体的微粒暴露到怀疑含有感兴趣的分析物的样品，并随后将这种微粒暴露到包含第二抗体的第一检测组合物，所述第二抗体对结合到所述第一抗体的感兴趣的分析物特异，并且本身偶联到适合的报告物例如酶。在将所述微粒暴露到所述样品和暴露到所述第一检测组合物后，可能需要进行清洗步骤以便除去否则可能干扰后续检测反应的任何未结合的第二抗体。因此，本发明的实施方式设想了使用涉及清洗缓冲液的清洗步骤从所述微粒中除去可能随后抑制或阻止适合的检测反应发生的任何不想要的组分。
在一个实施方式中，在下一步中将所述微粒暴露到第二检测组合物，其包含附连到所述第二抗体的用于报告酶的适合底物作为检测试剂。这种底物在被所述报告酶反应后变得可检测，优选地可光学检测，特别是可通过荧光检测。
在本发明的其他实施方式中，所述检测反应可能是核酸扩增反应。在这些实施方式中，所述微粒可以包含用于靶特异性扩增和检测的寡核苷酸引物和探针。这种分析物特异性试剂可能已被可逆地结合到所述微粒，或者可能与通用检测组合物的其他组分一起添加到所述微粒。通常，这种通用检测组合物包含执行感兴趣的核酸分析物的扩增反应所必需的试剂，并且也可能含有或可能不含引物和可选的适合的检测探针，这取决于这些引物和/或探针是否已成为所述微粒的一部分。如果这些分析物特异性试剂已经是所述微粒的一部分，它们将不被包含在所述通用检测组合物中。否则，这种通用检测组合物将包含除了引物之外用于执行感兴趣的核酸分析物的扩增反应的试剂，其中具体来说，所述通用检测组合物包含适合的缓冲液、单核苷酸、扩增酶例如适合的核酸聚合酶如Taq聚合酶，以及(可选的)用于检测扩增产物例如扩增的核酸的核酸染料。
根据本发明，所述方法还需要将所述微粒转移到用于隔绝单个微粒的非水性相中，从而有效地将它们的内含物密封并局限在所述微粒的体积中。这种非水性相通常是亲脂性化合物例如亲脂性油，例如优选地含有一种或几种适合的乳化剂的氟烃油。这种非水性相在将所述微粒转移到其中时需要，并且这种非水性相有助于驱替未被所述微粒吸收的任何水性液体，并有助于将这些微粒彼此隔绝，使得在不同微粒之间不再可能存在任何液体交换。因此，在稳定的微粒悬液形成后，排除了可能导致两种不同样品混合的微粒之间的任何样品交换。
此外，根据本发明的方法的实施方式通过将定量数字和定量实时分析方法桥接，能够实现用于分析物定量的优雅方法。尽管这个陈述对于在所述微粒上使用的任何种类的信号或靶扩增测定法来说都是正确的，但可以以PCR扩增为例来说明利用我们的方法来定量靶的方法。靶分子的定量优选地通过数字PCR(dPCR)来进行，因为这种方法允许比实时定量PCR(qPCR)更灵敏和精确的定量。数字PCR的缺点是测量范围的固有限制，其取决于对一种样品/分析物特异的微粒的数目。为了克服这个限制，本发明用实时定量PCR来补充数字PCR的分析，以用于高于数字PCR测量范围的靶浓度。这种方法的实施需要在PCR结束时和实时PCR的所有循环期间获取荧光图像。将所有获取的图像用图像分析算法进行分析，以便定量反应器区室中每个微粒的荧光水平。一种分割算法将明亮的圆盘状微粒对象与暗背景分开。在这种分割信息的基础上，最终将圆形拟合到微粒对象的轮廓，允许估算平均微粒荧光和微粒体积。实时PCR图像的分析包括在连续图像中跟踪微粒位置，以允许在每个相应微粒中监测反应过程中的荧光。
应用的定量方法的选择是基于在扩增反应后仍为阴性的微粒的数目/比例。这个信息从数字PCR数据获取。如果超过阴性微粒数目/比例的预定下限，则可以应用终点泊松分析。否则，使用在所有循环期间获取的实时定量PCR数据进行实时分析。允许使用泊松仍能进行稳健定量的阴性微粒比例的合理下限为0.5％。每个微粒的相应平均靶数目为5.3。为了考虑荧光图像上可能的假象，附加的要求可以是例如50的阴性微粒总数的下限。
终点泊松分析如下进行：确定阴性微粒的比例，并应用泊松校正来解释阳性微粒可以含有超过一个靶分子的事实。区分阳性和阴性微粒的阈值从已知为阴性的微粒的荧光信号强度直接估算。通过执行微粒体积特异性泊松校正，将可能的微粒体积变化考虑到定量中。测量之间总微粒体积的可能变化也通过算法被校正。
如果靶浓度超过数字PCR的测量范围，则实时分析将非线性函数拟合到每个单个微粒的荧光信号过程。所述拟合的非线性模型将S型和线性函数相结合，其中所述S型分量揭示出扩增动力学，并且线性分量代表了信号的基线。循环阈值(Ct)从具有最大二阶导数的S型函数的定义值的切线与基线的交点来计算。每个微粒的相应靶数目使用校准数据集来计算。校准曲线的偏离项可以是微粒体积的函数，以说明微粒体积变化的影响。
基于在由微粒产生的反应空间中执行信号或靶扩增反应后仍为阴性(即“暗”)的微粒的数目的简单规则，可用于确立哪种方法最适合于在宽测量范围内获得定量结果。所述规则可以如此表述：
a.对于使用根据本发明的文库进行的给定检测/定量测量来说，如果超过0.5％的对给定分析物特异的微粒保持阴性(即微粒(“珠子”)保持暗的概率(“P暗珠”或“P阴性”)>0.5％)，则可以应用泊松分析来确定样品中靶分析物的浓度；
b.对于使用根据本发明的文库进行的给定检测/定量测量来说，如果少于5％的对给定分析物特异的微粒保持阴性(即微粒(“珠子”)保持暗的概率(“P暗珠”或“P阴性”)<5％)，则可以应用实时分析算法来确定样品中靶分析物的浓度；
c.对于使用根据本发明的文库进行的给定检测/定量测量来说，如果所述“阴性”微粒出现的范围为0.5％<P阴性<5％，则可以互换应用两种方法。
这种定量原理也在图14和15以及实施例2中说明。
此外，参考为了说明而不是限制本发明而提供的附图。更具体来说，
图1A示出了根据本发明的实施方式的分析/方法的基本方案的实施方式，其显示这种方法的工作流程包括优选地执行与待测试的不同样品数量同样多的次数的样品特异性部分(在图中被称为“特异性过程部分”)，以及对无论暴露到哪个(哪些)样品的所有微粒来说共同的通用过程部分。上方的框描绘了所述过程的样品特异性部分的基本过程和可能组分的实施方式。将样品用裂解缓冲液裂解，作为其结果释放出感兴趣的分析物，其在本文中有时也被称为“靶”。可选地，可以使用适合的稀释缓冲液(在本文中有时也被称为“结合缓冲液”)将裂解缓冲液中某些试剂的浓度调整到可接受的范围，随后使所述包含怀疑的感兴趣的分析物的样品经历某种条件，在所述条件下所述包含感兴趣的分析物的样品可以被带有现在被指派给所述相应样品的某种标记物的微粒吸收或吸附，这种标记的微粒在本文中有时也被称为“编码微粒”或“编码珠子”。这种已被暴露到一种样品的“编码微粒”在本文中有时也被称为“微粒子集”。每个这种“子集”的特征在于附连到相应子集、包含在其中或以其他方式与其结合的特异性标记物组分。在某些实施方式中，所述相应的分析物也可以通过与形成所述粒子的基质或为此目的附连到所述粒子或包含在其中的分析物特异性试剂(ASR)的亲和结合，结合到所述微粒。在所述感兴趣的分析物已被并入/容纳在所述微粒中后，将相应的微粒子集暴露到适合的检测组合物，所述检测组合物的性质和内含物取决于将要使用所述感兴趣的分析物执行的检测反应(所述检测反应进而取决于待检测的分析物的类型)。这种检测反应包含用于执行所述感兴趣的分析物的检测反应所必需的试剂。这种检测组合物的优选实例在上文进一步定义。随后，在相应的检测组合物已被吸收在所述微粒中后，随后可以是除去在相应微粒周围的任何水性相的步骤。这种步骤可以涉及使用相应微粒进行的过滤、离心、振摇或其他机械搅拌及其组合。随后，优选地在除去相应微粒周围的任何水性相后，将所述相应微粒转移到可选地包含乳化剂的非水性相例如油中。在优选实施方式中，所述乳化剂有助于隔绝单个微粒。作为这种在非水性相中的转移的结果，将产生可能带有来自于该特定样品的感兴趣的分析物的隔绝微粒的悬液。使用不同编码的、即具有附连到微粒、包含在其中或以其他方式与其结合的不同标记物组分的不同类型(“子集”)的微粒重复相同的过程，其中将这些不同编码的微粒暴露到不同的样品。在对所需或所希望数量的不同样品执行这个过程后，可以产生指示哪个独立的微粒子集已被暴露到哪种样品的第一相关性记录。这种第一相关性记录在本文中有时也被称为“样品/珠子代码名单”。在已对所需或所希望数量的不同样品执行所述将不同微粒子集暴露到不同样品的过程后，可以将所述相应的隔绝的不同微粒子集混合，并在所述过程的通用部分中进行检测反应，其可以是核酸扩增或免疫化学反应或适合于检测感兴趣的分析物的任何其他生物化学反应。取决于相应样品(和微粒子集)中分析物的存在或不存在，对于特定微粒子集来说在这种检测反应中可能产生信号。由此可以产生对哪些珠子来说检测到信号的名单(“珠子/信号代码名单”或“第二相关性记录”)，其指示了在哪个微粒子集中在检测反应中产生了信号。随后，可以将在这种检测反应中产生的相应信号解码，例如通过将所述第二相关性记录(或“珠子/信号代码名单”)与所述第一相关性记录(或“样品/珠子代码名单”)进行比对或比较，导致发现所述感兴趣的分析物存在(或不存在)于最初被用于装填/装载相应微粒的一种或几种样品中。优选地，哪种样品含有所述感兴趣的分析物的确定、即检测到的信号的真正指派，通过将所述第一相关性记录(即指示哪个子集已被暴露到哪个样品的名单)与第二相关性记录(即指示在哪个子集中已产生信号的名单)相链接来进行。
