KR20150023331A

KR20150023331A - 음으로 대전된 입자들로의 폴리뉴클레오티드들의 크로마토그래피 정제

Info

Publication number: KR20150023331A
Application number: KR1020147033765A
Authority: KR
Inventors: 피터 가그논
Original assignee: 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치
Priority date: 2012-05-31
Filing date: 2013-05-30
Publication date: 2015-03-05
Also published as: EP2854982A1; WO2013180654A1; SG11201407808XA; CN104470606A; IN2014DN09945A; JP6363593B2; CN104470606B; EP2854982B1; EP2854982A4; US20150148528A1; US9890376B2; JP2015527052A

Abstract

폴리뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 정제하는 방법은, (i) 음으로 대전된 다공성 입자들을 갖는 팩형 크로마토그래피 칼럼을 제공하는 단계, (ii) 상기 칼럼을 상기 샘플 내의 폴리뉴클레오티드가 용리되는 조건들까지 평형화시키는 단계, (iii) 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼에 적용되는 상기 샘플 부피가 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼 내의 상기 음으로 대전된 다공성 입자들의 입자간 공간 보다 작거나 같아지도록 상기 샘플을 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼과 접촉시키는 단계, 그리고 (iv) 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼으로부터 상기 폴리뉴클레오티드를 용리시키는 단계를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 보다 순수한 상태 및 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼이 평형화되었던 조건들에 있다.

Description

음으로 대전된 입자들로의 폴리뉴클레오티드들의 크로마토그래피 정제{CHROMATOGRAPHIC PURIFICATION OF POLYNUCLEOTIDES WITH NEGATIVELY CHARGED PARTICLES}

본 발명은 폴리뉴클레오티드들의 정제를 위한 방법들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 원하는 레벨의 최종 정제를 구현하기 위해 이들의 능력들과 다른 정제 방법들의 통합에 관한 것이다.

본 출원은 2013년 3월 6일에 출원된 미국 임시 특허출원 제61/773,666호 및 2012년 3월 31일에 출원된 미국 임시 특허출원 제61/653,694호를 우선권들로 수반하며, 이들의 개시 사항들은 본 명세서에 참조로 포함된다.

대전된 표면들을 갖는 고체 물질들이 폴리뉴클레오티드 정제의 분야에 널리 사용된다. 이들 물질들은 통상적으로 두 적용 포맷들의 하나로 채용되는 이온 교환체들을 공통적으로 포함한다. 결합-용리(bind-elute) 모드에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드와 이온 교환체는 관심의 대상인 폴리뉴클레오티드 종들이 결합되는 조건들까지 평형화된다. 대전된 표면과 약하게 상호작용하거나 전혀 상호작용하지 않는 오염물들은 결합되지 않으며 제거된다. 상기 폴리뉴클레오티드 보다 강하게 상호작용하는 오염물들은 보다 강하게 결합된다. 결합되지 않은 오염물들을 제거하기 위해 세척한 후, 상기 칼럼은 염의 농도를 증가시켜 용리될 수 있다. 이는 상기 이온 교환체와 이들의 상호작용의 강도를 향상시키도록 결합된 종들의 분별을 가능하게 하며, 이에 따라 높은 정도의 폴리뉴클레오티드 정제들을 구현한다. 통과-량(flow-through) 모드에 있어서, 예를 들면 양이온 교환체 상에서, 상기 샘플 및 이온 교환체는 모두 상기 폴리뉴클레오티드가 결합되는 것을 방지하는 조건들까지 평형화된다. 상기 폴리뉴클레오티드보다 상기 이온 교환체와 더 강하게 상호작용하는 종들이 결합되고 이에 따라 제거되지만, 상기 폴리뉴클레오티드보다 약하게 결합하는 종들은 이를 통해 흐르고 오염물들로서 지속된다. 양 모드들은 칼럼들 내에 포장되거나, 큰 부피의 수성 샘플들에 첨가되거나, 모놀리스들(monoliths) 또는 멤브레인들 상의 다공성 또는 비다공성 입자들을 포함하는 다양한 고상의 구조물들 내에 존재하는 대전된 표면들 상에서 수행된다. 이들 상이한 구조물들은 다른 유동 특성들, 용량 및 해상도를 부여하지만, 통과-량 또는 결합-용리 크로마토그래피의 화학적 특징들의 결정은 물리적 포맷에 관계없이 일정하다. 양 방법들은 상기 샘플들이 상기 칼럼에 도입되기 전에 동일한 조건들까지의 상기 이온 교환체 및 샘플의 평형에 의존한다.

일부 크로마토그래피 배지들은 전하들과 다른 유형들의 화학 작용기들의 결합들을 구현한다. 이들 배지들은 혼합 모드들 또는 다중 모드의 물질들로 널리 알려져 있고, 전하들을 소수성기들, 금속 친화 기들 또는 수소 결합들의 형성을 선호하는 화학 기들과 다양하게 결합시킬 수 있다. 이들은 이차 작용기들의 성질에 따라 다른 화학적 조건들 하에서 작동하지만, 이들은 여전히 결합-용리 및 통과-량 모드에서 작동한다.

다중 모드 물질의의 작은 소수들은 전하를 물리적 작용기와 결합시키는 것으로 기술되었으며, 예를 들면, 여기서 대전된 물질은 또한 이들의 사이즈에 따라 종들을 분류하는 능력을 가진다. 이러한 하나의 예는 전기양성의 표면과 결합되는 가변적인 사이즈 배제 기능성을 채용한다[Hunter, A.의 "J. Chromatogr. A"(897：65-80 (2000)); Hunter, A.의 "J. Chromatogr. A"(897：81-97 (2000)); Hunter, A.의 "J. Chromatogr. A"(930：79-93 (2000)); Hunter, A.의 "J. Chromatogr. A"(971：105-116 (2000))]. 상기 방법은 일반적으로 단백질 상의 전하에 대한 공공 의존성뿐만 아니라 완충액 조건들을 나타내면서 사이즈 의존 방식으로 입자 기공들 내로의 단백질들의 도입을 수반한다. 분별을 위하여 다른 대전된 물질들과 같이, 상기 방법은 작동의 결합-용리 및 통과-량 모드들을 채용한다.

최근에(Nian 등의 "J. Chromatogr. A"(1282(2013), 127-132)) 크로마토그래피의 새로운 모드가 보이드 배제 크로마토그래피(void exclusion chromatography)로 호칭되어 기술되었다. 상기 방법을 수행하기 위한 물질은 칼럼에 적용되는 샘플 부피가 상기 입자들 사이의 공간에 의해 점유되는 부피 보다 크지 않을 조건으로 전기양성 입자들로 포장된 칼럼을 포함한다(비고: 위의 Hunter). 상기 방법은 항체들의 정제를 위해 기술되었다.

본 발명은 폴리뉴클레오티드들의 정제를 위한 방법을 제공한다.

폴리뉴클레오티드(polynucleotide)의 정제를 위한 방법들, 물질들 및 키트들(kits)이 제공된다. 특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 정제하기 위한 방법들을 제공하며, 상기 방법들은, (i) 음으로 대전된 다공성 입자들을 포함하는 팩형 크로마토그래피 칼럼(packed chromatographic column)을 제공하는 단계, (ii) 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼을 상기 샘플 내의 상기 폴리뉴클레오티드가 용리되는 조건들까지 평형화시키는 단계, (iii) 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼에 적용되는 상기 샘플 부피가 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼 내의 상기 음으로 대전된 다공성 입자들의 입자간 공간 보다 작거나 같아지도록 상기 샘플을 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼과 접촉시키는 단계, 그리고 (iv) 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼으로부터 상기 폴리뉴클레오티드를 용리시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 보다 순수한 상태에 있다.

특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 기공들로부터 독립적으로 또는 입체 제거(steric rejection)와 결합하거나, 상기 기공들로부터 입체 제거에만 의해 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)가 정전기적 반발에 의해 입자들 사이의 공간(즉, 입자간 또는 보이드(void) 공간)에 실질적으로 제한되는 전기음성(electronegative) 다공성 입자들로 포장된 칼럼(column)에 관한 것이다. 이는 상기 보이드 공간을 통한 배타적이 아닐 경우에 상기 폴리뉴클레오티드가 칼럼으로 실질적으로 이송되게 할 수 있다. 입체 제거는 특히 이에 따라 폴리뉴클레오티드가 상기 기공들 내의 음으로 대전된 리간드들의 구성에 의해 나타나는 물리적인 저항을 이들이 극복하는 것을 방지하는 조건들 하에서 상기 기공 공간에 들어갈 수 없게 될 수 있는 메커니즘을 언급한다. 염들, 비이온성 및 쌍성 이온성 종들을 포함하여 오염되는 단백질들(상기 폴리뉴클레오티드가 생성되는 숙주 세포(host cell)로부터 야기되는 것들을 포함하여) 및 세포 배양 배지 성분들의 많은 것들은 상기 입자들의 기공들로 들어갈 수 있으며, 이는 어떤 특정한 이론에 구속되지 않고 상기 칼럼을 통한 이들의 수송을 지연시키며 상기 칼럼을 통해 완충액이 흐르면서 이들이 빠르게 이동하는 폴리뉴클레오티드로부터 분리되게 하는 것으로 여겨진다. 산성 오염물들은 상기 전기음성의 표면에 결함함에 의해 더 지연될 수 있다.

이러한 방법이 샘플 조건들을 고려하지 않고, 대부분의 오염물들의 화학적 특성들을 고려하지 않으며, 상기 폴리뉴클레오티드가 상기 칼럼을 통한 샘플 적용에 즉시 뒤이어 적용되는 상기 완충액의 조성을 고려하지 않고, 그 중에서도 폴리뉴클레오티드의 효과적인 분별을 가능하게 하는 점이 발견되었다. 특정 실시예들에 있어서, 본 발명의 이점은 넓은 범위의 조건들(pH, 염 농도, 전도성 등)에서 수행될 수 있으며, 이에 따라 이들 조건들이 폴리뉴클레오티드의 제조 및 정제의 과정에서 본 발명의 방법들에 선행하거나 후속하는 프로세스들과 함께 본 발명의 방법들의 간편한 수행을 위해 선택될 수 있는 점이다. 특정 실시예들에 있어서, 이들 특유의 작동 특징들 및 결과들은 샘플 적용을 상기 칼럼 내의 음으로 대전된 입자들의 입자간 부피를 초과하지 않는 부피까지 제한함에 의해 구현된다. 또한, 일부 실시예들에 있어서, 상기 방법은 비다공성 입자들, 멤브레인들 또는 모놀리스들(monoliths)을 포함하는 다른 형태들의 음으로 대전된 물질들로 적용되지 않거나, 샘플 내에 음으로 대전된 다공성 또는 비다공성 입자들 혹은 가용성의 음으로 대전된 중합체들을 분산시켜 적용되지 않는다. 오히려, 본 발명의 일부 실시들에 있어서, 상기 방법은 다공성 입자들의 포장된 칼럼으로 수행된다. 특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 입자간 공간이이 분산적이기 보다는 대류적이기 때문에 다공성 입자들로 포장된 칼럼들을 사용하는 폴리뉴클레오티드 정제의 다른 방법에 대해 큰 이점을 가진다. 이는 수행되는 방법이 다른 입자 칼럼 방법들 노다 높은 유량들에서 효과적으로 되게 하며, 보다 높은 생산성을 가져온다.

본 발명의 특정 실시예들의 고유한 분별 능력이 상기 칼럼이 이들 추가적인 작용기들에 의해 상기 폴리뉴클레오티드가 지연되거나 상당하게 지연되는 것을 야기하지 않는 조건들까지 평형화되는 한 상기 칼럼 베드 내의 입자들 상의 추가적인 표면 작용기들을 포함함에 의해 향상될 수 있는 점도 발견되었다. 이와 같은 작용기들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 양으로 대전된 기들, 소수성 기들, pi-pi 결합 기들, 수소 결합 기들, 또는 금속 킬레이트화(chelation) 기들을 포함할 수 있다. 이들 추가적인 작용기들은 음으로 대전된 기들로서 동일한 화학적 모이어티 상에, 또는 음으로 대전된 기들로서 동일한 다공성 입자들 상에, 또는 다공성이나 비다공성이 될 수 있는 다른 입자들 상에 남을 수 있다. 추가적인 입자들의 도입을 통해 이차 작용기들이 추가되는 경우, 적용될 수 있는 상기 샘플의 부피는 상기 칼럼 내의 상기 음으로 대전된 다공성 입자들 사이에만 존재할 수 있는 입자간 공간에 대응되는 부피로 제한된다. 이러한 부피는 상기 칼럼 내의 양으로 대전된 다공성 입자들의 중력으로 고정된 부피들의 약 40%로 평가될 수 있지만, 상기 입자 베드가 물리적으로 압축되는 경우에는 작을 수 있으며, 실험에 의해 정량적으로 결정될 수 있다.

