CN104470606B - 用带负电荷颗粒对多核苷酸的色谱纯化 - Google Patents

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Abstract

纯化包括多核苷酸的样品的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供填充的色谱柱，其具有带负电荷的多孔颗粒，(ii)将所述柱平衡至所述样品中的多核苷酸洗脱的条件，(iii)使所述样品与所述填充的色谱柱接触，使得施加于所述填充的色谱柱的样品体积小于或等于所述填充的色谱柱内的带负电荷的多孔颗粒的颗粒间空间，(iv)从所述填充的色谱柱洗脱多核苷酸，其中所述多核苷酸处于更纯的状态且处于所述填充的色谱柱平衡至的条件。

Description

用带负电荷颗粒对多核苷酸的色谱纯化
相关申请的声明
本申请要求2013年3月6日提交的美国临时申请号61/773,666和2012年5月31日提交的美国临时申请号61/653,694的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及用于纯化多核苷酸的方法。其进一步涉及这些能力与其它纯化方法的结合以达到期望的最终纯化水平。
发明背景
具有带电荷表面的固体材料被广泛地用在多核苷酸纯化领域中。这些材料通常包括离子交换剂，所述离子交换剂经常以2种应用形式中的任一种采用。在结合-洗脱模式中，将多核苷酸和离子交换剂平衡至允许目标多核苷酸物质结合的条件。与带电荷表面较弱地相互作用或根本不相互作用的污染物不会结合并被消除。比多核苷酸更强地相互作用的污染物会更强地结合。洗涤以除去未结合的污染物以后，可以通过增加盐浓度来洗脱柱。这允许其与离子交换剂的相互作用强度处于递增次序的结合物质的分级分离，由此实现高多核苷酸纯化程度。在流穿模式中，例如在阳离子交换剂上，将样品和离子交换剂平衡至阻止多核苷酸结合的条件。与多核苷酸相比更强烈地与离子交换剂相互作用的物质发生结合且由此被除去，但是比多核苷酸更弱地结合的物质与它一起流穿且作为污染物持续。两种模式在存在于多种固相体系结构(包括填充在柱中的多孔或无孔颗粒)中的带电荷表面上进行，或直接加入大体积水性样品中，或在整体料或膜上。这些不同的体系结构会赋予不同的流动性能、能力和分辨率，但是限定流穿或结合-洗脱色谱法的化学特征是恒定的(不论物理形式如何)。两种方法依赖于离子交换剂和样品平衡至向柱引入样品之前的相同条件。
一些色谱介质体现了电荷与其它类型的化学官能团的组合。这些介质被概括地称作混合模式或多模式材料，且可以将电荷与疏水基团、金属亲和力、有利于氢键形成的基团或化学基团进行不同地组合。取决于第二官能团的性质，它们在不同的化学条件下运行，但是它们仍然以结合-洗脱和流穿模式运行。
已经描述了少数将电荷与物理官能团组合的多模式材料，例如，在带电荷材料也具有根据物质的大小来分选所述物质的能力的情况下。一个这样的例子采用与正电性表面组合的可变尺寸排阻官能团[Hunter,A.,J.Chromatogr.A 897:65-80(2000)；Hunter,A.,J.Chromatogr.A 897:81-97(2000)；Hunter,A.,J.Chromatogr.A 930:79-93(2000)；Hunter,A.,J.Chromatogr.A 971:105-116(2000)]。所述方法通常包括，使蛋白以尺寸依赖性的方式进入颗粒孔中，同时表现出对蛋白上的电荷以及缓冲液条件的协同依赖性。象用于分级分离的其它带电荷材料一样，所述方法采用结合-洗脱和流穿操作模式。
最近(Nian等人.J.Chromatogr.A 1282(2013)127-132.)，已经描述了被称作空隙排阻色谱法的新色谱法模式。用于实施所述方法的材料包括用正电性颗粒填充的柱(参见Hunter出处同上)，前提条件是，施加于柱的样品体积不大于被颗粒之间的空间占据的体积。描述了用于纯化抗体的方法。