应该指出，根据本发明的方法的主要优点如下：如果样品将要单独测试，则必须对每个样品单个且独立地进行检测反应。本发明允许对所有正在分析的样品一次执行所述方法的一个对所有检测反应来说相同且共同的部分(“通用部分”)，否则这个部分将为每个样品单个且单独地执行。
图1B示出了根据本发明的实施方式的分析/方法的基本方案的实施方式，其显示这种方法的工作流程也用有利地应用于处理单个样品。所使用的珠子提供了一种精益过程，其利用所述多孔材料进行靶富集、净化并进行在单个纳米反应器中的信号产生反应例如PCR，从而在广泛的测量范围内为样品中存在的靶提供了精确定量。
图2示出了根据本发明的示例性微粒的实施方式，所述微粒具有多孔基质并由聚合物构成，所述聚合物在这种特定情况下也能在施加外部触发物后经历相变。例如，在优选实施方式中，所述具有多孔基质的微粒由多孔聚合物基质构成，构成这种多孔聚合物基质的聚合物在例如升高温度后能够经历溶胶-凝胶转变。在相应的微粒已被隔绝在非水性相中后，可以将温度升高至一定水平，此时所述微粒经历这种相变，有效地导致可以在其中发生检测反应的水性液滴的形成。根据图2中示出的这种实施方式，所述微粒也对特定的感兴趣的分析物具有提高的结合亲和性。这可能是所述聚合物基质本身的特点，或者可以例如通过附连到所述基质的分析物特异性结合分子(结合物)试剂来实现。这些结合物在某些情况下可以例如是如上文进一步定义的分析物特异性试剂(ASR)。分析物特异性结合物可以选自核酸，包括核酸对、特别是引物对，适体、Spiegelmer，抗体或抗体片段，能够特异性结合分析物或分析物复合体的非抗体蛋白质例如受体、受体片段，和亲和蛋白。在优选实施方式中，所述分析物特异性试剂选自核酸，特别是核酸寡聚体和核酸引物。此外，所述微粒具有附连到所述微粒或包含在其中或以其他方式与其结合的标记物组分。
此外，这种微粒可以(可选地)包含可逆附连的试剂，用于在所述微粒提供的空间内进行产生信号的检测反应。应该指出，根据本发明的实施方式，适合于扩增特定核酸序列(其是“分析物”或“靶”)的一对引物在本文中可以有资格并被视为单一分析物特异性试剂(ASR)，尽管事实上这种引物对包含两条不同引物。然而，它们特异性针对单一核酸序列，因为它们在这个核酸序列的同一区域的两侧，并因此特异性针对同一核酸分析物。
在优选实施方式中，所述标记物组分是荧光染料，更优选为两种不同荧光染料的混合物。
根据本发明的实施方式的微粒具有在它们的多孔基质中容纳、优选地结合或富集所述感兴趣的分析物的能力，并且可以利用附连到相应微粒、包含在其中或以其他方式与其结合的相应标记物组分识别并与其他微粒区分开。由于根据本发明的微粒具有多孔性质，因此它们提供了可接近的足够的内部体积，以吸纳(或“吸收”)包括任何感兴趣的分析物(如果存在的话)的样品，或将所述分析物结合(“吸附”)到所述微粒的基质，后者通过例如下述物质来实现：附连到所述多孔聚合物基质的分析物特异性结合分子；固定在所述多孔聚合物基质上的可电离基团或多个可电离基团，所述可电离基团能够根据所述前体微粒周围的环境条件改变其电荷；固定在所述多孔聚合物基质上的带电荷基团或多个带电荷基团；或这些物质的任何组合。
优选地，此外，这些微粒在施加外部触发物后能够经历相变，使得它们例如在将温度升高到超过一定阈值后，从室温下的凝胶状态转变成高温下的可溶状态。当粒子同时处于液态时，它们在室温下的悬液将因此转变成在高温下的乳液。
以这种方式发挥作用的优选聚合物是单独或与明胶联合的琼脂糖聚合物。
图3示出了根据本发明的实施方式的微粒(“反应器珠子”)的基本功能。所述图示出了三种不同类型的微粒，每种类型利用与这种相应类型结合的相应标记物组分彼此区分。在图3的示意图中，不同的标记物组分用表示微粒/珠子的圆形中的不同阴影区域象征性地表示；这些不同的阴影区域可以代表任何适合的标记物组分，只要它们允许区分不同的微粒即可。例如，它们可以代表不同浓度的单一染料、不同比例的两种不同染料、不同的可检测物理标记物等。在作为所述过程的“样品特异性部分”的所述过程的第一部分中，将三种不同类型的微粒暴露于三种不同的样品1-3，使得在有效情况下，每种样品被暴露到这种样品的相应类型(“子集”)的微粒的标记物组分编码。在优选实施方式中，标记物组分与结合有它们的相应样品之间的这种相关性通过产生标记物组分(相应的微粒子集)和相应的结合样品的名单，在本文中有时也被称为“第一相关性记录”来获得。这种名单在本文中有时也可能被称为“样品/微粒代码名单”或“样品/珠子代码名单”，其指示了哪个微粒子集已被暴露到哪个样品。在这个实施方式中，在一系列过程步骤后，所述微粒被装载有检测试剂并被收集在非水性环境中，所述非水性环境提供所述微粒的隔绝并防止微粒之间的任何串扰。在作为所述过程的“通用部分”的所述过程的第二部分中，将所述编码并对应于不同样品的微粒在非水性相中的不同悬液混合，并同时(“一次性”，即不再彼此独立)经历执行所需检测反应例如快速扩增如涉及温度循环的PCR所必需的条件。由于这个“通用部分”允许处理大量样品，因此这便于使用大规模的整个患者组群的样品进行单一检测过程，例如在临床试验中。记录在这种检测反应中产生的信号，并确定/读出所述微粒(子集)的相应标记物组分。产生了指示在哪个微粒子集中产生信号的第二相关性记录。这种第二相关性记录在本文中有时也被称为“珠子/信号代码名单”。将在所述“珠子/信号代码名单”(即第二相关性记录)中得到的检测信号/微粒组合与所述“样品/微粒代码名单”(即第一相关性记录)进行比较，作为其结果可以确定(多个测试的样品中的)哪个样品含有或不含相应的感兴趣的分析物。
特别适合于根据本发明的实施方式的微粒是包含在用于在样品中进行感兴趣的分析物的特异性检测的预制微粒文库中的微粒，正如在共同提交的题为“预制微粒文库”的共同待决的欧洲专利申请(律师案号B33016EP)中所描述的。
图4示出了可能适合于执行根据本发明的方法的实施方式的新型流体柱筒的示例性布局的示意图。所述柱筒的独特特点是用于待分析的各个样品的独立的多个入口。每个入口独立地与其自己相应的样品区室或样品特异性模块相连，并且在所述柱筒中提供有多个不同的样品区室或样品特异性模块，每个区室或模块旨在并且被配置以用于独立的样品。术语“样品区室”、“样品区室模块”和“样品特异性模块”在本文中可互换使用，并且是指具体打算并被配置以容纳特定样品的区室。相应的样品特异性模块中被配置以包含样品(并包含用于该特定样品的特定微粒子集)的真实空间在本文中有时也被称为“样品腔室”。提供这些特定区室模块是为了确保安全的编码过程，即通过将特定的独立类型(“子集”)的微粒暴露于每个样品，从而导致每个所述不同的微粒子集分别“装载”有不同的样品，而使每个样品变得被编码/标记的过程。所述不同的样品特异性区室模块防止不同模块以及因此不同样品之间的交叉污染。所述相应的独立入口在图中用样品区室(样品特异性模块)中的三角形缩进示出，而所述样品区室由立在较小边上的矩形框表示。
该图中的示例性柱筒布局图包括示例性的阀和泵机构。在柱筒布局图上提供了三组独立的区室(或模块)：
1.便于样品特异性过程和在其他部分中含有样品编码的微粒的模块，
2.用于储存执行特异性(如果未提供在样品特异性模块中的话)和通用过程所需的试剂的区室；还示出了特别指定的用于包含非水性相的储存区室(“非水性相区室”)
3.便于通用过程的区室或模块(例如混合(可选的)和检测(强制性的)区室，或合并的混合和检测区室，即在其中组合了两种功能的区室(未示出))