특정 실시예들에 있어서, 정제의 정도는 상기 샘플을 상기 폴리뉴클레오티드와 연관되게 될 수 있는 오염물들의 해리를 증진시키도록 제제들로 전처리함에 의해 향상될 수 있는 방법에 의해 제공된다. 이러한 제제들은 특히 다른 것들 중에서 염들, 요소, 아미노산들, 비이온성 유기 중합체들, 유기 용제들 그리고 계면활성제들의 상승된 농도들을 포함하는 다양한 해리 작용제들(dissociating agents)을 포함한다. 특정 실시예들에 있어서, 6M까지의 농도에서 카오트로프염(chaotropic salt)의 가이드라인은 새롭게 균질화된 세포들 또는 다른 복합체 제조물들로부터 폴리뉴클레오티드를 해리시키는 데 특히 유용할 수 있다. 상기 해리 작용제들은 상기 방법의 통상적인 실행 동안에 상기 샘플 내의 다른 소분자들과 함께 제거된다. 이는 본 발명의 두 가지 이점들을 강조하며, 첫 번째는 심지어 상기 샘플 조건들이 결합-용리 또는 통과-량 모드에서 이온 교환 크로마토그래피를 수행하기 위해 기본적으로 불안정한 때라도 상기 칼럼이 작동할 것인 조건들까지 이전의 샘플 평형을 요구하지 않은 점이며, 두 번째는 상기 샘플의 조성이 어떻더라도 상기 칼럼을 평형화시키는 데 사용되는 상기 완충액 내에 상기 샘플이 용리되며, 이에 따라 상기 폴리뉴클레오티드의 정제와 함께 완충액 교환들 구현하는 점이다.

특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 함유하는 샘플을 정제하기 위한 방법들을 제공하며, 상기 방법들은, (i) 음으로 대전된 다공성 입자들을 포함하는 팩형 크로마토그래피 칼럼(packed chromatographic column)을 제공하는 단계, (ii) 상기 칼럼을 상기 샘플 내의 상기 폴리뉴클레오티드가 용리되는 조건들까지 평형화시키는 단계, (iii) 상기 칼럼에 적용되는 상기 샘플 부피가 상기 칼럼 내의 상기 음으로 대전된 다공성 입자들의 입자간 공간 보다 작거나 같아지도록 상기 샘플을 상기 칼럼과 접촉시키는 단계, 그리고 (iv) 상기 칼럼으로부터 상기 폴리뉴클레오티드를 용리시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 보다 순수한 상태 및 상기 칼럼이 평형화되었던 조건들에 있다.

전술한 실시예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 종들은 게놈(genomic) 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 조각(fragment), 또는 폴리뉴클레오티드 플라스미드(plasmid)가 될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 천연이나 재조합 기원이 될 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 미리 정제되지 않을 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 본 발명을 실행하기 이전에 농축될 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 초미세여과(ultrafiltration)에 의해 농축되었을 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 순도의 중간 레벨 또는 순도의 높은 레벨까지 미리 정제 단계를 거칠 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 순도의 중간 레벨은 약 40% 내지 약 90%, 또는 그 이상의 순도의 범위에 있을 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 순도의 높은 레벨은 약 90% 또는 그 이상이 될 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 샘플 부피는 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼 내의 상기 음으로 대전된 다공성 입자들의 입자간 공간의 90% 보다 작을 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 샘플 부피는 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼 내의 상기 음으로 대전된 다공성 입자들의 입자간 공간의 80% 보다 작을 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 샘플 부피는 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼 내의 상기 음으로 대전된 다공성 입자들의 입자간 공간의 70% 보다 작을 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 샘플 부피는 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼 내의 상기 음으로 대전된 다공성 입자들의 입자간 공간의 60% 보다 작을 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 샘플 부피는 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼 내의 상기 음으로 대전된 다공성 입자들의 입자간 공간의 50% 보다 작을 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 샘플 부피는 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼 내의 상기 음으로 대전된 다공성 입자들의 입자간 공간의 0.1% 보다 작을 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼은 음으로 대전된 다공성 입자들만으로 포장될 수 있으며, 상기 샘플 부피는 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼의 부피의 40% 보다 작을 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 샘플 적용 조건은 대략 2의 pH 내지 대략 9의 pH의 범위 내의 pH를 포함한다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼은 대략 4 내지 대략 8의 pH까지 평형화될 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼은 약 4.5 내지 약 6.0의 pH에서 완충액으로 평형화될 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 샘플 적용 조건은 대략 0.1mS/㎝ 내지 대략 250mS/㎝의 범위의 도전성 값을 포함한다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼은 대략 0.1mS/㎝ 내지 대략 30mS/㎝의 범위의 도전성 값까지 평형화될 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼은 약 0.1mS/㎝ 내지 약 15mS/㎝의 도전성 값까지 평형화될 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼은 약 4.5의 pH 및 약 1mS/㎝ 보다 작은 0이 아닌 전도성에서 완충액으로 평형화될 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼은 상기 용리물에 대해 수행되는 후속하는 정제 단계를 위한 샘플 적용 조건들에서 또는 가까운 조건들까지 평형화될 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 음으로 대전된 다공성 입자들 양이온 교환 입자들이다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 양이온 교환 입자들은 전기음성도(electronegativity)를 가지며, 상기 전기 음성도의 적어도 일부는 카르복시기들(carboxyl groups), 술포기들(sulfo groups) 또는 포스포릴기들(phosphoryl groups)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 모이어티(moiety)에 의해 제공된다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 전기음성도는 음으로 대전된 모이어티의 하나 이상의 종들(species)에 의해 부여될 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 전기음성도는 이차적 반응성들을 부여하는 다른 작용기들과 결합되는 카르복시, 술포 또는 포스포 기들을 포함하는 착물 리간드들(complex ligands)에 의해 부여될 수 있다. 이러한 일 실시예에 있어서, 전기음성도는 상기 음으로 대전된 리간드가 금속 배위(coordination)에 참가하는 강한 능력을 구현하도록 적어도 하나의 아미노기와 결합되는 하나 또는 그 이상의 카르복실들(carboxyls)을 포함하는 복합체 리간드에 의해 부여될 수 있다. 이와 같은 리간드의 예는 이미노디아세트산(iminodiacetic acid) 또는 니트릴로아세트산(nitiriloacetic acid)이 될 수 있다. 이와 같은 다른 실시예에 있어서, 상기 착물 리간드는 하나 또는 그 이상의 음 전하들에 직접적으로 또는 간접적으로 공유결합으로 링크되는 방향족 또는 지방족 소수성 기를 포함할 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼은 상기 전기음성의 다공성 입자들 이외에 다른 입자들을 더 포함한다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 전기음성의 다공성 입자들 또는 상기 다른 입자들의 적어도 하나는 음이온 교환, 소수성 상호작용들, 수소 결합, pi-pi 상호작용들 그리고 금속 킬레이트화로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 이차 화학적 작용기들을 포함한다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 방법은 상기 샘플을 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼과 접촉시키는 단계 이전에 상기 샘플을 해리 작용제들(dissociating agents)의 하나 또는 그 이상의 종들과 접촉시키는 추가적인 단계를 더 포함할 수 있으며, 여기서 상기 해리 작용제의 목적은 이가 비특이적으로 연관될 수 있는 오염물들로부터 상기 폴리뉴클레오티드 종들을 해리시키는 것이다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 해리 작용제는 유기 용제가 될 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 해리 작용제는 에틸렌 클리콜(ethylene glycol), 프로필렌 클리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜((polyethylene glycol), 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide), 글리세롤(glycerol), 에탄올(ethanol) 또는 이소프로판올(isopropanol)이 될 수 있다.

하나 또는 그 이상의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 해리 작용제는 0이 아닌 양으로부터 0.1% 또는 그 이상, 1% 또는 그 이상, 10% 또는 그 이상, 혹은 20% 또는 그 이상의 범위의 농도에서 존재할 수 있다.

하나 또는 그 이상의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 해리 작용제는 0이 아닌 농도로부터 8M 또는 그 이상, 예를 들면 0.5M 또는 그 이상, 1M 또는 그 이상, 2M 또는 그 이상, 4M 또는 그 이상, 혹은 6M 또는 그 이상까지의 범위의 요소와 같은 카오트로프(chaotrope)가 될 수 있다.

하나 또는 그 이상의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 해리 작용제는 계면활성제가 될 수 있다.

하나 또는 그 이상의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 계면활성제는 트리톤(Triton) 또는 트윈(Tween) 또는 브리즈(Brij)와 같은 비이온성 계면활성제가 될 수 있거나; 챕스(CHAPS), 챕소(CHAPSO) 또는 옥타클루코시드(octaglucoside)와 같은 쌍성 이온성 계면활성제가 될 수 있다.

하나 또는 그 이상의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 계면활성제는 0.1% 보다 작은 농도에서 상기 샘플 내에 존재할 수 있다.

하나 또는 그 이상의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 해리 작용제는 요소 또는 소르비톨(sorbitol)과 같은 수소 결합 디스럽터(disruptor)가 될 수 있다.

하나 또는 그 이상의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 해리 작용제는 아르기닌(arginine), 리신(lysine) 또는 히스티딘(histidine)과 같은 아미노산이 될 수 있다.

하나 또는 그 이상의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 아미노산은 0이 아닌 양으로부터 500mM까지 범위의 농도에 있을 수 있다.

하나 또는 그 이상의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 해리 작용제는 에틸렌 디아민 트리아세트산(ethylene diamine tetraacetic acid: EDTA), 트리스(tris)(2-아미노에틸(aminoethyl))아민(amine)(TREN) 또는 디페록사민(deferoxamine)과 같은 킬레이트화제(chelating agent)가 될 수 있다.

하나 또는 그 이상의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 킬레이트화제는 0이 아닌 양으로부터 50mM까지 범위의 농도에 있을 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 방법은 상기 샘플을 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼과 접촉시키는 단계 이전에 상기 샘플을 염들의 하나 또는 그 이상의 종들과 접촉시키는 추가적인 단계를 더 포함할 수 있으며, 여기서 상기 염의 목적은 이가 비특이적으로 연관될 수 있는 오염물들로부터 상기 폴리뉴클레오티드 종들을 해리시키는 것이다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 샘플에 첨가되는 염은 염화나트륨, 염화칼륨 또는 다른 이른바 천연염으로 구성될 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 샘플에 첨가되는 염은 구아니딘(guanidine)과 같은 카오트로프염(chaotropic salt)으로 구성될 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 염은 0이 아닌 양으로부터 2M 또는 그 이상, 예를 들면 50mM 또는 그 이상, 100mM 또는 그 이상, 200mM 또는 그 이상, 500mM 또는 그 이상, 혹은 1M 또는 그 이상까지의 범위의 농도에 있을 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 오염물은 금속 이온, 단백질, 지질(lipid), 내독소(endotoxin), 바이러스, 세포 배양 구성 성분, 뉴클레오티드의 원하지 않는 종들 또는 이들의 결합들이 될 수 있다.

하나 또는 그 이상의 각각의 전술한 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 하나 또는 그 이상의 오염물들을 함유할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드의 보다 순수한 상태는 여기에 개시된 방법들을 수행한 결과로서의 샘플에 비하여 감소된 농도의 이러한 오염물들을 가진다.

키트(kit)가 전술한 실시예들의 임의의 하나에 따른 방법의 편리한 실행을 위해 제공될 수 있다.

특정 실시예들에 있어서, 상기 입자간 공간은 상기 샘플의 부피의 대략 2배 보다 크다. 특정 실시예들에 있어서, 다공성의 전기음성 입자들을 함유하는 상기 칼럼의 일부의 입자간 공간은 상기 샘플 부피 보다 크다. 음으로 대전된 다공성 입자들만으로 포장되는 칼럼들을 갖는 특정 실시예들에 있어서, 상기 샘플 부피는 is 상기 포장된 칼럼의 부피의 약 40% 또는 그 이하이며; 음으로 대전된 다공성 입자들 및 다른 입자들로 포장된 칼럼들을 갖는 특정 실시예들에 있어서, 상기 샘플 부피는 상기 칼럼 내의 중력으로 정해진 음으로 대전된 다공성 입자들의 부피의 약 40% 또는 그 이하이다.

특정 실시예들에 있어서, 상기 칼럼 내에 포장된 상기 음으로 대전된 다공성 입자들의 입자간 공간은 대략 상기 샘플과 동일하거나, 상기 샘플 부피보다 10% 이상 크거나, 생기 샘플보다 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 혹은 100% 이상 크거나, 상기 샘플보다 1.5배 혹은 2배 혹은 2.5배 혹은 3배 혹은 4배 혹은 5배 또는 그 이상 큰 부피이다.

특정 실시예들에 있어서, 상기 칼럼은 상기 샘플을 상기 칼럼과 접촉시키기 이전에 평형 완충액으로 평형화된다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 칼럼은 대략 3 내지 대략 9의 pH에서 평형화된다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 칼럼은 약 4 내지 약 6.0의 pH에서 완충액으로 평형화된다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 칼럼은 약 4.5 내지 약 5.5의 pH에서 완충액으로 평형화된다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 칼럼은 대략 1mS/㎝ 내지 대략 30mS/㎝의 전도성 값까지 평형화된다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 칼럼을 위한 상기 pH, 염 농도 및 전도성 조건들은 상기 전기음성의 다공성 입자들과 상기 샘플로부터의 성분들 사이의 정전기적 상호작용들이 상기 폴리뉴클레오티드 보다 실질적으로 현탁되도록 선택된다. 상기 평형 완충액이나 상기 용리 완충액을 위한 상기 pH, 염 농도 및 전도성 조건들은 상기 전기음성의 다공성 입자들과 상기 샘플로부터의 성분들 사이의 정전기적 상호작용들이 상기 원하는 단백질보다 실질적으로 현탁되도록 본 발명의 특정 실시예들에서 선택될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 평형화된 칼럼의 전도성은 약 0.1mS/㎝ 내지 약 15mS/㎝이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 칼럼은 상기 용리물에 대해 수행되는 후속하는 정제 단계를 위한 상기 샘플 정제 조건들에서 또는 가까운 조건들까지 평형화될 수 있다.