发明内容
提供了用于纯化多核苷酸的方法、材料和试剂盒。在某些实施方案中，本发明提供了用于纯化包含多核苷酸的样品的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供填充的色谱柱，其包含带负电荷的多孔颗粒，(ii)将所述填充的色谱柱平衡至允许所述样品中的多核苷酸洗脱的条件，(iii)使所述样品与所述填充的色谱柱接触，使得施加于所述填充的色谱柱的样品体积小于或等于所述填充的色谱柱内的带负电荷的多孔颗粒的颗粒间空间，和(iv)从所述填充的色谱柱洗脱多核苷酸，其中所述多核苷酸处于更纯的状态。
发明的详细描述
在某些实施方案中，本发明涉及用负电性的多孔颗粒填充的柱，其中多核苷酸可以通过静电排斥力(其不依赖于来自孔的空间位阻或与来自孔的空间位阻组合)或仅通过来自孔的空间位阻而基本上限于颗粒之间的空间(即颗粒间或空隙空间)。这可以造成所述多核苷酸基本上(如果不是排它地)穿过空隙空间而经过柱。具体地，空间位阻表示这样的机制：其中在阻止多核苷酸克服由孔内的带负电荷的配体的构型产生的物理阻力的条件下，多核苷酸不能进入孔空间中。许多污染性蛋白(包括从生产多核苷酸的宿主细胞产生的那些)和细胞培养基组分(包括盐、非离子的物质、和两性离子的物质)能够进入颗粒的孔中，这被认为(不限于任何具体理论)会减慢它们穿过柱的运输，并造成它们随着缓冲液流过柱而变得与更快迁移的多核苷酸分离。酸性污染物可以通过结合至负电性表面而进一步减慢。
已经发现，该方法允许有效地分级分离尤其是多核苷酸，不论样品条件如何，不论大多数污染物的化学特性如何，且不论在样品施加以后为了迫使多核苷酸穿过柱而立即施加的缓冲液的组成如何。在某些实施方案中，本发明的一个优点是，它可以在宽范围的条件(pH、盐浓度、电导率等)下实施，且因此可以为了在制备和纯化多核苷酸的过程中方便实现本发明的方法以及在本发明的方法之前或之后的方法而选择那些条件。在某些实施方案中，通过将样品施加限制为不超过柱内的带负电荷颗粒的颗粒间体积的体积，可以实现这些独特的操作特征和结果。另外，在某些实施方案中，所述方法既不与其它类型的带负电荷材料(包括无孔的颗粒、膜或整体料)一起应用，也不通过将带负电荷的多孔或无孔颗粒或可溶性的带负电荷聚合物分散在样品内来应用。相反，在本发明的某些实施方案中，所述方法用多孔颗粒的填充柱实现。在某些实施方案中，与使用多孔颗粒填充柱的其它多核苷酸纯化方法相比，本发明是非常有利的，因为穿过颗粒间空间的运输是对流的，而不是扩散的。这允许所述方法以比其它颗粒-柱方法更高的流速有效地进行，这会转化成更高的生产力。
已经进一步发现，可以如下增强本发明的某些实施方案的固有分级分离能力：在柱床内的颗粒上包括额外表面官能团，只要将柱平衡至不会造成多核苷酸被那些额外官能团截留或显著减慢的条件。这样的官能团可以包括、但不限于带正电荷的基团、疏水基团、π-π键合基团、氢键合基团或金属-螯合基团。这些额外官能团可以位于与带负电荷的基团相同的化学部分上，位于与带负电荷的基团相同的多孔颗粒上，或位于可为多孔或无孔的不同颗粒上。在通过包括额外颗粒而添加第二官能团的情况下，可以施加的样品的体积可以限于这样的体积：其对应于仅在柱中的带负电荷的多孔颗粒之间存在的颗粒间空间。该体积可以估计为柱中的带负电荷的多孔颗粒的重力沉降体积的约40％，但是如果物理地压缩颗粒床的话可以更小，且可以通过实验定量地确定。