在编码过程完成之前并且在微粒被隔绝、即固定在非水性相中之前，将所有试剂以单向方式递送到相应的模块。最终，从每个样品模块收集微粒悬液，然后将不同悬液混合在一起以形成单一悬液。然后将这种混合的微粒转移到检测区室并经历执行检测反应所需的必要条件。一种可以被调整并在改良后根据本发明的实施方式使用的柱筒，是在2019年7月18日提交的欧洲专利申请号19187064.1中所描述的柱筒，但所述柱筒需要被调整，它需要改良是因为根据本发明的柱筒具有多个样品区室，并且每个这样的样品区室具有其自己的样品入口。这允许独立地操作多个样品，每个样品根据本发明进行独立标记。
图5示出了根据本发明的方法的一个实施方式。更具体来说，不同微粒子集(在图中分别被称为“珠子1”、“珠子2”、“珠子3”和“珠子4”)附连有不同的标记物组分，但完全不含分析物特异性试剂或者它们只含有对一种特定的感兴趣的分析物特异的一种类型的分析物特异性试剂。所述不同微粒子集可以通过它们不同的标记物组分识别，并被独立地提供在例如不同容器中，例如上文进一步描述的柱筒中的不同样品区室或样品特异性模块中，并且它们每个被独立地暴露到不同的样品。有效情况下，将使用与待测试的样品同样多的微粒子集。然后，向每个子集添加必需的(通用)检测试剂/试剂组合物(其中这种检测组合物可选地还另外包括如上所进一步定义的分析物特异性试剂，如果这种分析物特异性试剂在一开始未被包含在所述微粒中的话)。然后，将所述相应的微粒子集仍然独立地转移到非水性相(其可以是油，可选地含有乳化剂)中，从而变得彼此隔绝，作为其结果在由相应的微粒提供的空间之间不再存在“串扰”，即样品的混合，并且随后进行(通用)检测反应(“一锅法检测反应”)。这种(通用)检测反应的结果允许关于所述一种感兴趣的分析物存在于哪个样品中得出结论。令人吃惊的是，本发明人发现事实上在通过转移到非水性相中使微粒变得彼此隔绝后，不同微粒之间不存在溢出或“串扰”。因此在(待测试分析物的存在的)样品之间也不存在交叉污染，尽管事实上它们相应的微粒已变得混合在一起。
图6示出了根据本发明的方法的一个实施方式，其中测试了多个样品的多种分析物。原则上，流程类似于图5中示出的流程，区别在于将使用与待测试的样品乘以待检测的不同分析物的数目同样多的微粒子集。作为实例，图6中的第一样品使用两个不同微粒子集来测试/分析，所述微粒子集的区别不仅在于与它们结合的标记物组分，而且在于附连到这种类型的分析物特异性试剂。对第二样品(“样品2”)来说同样如此。因此，在这个实例中总共存在4种不同的微粒子集，它们各自具有其独特的标记物组分与分析物特异性试剂的组合。然后仍然在逐个样品的基础上添加相应的必需(通用)检测试剂/检测组合物，以避免不同样品之间的交叉污染。随后，同样在逐个样品的基础上将所述相应的微粒转移到非水性相中，并且仅在这些相应的微粒以这种方式被隔绝并且不再能够相互干扰和交叉污染后，才进行必需的检测反应。最终的结果将发现测试的每个样品是否没有或具有一个或两个待检测的分析物。同样地，正如上文指出的，令人吃惊的是，本发明人已发现事实上在通过转移到非水性相中使微粒变得彼此隔绝后，不同微粒之间不存在溢出或“串扰”。因此在(待测试分析物或几种分析物的存在的)样品之间也不存在交叉污染，尽管事实上它们相应的微粒(每个微粒包含小体积的待测试的相应样品)已变得混合在一起。
图7示出了用于产生根据本发明的微粒的装置的微流体交汇部的显微照片。微滴在油中形成并形成水凝胶溶液(左侧)。随后液滴被冷却并形成微粒。
图8示出了在装备有数字相机的Zeiss Axioscope上使用Cy3滤光片组获取的荧光显微照片。可以看到三种不同的荧光水平(亮、中、低)，代表了标记物组分(Cy3染料)的三种浓度，有效地对应于三种不同标记物组分。
图9示出了检测区室的拼接图像，代表了编码珠子的标记物的荧光通道。在右下方放大的插入图像中，可以清楚地识别(亮、中等和低信号)可以通过它们相应的标记物组分区分(以及因此编码)的三种不同类型的微粒(或“珠子”)。由于它们的标记物组分不同，这些珠子可用于标记或“编码”不同样品(因此在本文中有时也被称为“样品编码珠子”)。所述珠子在空间上以六方紧密堆积分布。在该PCR区室内通过所使用的软件算法识别的所有样品编码珠子(平均直径d＝105μm)的总数被确定为N＝17,698。
图10A示出了在PCR扩增后颜色编码的琼脂糖-明胶混杂微粒的荧光图像。三种标记物可以通过它们在通道1中的荧光强度来识别。通道2代表了用于内部过程控制(MS2噬菌体)的荧光信号，通道3代表了对HCV靶的PCR扩增特异的荧光。每种标记物对应于已被处理和分析的不同样品。图10B(上图)示出了为来自于通道1的不同珠子(图10A中的上图)确定的荧光强度的直方图。发现了三个独立的标记物种类。在中图和下图中示出了小提琴图，其代表了为通道2(MS2)和通道(3)发现的信号在相应珠子种类之间的分布。通过应用泊松分析，将发现的数字转化为施加到珠子上的每单位体积样品的特定拷贝数。
图11总结了来自于实施例3的关于不同微粒制剂的RNA结合效率的数据。所述数据表明，对微粒组成的调整允许优化结合特性。
图12示出了时间过程荧光图像，示出了RNA与实施例3中制备的微粒的结合。
图13说明了使用微粒达到的富集效果。所述图示出了两种不同微粒组成的数据。黑点指示在与微粒孵育之前通过数字RT-PCR确定的样品中的靶浓度。白色柱表示在上清液中孵育后检测到的靶浓度，灰色柱表示微粒上的靶浓度。富集效果清晰可见，显示了相应上清液的耗尽。
图14示出了组合的数字和实时定量PCR分析方法用于微粒中的靶定量的精确度。示出了两种方法的置信区间。λ＝5cp/微粒(cp＝拷贝)处的竖直线指示了方法可以在此处互换使用的近似值(“CI”＝置信区间)。
图15示出了在PCR扩增期间从油中的微粒采集的一系列图像获得的实时荧光数据。在左侧示出了检测区室的拼接图像和在对扩增特异的一个荧光通道中检测到的终点荧光信号。中间的图示例性示出了从左侧的荧光图像上选择的12个代表性个体微粒的荧光强度随时间的变化。在荧光图像中检测到的每个微粒的计算ct值的分布示出在右侧的直方图中。
此外，参考具体的描述，特别是下述实施例，提供所述实施例是为了说明而不是限制本发明。
实施例
实施例1：用于RNA检测分析的“样品编码珠子”的产生
产生了具有由明胶和琼脂糖构成的基质的不同标记的微粒，其中所述组合物的明胶级分充当所述基质的染料携带部分，因为它的组成提供了靶结合和富集。
用荧光染料标记明胶以产生粒子代码如下所述来进行：
利用NHS偶联化学，将来自于A型牛皮的明胶的丙酮不溶性级分用荧光染料标记。将
Figure BDA0003797165030000331
单NHS酯(GE Healthcare)溶解在DMF中以制成10％(w/v)的最终溶液。将组分1溶解在70mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0-8.3，无菌过滤)中，以使终浓度为0.25％(w/v)。使用与游离明胶的氨基相比低10倍的分子数量的相应染料来标记25mL的任一明胶类型。使用Multi-Rotator PTR-60(Grant-bio)在竖直模式下将标记物溶液在4℃孵育过夜。使用饱和(NH4)2SO4溶液通过反复的硫酸铵沉淀来实现荧光标记的明胶的纯化及其浓缩。或者，明胶可以采取凝胶粒子尺寸的格式进行偶联，并且可以不进行硫酸铵沉淀，而是通过在环境温度下简单地清洗和离心来纯化。也可以进行超速离心、使用异丙醇、丙酮或甲醇的溶剂萃取、使用琼脂糖凝胶柱的凝胶过滤或透析来纯化明胶。
在任一种情况下，纯化被重复到流出物变得透明且不显示出荧光。最后，在用dH2O将沉积物清洗4次后，将纯化的荧光标记的明胶样品真空干燥，产生组分3。
明胶/琼脂糖混杂溶液的制备：
制备了由三种组分组成的混杂水凝胶溶液用于制备纳米反应器。
组分1：来自于A型牛皮G1890(Sigma)的丙酮不溶性明胶
组分2：低熔点2-羟乙基琼脂糖(A4018，Sigma)
组分3：Cy3标记的明胶(A型)
为了产生组分1的均匀的4％(w/v)溶液，将40mg组分1溶解在1mL无核酸酶水(CarlRoth)中，并在50℃和轻柔搅拌(750rpm)下孵育。同样地，将20mg组分2溶解并融化在1mL无核酸酶水中，并在80℃和轻柔搅拌下孵育，以制备均匀的2％(w/v)琼脂糖溶液。为了制备标记的明胶的4％(w/v)溶液，将组分3的干燥的沉积物转移到相应体积的无核酸酶水中并在55℃孵育直至明胶熔化。将所有三种组分混合并用无核酸酶水补足，以产生分别对于明胶来说终浓度为1％(w/v)并且对于琼脂糖A4018来说终浓度为0.5％(w/v)的混杂水凝胶溶液。将各种不同体积的组分3和组分1混合，产生n种不同颜色的微粒集。在这个实施方式中，将重悬浮的组分3和组分1以1:1000、1:500、1:250的比例混合，以获得三种单独的标记物组分，允许用于识别和分析三种不同样品。所有溶液在进一步使用之前保持在55℃。非交联明胶/琼脂糖微粒的产生