특정 실시예들에 있어서, 상기 샘플 조건들은 대략 3의 pH 내지 대략 10의 pH의 범위가 될 수 있다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 샘플 조건들의 전도성 값은 대략 0.1mS/㎝ 내지 대략 250mS/㎝의 범위가 될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 샘플 조건들은 대략 2의 pH 내지 대략 10의 pH의 범위가 될 수 있으며, 특정 실시예들에서, 상기 샘플 조건들의 전도성 값은 대략 0.1mS/㎝ 내지 대략 250mS/㎝의 범위가 될 수 있다.

특정 실시예들에 있어서, 상기 용리 조건들은 대략 2의 pH 내지 대략 10의 pH의 범위가 될 수 있다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 샘플 후에 즉시 적용되는 상기 완충액의 전도성은 대략 0.1mS/㎝ 내지 대략 250mS/㎝의 범위가 될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 샘플 후에 즉시 적용되는 상기 완충액의 전도성은 상기 샘플 또는 상기 평형 완충액보다 낮은 전도성을 가진다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 샘플 후에 즉시 적용되는 상기 완충액의 전도성은 상기 샘플 또는 상기 평형 완충액보다 높은 전도성을 가진다.

특정 실시예들에 있어서, 상기 칼럼 평형 완충액은 추가되는 염이 없이 20mM 또는 그 이하의 아세트산 농도에 의해 매개되는 바와 같이 약 5.0의 pH 및 1mS/㎝ 보다 작은 전도성이 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 아세트산염(acetate)의 농도는 약 20mM 내지 약 50mM의 범위에 있을 수 있다.

특정 실시예들에 있어서, 상기 샘플 후에 즉시 적용되는 상기 완충액은 상기 평형 완충액과 동일한 조성을 가질 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 샘플 후에 즉시 적용되는 상기 완충액은 평형 완충액과 다른 조성을 가질 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 샘플 후에 즉시 적용되는 상기 완충액은 상기 음으로 대전된 입자들에 결합될 수 있는 양으로 대전된 물질들의 제거의 목적으로 상기 평형 완충액 보다 훨씬 높은 전도성이 될 수 있다.

특정 실시예들에 있어서, 과잉의 염 또는 다른 첨가제들이 후속하는 사용 사이클을 위한 준비에서 상기 칼럼을 세정하도록 상기 샘플 내에 포함될 수 있다. 이러한 첨가제들이 또한 상기 기술에 의해 구현되는 순도의 정도를 증가시키거나 및/또는 응집체 감소의 결과로 상기 폴리뉴클레오티드와 오염물 종들 사이의 비특이적 상호작용들을 해리시키는 유익한 효과를 중재할 수 있는 점이 이해될 것이다.

특정 실시예들에 있어서, 상기 음으로 대전된 다공성 입자들은 양이온 교환 입자들이다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 양이온 교환 입자들은 카르복시기, 술포기, 포스포기, 이미노디아세트산기 또는 니트롤아세트산기와 같은 모이어티에 의해 부분적으로 부여되는 전기음성도를 가진다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 칼럼은 상기 전기음성의 다공성 입자들 이외의 입자들을 함유한다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 전기음성의 다공성 입자들 및 상기 추가적인 입자들의 적어도 하나는 양이온 교환, 소수성 상호작용들, 수소 결합, pi-pi 상호작용들 및 금속 킬레이트화로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 이차 화학적 작용기들을 가진다.

특정 실시예들에 있어서, 상기 기술은 상기 입자들의 기공들 내에 대전된 기들의 치밀한 네트워크를 생성하는 이른바 크라프트된 리간드들(grafted-ligands)을 이용하므로, 상기 네트워크가 강한 양 전하가 결핍된 용질들의 진입을 물리적으로 방해하거나 방지한다.

특정 실시예들에 있어서, 상기 기술은 폴리뉴클레오티드의 진입을 효과적으로 방지하는 기공 사이즈를 갖는 음으로 대전된 다공성 입자 크로마토그래피 배지들을 사용한다. 폴리뉴클레오티드 입자들의 엔트리를 방지하는 데 유용한 예시적인 기공 사이즈들은 상기 폴리뉴클레오티드의 사이즈에 따라 이들 사이의 임의의 값들 및 부분들을 포함하여 약 10㎚ 내지 약 100㎚의 범위를 가진다. 해당 기술 분야의 숙련자는, 제한되지는 않지만, 1㎚, 2㎚, 3㎚, 4㎚, 5㎚, 6㎚, 7㎚, 8㎚, 또는 9㎚를 포함하여 10㎚ 보다 작은 기공 사이즈들도 적용될 수 있는 점을 인식할 수 있을 것이다. 마찬가지로, 해당 기술 분야의 숙련자는 또한, 제한되지는 않지만, 이들 사이의 임의의 값들 및 부분들을 포함하여 120㎚, 150㎚, 200㎚, 300㎚ 및 500㎚,을 포함하는 100㎚ 보다 기공 사이즈들도 적용될 수 있는 점을 인식할 수 있을 것이다. 해당 기술 분야의 숙련자들은 정제되는 상기 폴리뉴클레오티드에 기초하는 상기 기공 사이즈의 적절한 선택을 인식할 수 있을 것이다. 이와 같은 다공성 입자들은 전체 샘플 부피 또는 이의 임의의 보다 작은 부분을 구성할 수 있다.

특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 샘플을 상기 칼럼과 접촉시키는 단계 이전에 상기 샘플을 해리 작용제와 접촉시키는 추가적인 단계를 제공한다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 해리 작용제는 염, 유기 용제, 유기 중합체, 수소 결합 디스럽터(disruptor), 카오트로프(chaotrope), 계면활성제, 또는 킬레이트화제(chelating agent)가 될 수 있다.

특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 샘플을 상기 칼럼과 접촉시키는 단계 이전에 상기 샘플을 하나 또는 그 이상의 해리 작용제와 접촉시키는 추가적인 단계를 제공한다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 해리 작용제들은 다음 클래스들의 해리 작용제의 하나 또는 다른 클래스들로부터의 제제들의 결합의 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 클래스들은, 예를 들면, 염, 유기 용제 혹은 유기 중합체, 수소 결합 디스럽터, 카오트로프, 계면활성제, 또는 킬레이트화제를 포함한다.

이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 해리 작용제는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리부틸렌 글리콜(polybutylene glycol)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 비이온성 유기 중합체이다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 해리 작용제는 대략 500D 또는 그 이하의 평균 분자량을 가진다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 해리 작용제는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 디메틸술폭시드, 에탄올 및 글리세롤로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 유기 용제이다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 해리 작용제는 대략 1%(w/v) 또는 그 이상의 농도에서 제공된다.

특정 실시예들에 있어서, 상기 해리 작용제는 트윈(Tween), 트리톤(triton), 챕스(CHAPS), 챕소(CHAPSO) 및 옥틸 글루코시드(octyl glucoside)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 계면활성제 이다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 계면활성제는 대략 1%(w/v) 또는 그 이하의 0이 아닌 농도에서, 또는 대략 0.1%(w/v) 또는 그 이하의 0이 아닌 농도에서 제공된다.

특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 샘플을 상기 칼럼과 접촉시키는 단계 이전에 불용성 고체들을 제거하는 추가적인 단계를 포함하는 방법들을 제공한다.

특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 샘플이 하나 또는 그 이상의 오염물들을 포함하고, 여기서 상기 방법의 수행의 결과도 야기되는 상기 폴리뉴클레오티드가 상기 샘플에 비하여 이러한 오염물들의 감소된 함량을 갖는 방법들을 제공한다. 예를 들면, 상기 오염물이 단백질인 일부 실시예들에 있어서, 상기 단백질 농도는 10-폴드(fold) 이상, 또는 20-폴드 이상, 또는 50-폴드 이상, 또는 90-폴드 이상, 또는 95-폴드 이상으로 감소될 수 있다.

특정 실시예들에 있어서, 분류되지만 여전히 정제되지 않은 샘플은 본 발명을 실행하기 전에 높은 산성 오염물들을 청소하는 목적을 위하여 상기 폴리뉴클레오티드가 이들 입자들에 의해 실질적으로 결합되지 않는 조건들 하에서 음으로 대전된 입자들에 노출됨에 의해 상태가 조절된다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 음으로 대전된 입자들은 예를 들면, 상기 전체 샘플 부피의 약 2-5%(v：v)의 양으로 상기 샘플에 직접 첨가된다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 상기 음으로 대전된 입자들은 소수성 상호작용들이나 금속 배위에 참가하는 능력과 같은 이차적인 기능성들을 포함한다. 이러한 실시예들에 있어서, 이러한 실행은 상기 폴리뉴클레오티드와 본 발명을 실행하는 데 사용되는 음으로 대전된 칼럼 포장된 입자들의 상호작용을 간섭할 수 있는 샘플 구성 성분들을 제거함에 의해 본 발명의 수행을 개선하는 점이 이해될 것이다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 이와 같은 처리는 초미세여과에 의한 상기 폴리뉴클레오티드의 농축 이전에 일어난다. 다른 이러한 실시예들에 있어서, 이와 같은 처리는 연관된 초미세여과 단계 없이 일어날 수 있다. 다른 이러한 실시예들에 있어서, 이러한 처리는 초미세여과에 의한 상기 폴리뉴클레오티드의 농축 이후에 일어난다. 첫 번째 경우에 있어서, 이는 상기 초미세여과 단계의 성능을 잠재적으로 개선시키는 것으로 이해될 수 있다. 마지막 경우에 있어서, 이는 상기 처리 프로세스의 부피와 강한 산성 오염물들을 청소하기 위해 요구되는 음으로 대전된 입자들의 부피를 감소시키는 것으로 이해될 것이다. 어떤 경우에서도, 중간 단계가 본 발명에 의한 처리 이전에 상기 입자들을 제거하기 이전에 추가될 수 있다.

특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 바람직하게는 본 발명의 방법의 수행을 위해 편리한 양들 및 농도들로 본 발명의 수행을 위해 필요한 물질들의 일부 또는 전부를 포함하는 본 발명의 방법의 편리한 실행을 위한 키트(kit)를 제공한다. 이와 같은 키트들은 또한 상기 키트 내에 제공되는 물질들의 사용을 위한 지시들을 포함할 수 있다.

다음의 용어들은 본 발명을 보다 용이하게 이해하도록 정의되는 것이다. 추가적인 정의들은 상세한 설명을 통해 설시된다.

"칼럼 평형(column equilibration)"은 크로마토그래피 배지로 포장된 칼럼 내의 원하는 완충액의 안정하고 균등한 분포의 구현하는 것을 언급한다. 평형에 있어서, 칼럼 유출구에서 측정된 용리액(eluent)의 상기 pH, 전도성 및 UV 흡수는 상기 칼럼의 유입구에서 도입되는 용리액과 실질적으로 동일하다.

"칼럼 부피(column volume)"는 칼럼으로 호칭되는 대체로 실린더형 장치 내의 포장된 입자들의 전체 부피를 언급한다. 칼럼 부피라는 용어는 일반적으로 세 부분들로 구성된 이른바 전체 칼럼 부피에 대응되는 것으로 이해되며, 이들은 보이드(void) 부피로 알려진 입자간 공간들, 기공 부피로 알려진 상기 기공들 내부의 부피 그리고 매트릭스(matrix) 부피로 자주 언급되는 상기 입자의 고체 매트릭스에 의해 점유되는 부피이다.

"전도성 값(conductivity value)"은 전기를 전도하는 전해질 용액의 능력을 언급하는 것이다. 전해질의 용액의 전도성은, 예를 들면, 고정된 거리로 이격되는 두 전극들 사이의 용액의 저항을 결정하여 의해 측정될 수 있다. 전도성 값들은 대부분 공통적으로 ㎝ 당 밀리지멘스(mS/㎝)로 표현된다.

"오염물(contaminant)"은 원하는 폴리뉴클레오티드의 순도를 감소시키는 임의의 원하지 않는 유기 또는 유기 실체(entity)를 언급한다. 오염물들은 폭넓게 다양한 조건들에 대해 안정한 상태로 남아 있는 폴리뉴클레오티드와 연관체를 형성할 수 있는 실체들을 포함한다. 본 발명의 방법들은 폴리뉴클레오티드를 연관된 오염물로부터 회수하도록 이러한 응집체들의 해리를 구현을 제공할 수 있다. 예시적인 오염물들은 특히 단백질들뿐만 아니라, 폴리뉴클레오티드, 세포 구성 성분들, 세포 배양 배지들 및 유사한 것들을 포함한다.

"전기음성의 다공성 입자(electronegative porous particle)" 또는 "음으로 대전된 다공성 입자(negatively charged porous particle)"는 대체로 구형이거나 그렇지 않을 수 있으며, 임의의 사이즈의 기공들을 가질 수 있는 불용성 고체를 언급한다. 선택적으로 입자들은 10미크론 이하로부터 100미크론 이상의 범위의 크기가 될 수 있고, 평균 기공 사이즈는 10㎚(미세다공성) 이하로부터 100㎚(거대다공성) 이상의 범위가 될 수 있다. 입자의 전기음성도는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 약한 음이온 교환기들, 카르복시(carboxyl) 또는 인(phosphor) 기들, (sulfo groups)과 같은 강한 음이온 교환기들, 또는 네트(net) 음전하를 갖는 다중 모드의 모이어티(moiety)들, 또는 이들의 결합들을 포함하는 화학 기들에 의해 부여될 수 있다. 음으로 대전된 표면상에 다중 모드의 특성체를 생성하는 이차 작용기들은 음으로 또는 양으로 대전된 기들, 소수성기들, pi-pi 결합기들, 수소 결합기들, 또는 금속 킬레이트화(chelation)기들로 구성될 수 있다. 상기 이차 작용기들은 제조 물질들의 의도하지 않은 부산물로서 또는 입자들이 합성되는 공정에 의해 전기음성 입자들 상에 존재할 수 있거나, 이들은 세심한 설계에 의해 존재할 수 있다. 상기 이차 작용기들의 농도는 입자들의 mL 당 1밀리당량(milliequivalent) 이하로부터 mL 당 100밀리당량 이상의 범위가 될 수 있다. 상기 전기음성 다공성 입자라는 용어는 양이온 교환체들로 언급되는 상업적인 다공성 입자 크로마토그래피 물질들을 포함하며, 전기음성인 이른바 혼합 모드 크로마토그래피 물질들을 포함할 수 있다.

"입자간 부피(inter-particle volume)" 또는 "보이드 부피(void volume)"는 상기 입자들 자신들에 의해 점유되지 않는 상기 입자들 사이의 공간인 칼럼 내의 부피를 언급한다. 이는 흔히 칼럼의 보이드 부피로 언급된다. 유사한 크기들을 갖는 대략적으로 구형인 입자들에 대하여, 상기 보이드 부피는 상기 입자들이 중력에 의해 고정되고 기계적인 수단에 의해 물리적으로 압축되지 않을 때에 약 40%의 통상적으로 이들 입자들을 구비하는 포장된 칼럼으로 구성된다.

" 공극 부피(pore volume)"는 다공성 입자들의 기공들 내의 부피를 언급한다. 상기 기공들은 상기 기공 벽들 상에 주로 분산되는 양으로 대전된 기들로 물리적으로 방해받지 않을 수 있거나, 상기 기공들 내에 머무르는 중합체들의 네트워크상에 또는 내부에 분산되는 양으로 대전된 기들로 부분적으로 방해받을 수 있다. 상기 기공들이 부분적으로 방해받을 경우, 명백한 방해의 정도는 상기 항체나 다른 샘플 구성 성분들의 전하 특성들과 함께 및/또는 pH 및 전도성과 같은 완충액 조건들의 함수로서 변화될 수 있다.

"비이온성 유기 중합체(non-ionic organic polymer)"는 자연적으로 생성되거나, 대전된 기들이 결핍된 결합된 반복되는 유기 서브유닛들로 구성된 합성 탄화수소를 언급한다. 이는 선형이 될 수 있거나, 일부 가지들을 구비하는 주로 선형이 될 수 있거나, 주로 분기될 수 있다. 본 발명의 실행에 적합한 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리비닐피르롤리돈(polyvinylpyrrolidone: PVP)을 포함한다. PEG는 HO-(CH₂-CH₂-O)_n-H의 구조식을 가진다. 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 100달톤(dalton) 이하로부터 1000달톤 이상의 범위의 평균 중합체 분자량을 갖는 조성물들을 포함한다.

"해리 작용제(dissociating agent)"는 정제되는 폴리뉴클레오티드로부터 오염물들의 해리를 증진시키는 오염의 감소에 도움이 되도록 감소시키거나 다른 시약들과 함께 감소시키는 유기 또는 무기 화합물을 언급한다. 유기 해리 작용제들은, 제한되지는 않지만, 다른 것들 중에서 우레이드들(ureides), 아미노산들, 비이온성 유기 중합체들, 유기 용제들, 킬레이트화제들(chelating agents) 및 계면활성제들을 포함할 수 있다. 무기 해리 작용제들은 특히 염들을 포함한다.

"유기 용제(organic solvent)"는 액체 상태로 존재하는 자연적으로 생성되거나 합성의 유기 화합물을 언급한다. 본 발명을 실행하기 데 적합한 예들은 , 이에 한정되는 것은 아니지만. 에틸렌 글리콜(ethylene glycol), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 글리세롤(glycerol), 디에틸 술폭사이드(dimethyl sulfoxide), 에탄올(ethanol) 및 페녹시에탄올(phenoxyethanol)을 포함한다.

"폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 사슬 내에 공유 결합으로 결합되는 다중의 뉴클레오티드 모노머들로 구성되는 생체 고분자를 언급한다. DNA(디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid)) 및 RNA(리보핵산(ribonucleic acid))는 폴리뉴클레오티드들의 예들이다. 폴리뉴클레오티드들의 예들은, 제한되지는 않지만, 게놈(genomic) DNA, cDNA, 이중 가닥 DNA(dsDNA), 단일 가닥 DNA(ssDNA), 전령(messenger) RNA(mRNA), 짧은 간섭(short interfering) RNA(siRNA), 미이크로(micro)RNA(miRNA) 및 유사한 것들을 포함한다. 폴리뉴클레오티드들은 수소 결합의 형성에 대한 높은 경향을 가질 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드들은 본 발명에 의해 처리될 수 있는 임의의 사이즈들과 구성들의 범위 내에서 발생될 수 있다.

폴리뉴클레오티드들은 또한 티오인산염(thiophosphate) 백본(backbone)과 같은 비천연의 백본 또는 비천연의 염기들에 포함되는 것들을 포함하는 비천연의 폴리뉴클레오티드들을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드들은 또한 펩티드 핵산들(PNA)을 포함할 수 있다.

"단백질(protein)"은 탄소, 수소, 산소, 질소 및 통상적으로 황을 포함하고, 펩티드 결합들에 의해 연결된 아미노산들의 하나 또는 그 이상의 사슬들로 주로 구성되는 복합 유기 거대분자들의 그룹의 임의의 것을 언급한다. 상기 단백질은 천연 또는 재조합 기원일 수 있다. 단백질들은 글리코실화(glycosylation), 페길레이션(pegylation), 또는 컨주게이션(conjugation)을 통하는 바와 같이 비아미노산 모이어티들 또는 다른 화학적 모이어티들과 결합하여 변형될 수 있다. 단백질들의 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만 항체들, 응혈 인자들(clotting factors), 요소들 및 펩티드 호르몬들을 포함한다.

"폴리뉴클레오티드(polynucleotide preparation)"는 세포를 함유하는 세포 배양 수확물, (실질적으로)세포가 없는 세포 배양 상층액 또는 정제의 단계로부터의 관심의 대상인 폴리뉴클레오티드를 함유하는 용액과 같은 임의의 수성 또는 대부분이 수성인 관심의 대상인 폴리뉴클레오티드를 언급한다.

"샘플 적용 조건(sample application condition)"은 상기 원하는 단백질을 함유하는 상기 샘플이 어떻게 적용되는 지를 언급하며, 예를 들면, 샘플 농도, 용리액 전도성, pH 및 유사한 것들을 포함한다. 상기 샘플 적용 조건은 일반적으로 정제를 확보하기 위해 상기 칼럼이 평형화되는 조건들로 선택될 수 있거나, 이러한 조건들과 다를 수 있다.

"고체 물질(solid material)"은 미립자, 결정, 중합체, 섬유, 다공성 중공형 섬유, 모놀리스 또는 멤브레인 성질이 될 수 있는 불용성 유기 고체를 언급한다. 이는 비다공성 또는 다공성 입자들, 다공성 멤브레인, 다공성 필터 또는 다공성 모놀리스로 구성될 수 있다. 미립자의 경우, 상기 입자들은 대체로 구형이거나 그렇지 않을 수 있으며, 100㎚ 이하로부터 100미크론 이상의 범위의 사이즈를 가질 수 있다. 다공성 입자들의 평균 기공 사이즈는 약 10㎚(미세다공성) 이하로부터 약 100㎚(거대다공성) 이상의 범위가 될 수 있다. 상기 멤브레인들 내의 평균 기공 사이즈는 100㎚ 이하로부터 1미크론 이상의 범위가 될 수 있다. 멤브레인들 또는 모놀리스들 내의 평균 채널 사이즈는 1미크론 이하로부터 10미크론 이상의 범위가 될 수 있다. 상기 고체 물질은, 예를 들면 입자들이 그물 형상의 매트릭스 내에 내장되거나, 멤브레인들 사이에 끼이거나, 이들 모두가 될 수 있는 화합물 구조체들로 더 구성될 수 있다.

"계면활성제(surfactant)"는 이들을 양쪽 친매성으로 언급되게 하는 소수성 부분 및 친수성 부분을 일반적으로 포함하는 유기 분자들의 부류로서 "표면 활성제들(surface active agents)"을 포함한다. 수성 용액들 내의 충분한 농도들에서, 계면활성제들은 물과의 접촉을 최소화하도록 중심에 집중되는 소수성 부위들 및 물과의 접촉들 최대화하도록 외측으로 방사되는 친수성 부위들을 갖는 클러스터들 내로 자기 연관될 수 있다. 특히 이들이 소수성 특성체를 가지거나 소수성 특성체의 영역들을 소유하는 물질들을 함유하는 생리적 조제물들의 존재에서, 상기 계면활성제들의 소수성 부분은 상기 물질의 일부 소수성 부분들과 자발적으로 연관되는 경향이 있고, 상기 계면활성제의 친수성 부분의 영향을 통해 이들의 용해도를 증가시킨다. 이들은 또한 수성 용액에 모두 용해되는 상이한 소수성 물질들 사이에 일어나는 소수성 상호작용들을 완화시키는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시예들을 수행하기 위해 적합한 계면활성제들의 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 폴리소르베이트(polysorbate) 계면활성제들(예를 들면, 트윈(Tween) 20, 폴리옥시에틸렌(polyoxyethylene)(20) 소르비탄 모노로레이트(sorbitan monolaurate) 및 트윈 80, 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올리에이트(sorbitan monooleate)) 및 트리톤(Triton)(예를 들면, 폴리에틸렌글리콜 p-(1,1,3,3-테트라메틸부틸(tetramethylbutyl))-페닐 에테르(phenyl ether))와 같은 비이온성 계면활성제들 그리고 CHAPS (3-[(3-클로라미도프로필(colamidopropyl))디메틸암모니오(dimethylammonio)]-1-프로판술포네이트(propanesulfonate)), CHAPSO (3-[(3-클로라미도프로필(cholamidopropyl))디메틸암모니오(dimethylammonio)]-2-하이드록시(hydroxy)-1-프로판술로네이트(propanesulfonate)) 및 옥틸 글루코시드(octyl glucoside)(예를 들면, (2R,3S,4S,5R,6R)-2-(하이드록시메틸(hydroxymethyl))-6-옥톡시옥산(octoxyoxane)-3,4,5-트리올(triol))과 같은 양성 이온성 계면활성제들을 포함한다.

"우레이드(ureide)"는 하나 또는 그 이상의 요소 모이어티들 또는 이의 유도체들을 포함하는 천연 또는 합성 기원의 고리형이나 비고리형 유기 분자를 언급한다. 특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 요소, 요산, 히단토인(hydantoin), 알란토인(allantoin)(CAS 번호 97-59-6; 알클록사(alcloxa), 알디옥사(aldioxa), 헤모카인(hemocane), 우레이도히단토인(ureidohydantoin), 5-우레이도히단토인, 글리옥실우레이드(glyoxylureide), 글리록실산 디우레이드(glyoxylic acid diureide), 2,5-디옥소(dioxo)-4-이미다졸리디닐(imidazolidinyl) 요소, 푸린들(purines) 그리고 이들의 유도체들과 같은 우레이드들을 제공한다. 특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 R-CO-NH-CO-NH₂ 또는 R-CO-NH-CO-NH-CO-R' 혹은 R'R''NH-CO-NR'''R''''의 화학식의 유기 분자들을 제공하며, 여기서 관련된 "R-기들"은 H 또는 임의의 유기 모이어티가 될 수 있다.

"보이드 배제(void exclusion)"는 정전기적으로 대전된 입자로 포장된 칼럼의 환경 내부의 상기 샘플의 적어도 하나의 성분이 정전기적으로 쫓겨나는 결과로서 상기 칼럼 베드의 입자간 공간 내에 실질적으로 마무르는 것이 제한되거나 및/또는 상기 입자들 내에 마무르는 기공들의 고유의 치수에 의해 부여될 수 있거나 정전기적 전하들이 상기 기공들 내부에 존재하는 물리적인 포맷에 의해 이차적으로 부여될 수 있는 상기 기공 진입에 대한 물리적인 저항을 극복할 수 있는 화학적 상호작용들을 언급한다.