使用微流体粒子发生器系统(Dolomite,UK)制备单分散的颜色编码的琼脂糖-明胶混杂微粒。单分散的混杂微粒使用简单的流动聚焦装置，在乳液形成的一步法中制备。详细来说，将标准的亲氟性质的液滴联结芯片(100μm)与4路线性连接器和芯片接口H一起用于连接管路与芯片之间的流体连接。两个Mitos P-泵递送所述水凝胶溶液和载体油。通过集成加热装置对所述系统进行了改良，所述加热装置被放置在加热板顶上，允许将明胶/琼脂糖混杂溶液维持在液态并加热驱动液，以确保在油和明胶/琼脂糖混杂溶液在芯片联结部发生接触时具有一致的温度。Picosurf 2(Spherefluidics,UK)和所述混杂水凝胶溶液均用0.22μm滤器预过滤，然后将它们分别放置在P-泵(Mitos)和液滴系统的加热装置内的水凝胶储液器中。将所述加热装置的温度设定到55℃。使用流动控制软件将流体管线在2000mbar下启动1min。将流速调整到15-20μl/min以实现稳定的液滴形成。使用DolomiteFlow Control Advanced软件监测参数。
图7示出了微流体交汇部的显微照片，其中在左侧微滴在油相中形成。随后所述水凝胶液滴固化并变成微粒。
在两种情况下，将颜色编码的琼脂糖-明胶混杂微粒在冰上收集在2mL微量离心管或15mL离心管(Falcon管)中，以开始所述混杂水凝胶的固化。为了防止微粒的水性相在油-空气边界处的损失，用500μL无核酸酶水覆盖500μL含有微粒的乳液油。随后，将微粒冷却到4℃至少24小时(优选地48h)，以形成稳定的混杂支架。
从连续相回收混杂微粒
固化的混杂微粒堆积在乳液油顶上。用移液管小心地除去乳液油，注意不要除去粒子。然后，向管添加500μL 1H,1H,2H,2H-全氟代辛醇(PFO；Sigma)以打破乳液。为了将所述混杂水凝胶粒子转移到油相中，将管涡旋振荡5s并以2,500x g离心5s。将混杂水凝胶微粒转移到新的1.5mL微量离心管中。
可选地，可以重复这个程序以除去残留的氟代烃油和表面活性剂。在PFO清洗后，将回收的微粒用1mL无核酸酶水清洗两次。使用显微镜目测检查微粒的质量和尺寸。所描述的程序的最终结果产生具有多孔聚合物基质和样品编码能力的纳米反应器微粒(直径d＝100μm)。
图8示出了在装备有数字相机的Zeiss Axioscope上使用Cy3滤光片组获取的荧光显微照片。可以看到三种不同的荧光水平(亮、中、低)，代表了染料(Cy3染料)的三种浓度以及因此有效地代表了三种不同的标记物组分，允许在用它们标记的相应微粒之间进行区分。
微粒集的冻干
可选地，可以将微球集冻干以给出微粒沉积物用于长期储存。因此，将所需的微球集和浓缩物用等体积的600mg/mL海藻糖溶液增补，以产生含有30％(w/v)海藻糖的微粒文库浆液。随后，在无RNase/DNase PCR排管中准备100μl的文库等分试样，以备冻干。赋形剂(例如海藻糖)的类型及其在冻干制剂中的浓度影响冷冻干燥的微球在过程中的晚些时候暴露到洗脱液时溶胀的程度。在干冰上冷冻2h后，使用Alpha 2-4LSCplus冷冻干燥机(Christ)将所述微球集在真空下冷冻干燥(-25℃和0.1mbar)。将样品留在冷冻干燥机中总共200min的时间。主要的干燥阶段在0.01mbar下保持3h，并从-25℃至25℃逐步提高温度。最终的干燥步骤在25℃和0.05mbar下进行20min。
实施例2：用“样品编码珠子”编码样品
使用混杂珠子制备样品
凝胶过滤树脂的制备
允许干燥的P-2Bio-Gel Media Extra fine<45μm(BIO-RAD 150-4118)在无核酸酶去离子H2O中水合。然后将凝胶装填到空的离心柱(即SigmaPrepTM离心柱，Sigma-AldrichSC1000-KT)中，得到400μl的最终床体积。将所述柱在1000rcf下进行1min的短暂离心步骤以除去流动相。通过添加400μl pH 8.4的50mM Tris HCl缓冲液并随后如上所述将柱离心，将所述柱用所述缓冲液清洗两次。
样品裂解
从健康供体(Institute of Transfusion Medicine,University HospitalJena)获得的三个30μl全血样品已掺有300cp/μL的MS2病毒(样品1、2和3)，并且三个样品之一(样品1)已掺有在Basematrix阴性稀释剂(SeraCare 1805-0075)中稀释的AccuPlex HCV重组辛德比斯病毒(SeraCare 0505-0036)，产生5,500cp/μL样品的名义滴度。
将所有样品各自单独地与195μl裂解缓冲液混合，所述缓冲液含有4.5M盐酸胍、9％Triton X100、18mM EDTA和100mM Tris HCl pH 8.0。将每个裂解混合物在65℃孵育5分钟。
凝胶过滤以除去盐酸胍
在裂解后立即将每种混合物施加到P-2柱。在以1,000rcf离心1分钟后，将穿流液/滤液回收到含有200U RNA酶抑制剂(biotechrabbit,DE)的新的反应管中。
分析物与样品编码珠子的结合
如下表中所示将样品指派给荧光标记的微粒。
样品向样品编码珠子的指派
样品编码亚型 HCV MS2
样品1 0 + +
样品2 1 - +
样品3 2 - +
+＝阳性；-＝阴性
将冻干微粒的沉积物重悬浮在70μL含有RNA的结合缓冲液(组分4)中，每个集由大约10,000个可用于数字PCR分析的纳米反应器组成。允许它们吸收所述缓冲液并立即溶胀，提供被开发用于核酸的高效和非特异性结合并且与数字PCR相容的有功能的多孔3D明胶-琼脂糖基质。将单独的样品与它们相应的珠子在独立的管中在15℃以1000rpm孵育5min以完全捕获CV和MS2 RNA，导致核酸在所述纳米反应器中的富集。
清洗微粒
向每个样品添加200μl清洗缓冲液(50mM Tris HCl pH 8.4，1U/μl RNA酶抑制剂)。在12,000至16,000rpm简短涡旋振荡1秒的步骤后，通过以300rcf离心30秒将微粒沉降并除去上清液。将所述清洗步骤重复3x。
1.使用“样品编码珠子”在不同样品中检测和定量分子靶
在微粒上装载试剂
用于在纳米反应器中检测分析物的试剂作为冷冻干燥的沉积物提供，将其用100μL 1x PCR缓冲液(组分7)重悬浮，制成2x试剂混合物(组分8)。通过短暂的涡旋振荡步骤小心地将所述试剂重悬浮。将相对于珠子浆液等体积的所述试剂混合物分配到单个容器中，所述容器含有已捕获RNA的单个样品编码珠子集。通过在15℃短暂孵育5min并同时以1000rpm振摇，允许所述扩增和检测试剂扩散到(并结合到)水凝胶基质。
组分7：PCR缓冲液(20mM Tris HCl，22mM KCl，22mM NH4Cl，3mM MgCl2，pH 8.5)
组分8：试剂混合物(2x)
-含核糖核酸酶抑制剂的2x热稳定反转录酶(biotechrabbit GmbH)
-0.4U/μl热启动Taq DNA聚合酶(biotechrabbit GmbH)
-0.8mM dNTPs(biotechrabbit GmbH)
-0.2％(w/v)低生物负载、无蛋白酶、用于分子生物学的BSA(Sigma)
分析物特异性试剂(HCV)
-0.8μM HCV-Brun正义引物(5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGA-3’)SEQ ID NO：1
-0.8μM HCV-Brun反义引物(5’-CGCAAGCACCCTATCAGGCAGT-3’)SEQ ID NO：2
-0.8μM HCV-Brun TaqMan探针(5'-Atto647-CCGAGTAGYGTTGGGTYGCGAAAGG-BHQ-2-3')SEQ ID NO：3
内部过程对照特异性试剂(MS2)
-0.8μM MS2-Nino正义引物(5’-CTCTGAGAGCGGCTCTATTGGT-3’)SEQ ID NO：4