"보이드 배제 모드(void exclusion mode)" 또는 "보이드 배제 크로마토그래피(void exclusion chromatography)"는 정전기적으로 대전된 입자들로 포장된 칼럼들 내에서 실행되는 분별 방법을 언급하며, 이에 따라 상기 칼럼에 적용되는 상기 샘플 부피가 상기 포장된 베드 내부의 입자간 부피 보다 크지 않고, 단백질과 같은 원하지 않는 샘플 구성 성분이 상기 입자들의 기공들로 들어갈 수 없으며, 이에 따라 상기 보이드 부피로서도 통상적으로 알려진 상기 입자간 공간을 통해 진행하는 것이 제한된다. 보이드 배제 크로마토그래피의 기본적이고 구분되는 특징은 상기 샘플이 상기 샘플 조건들이 정전기적으로 대전된 입자들에 대해 크로마토그래피를 수행하기 위해 부적합한 것으로 간주되는 극히 높은 염 농도들 및 pH 값들을 포함할 수 있는 결과로서 상기 칼럼 작동 조건들까지 평형화될 필요가 없는 점이다. 보다 기본적이고 구별되는 특징들은 분별과 함께 완충액 교환을 구현하는 이의 독특한 능력을 포함한다. 보이드 배제 크로마토그래피에 있어서, 상기 칼럼에 적용되는 상기 샘플 조성과 독립적으로 상기 칼럼이 평형화되는 상기 완충액 내의 원하는 단백질이 용리된다.

특정 실시예들에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 샘플 적용 이전에 상기 칼럼이 평형화되는 동일한 완충액 내에 용리될 수 있다. 이러한 실시예들에 있어서, 본 발명은 다른 방법들에 의한 후속하는 처리들을 위한 보다 안정한 제형에 대한 이의 초기 제형으로부터 상기 샘플이 머무르는 상기 완충액을 교환하는 목적을 위해 사용될 수 있는 이점을 제공할 수 있다. 상기 샘플이 초기에 머무르는 상기 완충액의 조성은 상기 폴리뉴클레오티드를 손상시키는 것을 방지할 필요를 제외하면 제한되지 않지만, 상기 칼럼 평형 완충액의 조성은 상기 음으로 대전된 입자들에 상기 폴리뉴클레오티드의 실질적인 비율이 결합되는 것을 야기하기에 충분한 레벨에서 상기 폴리뉴클레오티드 상에 양 전하를 생성하지 않는 범위 내에 있어야 한다. 적절한 평형 조건들은 음으로 대전된 다공성 입자들 및 특정 폴리뉴클레오티드의 특정한 특성들의 선택에 따라 변화된다. 일반적으로, 칼럼 평형 조건들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 0.1mS/㎝ 이하 내지 30mS/㎝ 이상의 전도성 값들 및 4.0 이하 내지 9.0 이상의 pH 값들의 범위가 될 수 있다.

기술의 목적이 오염 레벨들을 감소시키는 것인 특정 실시예들에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 상기 음으로 대전된 입자들에 실질적으로 결합되기 않게 하는 가장 낮은 pH 및/또는 가장 낮은 전도성을 적용하는 것이 유리하게 될 것이다. 가장 낮은 pH 및/또는 가장 낮은 전도성의 가이드라인들은 상기 항체의 용해도와 안정성 요구 사항들에 따라 완화될 수 있는 점이 이해될 것이다.

전기음성의 입자들이 추가적인 화학적 작용기들을 담당하는 특정 실시예들에 있어서, 상승된 pH 값들을 적용하거나 상기 방법을 실행하기 위해 상기 입자들의 표면과 상기 폴리뉴클레오티드의 상호활성을 완화시키는 첨가제들을 포함하는 것이 필요하거나 유리할 수 있다. 가장 간단한 이러한 변경은 NaCl 또는 다른 염들을 첨가하는 것이 될 수 있다. 가장 효과적인 레벨은 25mM, 50mM, 100mM, 200mM 등과 같이 NaCl 농도의 다른 증가분들을 평가하여 실험적으로 결정될 수 있다. 효과적인 범위가 결정되면, 이는 보다 미세한 증가분들로 수행되는 후속하는 실험들로 또는 이른바 실험 계획(DoE)과 같은 통계적인 방법들에 의해 정제될 수 있다. 선택적인 염들도 고려될 수 있을 뿐만 아니라 다른 것들 중에서 당들, 카오트로프들, 유기 용제들 및 계면활성제들을 포함하는 다른 첨가제들도 고려될 수 있다. 다양한 pH 값들과의 결합을 포함하여 첨가제들의 결합들도 평가될 수 있다.

특정 실시예들에 있어서, 상기 칼럼 내부에 머무르는 상기 음으로 대전된 입자들은 다공성 및 비다공성 입자들의 결합들, 또는 다공성 입자들과 다른 기공 사이즈들의 결합들을 포함하는 단일 유형 또는 다중 유형들이 될 수 있다. 본 발명이 입자들과 다른 사이즈들의 기공들의 결합을 채용할 경우, 입자들의 하나의 서브세트(subset)는 물리적으로 항체를 배제하는 사이즈의 기공들을 포함할 수 있는 반면, 다른 서브세트는 폴리뉴클레오티드를 배제하지 않는 기공 사이즈를 가질 수 있다. 이와 같은 경우에 있어서, 폴리뉴클레오티드를 배제하지 않도록 충분히 큰 기공들을 갖는 서브세트는 강한 양 전하가 결핍된 폴리뉴클레오티드에 의한 기공 진입을 물리적으로 방해하는 방식으로 리간드를 제공할 수 있다.

특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 원료 샘플들로부터 또는 정제의 임의의 단계에서 폴리뉴클레오티드의 초기 분별을 위해 이용될 수 있으며, 어느 경우에라도 본 발명이 특정한 폴리뉴클레오티드 적용을 위해 요구되는 정제의 전체적인 정도를 구현하도록 다른 정제 방법들과 결합될 수 있는 점이 예시된다.

특정 실시예들에 있어서, 상기 도입되는 샘플은 초미세여과에 의해 농축될 수 있다.

특정 실시예들에 있어서, 상기 샘플을 음으로 대전된 표면 또는 상기 칼럼에 대한 이의 도입 이전의 표면들에 노출시키는 것이 유리할 수 있다. 이와 같은 노출은 본 발명을 수행하는 데 사용되는 상기 칼럼을 더럽히는 경향이 있을 수 있는 매우 전기양성인 샘플 성분들을 제거하는 것으로 이해되지만, 또한 폴리뉴클레오티드의 손실 없이 더럽히는 제제들을 제거하는 특별한 조건들의 개발을 요구할 것으로 이해된다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드의 결합을 방지하기에 충분하지만 상기 폴리뉴클레오티드가 생성되는 숙주 세포들(host cells)로부터 폴리뉴클레오티드 압축 단백질들의 결합을 제거하기에는 충분하지 않은 염을 추가하는 것이 필요할 수 있다. 본 발명을 실행하기 이전에 상기 샘플이 노출되는 상기 음으로 대전된 표면들은 입자들, 멤브레인들, 섬유들, 모놀리스들 또는 화합물 구조체들을 포함할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 보이드 배제 크로마토그래피 모드에 적용되는 전기음성 크로마토그래피 배지들은 양이온 교환체들, 금속 친화 배지들 및 다중 모드 크로마토그래피 배지들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하며, 이의 특정한 예들은 Uno스피어(sphere) S 및 UNO스피어 라피드(Rapid) S; UNO스피어 프로피니티(Profinity); 캅토(Capto) MMC, 그리고 상기 방법의 실행을 위해 적합한 배지들에 기초하는 다른 전기음성의 입자를 포함한다. 그러나, 전기음성의 기들을 갖는 임의의 양이온 교환 매체들이 기여할 수 있는 일부 실시예들에 있어서, 해당 기술 분야의 숙련자들은 모든 전기음성의 배지들이 적합하지는 않은 점을 이해할 수 있을 것이다. 성공적인 배지들을 정의하는 정확한 변수들이 완전하게 기재되지는 않았지만, 해당 기술 분야의 숙련자들은 보이드 배제 음이온 교환 크로마토그래피에서 수행되는 이의 능력을 위한 임의의 특정한 전기음성 배지들을 쉽게 가려낼 수 있을 것이다. 가장 기본적인 레벨에서, 이는 후보 물질인 양이온 교환 입자들이, 예를 들면, 20mL의 부피로 상기 칼럼 내에 포장되는 간단한 실험에서 쉽게 구현된다. 상기 입자들은 이상적으로는 중력에 의해 고정될 수 있고, 이후에 유동 어댑터(flow adaptor)가 상기 베드에 접촉되지만 상당히 압축하지는 않도록 설치된다. 상기 기술은 상기 베드가 압축되었던 칼럼들에 대해 수행될 수 있지만, 압축은 상기 칼럼의 부피 샘플 용량을 감소시키는 직접적인 결과로 상기 입자간 공간을 감소시킨다. 예를 들면, 20mL의 중력 고정 베드는 약 8mL만큼 큰 샘플 부피 용량을 가질 수 있지만, 15mL의 부피까지의 상기 베드의 25% 압축은 중력 고정 베드 내의 상기 샘플 배지의 15mL의 용량 보다 낮은 레벨까지 상기 용량을 감소시킬 것이다. 실험 증거들이 이러한 개념을 지지하는 경향이 있을 경우에 이는 상기 입자 부피에 대향하여 입자간 부피를 불균형적으로 감소시키는 점을 제시한다. 상기 기술이 상기 칼럼 내의 입자간 부피 보다 크지 않은 상기 칼럼 내로 들어가는 상기 샘플의 부피에 의존하기 때문에, 상기 칼럼이 머무르는 상기 크로마토그래피 시스템은 이상적으로는 샘플이 도중에 상기 칼럼에 대한 상당한 희석을 야기하지 않는 방식으로 상기 샘플을 전달하는 방법으로 구성된다. 층류(laminar flow)는 경계들에서 상기 샘플을 희석시키는 것으로 잘 알려져 있다. 몇 미터의 길이를 갖는 5mL의 샘플 루프(loop)의 예에 있어서, 상기 칼럼으로 들어가는 경우에 상기 샘플의 부피는, 예를 들면, 7.5mL 또는 심지어 10mL 또는 그 이상까지 증가가 가능하게 상기 루프 내로 초기에 도입되는 5mL 보다 실질적으로 클 수 있다. 이른바 슈퍼루프(superloop)를 갖는 시스템들은 이들이 층류를 통한 과도한 희석의 부여 없이 큰 샘플 부피들의 적용을 허용하게 하는 실린더-플런저(cylinder-plunger) 설계에 대한 이들의 의존성에 의하여 본 발명의 수행을 위해 잘 맞게 된다. 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자들이라면 유체가 다양한 밸브들 및 혼합기들을 통과하는 결과로서 임의의 정해진 크로마토그래피 시스템도 샘플 도입 장치(인젝터)와 상기 칼럼 사이의 샘플 희석의 특정한 양을 도입하는 점과 일반적인 문제로서 특정한 시스템의 내부의 상대적으로 보자 낮은 전칼럼(pre-column) 희석 부피에 대한 상기 칼럼 부피의 보다 큰 비율이 시스템 희석의 함수로서 상기 칼럼에서의 샘플 부피를 증가시키는 점을 이해할 수 있을 것이다. 실제 기간들에서, 이는 대뷰고의 사용을 위해 설계되고 구성되는 크로마토그래피 상에서의 작은 칼럼의 작동이 상기 샘플의 부피에 대한 상기 인젝터에 적용될 수 있는 심각한 이차적인 제한들을 초래할 수 있지만, 이러한 시스템 상에서 큰 칼럼의 작동은 사용자가 상기 샘플들이 상기 칼럼으로 들어가는 시점에서 정해진 칼럼의 부피적인 한계들 내에 잔류하는 보다 큰 부피의 상기 샘플을 적용하게 하는 점을 의미한다. 암녹색 피크 튜빙(peek tubing)을 이용하고, 폴리뉴클레오티드를 함유하는 샘플이 미리 적재되었으며 상기 칼럼이 50mM 아세트산염(acetate)으로 pH 4.0로 평형화되었던 슈퍼 루프가 구비된 AKTA Explorer 100과 같은 시스템 상의 상기 20mL의 중력 팩형의 압축되지 않은 칼럼을 사용할 경우, 1mL의 샘플이 상기 칼럼 내로 적재된다. 차트 마크(chart mark)는 상기 항체가 상기 칼럼으로부터 떠나기 시작하는 시점에서 만들어진다. 다른 차트 마크는 사이 샘플과 연관된 소분자들의 통과를 나타내는 상기 전도성이 변화되는 시점에서 만들어진다. 상기 마크들 사이의 부피는 이용할 만한 상기 칼럼의 입자간 부피의 이용할 만한 추정을 제공한다. 상기 전체 칼럼 부피에 대한 상기 입자간 부피의 비율이 계산된다. 보이드 배제 양이온 교환 크로마토그래피의 기술을 위해 적합한 양이온 교환 크로마토그래피 배지들은 약 1/2.5의 비율을 나타낼 것이지만, 1/2.4, 1/2.3, 1/2.2, 1/2.1, 1/2.0 또는 그 이하의 보자 낮은 비율들을 나타내는 배지들은 상기 칼럼으로 들어가는 상기 샘플의 부피가 전술한 결과들에 따라 조절되는 조절된 부피를 초과하지 않는 한 유용한 결과들을 제공할 수 있다. 폴리뉴클레오티드로 보이드 배제 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하기 위해 정해진 음이온 교환 배지의 적합성을 경정하기 위하여 여기서 제시되는 조건들이 가장 효과적인 오염물 제거를 구현하는 필수적인 조건들이나, 모든 유형들의 폴리뉴클레오티드들에 가장 적합한 필수적인 조건들이 아닌 점이 이해될 것이다. 또한, 이들이 이른바 다중 모드 크로마토그래피로 시판되는 추가적인 화학적 작용기들을 포함하는 전기음성의 배지들이 정해진 배지가 상기 정해진 배지가 보이드 배제 모드에서 흡수 크로마토그래피를 수행하기 위해 적합한 지를 결정하는 다른 완충액 조건들의 평가를 수반하는 프로세스 개발의 추가적인 치수를 요구할 것인 점이 이해될 것이다. 하나의 예는 캅토(Capto) MMC라는 상품명으로 시판되는 이은바 혼합 모드 또는 다중 모드의 전기음성 크로마토그래피 배지를 포함하며, 이는 수소 결합들 및 소수성 상호작용들에 참가하게 하는 작용기들을 포함하는 것을 호칭한다.

본 발명의 추가적인 목적들과 이점들은 다음의 설명들에서 부분적으로 설시될 것이며, 이러한 설명들로부터 부분적으로 명백하게 되거나, 본 발명을 수행함에 의해 알 수 있을 것이다. 본 발명의 목적들과 이점들은 특허청구범위에 명시되는 요소들 및 결합들에 의해 구현되고 수득될 것이다.

전술한 일반적인 기재와 다음의 상세한 기재는 단지 예시적이고 설명적인 것이며, 청구된 본 발명을 제한하는 것은 아닌 점이 이해될 것이다.

본 발명의 특정 실시예들을 이용하는 제조에 있어서, 상기 칼럼에 대해 사용 가능한 샘플 부피가 결정되어야 한다. 상기 칼럼 내의 모든 입자들이 음으로 대전된 다공성 입자들인 이의 가장 간단한 모드에 있어서, 이와 같은 값은 이러한 값은 압축되지 않은 중력으로 고정된 팩형 크로마토그래피 베드의 전체 부피에 0.4를 곱하여 계산될 수 있다. 허용 가능한 최대 샘플 부피는 상기 칼럼이 적정한 pH에서 고농도의 염 완충액까지 평형화되는 간단한 실험에 의해 정확하게 결정될 수 있고, 저농도의 염 완충액 내의 폴리뉴클레오티드의 샘플이 적용되며, 이후에 추가적인 평형 완충액이 수반된다. 280㎚에서의 UV 흡수의 증가로 나타나는 바와 같이 폴리뉴클레오티드가 용리되기 시작하는 시점이 표기된다. 전도성의 증가로 나타나는 바와 같이, 상기 고농도의 염이 용리되기 시작되는 시점이 표기된다. 상기 표기들 사이의 부피는 상기 칼럼을 위한 사이클 당 최대 샘플 부피를 나타낸다.

다공성의 전기음성 입자들 외의 추가적인 입자들(이차적인 화학적 표면들을 담당하는 것들과 같은)을 포함하는 칼럼들에 대한 본 발명의 특정 실시예들의 수행을 위한 적합한 샘플 부피들은 상기 음으로 대전된 다공성 입자들만의 부피를 곱하여 계산될 수 있다. 상기 실험은 상기 최대 샘플을 구체적으로 정의하는 데 적용될 수 있다. 혼합된 음의 및 다른 입자들의 정해진 칼럼을 위한 상기 최대 샘플 부피가 음성이 아닌 입자들에 의해 점유되는 상대적인 칼럼 부피에 비례하여 배타적으로 음성인 다공성 입자로부터 감소될 것인 점도 명백할 것이다.

특정 실시예들에 있어서, 특정한 폴리뉴클레오티드 의 정제를 위한 방법의 개발은 가장 간단한 옵션의 평가로 시작될 것이며, 이는 음으로 대전된 다공성 입자들로 배타적으로 포장된 칼럼이 될 것이다. 적절한 입자들은 이른바 음이온 교환 크로마토그래피의 기술을 실행하기 위해 시판되는 상업적 크로마토그래피 배지들로 구성될 수 있다. 수십 가지의 이러한 제품들의 예들은, 캅토(Capto) S, 캅토 CM, 캅토 MMC, S 세파덱스(Sephadex), CM 세파덱스(GE 헬스케어(Healthcare)); 기가캡(GigaCap) S 및 S-토요펄(Toyopearl)((토소 바이오세퍼레이션즈(Tosoh Bioseparations)); 마크로프렙 하이(Macroprep High)-S, UNO스피어(sphere) S, UNO스피어 래피드(Rapid) S, 누비아(Nuvia) S, 프로피니티(Profinity)(바이오-라드 라보라토리즈(Bio-Rad Laboratories)); 에쉬무노(Eshmuno) S, S 프락토겔(Fractogel)(메르크(Merck)); 그리고 S-히이퍼(Hyper)D(팔(Pall))를 포함한다. 이와 같은 제품들은 이들의 표면들 상의 이차적인 작용기들의 농도들이나, 기공 사이즈나, 배제 한계나, 이들 각각의 이들의 기능성을 향상시키는 리간드 그래프팅(ligand grafting) 방법들의 적용으로부터 야기되는 실제 기공 사이즈나, 이러한 정보들이 일반적으로 제공자로부터 사용 가능한 지의 식별에 대하여 제시된 라벨이 있지 않다. 모든 이러한 제품들이 다중의 물리적 및 화학적 작용기들을 포함하는 점 및 특정한 폴리뉴클레오티드 제조물의 정제의 정제에 고유하게 가장 적합하게 결정되는 하나 이상의 제품이 신중하게 평가되는 점이 예상되어야 한다. 일 실시예에서, 평가는 UNO스피어 S 및 UNO스피어 라피드 S, 캅토 MMC 또는 후보 물질들의 보다 작은 서브세트로 시작될 수 있다.

임의의 정해진 폴리뉴클레오티드를 위하여, 상기 칼럼이 초기에 평형화되는 pH 및 전도성 값들의 범위를 평가하는 것이 권고될 것이다. 사실상 일반적으로, 응집체 및 오염물 감소가 상기 폴리뉴클레오티드가 가용성이고 안정하게 남아 있는 가장 높은 pH 및 가장 낮은 전도성에서 최상이므로, pH 4.5의 20-50mM 아세트산염과 같은 완화된 산성의 완충액의 초기 조건들이 개시에 편리한 상태가 될 수 있다. 보다 낮고 보다 높은 pH 값들이 2.0만큼 낮거나 9.0 보다 높은 pH 값들 및 0.1mS/㎝ 이하부터 30mS/㎝ 이상의 범위의 전도성 값들로 후속하여 평가될 수 있다.

적용을 위해 적합한 상기 용리된 샘플이 다른 샘플 조제물(preparation)에 대한 요구 없이 후속하는 정제 단계에 투여될 수 있는 점은 일부 실시예들에서 조건들을 평가하는 데 유용할 수 있다. 예를 들면, 상기 용리된 샘플이 6.0의 pH에서 음이온 교환 칼럼에 후속하여 작용되는 경우, pH 6.0에서 상기 칼럼을 평형화시키는 것이 바람직할 수 있다. 상기 용리된 샘플이 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 칼럼에 후속하여 적용되는 경우, 중성의 pH를 적용하고 상기 완충액의 인산염 농도를 상기 하이드록시아파타이트 칼럼에 의해 요구되는 레벨로 설정하며, EDTA 또는 시트르산염(citrate)과 같은 킬레이트제들(chelating agent)을 생략하는 것이 적합할 수 있다. 상기 평형 완충액이 후속하는 분별 방법과의 연속성을 위해 선택되는 어떠한 경우에 있어서, 낮은 pH 및 낮은 전도성 조건들은 정제 잠재성이 본 발명의 단계에서 희생되지 않는 점이 보장되도록 여전히 일반적으로 평가될 것이다.

어떤 특정한 이론에 얽매이지 않고, 상기 방법은 샘플 조성으로부터 사실상 독립적인 것으로 여겨진다. 이에 따라, 특정 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 폴리뉴클레오티드-오염물 복합체들의 해리를 향상시키도록 개별적으로 또는 결합된 다양한 제제들을 함유할 수 있다.

상기 샘플 내의 폴리뉴클레오티드가 전술한 바와 같이 미리 해리 작용제들로 처리되었던 특정 실시예들에 있어서, 또는 상기 방법이 정제되지 않은 세포 배양 상층액의 샘플들에 대해 실행되는 경우, 상기 방법의 수행은 실질적인 이차적인 기능성들을 구현하는 음으로 대전된 다공성 입자들을 이용하여 향상될 수 있다. 예들은 이차적인 작용기들과 세심하게 결합되는 양의 전하들을 구현하는 다공성 입자 기반의 상업적 크로마토그래피 제품들을 포함할 수 있다. 이러한 배지들은 공통적으로 혼합 모드들로 언급된다. 캅토 MMC(GE 헬스케어) 및 누비아 c프라임(Prime)(바이오-라드 라보라토리즈)은 양 전하들을 소수성 상호작용들, pi-pi 결합 및 수소 결합에 참가하는 능력을 부여하는 작용기들과 결합시키는 상업적인 혼합 모드 크로마토그래피(mixed mode chromatography) 제품들의 예들이다. 유사한 결합들이 문헌들에 알려져 있으며, 추가적인 상업적 엔트리들이 예상될 수 있다. 해당 기술 분야의 숙련자에게는 상기 평형 완충액의 제형이 이차적 작용기들에 의해 유지되거나 지연되는 갓을 방지하도록 변경될 필요가 있는 점이 분명할 것이다. 캅토 MMC 및 누비아 c프라임의 경우에 있어서, 예를 들면, 양이온 교환을 위해 시판되는 크로마토그래피 배지들로 요구되는 경우 보다 높은 pH 및 보다 높은 전도성에서 작동하는 것이 필요할 수 있다. 이른바 다중 모드의 음으로 대전된 배지들의 다른 클래스는 이미노디아세트산 또는 니트릴로아세트산과 같은 이른바 고정 금속 친화 크로마토그래피(immobilized metal affinity chromatography: IMAC) 리간드들을 포함할 수 있다. 그러나, 이차적인 작용기들의 도입은 샘플 조성에 관계없이 샘플들을 수용하는 본 발명의 능력을 손상시킨다. 이는 높은 전도성들을 갖는 샘플들의 존재에서 분별을 전체적으로 분별을 구현하지 못하는 표준 통과-량 및 결합-용리 방법들로부터의 기본적이고 중요한 구별이다.

상기 샘플이 전술한 바와 같은 조성물들을 포함하는 특정 실시예들에 있어서, 다공성의 전기음성 입자들을 이차적 기능성들을 구현하는 구별되는 입자들과 결합시키고, 이들 두 가지 또는 몇몇의 입자들 유형들을 함께 동일함 칼럼 내에 포장하는 것이 선택적으로 유용할 수 있다. 이차적인 작용기들을 담당하는 입자들은 다공성 또는 비다공성일 수 있다. 전술한 바와 같이, 상기 방법은 샘플 조성과 독립적으로 남게 된다. 마찬가지로, 평형 조건들은 상기 항체와 상기 이차적 작용기들 사이의 상호작용들을 중단시키는 필요에 의해 제한될 수 있다. 예를 들면, 양 전하 작용기를 담당하는 입자들이 존재하고 특정한 폴리뉴클레오티드가가 이러한 전하들에 결합하는 강한 경향을 가질 경우, pH 및/또는 전도성을 감소시키는 것이 필요할 수 있다. 전술한 바와 같이 이러한 경우에서 바람직한 균형은 하나 또는 그 이상의 이차적인 작용기들의 포함이 보다 높은 정도의 정제를 가능하게 하는 것이다.

다공성의 전기음성 입자들이 이차적인 기능성들을 구현하는 별개의 입자들과 결합되는 특정 실시예들에 있어서, 후자는 전기음성 입자들의 베드의 상부 상에 층으로 될 수 있거나, 상기 전기음성 입자들의 칼럼의 전이나 직후에 즉시 연결될 수 있는 별개의 칼럼 내에 포장될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 다공성의 전기음성 입자들은 이차적인 기능성들을 담당하는 별개의 입자들과 혼합된다.