-0.8μM MS2-Nino正义引物(5’-GGTCCCTACAACGAGCCTAAATTC-3’)SEQ ID NO：5
-0.8μM MS2-Nino TaqMan探针(5'-FAM-TCAGACACGCGGTCCGCTATAACGA-BHQ-1-3’)SEQ ID NO：6
微粒的乳化
通过将微粒分散到组分9中，将各个纳米反应器集独立地转移到非水性相中，以防止样品编码珠子之间的串扰。将珠子以500rcf离心30s并舍弃上清液。使用1.5mL微量离心管将珠子床与过量的组分9(200μL)进行接触。需要施加高剪切力以将水性微粒解聚并在氟代烃油中乳化成单个纳米反应器。通过使用SonifierTM S-450和Ultrasonics SonifierTMCup Horn(Branson)施加超声波或通过将管以大约20/s的频率在微量离心管架的孔上简单地滑动20次并同时将管压紧在架表面上，来搅拌所述混合物。这施加机械应力并破坏水性微粒之间的吸引力并产生表面张力，从而形成悬液/悬液。所述水凝胶微粒和过量的水性相两者都在油相中乳化。通过经温和的离心(500rcf)将乳液清洗三次，来消除作为副产物产生的亚微米级液滴。用相同的油(组分12)重复清洗除去了基本上所有不想要的液滴。组分12还产生了所述乳液的有效热稳定性，用于后续的数字乳液PCR。所述三个乳化的样品编码珠子集现在可以简单地合并到一个容器(管)中，准备用于平行数字信号放大和编码样品的检测。
组分9：相转移和信号放大油
-HFE-7500氟代烃油(3M Deutschland GmbH)
增补有
-2-5％(v/v)PicoSurf(Dolomite Microfluidics)或2-5％(v/v)FluoSurf(Emulseo)或2-5％(v/v)008-FluoroSurfactant(RAN Biotechnologies)样品编码珠子中的平行数字PCR扩增反应
将含有封装的样品1、样品2和样品3的单分散乳液转移到面积约为2.5cm2并且层厚度为100μm的检测区室中。所述区室的检测窗由0.8mm聚碳酸酯(Makrolon 6555；Covestro AG)制成，而所述区室的相反一侧由抛光且未改性的透明125微米聚碳酸酯(Lexan 8010)薄膜(Koenig Kunststoffe GmbH)构成，便于单个纳升反应所需的高效热传递。由于反应区室的维度，迫使悬浮在氟代烃油中的纳米反应器形成单层。因此，微球为后续的平行信号放大反应提供了大约20,000-30,000个纳米反应器(≈7,000-10,000/样品)的间隔平均的阵列。
使用改良的PELTIER元件30x30x4.7mm,19.3W(Quick-Ohm,Küpper&Co.GmbH,#QC-71-1.4-3.7M)和已建立的区室特异性PCR控制模式，对微粒进行超快温度循环。使用的热RT-PCR条件是：在50℃反转录10min，在95℃初始变性30s，然后是30-45个循环的两步PCR，其由95℃变性2s和65℃退火/延长5s构成。由于其溶胶-凝胶切换能力，所述悬液变成了含有单个纳升液滴的乳液。来自于不同样品的HCV和MS2(对照)的多个双路扩增在标记的纳米反应腔室中发生。
自动图像采集由BLINK工具箱软件触发，并使用装备有5x物镜(视野为4,416mm x2,774mm)和pE-4000(CoolLED Ltd.)光源的荧光显微镜(Zeiss AxioObserver)完成。所述显微镜还装备有三个荧光滤光片组(Cy5 ET、Cy3 ET、FITC/FAM HC，AHF Analysentechnik)和安装有带有反应区室的热循环仪的自动x-y台。
图像采集设置如下：100-1000ms，增益为1-10x。为标记物识别获取一个图像(λexc1＝580nm)，为内部对照PCR信号获取一个图像(λexc 2＝470nm)，并为特异性PCR信号获取一个图像(λexc 3＝635nm)。对于可选的纳米反应器特异性实时分析来说，在每个循环时，在所述区室的适合位置处可以获取对应于三个荧光通道的三张图像。
在热流程完成后，使用相同的设备在上述设置下扫描整个检测区室视野。总共需要48-56个图像来覆盖扩增/检测区室的尺寸。
图9中示出了检测区室的拼接图像，代表了编码珠子的标记物的荧光通道。在右下方放大的插入图像中可以清楚地识别三种不同的样品编码珠子(亮、中等和低信号)。所述珠子在空间上以六方紧密堆积分布。在该PCR区室内通过所使用的软件算法识别的所有样品编码珠子(平均直径d＝105μm)的总数被确定为N＝17,698。
样品的解码和终点分析
所有获取的图像都经历自动多面图像处理算法。所述方法采用利用最大稳定极值区域(MSER)的图像分割，从基于MSER的图像分割结果检测相邻的液滴。详细来说，首先对图像进行涉及中值过滤的预处理。其次，将MSER算法应用于图像背景以确定背景轮廓的凸转点及其Delaunay三角剖分，以识别液滴/微粒之间的适当切割。此外，使用MSER算法对液滴/微粒进行分割。最后，对液滴/微粒轮廓进行合理性检查(对比度、形状、凸度)。随后收集所有分割的液滴/微粒的特点，包括每个通道中的荧光信号、位置、直径/体积等。将实验数据应用于Jupyter脚本，识别各个标记物(偶联的Cy3染料的graduation)及其相应的特异性扩增。
将PCR扩增至终点，并由此为每个单独标记物确定荧光阳性和阴性液滴的总数。阳性液滴含有特定靶的至少1个拷贝，因此显示出高于定义的强度阈值的荧光信号增加。所述阈值源自于先前进行的没有模板的扩增反应，或者在每个实验中使用统计学确定。对每个纳米反应器类型的阴性和阳性分数进行聚类，然后将阳性液滴分数拟合到泊松算法，以确定靶RNA分子的初始浓度，以拷贝/μL(cp/mL)输入物为单位。由于上述分析提供了3个不同样品中HCV的同时检测，因此将反应器聚类为6个组：
数字PCR终点数据聚类
Figure BDA0003797165030000401
图10A中示出了在PCR扩增后颜色编码的琼脂糖-明胶混杂微粒的荧光图像。三种标记物可以通过它们在通道1中的荧光强度来识别。通道2代表了用于内部过程控制(MS2噬菌体)的荧光信号，通道3代表了对HCV靶的PCR扩增特异的荧光。每种标记物对应于已被处理和分析的不同样品。图10B(上图)示出了为所述不同珠子确定的荧光强度的直方图。发现了三个独立的标记物种类。在中图和下图中示出了小提琴图，其代表了为通道2(MS2)和通道(3)发现的信号在相应珠子种类之间的分布。通过应用泊松分析，将发现的数字转化为施加到珠子上的每单位体积样品的特定拷贝数(cp/μl)。
实施例3：琼脂糖-明胶混杂珠子的RNA结合能力
检查了由各种不同浓度的不同明胶和琼脂糖A4018构成的各种不同的混杂珠子的RNA结合。微粒上结合的RNA使用RNA染料分析定性测量或使用上述的数字PCR格式定量测量。
珠子的制备
如前所述产生微粒，并做出下述修改：
·标记的明胶级分被省略，从而产生未标记的微粒
·用于产生微粒的混杂水凝胶溶液由不同浓度的琼脂糖和明胶组成，即：
a)1.3％明胶，1.0％琼脂糖
b)0.5％明胶，0.5％琼脂糖
c)1.3％明胶，0.5％琼脂糖
d)2.0％明胶，0.5％琼脂糖
e)4.0％明胶，0.5％琼脂糖
·将两个制造商的各两种不同的明胶类型用于微粒制备，即
oGELITA Imagel AP(A型)
oGELITA Imagel SI(B型)
oG1890(Sigma，A型)的丙酮不溶性级分
oG9391(Sigma，B型)的丙酮不溶性级分
RiboGreen RNA结合分析
将UV-Star微量滴定板(Greiner)的孔用3μL1x结合缓冲液(组分4)中的50％珠子浆液装填。将终浓度为1ng/μL的来自于不同制备物的RNA，即RNA间隔物(Metabion)、来自于面包酵母的tRNA(Roche Diagnostic)和从血液提取的总RNA，在15℃孵育5-10min，允许RNA渗透到所述多孔水凝胶基质中/上并结合。由于结合快速发生，因此在向珠子添加RNA后直接混合对于RNA在珠子上的均匀分布至关重要。
为了可视化结合到混杂微粒的RNA，将0.5μL 1:2稀释的Quant-iTTM
Figure BDA0003797165030000411
RNA试剂的等分试样移液到微量滴定板孔中并混合。将珠子用200μL TE缓冲液清洗两次，随后使用荧光显微镜(Zeiss AxioObserver)和pE-4000(CoolLED Ltd.)光源测量它们的荧光信号。
图11说明了对微粒组成的调整允许优化结合特性。与来自于Sigma的G1890 A型明胶的丙酮不溶性级分相比，GELITA Imagel A明胶与A4018的组合在珠子上产生相对低的RiboGreen信号。总RNA、tRNA和短RNA片段可以以更高的程度与由>1.3％明胶和0.5％琼脂糖的组合制成的混杂珠子结合。对于所测试的RNA来说，与1％琼脂糖的组合也获得了更好的信号(总RNA样品的结果丢失)。B型明胶与A型相比在珠子上的RNA富集方面表现不同。尽管对于任何GELITA SI明胶珠子来说对任何RNA几乎没有可见的信号(意味着仅仅扩散到粒子中但没有富集)，但由G9391 B型明胶的丙酮不溶性级分制成的珠子显示出RiboGreen信号，尽管对于RNA间隔物1和tRNA来说信号弱。总的来说，总RNA、tRNA和短RNA片段均可以以更高的程度与由>1.3％明胶和0.5％琼脂糖的组合制成的混杂珠子结合。
图12示出了随着时间的流逝来自于酵母的总RNA与微粒的结合，其使用Quant-iTTM
Figure BDA0003797165030000421
RNA试剂可视化。所述测定格式也允许直接监测RNA与微粒的结合。每6s采集图像，并且可以直接测量RiboGreen信号的增加。
通过数字PCR定量RNA结合
为了定量评估根据本发明的微粒的RN结合能力，如上所述在纳米反应器内进行了数字PCR。所述微粒从固化的粒子转变成液滴的能力允许提供结合基质和数字PCR检测基质两者。因此，可以在所述珠子上直接测量结合的HCV RNA分子。或者，可以使用用于液滴生成的DG8柱筒(Bio-Rad)以数字格式测量上清液。
将40μL含有纯化的(QIAamp病毒RNA小量试剂盒)Accuplex HCV RNA(SeracareLife Sciences Inc.)的结合缓冲液(组分4)添加到40μL珠子床，并在15℃和1000rpm下孵育5min以结合RNA。随后将珠子以300xg离心30s，并将上清液保持在冰上用于后续分析。向珠子床(40μL)添加40μL2x试剂混合物(组分X)，并通过在15℃和1000rpm振摇下短暂孵育5min使扩增和检测试剂扩散到水凝胶基质中。
组分X：试剂混合物(2x)
-含核糖核酸酶抑制剂的2x热稳定反转录酶(biotechrabbit GmbH)
-0.4U/μl热启动Taq DNA聚合酶(biotechrabbit GmbH)
-0.8mM dNTPs(biotechrabbit GmbH)
-0.2％(w/v)低生物负载、无蛋白酶、用于分子生物学的BSA(Sigma)
分析物特异性试剂(HCV)
-0.8μM HCV-Brun正义引物(5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGA-3’)SEQ ID NO：1
-0.8μM HCV-Brun反义引物(5’-CGCAAGCACCCTATCAGGCAGT-3’)SEQ ID NO：2
-0.8μM HCV-Brun TaqMan探针(5'-Atto647-CCGAGTAGYGTTGGGTYGCGAAAGG-BHQ-2-3')SEQ ID NO：3
如前所述进行珠子的相转移、扩增反应和分析。将上清液(40μL)用PCR试剂(40μL2x试剂混合物)增补，随后使用DG8柱筒(Bio-Rad)乳化。将100μL含有2-5％Picosurf 2(Sphere Fluidics)和40μL的乳液试剂HFE-7500施加到柱筒的底部孔中。通过轻轻拉动连接到收集孔的注射器，在收集孔中施加真空。收集液滴并将其转移到独立的检测区室进行数字分析。液滴的扩增反应和分析的设置与珠子的设置相同。此外，由等体积的2x试剂混合物和PCR缓冲液组成的参考样品同样被乳化和分析。
图13示出了关于这些被设计用于评估微粒的两种不同组成的富集能力的实验的概括数据。黑点指示在与微粒孵育之前样品中的靶浓度。白色柱表示在孵育后在上清液中检测到的靶浓度，灰色柱表示微粒上的靶浓度。富集效果清晰可。
图14示出了上文进一步概述的组合的数字和实时定量PCR分析方法用于微粒中的 靶定量的精确度。示出了两种方法的置信区间。λ＝5cp/微粒(cp＝拷贝)处的竖直线指示了 方法可以在此处互换使用的近似值(“CI”＝置信区间)。
图15示出了在PCR扩增期间从油中的微粒采集的一系列图像获得的实时荧光数据。在左侧示出了检测区室的拼接图像和在对扩增特异的一个荧光通道中检测到的终点荧光信号。中间的图示例性示出了从左侧的荧光图像上选择的12个代表性个体微粒的荧光强度随时间的变化。在荧光图像中检测到的每个微粒的计算ct值的分布示出在右侧的直方图中。
序列表
<110> 布林克公司
<120> 检测和/或定量多个生物液体样品中的感兴趣的分析物的方法
<130> AJ4799PT2204
<150> EP19216592.6
<151> 2019-12-16
<160> 6
<170> BiSSAP 1.3.2
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HCV-Brun正义引物
<400> 1
gtggtctgcg gaaccggtga 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HCV-Brun反义引物
<400> 2
cgcaagcacc ctatcaggca gt 22
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HCV-Brun TaqMan探针
<400> 3
ccgagtagyg ttgggtygcg aaagg 25
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MS2-Nino正义引物
<400> 4
ctctgagagc ggctctattg gt 22
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MS2-Nino正义引物
<400> 5
ggtccctaca acgagcctaa attc 24
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MS2-Nino TaqMan探针
<400> 6
tcagacacgc ggtccgctat aacga 25

Claims (27)

1.一种检测和/或定量多个生物液体样品中的感兴趣的分析物的方法，所述方法包括样品特异性过程部分，然后是通用过程部分；
所述样品特异性过程部分包括下述步骤：
-以任何顺序独立地提供多个不同的怀疑含有感兴趣的分析物的生物液体样品和多个不同标记的多孔微粒子集，其中在所述多个子集中每个所述子集与其他子集分开；
-通过将每个所述独立的微粒子集独立地暴露于每一个生物液体样品从而允许每个样品在水性环境中被一个特异性标记的多孔微粒子集吸收，将每个所述不同的生物样品特异性标记；
-将每个多孔微粒子集从所述水性环境独立地转移到非水性环境；所述通用过程部分包括下述步骤：
-将所述非水性环境中的不同标记的多孔微粒子集混合在一起，从而在其中产生多个不同标记的多孔微粒子集的悬液；
-对所述多个不同标记的多孔微粒子集的所述悬液执行用于检测所述感兴趣的分析物的检测反应；以及
-如果所述感兴趣的分析物存在于任何所述不同标记的悬浮微粒子集中，检测和/或定量所述感兴趣的分析物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述将每个所述独立的微粒子集独立地暴露于每一个生物液体样品的步骤中，将每个所述独立的微粒子集以任何顺序暴露于每一个生物样品和用于执行化学检测反应或生物化学检测反应的检测组合物，使得每个微粒子集吸收它所暴露到的相应生物样品和检测组合物。
3.一种检测和/或定量多个生物液体样品中的感兴趣的分析物的方法，特别是根据权利要求1和2中的任一项所述的方法，所述方法包括下述步骤：