특정한 선택적인 실시예들에 있어서, 상기 방법은 상기 이차적인 입자들이 잠재적으로 문제가 있는 오염물들을 청소하기 전에 상기 샘플에 직접 첨가될 수 있고, 이후에 상기 입자들이 상기 부분적으로 정제된 샘플이 후에 상기 칼럼과 접촉되도록 상기 샘플로부터 분리되게 실행될 수 있다.

특정한 폴리뉴클레오티드의 정제를 최적화하기 위한 입자 혼합물들을 개발할 때, 상기 이차 작용기들은 pH 조절을 향상시키거나 및/또는 상기 칼럼을 이의 원하는 작동 pH까지 적정하는 데 요구되는 완충액 부피들을 감소시키는 이들의 능력에 따라 선택적으로 또는 추가적으로 선택될 수 있다. 예를 들면, 양이온 교환체들이 상승된 전도성에 노출될 때에 조절되지 않는 일시적인 pH를 생성하는 것으로 알려져 있다. 이들은 전도성이 감소될 때에 조절되지 않는 일시적인 pH 감소들을 생성한다. 이들 효과들의 크기들과 지속들은 단계들 사이의 전도성 차등, 상기 교환체의 전하 특성들 및 완충액 용량에 따라 변화된다. 양이온 교환체들은 동일한 문제들을 갖지만 음이온 교환체들로 일어나는 경우와 반대로 조절되지 않는 pH 도래들의 방향이다. 이차적인 전기양성의 작용기를 일차적인 전기음성의 작용기와 결합하는 것은 이에 따라 pH 도래들의 규모와 지속을 감소시킨다. 작용기들의 이상적인 혼합은 실험에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

상기 전기음성의 입자들과 구별되는 기능성들을 갖는 추가적인 입자들을 채용하고, 이들 구별되는 입자들이 상기 전기음성의 입자들 이전의 칼럼 내에 혼합되거나 포장되는 특정 실시예들에 있어서, 상기 구별되는 입자들 내의 기공들 내부로 및 외부로 폴리뉴클레오티드가 확산됨에 따라 상기 폴리뉴클레오티드의 분산의 결과로서 일어나는 샘플 부피의 증가의 이유가 되는 배타적으로 전기음성인 입자들의 칼럼에 적용될 수 있는 양으로부터의 초기 샘플 부피의 감소를 조절하는 것이 필요할 수 있다. 초기 샘플 부피의 감소의 필요한 정도는, 필요한 경우, 단일 실험에 의해 용이하게 결정될 수 있고, 여기서 기준은 상기 평형 완충액 내의 상기 폴리뉴클레오티드의 용리이다.

특정 실시예들에 있어서, 상기 방법은 상기 방법은 샘플 적용 후에 즉시 적용되는 상기 완충액의 조성에 독립적인 이의 효능으로 인하여 음으로 대전된 다공성 입자들의 다른 적용들과 구별된다. 많은 예들에 있어서, 상기 다공성 입자들에 결합된 물질들을 완전히 용리시키도록 의도되는 완충액 조성물과 함께 즉각적으로 상기 샘플 적용을 수반하는 것이 유리할 것이다. 예를 들면, 칼럼은 25mM의 아세트산염(acetate)으로, pH 4.5까지 평형화될 수 있다. 1.0M의 염화나트륨을 포함하는 pH 7.0의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포 배양 상층액이 상기 칼럼 부피의 35%까지 양의 부피에 적용되며, 이후에 2M의 염화나트륨으로 pH 8.0이 수반되었다. 상기 실질적으로 정제된 폴리뉴클레오티드가 상기 아세트산염 완충액 내에 용리되었다. 이는 상기 폴리뉴클레오티드가 전술한 바와 같이 상기 입자간 공간을 통해 배타적으로 진행하지만, 추적 완충액도 상기 입자간 공극 공간을 통해 진행해야 하기 때문에 일어난다. 이러한 접근을 만드는 특징은 이가 상기 프로세스 사이클을 단축시키는 실제적인 이익으로 상기 오염물들을 용리시키고 상기 칼럼을 동시에 세정하는 고유의 능력을 지지하는 것이며, 프로세스 시간과 물질 사용을 감소시킨다. 이는 물질 사용을 더 감소시키는 큰 칼럼에 대한 단일 사이클 보다는 작은 칼럼에 대한 다중 사이클들을 수행하는 것에 이끌리게 만든다.

특정 실시예들에 있어서, 폴리뉴클레오티드와 같은 상기 전기음성 다공성 입자들의 평균 기공 직경 보다 큰 유체역학적 사이즈를 갖는 산성의 오염물들의 유지를 향상키기는 나타난 목적을 위해, 이들이 그렇지 않으면 상기 폴리뉴클레오티드를 뒤따르는 경계에서 용리될 수 있고 잠재적으로 과도하고 불필요한 정도까지 이를 오염시킬 수 있기 때문에, 상기 샘플을 평형 완충액 또는 보다 낮은 전도성의 완충액, 예를 들면 pH 4.0의 20mM 아세트산염에 수반되게 하는 것이 유리할 수 있다. 상기 칼럼이 전기양성의 입자들의 증가분을 포함할 수 있는 정도까지, 이는 또한 전기음성의 오염물들의 제거를 향상시킬 수 있다. 낮은 전도성의 추적 완충액의 이상적인 부피는 약 50%의 상기 팩형 칼럼 부피로 개시하여 실험적으로 결정될 수 있다.

특정 실시예들에 있어서, 상기 방법은 상기 방법은 다공성 입자들에 대한 크로마토그래피를 위해 일반적으로 이용되는 경우보다 빠른 유량을 유지한다. 이는 상기 폴리뉴클레오티드가 물질 전달이 대류적인 상기 입자간 공간을 통해 배타적으로 진행하고, 이에 따라 상기 폴리뉴클레오티드의 느린 확산 상수에 의해서나 유량이나 샘플 점도에 의해 영향을 받지 않기 때문이다. 상기 방법은 50-100㎝/hr 또는 그 이하에서 수행되는 통상의 다공성 입자 크로마토그래피에 대하여 1000㎝/hr 또는 그 이상까지의 선형 유량들에서 높은 효율로 실행될 수 있다. 그러나, 300㎝/hr 이상의 유량들은 감소된 샘플 부피를 요구할 수 있다. 이는 결합되지 않은 오염물들을 위한 물질 전달이 확산적이고, 유량이나 샘플 점성의 증가로 낮은 효율을 가져오기 때문이다. 과도한 유량들은 오염물들이 상기 다공성 입자들의 기공들로 확산 평형을 구현하는 낮은 기회를 제공한다. 실험은 임의의 정해진 폴리뉴클레오티드 및 완충액 조성물들의 세트를 위한 이상적인 유량을 나타낼 것이다.

상기 전기음성의 다공성 입자들이 다른 표면 화학들을 담당하는 다공성 입자들의 칼럼 내에 결합되는 특정 실시예들에 있어서, 일반적으로 상기 전기음성 입자들만의 부피에 대한 상기 최대 샘플 부피를 기초로 하는 것이 유용할 것이다. 심지어는 이후에, 전기음성의 표면이 결핍된 입자들의 존재가 상기 칼럼 내의 상기 샘플을 희석시키는 효과를 갖기 때문에 실험적으로 최대 샘플 부피를 세심하게 결정할 수 있다.

특정 실시예들에 있어서, 전기음성도보다는 표면 화학들을 담당하는 입자들은 전기음성의 입자들의 칼럼 내에 직렬로 연결되는 별도의 칼럼 내에 포장될 수 있다. 이와 같은 구성에 있어서, 동일한 주의들이 다른 화학 입자들이 전기음성의 입자들을 갖는 동일한 칼럼 내에 혼합되는 상황에 대해 기술한 경우와 같이 작용될 수 있다.

특정 실시예들에 있어서, 여기에 개시된 방법들은 샘플 제조에 수반되는 초기 정제 단계를 위해 이용될 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 이는 중간 정제를 위해 사용될 수 있거나, 최종 정제를 위해 이용될 수 있다. 해당 기술 분야의 숙련자에게는 상기 방법이 프로세스의 최종 단계로 이용되지 않은 임의의 경우에서, 상기 방법이 오염물들의 감소와 동시에 상기 샘플을 완충액 교환하는 능력의 덕택으로 전체적인 프로세스 연속성을 용이하게 하는 능력을 가지는 점이 분명해질 것이다.

특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 다른 정제 방법들과 함께 실행될 수 있다. 구체적으로, 이는 사이즈 배제, 음이온 교환, 양이온 교환, 소수성 상호작용, 우선적 배제(preferential exclusion), 하이드록시아파타이트 또는 다른 형태들이나 혼합 모드 크로마토그래피, 혹은 바이오친화(bioaffinity) 크로마토그래피와의 임의의 결합으로 이용될 수 있으며, 또한 침전, 결정화 및 수성의 2상 분할(partitioning)의 방법들과 함께 이용될 수 있다.

상기 처리된 폴리뉴클레오티드를 얻은 후, 상기 칼럼의 내용물들은 폐기될 수 있다. 선택적으로는, 상기 칼럼은 높은 농도의 염들로 세정될 수 있고, 이후에 재평형에 의해 최초의 조건들로 회복될 수 있으므로, 이는 추가적인 사이클들을 위해 사용될 수 있다. 상기 칼럼은 또한 수산화나트륨과 같은 적절한 제제들로 위생 처리될 수 있다.

특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 처리량을 증가시키도록 기계화되고 자동화될 수 있다. 이러한 특정 실시예들에 있어서, 예를 들면, 상기 방법은 모의 실험된 이동층(moving bed) 크로마토그래피를 수행하는 데 이용되는 바와 같은 자동화된 다중칼럼 시스템을 포함할 수 있다.

실험예들

다음의 실험예들은 본 발명의 수행에 있어서의 지침을 제공한다. 실험예들은 특히 DNA의 다양한 정제들을 나타내도록 제공되지만, 해당 기술 분야의 숙련자라면 유사한 조건들과 원리들이 RNA와 다른 천연 또는 비천연의 폴리뉴클레오티드들의 정제에 적용될 수 있는 점을 인지할 수 있을 것이다. 더욱이, 해당 기술 분야의 숙련자라면 이들의 큰 불안정성으로 인하여 RNA와 같은 일부 뉴클레오티드들의 작동에 필요할 수 있는 적정한 예방 방안들을 인지할 서 있을 것이다. 이와 같은 필요한 예방 방안들은 해당 기술 분야의 숙련자들의 이해의 범주 내에 포함된다.

실험예 1

칼럼은 다공성 입자 양이온 교환 배지(누비아(Nuvia) S, 바이오-라드(Bio-Rad))로 포장되었다. 상기 칼럼은 50mM의 헤페스(Hepes)로 pH 7.0으로 평형화되었다. 포유류(중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary: CHO)) 세포들이 4M의 구아니딘(guanidine) 내에서 균질화되었다. 물리적인 잔류물들은 원심분리에 의해 침전되었다. 상기 칼럼 부피의 20%까지의 양으로 4M의의 구아니딘(guanidine) 내의 상층액이 상기 칼럼에 적용되었으며, 상기 샘플은 평형 완충액으로 추적되었다. 90% 이상의 DNA가 상기 평형 완충액 내에 용리되었다. 단백질들 및 다른 오염물들은 최초 샘플로부터의 구아니딘과 함께 후에 제거되었다.

실험예 2

연어 정자로부터의 정제된 DNA가 실험예 1에서 기술한 바와 같은 칼럼에 적용되었다. 상기 평형 완충액은 50mM의 트리스(Tris), pH 8.0이었고, 이는 상기 완충액 내에 상기 DNA의 용리를 야기하였다. 상기 용리된 DNA는 동일한 조건들까지 평형화되었던 음이온 교환 모놀리스(QA)에 직접 적용되었다. 상기 DNA는 후속하여 염 구배를 갖는 음이온 교환 모놀리스로부터 용리되었고, 약 60mS/㎝의 전도성에서 용리를 가져왔다. 이와 같은 실험예는 본 발명이 어떻게 DNA를 정제하고 단일 유닛 동작에서 후속하는 프로세스 단계를 위한 샘플을 제조하는 지에 대한 예를 나타낸다.

실험예 3

연어 정자로부터의 정제된 DNA가 실험예 2에 기술한 바와 같은 누비라 S 칼럼에 적용되었다. 상기 평형 완충액은 50mM의 헤페스, 50mM의 인산염(phosphate), pH 7.0이었고, 이는 상기 완충액 내에 상기 DNA 용리를 가져왔다. 상기 용리된 DNA는 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)(CHT I형, 40미크론)의 칼럼에 직접 적용되었고, 이후에 인산염 구배 내에 용리되어 약 225mM 내지 275mM의 인산염 농도 범위에 대해 용리를 가져왔다. 이러한 실험예는 본 발명이 어떻게 DNA를 정제하고 단일 유닛 동작에서 후속하는 프로세스 단계를 위한 샘플을 제조하는 지에 대한 다른 예를 나타낸다. 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게는, 예를 들면, 하이드록시아파타이트로 초기 정제 단계를 수행하고, 음이온 교환 칼럼에 대한 적용을 위해 상기 샘플을 평형화시키면서 추가적인 정제를 구현하도록 본 발명을 이용하며, 이후에 상기 음이온 교환 단계를 수행하는 것과 같이 두 정제 단계들을 연결하는 데 유사하게 이용될 수 있는 점이 분명해질 것이다. 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게는 이러한 3단계 프로세스들이 생체 내에서 인간 치료를 위해 적합한 레벨까지 유전자 치료 벡터들의 정제를 위하여 적합할 수 있는 점이 분명할 것이다.