a.以任何顺序独立地提供多个独立的怀疑含有感兴趣的分析物的生物液体样品和多个多孔微粒的步骤；每个所述多孔微粒具有多孔基质并被配置以在所述多孔基质中容纳一定体积的液体；其中在所述多个多孔微粒中提供有不同的微粒子集，每个微粒子集的特征在于附连到相应的子集、包含在其中或以其他方式与其结合的特异性标记物组分；其中在所述提供的步骤中，提供的不同微粒子集的数目至少与提供的独立生物液体样品的数目一样大，并且其中此外在所述提供的步骤中，所述不同的微粒子集彼此独立地提供；其中可选地，所述不同的独立微粒子集在它们相应的多孔基质中含有检测组合物，其包含用于执行分析物的化学检测反应或生物化学检测反应的试剂；
b.将每个独立的微粒子集暴露于正好一个独立的生物液体样品的步骤，从而允许每个独立的微粒子集与一定体积的正好一个独立的生物液体样品孵育并吸收这种样品或其一部分，并可选地如果分析物存在于所述样品中，在所述微粒的基质中或其上积累分析物；以及此外可选地，在所述不同的独立微粒子集当在步骤a)中提供时尚未包含用于执行分析物的化学或检测反应生物化学检测反应的试剂的情况下，将每个独立的微粒子集暴露于包含用于执行分析物的化学检测反应或生物化学检测反应的试剂的检测组合物的步骤，从而允许每个独立的微粒子集容纳所述试剂；
c.将每个微粒子集独立地转移到非水性相中并除去所述子集的各个预制微粒周围的一些或所有的水性相，从而产生用于检测所述分析物的隔绝反应空间的多个独立的子集，所述反应空间包含水性相，其包括样品和所述用于执行分析物的化学检测反应或生物化学检测反应的试剂，并且所述反应空间局限于所述微粒的所述空隙体积；
d.将所述非水性相中的所述独立的不同微粒子集混合，使得所有所述不同的微粒子集形成不同微粒在所述非水性相中的悬液；使所述混合的不同微粒子集经历执行分析物的化学检测反应或生物化学检测反应所需的条件；进行所述感兴趣的分析物的这种检测反应；以及如果存在所述感兴趣的分析物，检测和/或定量任何所述不同的微粒子集中的所述感兴趣的分析物，这利用了如果所述感兴趣的分析物存在于所述相应子集中，则相应微粒子集中在所述检测反应中产生的信号。
4.根据权利要求3所述的方法，所述方法还包括下述步骤：
e.通过确定在步骤d)中在其中检测到所述感兴趣的分析物的微粒子集的身份来确定在步骤a)中提供的所述多个样品中的哪个或哪些样品含有所述感兴趣的分析物，其中优选地在步骤e)中利用附连到相应的微粒子集、包含在其中或以其他方式与其结合的特异性标记物组分来确定所述微粒子集的身份。
5.根据权利要求3-4中的任一项所述的方法，其中步骤b)还包括产生指示哪个独立的微粒子集被或已被暴露到哪个样品的第一相关性记录的子步骤，并且步骤d)包括产生指示在所述检测反应中在哪个微粒子集中已产生信号的第二相关性记录的子步骤。
6.根据权利要求4-5所述的方法，其中步骤e)通过参考所述第一相关性记录和第二相关性记录并通过链接所述记录来进行，从而允许确定所述在步骤a)中提供的多个样品中的哪个或哪些样品含有所述感兴趣的分析物。
7.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中每个所述多孔微粒具有多孔基质，所述多孔基质允许通过下述物质与分析物结合来积累感兴趣的分析物：
(i)聚合物或聚合物混合物，其形成所述多孔基质或者是所述多孔基质；或
(ii)固定在所述多孔基质上的至少一个可电离基团或多个可电离基团，所述可电离基团能够根据所述微粒周围的环境条件改变其电荷；或
(iii)固定在所述多孔基质上的至少一个带电荷基团或多个带电荷基团；或
(iv)(i)-(iii)的任何组合。
8.根据权利要求1-6或7中的任一项所述的方法，其中每个所述多孔微粒具有多孔基质并包含附连到所述多孔基质或被所述微粒包含的分析物特异性试剂(ASR)，这种分析物特异性试剂允许感兴趣的分析物的富集和/或允许涉及所述分析物的特异性信号或靶扩增反应；其中所述分析物特异性试剂能够与感兴趣的分析物特异性结合，其中优选地所述分析物特异性试剂选自：核酸，包括适体、Spiegelmer；抗体或抗体片段；能够特异性结合分析物或分析物复合体的诸如受体、受体片段和亲和蛋白的非抗体蛋白；其中优选地所述分析物特异性试剂选自核酸，特别是核酸寡聚体和核酸引物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中每个所述多孔微粒含有或具有附连到其多孔基质的相同的分析物特异性试剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其中在所述多个多孔微粒中存在不同的微粒子集，
其中每个子集
-具有附连到所述子集的所述微粒、包含在其中或以其他方式与其结合的独特的标记物组分；并且
所有所述不同子集具有
-附连到所述子集的所述微粒或包含在其中的相同的分析物特异性试剂，所述分析物特异性试剂是对一种感兴趣的分析物特异性的；
使得所述不同微粒子集在附连或包含的分析物特异性试剂方面相同，但区别在于
-附连到每个子集的所述微粒、包含在其中或以其他方式与其结合的相应的标记物组分；
并且每个子集由所述相应标记物组分明确定义并且是通过所述相应标记物组分可识别的。
11.根据权利要求1-7中的任一项或根据权利要求8-10中的任一项所述的方法，其中所述方法是检测和/或定量多个生物液体样品中的一种感兴趣的分析物的方法，其中提供的、优选地在步骤a)中提供的不同微粒子集的数量等于提供的独立生物液体样品的数量。
12.根据权利要求8所述的方法，其中在所述多个多孔微粒中存在附连到所述微粒或包含在其中的几种不同的分析物特异性试剂。
13.根据权利要求12所述的方法，其中存在不同的微粒子集
并且每个子集
-具有附连到所述子集的所述微粒、包含在其中或以其他方式与其结合的独特标记物组分；并且
其中此外在所述多个多孔微粒中存在不同类别的微粒子集，并且每个类别的子集
-具有附连到所述微粒的多孔基质或包含在所述微粒中的不同分析物特异性试剂；其中优选地存在至少两个不同类别的微粒子集，更优选地至少三个以上不同类别的微粒子集；
使得所述不同微粒子集的区别在于附连到每个子集的所述微粒、包含在其中或以其他方式与其结合的相应标记物组分；并且每个微粒子集构成一类微粒子集的一部分；并且每个子集由所述相应标记物组分和所述相应分析物特异性试剂明确定义并且是通过所述相应标记物组分和所述相应分析物特异性试剂可识别的；并且
使得所述不同类别的微粒子集的区别在于附连或包含的相应分析物特异性试剂；并且每个所述不同类别包含几个微粒子集，所有所述子集都附连或包含有相同的分析物特异性试剂。
14.根据权利要求12-13中的任一项所述的方法，其中所述方法是检测和/或定量多个生物液体样品中的超过一种感兴趣的分析物的方法，其中提供的、优选在步骤a)中提供的不同微粒子集的数目等于提供的独立生物液体样品的数目乘以待检测的感兴趣的分析物的数目，并且其中存在与待检测的感兴趣的分析物的数目同样多的提供的、优选在步骤a)中提供的微粒子集的类别。
15.根据权利要求3-14中的任一项所述的方法，其中所述多孔基质是由聚合物或聚合物混合物形成的多孔聚合物基质，其中优选地所述多孔聚合物基质由未交联的聚合物组成，其中更优选地，形成所述多孔聚合物基质的所述聚合物或聚合物混合物由琼脂糖或琼脂糖与明胶的组合组成，其中更优选地，在所述琼脂糖与明胶的组合中，所述琼脂糖以0.1％(w/v)至4％(w/v)的范围存在，并且所述明胶以0.1％(w/v)至20％(w/v)、优选地0.5％(w/v)至20％(w/v)的范围存在。
16.根据权利要求3-15中的任一项所述的方法，其中所述感兴趣的分析物是核酸，所述检测反应是核酸扩增，并且所述检测组合物是用于执行核酸扩增的组合物，其包含缓冲液、三磷酸单核苷、扩增酶例如适合的核酸聚合酶例如Taq聚合酶，和用于检测扩增产物例如扩增的核酸的核酸染料，可选地如果一对或多对扩增引物以及进一步可选的诸如TaqMan探针、分子诱饵等的相应的分子探针尚未作为附连到所述微粒或包含在其中的分析物特异性试剂(ASR)提供，所述检测组合物还包括这种引物和/或探针；和/或
其中所述感兴趣的分析物是蛋白质或其他非核酸分子，所述检测反应是免疫化学检测反应，并且所述检测组合物是用于执行这种免疫化学检测反应的组合物，并在所述方法中作为两个独立的组分提供：其中所述检测组合物的第一组分包含用于执行免疫化学检测反应的必需试剂，例如缓冲液和偶联到适合的报告酶并且对与在所述免疫化学检测反应中用作分析物特异性试剂(ASR)的第一抗体、抗体片段或非抗体蛋白相同的分析物特异的第二抗体或第二抗体片段，以及可选的如果能够特异性结合所述蛋白质分析物或其他非核酸分析物的第一抗体、抗体片段或非抗体蛋白质尚未作为附连到所述微粒或包含在其中的分析物特异性试剂(ASR)提供，所述检测组合物的第一组分还包含这种第一抗体、抗体片段或非抗体蛋白质；并且其中所述检测组合物的第二组分包含所述适合的报告酶的适合的底物作为检测试剂，所述底物在被所述报告酶反应后变得可检测，优选地可光学检测，更优选地可通过荧光检测。