실험예 4

신선한 포유류 세포들로부터의 DNA의 정제. 세포 배양으로부터 중국 햄스터 난소 세포들이 원심 분리에 의해 농축되었다. 상기 상층액은 버려졌고, 건조 구아니딘이 3M의 최종 농도를 생성하도록 상기 샘플에 직접 첨가되었다. 상기 세포들은 구아니딘 내에서 수동으로 균질화되었고, 이후에 0.45미크론 멤브레인을 통하는 여과에 의한 이들의 제거에 수반하여 미립자들은 대부분 원심분리에 의해 제거되었다. 깨끗한 상층액의 5mL 샘플이 0.05M의 아세트산염으로, pH 4.1까지 평형화된 UNO스피어(sphere) 라피드(Rapid) S의 20mL에 적용되었다. 상기 샘플이 상기 칼럼을 통하도록 상기 샘플은 충분한 완충액에 수반되었다. 상기 칼럼 용리액은 254㎚ 및 280㎚에서 동시에 모니터되었다. 254/280 비율의 용리된 피크는 높지만 불완전하게 정제된 DNA를 나타내는 약 1.7이었다. 제2 피크에 용리된 오염물들과 구아니딘은 버려졌다. pH 4.1의 0.04M의 아세트산 내의 상기 DNA-함유 샘플은 pH 7.0까지 적정되었고 다른 정제를 위해 동일한 조건들까지 평형화된 QA 334마이크로리터 모놀리스 디스크에 적용되었다. 상기 모놀리스는 5분의 선형 구배 내지 1M의 NaCl(4mL/분)으로 용리되었다. 0.6M의 NaCl에서 2：1의 254/280 비율의 예리한 피크 내의 용리된 DNA는 매우 높은 정도의 순도를 나타내었다.

실험예 5

건조된 포유류 세포들로부터의 DNA의 정제. 페트리(petri) 접시 상의 얇은 층 내에 얼룩진 CHO 세포들이 흄 후드(fume hood) 내에서 하룻밤 동안 건조되었고, 이후에 5M의 구아니딘 내의 pH 5에서 균질화되었던 점을 제외하면 실험예 4의 형태가 수반되었다. 결과들은 실험예 4에서 수득된 바와 동일하였다.

실험예 6

음으로 대전된 소수성 다중 모드의 크로마토그래피 배지들 상의 DNA 정제. 연저 정자로부터의 정제된 게놈 DNA이 50mM의 헤페스, 100mM의 NaCl, pH 7.0에 재현탁되었다. 상기 샘플은 미립자들을 제거하도록 0.22미크론의 멤브레인을 통해 여과되었고, 이후에 5mL가 50mM의 아세트산염, 100mM의 NaCl로 pH 4.0까지 평형화된 음성 전하들, 소수성 잔기들 및 수소 결합 잔기들로 구성된 다중 모드 크로마토그래피 배지들인 캅토 MMC로 포장된 20mL의 칼럼에 적용되었다. 90%의 DNA가 보이드 부피를 위해 완전히 분할되었고, 상기 아세트산염 완충액 내에 용리되었으며, 나머지는 상기 칼럼을 통한 염의 통과 후에 용리되었다.

실험예 7

음으로 대전된 금속 친화 다중 모드 크로마토그래피 배지들 상의 DNA 정제. 연어 정자로부터의 정제된 게놈 DNA가 50 헤페스, 100mM의 NaCl 내에 pH 7.0로 현탁되었다. 상기 샘플은 미립자들이 제거되도록 0.22미크론의 멤브레인을 통해 여과되었으며, 이후에 50mM의 아세트산염, 100mM의 NaCl로 pH 4.0까지 평형화된 5mL가 금속 친화도를 부여하도록 음성 전하들로 구성된 다중 모드 크로마토그래피 배지(UNO스피어 프로피니티(Profinity))인 캅토 MMC로 포장된 20mL 칼럼에 적용되었다. 상기 DNA는 상기 보이드 부피를 위해 완전히 분할되었고, 상기 아세트산염 완충액 내에 용리되었다.

상기 칼럼 부피에 대한 샘플 부피의 중요성이 정해질 경우, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 칼럼으로 들어가기 전에 상기 샘플 부피의 의도하지 않은 증가의 효과를 가질 수 있는 상기 샘플 경계들에서 상기 샘플의 조절되지 않는 분산을 야기하지 않는 방식으로 상기 샘플을 적용하는 중요성을 인식할 것이다. 샘플은 상기 샘플 경계들에서의 분산을 특히 회피하는 슈퍼루프로 호칭되는 장치에 의해 전술한 모든 실험예들에 적용되었다.

해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 이들 샘플들이 동등한 성공적인 예상으로 다른 폴리뉴클레오티드들의 정제에 대해 적용될 수 있는 점은 분명해질 것이다. 실험예들은 특히 RNA를 포함한다.

본 발명은 보다 정제의 높은 레벨들을 구현하도록 다른 정제 방법들과 결합될 수 있다. 이와 같은 다른 정제 방법들의 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 초미세원심분리, 초미세여과, 밀도 구배 여과, 친화 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고정 금속 친화 크로마토그래피, 그리고 추가적인 혼합 모드 크로마토그래피 방법들과 같은 폴리뉴클레오티드를 정제하기 위해 공통적으로 이용되는 다른 방법들을 포함하며; 또한 침전, 결정화 및 액체-액체 추출의 방법들을 포함한다. 특정한 폴리뉴클레오티드의 필수적인 정제를 구현하기 위하여 다양한 방법들에 대한 적절한 조건들을 개발하고 이들을 여기서의 본 발명과 통합시키는 점은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자의 이해의 범위 내에 있을 것이다.

본 명세서에서 언급되는 모든 참조 문헌들은 그 개시 사항들이 각각의 개별적인 공보 또는 특허 혹은 특허 출원은 그 개시 사항들이 모든 목적들을 위해 참조로 포함되도록 구체적으로 및 개별적으로 나타낸 바와 같이 참조로서 및 모든 목적들을 위해서 포함된다. 참조로 포함되는 공보들과 특허들 및 특허 출원들이 본 명세서에 포함되는 개시 사항들에 모순되는 정도에 대해, 본 명세서는 임의의 이러한 모순적인 물질에 대하여 대체 및/또는 우선적인 것으로 의도된다.

성분들, 크로마토그래피 조건들의 수량들을 표현하고, 본 명세서 및 특허청구범위에 사용되는 모든 숫자들은 "약(about)"이라는 용어에 의해 모든 예들에서 변경될 수 있는 것으로 이해된다. 이에 따라, 특별히 대조적으로 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 설정된 수치 변수들은 원하는 본 발명에 의해 수득되는 것으로 간주되는 수행에 따라 변화될 수 있는 근사치들이다.

본 발명의 많은 변형들과 변경들이 본 발명의 사상과 범주를 벗어나지 않고 이루어질 수 있고, 이러한 사실은 해당 기술 분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 여기에 기재되는 특정한 실시예들은 예만으로서 제공되며, 어떠한 방식으로도 제한하려는 것을 의미하지는 않는다. 본 명세서와 예들은 다음의 특허청구범위에 의해 나타나는 본 발명의 범주와 사상을 구비하는 예시들만으로 간주되도록 의도된 것이다.

Claims

폴리뉴클레오티드(polynucleotide)를 포함하는 샘플을 정제하는 방법에 있어서, (i) 음으로 대전된 다공성 입자들을 포함하는 팩형 크로마토그래피 칼럼(packed chromatographic column)을 제공하는 단계, (ii) 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼을 상기 폴리뉴클레오티드가 용리되는 조건들까지 평형화시키는 단계, (iii) 상기 적용되는 샘플 부피가 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼 내의 상기 음으로 대전된 다공성 입자들의 입자간 공간 보다 작거나 같아지도록 상기 샘플을 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼과 접촉시키는 단계, 그리고 (iv) 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼으로부터 상기 폴리뉴클레오티드를 용리시키는 단계를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 보다 순수한 상태에 있는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 정제하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 게놈(genomic) DNA, 미토콘드리아(mitochondrial) 또는 엽록체(chloroplast) DNA와 같은 세포소기관(organelle) DNA, 플라스미드(plasmid) DNA, 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, 또는 다른 형태의 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 샘플은 정제되지 않거나, 순도의 중간 레벨 또는 고도로 정제되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 칼럼에 대한 적용 이전에 농축되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼에 대한 적용 이전에 초미세여과에 의해 농축되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 샘플은 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼에 대한 적용 이전에 상기 폴리뉴클레오티드가 음으로 대전된 표면 또는 표면들에 실질적으로 결합되지 않는 조건들 하에서 상기 음으로 대전된 표면 또는 표면들에 노출되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 음으로 대전된 표면 또는 표면들은 소수성 상호작용들, 금속 친화 상호작용들 또는 이들의 결합들에 참가하는 능력을 포함하는 이차적 반응성들을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 상기 음으로 대전된 표면 또는 표면들은 멤브레인, 모놀리스(monolith), 섬유 또는 복수의 섬유들, 입자 또는 복수의 입자들, 또는 이들의 화합물 구성을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼은 음으로 대전된 다공성 입자들로만 포장되며, 상기 샘플 부피는 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼의 부피의 40% 보다 작은 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼은 약 2 내지 약 9의 범위의 pH까지 평형화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼은 약 0.1mS/㎝ 내지 약 30mS/㎝의 범위의 전도성 값까지 평형화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼은 (1) 약 2 내지 약 8, (2) 약 4 내지 약 7 및 (3) 약 4.5 내지 약 6.0으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위의 pH를 갖는 완충액으로 평형화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼은 약 0.1mS/㎝ 내지 약 15mS/㎝의 범위의 도전성 값까지 평형화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 용리물에 대해 수행되는 후속하는 정제 단계에 사용을 위한 샘플 적용 조건에 또는 가까운 조건들까지 평형화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 샘플을 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼과 접촉시키기 위한 상기 샘플 적용은 조건 약 2 내지 약 10 범위의 pH를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 샘플을 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼과 접촉시키기 위한 상기 샘플의 전도성 값은 0이 아닌 전도성으로부터 특정한 염 또는 염들의 결합의 포화 용액에 대응되는 전도성까지의 범위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼을 평형화시키는 단계는 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼을 약 4 내지 약 9 범위의 pH를 갖는 평형 완충액에 적용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 평형 완충액의 전도성 값은 약 0.1mS/㎝ 내지 약 30mS/㎝의 범위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 음으로 대전된 다공성 입자들은 양이온 교환 입자들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 전기음성도는 카르복실(carboxyl), 술포(sulfo) 또는 포스포(phosphor) 모이어티(moiety)로부터 선택되는 모이어티에 의해 부분적으로 상기 음으로 대전된 다공성 입자들에 부여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼은 상기 음으로 대전된 다공성 입자들 이외의 입자들을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 21 항에 있어서, 상기 음으로 대전된 다공성 입자들, 상기 다른 입자들, 또는 모두의 적어도 하나는 음이온 교환, 소수성 상호작용들, 수소 결합들, pi-pi 상호작용들 및 금속 킬레이트화로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 이차 기능성들을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 샘플을 상기 팩형 크로마토그래피 칼럼과 접촉시키는 단계 이전에 상기 샘플을 하나 또는 그 이상의 오염물 해리 작용제들(contaminant-dissociating agents)과 접촉시키는 추가적인 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항에 있어서, 상기 샘플을 상기 칼럼과 접촉시키는 단계 이전의 상기 오염물 해리 작용제는 염들, 비이온성 유기 중합체들, 유기 용제들, 계면활성제들 그리고 카오트로프들(chaotropes)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 상기 오염물 해리 작용제는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol) 및 폴리부틸렌 글리콜(polybutylene glycol)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 비이온성 중합체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 25 항에 있어서, 상기 비이온성 유기 중합체는 약 130D 내지 약 1000D의 범위에 있는 평균 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오염물 해리 작용제는 에틸렌 글리콜(ethylene glycol), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 부틸렌 글리콜(butylene glycol), 디메틸술폭시드(dimethylsulfoxide), 에탄올(ethanol) 그리고 페녹시에탄올(phenoxyethanol)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 유기 용제인 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오염물 해리 작용제는 약 0.01%중량/부피 내지 약 25%중량/부피의 범위 내의 농도에서 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오염물 해리 작용제는 트윈(Tween), 트리톤(triton), 챕스(CHAPS), 챕소(CHAPSO) 및 옥틸 글루코시드(octyl glucoside)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 계면활성제인 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항에 있어서, 상기 계면활성제는 약 0.001%중량/부피 내지 약 1%중량/부피의 범위 내의 농도에서 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 상기 계면활성제는 약 0.001%중량/부피 내지 약 0.1%중량/부피의 범위 내의 농도에서 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항의 방법의 간편한 실행을 제공하는 키트(kit).