17.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中在所述检测和定量所述感兴趣的分析物的步骤中，所述分析物的定量通过选自下述的方法来进行：
a)数字核酸扩增，特别是数字聚合酶链反应(PCR)；
b)实时定量核酸扩增，特别是实时聚合酶链反应(PCR)；
c)免疫化学检测方法，特别是数字免疫化学检测方法，例如数字免疫测定法如数字酶联免疫吸附测定法(ELISA)；
d)免疫化学检测方法，特别是与核酸扩增组合的数字免疫化学检测方法，例如免疫-聚合酶链反应，特别是数字免疫-PCR；和
e)a)-d)的任何组合，
其中如果所述感兴趣的分析物是核酸，则定量使用方法a)或b)中的任一者或a)与b)的组合来进行；并且其中如果所述分析物是蛋白质、肽或其他非核酸分析物，则定量使用方法c)或d)中的任一者来进行。
18.一种用于在多个生物液体样品中检测感兴趣的分析物、特别是用于执行根据权利要求1-17中的任一项所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包含：
-包含多个微粒的多个容器，每个容器包含所述多个多孔微粒子集，每个子集中的每个所述多孔微粒具有多孔基质并被配置以在所述多孔基质中容纳一定体积的液体；每个微粒子集的特征在于附连到相应子集、包含在其中或以其他方式与其结合的特异性标记物组分，其中优选地所述微粒如权利要求1-17中的任一项中所定义；可选地包含用于清洗所述微粒的水性清洗试剂的容器；
-包含用于检测感兴趣的分析物的检测组合物的容器；所述检测组合物包含用于执行分析物的化学检测反应或生物化学检测反应的试剂，其中所述检测组合物是用于执行核酸扩增的组合物，或者是用于执行免疫化学检测反应的组合物；
-包含非水性相的容器，用于在每个子集已被暴露到生物液体样品后将所述不同微粒子集转移到非水性相中，并用于产生微粒子集在非水性相中的独立的不同悬液；
-混合容器，用于将所述微粒子集在非水性相中的独立的不同悬液混合在一起，使得所有所述微粒子集的不同悬液形成不同微粒在所述非水性相中的单一悬液，然后对其进行检测反应；
-用于执行检测反应的容器。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中每个所述多孔微粒具有附连到其多孔基质的分析物特异性试剂(ASR)或含有分析物特异性试剂(ASR)，这种分析物特异性试剂允许感兴趣的分析物的富集和/或允许涉及所述分析物的特异性信号或扩增反应；其中所述分析物特异性试剂能够与感兴趣的分析物特异性结合，其中优选地所述分析物特异性试剂选自：核酸，包括适体、Spiegelmers；抗体或抗体片段；能够特异性结合分析物或分析物复合体的诸如受体、受体片段和亲和蛋白的非抗体蛋白；其中优选地所述分析物特异性试剂选自核酸，特别是核酸寡聚体和核酸引物。
20.根据权利要求18-19中的任一项所述的试剂盒，其中所述感兴趣的分析物是核酸，所述检测反应是核酸扩增，并且所述检测组合物是用于执行核酸扩增的组合物，其包含缓冲液、三磷酸单核苷、扩增酶例如适合的核酸聚合酶如Taq聚合酶，和用于检测扩增产物例如扩增的核酸的核酸染料，以及可选地如果一对引物尚未作为附连到所述微粒或包含在其中的分析物特异性试剂(ASR)提供，所述检测组合物还包含这对引物；或者
其中所述感兴趣的分析物是蛋白质或其他非核酸分子，所述检测反应是免疫化学检测反应，并且所述检测组合物是用于执行这种免疫化学检测反应的组合物并在所述试剂盒中提供在两个独立的腔室或容器中；其中所述检测组合物在第一腔室或容器中包含执行免疫化学检测反应必需的试剂，例如缓冲液和偶联到适合的报告酶并且对与在所述免疫化学反应中用作分析物特异性试剂(ASR)的第一抗体、抗体片段或非抗体蛋白质相同的分析物特异的第二抗体或第二抗体片段，可选地如果能够特异性结合所述蛋白质分析物或其他非核酸分析物的第一抗体、抗体片段或非抗体蛋白质尚未作为附连到所述微粒或包含在其中的分析物特异性试剂(ASR)提供，所述检测组合物还包含这种第一抗体、抗体片段或非抗体蛋白质；并且其中所述检测组合物在第二腔室或容器中包含作为检测试剂的用于所述适合的报告酶的适合的底物，所述底物在被所述报告酶反应后变得可检测，优选地可光学检测，更优选地可通过荧光检测。
21.根据权利要求18-20中的任一项所述的试剂盒，其中每个所述多孔微粒具有附连到其多孔基质的相同的分析物特异性试剂或含有所述相同的分析物特异性试剂。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中在所述多个多孔微粒中存在不同的微粒子集，
并且每个子集
-具有附连到所述子集的所述微粒、包含在其中或以其他方式与其结合的独特的标记物组分；并且
所有所述不同子集具有
-附连到所述子集的所述微粒或包含在其中的相同的分析物特异性试剂，所述分析物特异性试剂是对一种感兴趣的分析物特异性的；
使得所述不同微粒子集在附连或包含的分析物特异性试剂方面相同，但区别在于
-附连到每个子集的所述微粒、包含在其中或以其他方式与其结合的相应的标记物组分；
并且每个子集由所述相应标记物组分明确定义并且可以通过它识别，并被提供在独立容器中。
23.根据权利要求21-22中的任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒是用于在多个生物液体样品中检测一种感兴趣的分析物的试剂盒，其中所述试剂盒中提供的不同微粒子集的数目等于提供的独立生物液体样品的数目。
24.根据权利要求18-20中的任一项所述的试剂盒，其中在所述多个多孔微粒中存在附连到所述微粒或包含在其中的几种不同的分析物特异性试剂。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中存在不同的微粒子集，
并且每个子集
-具有附连到所述子集的所述微粒、包含在其中或以其他方式与其结合的独特的标记物组分；并且
其中此外，在所述多个多孔微粒中存在不同类别的微粒子集，每个类别的子集
-具有附连到所述微粒的多孔基质或包含在所述微粒中的不同的分析物特异性试剂；其中优选地存在至少两个不同类别的微粒子集，更优选地至少三个以上不同类别的微粒子集；
使得所述不同微粒子集的区别在于附连到每个子集的所述微粒、包含在其中或以其他方式与其结合的相应标记物组分；并且每个微粒子集构成一类微粒子集的一部分；并且每个子集由所述相应标记物组分和所述相应分析物特异性试剂明确定义并且是通过所述相应标记物组分和所述相应分析物特异性试剂可识别的，并被提供在独立容器中；并且
使得所述不同类别的微粒子集的区别在于附连到所述微粒的多孔基质或包含在所述微粒中的相应的分析物特异性试剂；并且每个所述不同类别包含几个微粒子集，所述子集全都附连有或包含有相同的分析物特异性试剂。
26.根据权利要求24-25中的任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒是用于在多个生物液体样品中检测超过一种感兴趣的分析物的试剂盒，其中所述试剂盒中提供的不同微粒子集的数目等于提供的独立生物液体样品的数目乘以待检测的感兴趣的分析物的数目，并且其中在所述试剂盒中提供有与待检测的感兴趣的分析物的数目同样多的微粒子集的类别。
27.一种柱筒，其用于执行根据权利要求1-17中的任一项所述的检测和/或定量多个生物液体样品中的感兴趣的分析物的方法，其中优选地所述柱筒包含多个样品特异性模块、多个储存区室、至少一个用于储存非水性相的非水性相区室和单个合并的混合和检测区室或独立的混合区室和独立的检测区室的组合；
其中每个样品特异性模块包含具有其自己的独立样品入口的样品腔室，每个样品特异性模块被配置以在相应的样品腔室中仅容纳正好一种生物样品；每个样品特异性模块被进一步配置以在所述样品腔室中容纳微粒，所述微粒如权利要求1-17中的任一项中所定义；每个样品特异性模块被进一步配置以促进所述微粒从水性环境向非水性环境的相转移。
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