在某些实施方案中，可以如下增强通过所述方法提供的纯化程度：用试剂预处理所述样品，以促进可能已经与多核苷酸结合的污染物的解离。这样的试剂具体地包括各种解离剂，包括高浓度的盐、脲、氨基酸、非离子有机聚合物、有机溶剂和表面活性剂等。在某些实施方案中，在高达6M浓度的离液盐胍对于从新鲜匀浆化的细胞或其它复杂制品解离多核苷酸而言可能是特别有用的。在所述方法的常规实施过程中，与样品中的其它小分子一起除去解离剂。这凸显了本发明的2个优点：第一个是，它不需要将样品预先平衡至所述柱将运行的条件，即使当样品条件根本不适合用于以结合-洗脱或流穿模式进行离子交换色谱法时；第二个是，不论样品的组成如何，样品洗脱在用于平衡柱的缓冲液中，从而实现缓冲液更换与多核苷酸的纯化结合。
在某些实施方案中，本发明提供了用于纯化含有多核苷酸的样品的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供填充的色谱柱，其包含带负电荷的多孔颗粒，(ii)将所述柱平衡至要洗脱所述样品中的多核苷酸的条件，(iii)使所述样品与所述柱接触，使得施加于所述柱的样品体积小于或等于所述柱内的带负电荷的多孔颗粒的颗粒间空间，(iv)从所述柱洗脱多核苷酸，其中所述多核苷酸处于更纯的状态且处于所述柱要平衡至的条件。
在上述实施方案中，所述多核苷酸物质可以是基因组多核苷酸、多核苷酸片段或多核苷酸质粒。所述多核苷酸可以具有天然或重组起源。
在每个上述实施方案的一个或多个中，所述样品可以是没有预先纯化的。
在每个上述实施方案的一个或多个中，所述样品可以在实施本发明之前浓缩。
在每个上述实施方案的一个或多个中，所述样品可以已经通过超滤进行浓缩。
在每个上述实施方案的一个或多个中，所述样品可以已经经历先前纯化步骤达到中间纯度水平或高纯度水平。
在每个上述实施方案的一个或多个中，所述样品的中间纯度水平可以是约40％至约90％纯度的范围内或更大。
在每个上述实施方案的一个或多个中，所述样品的高纯度水平可以是约90％或更大。
在每个上述实施方案的一个或多个中，所述样品体积可以小于所述填充的色谱柱内的带负电荷的多孔颗粒的颗粒间空间的90％。
在每个上述实施方案的一个或多个中，所述样品体积可以小于所述填充的色谱柱内的带负电荷的多孔颗粒的颗粒间空间的80％。
在每个上述实施方案的一个或多个中，所述样品体积可以小于所述填充的色谱柱内的带负电荷的多孔颗粒的颗粒间空间的70％。
在每个上述实施方案的一个或多个中，所述样品体积可以小于所述填充的色谱柱内的带负电荷的多孔颗粒的颗粒间空间的60％。
在每个上述实施方案的一个或多个中，所述样品体积可以小于所述填充的色谱柱内的带负电荷的多孔颗粒的颗粒间空间的50％。
在每个上述实施方案的一个或多个中，所述样品体积可以小于所述填充的色谱柱内的带负电荷的多孔颗粒的颗粒间空间的0.1％。
在每个上述实施方案的一个或多个中，所述填充的色谱柱可以仅用带负电荷的多孔颗粒填充，且所述样品体积可以小于所述填充的色谱柱的体积的40％。
在每个上述实施方案的一个或多个中，样品施加条件包括在大约2至大约9的pH范围内的pH。
在每个上述实施方案的一个或多个中，可以将所述填充的色谱柱平衡至大约4至大约8的pH。
在每个上述实施方案的一个或多个中，可以用具有约4.5至约6.0的pH的缓冲液平衡所述填充的色谱柱。
在每个上述实施方案的一个或多个中，样品施加条件包括在大约0.1mS/cm至大约250mS/cm的范围内的电导率值。
在每个上述实施方案的一个或多个中，可以将所述填充的色谱柱平衡至大约0.1mS/cm至大约30mS/cm的电导率值。
在每个上述实施方案的一个或多个中，可以将所述填充的色谱柱平衡至约0.1至约15mS/cm的电导率值。
在每个上述实施方案的一个或多个中，可以用具有约4.5的pH和小于约1mS/cm的非零电导率值的缓冲液平衡所述填充的色谱柱。
在每个上述实施方案的一个或多个中，为了在洗脱液上进行后续纯化步骤，可以将所述填充的色谱柱平衡至处于或接近样品施加条件的条件。
在每个上述实施方案的一个或多个中，所述带负电荷的多孔颗粒是阳离子交换颗粒。
在每个上述实施方案的一个或多个中，所述阳离子交换颗粒具有电负性，所述电负性的至少部分由选自以下的基团提供：羧基、磺基或磷酰基。
在每个上述实施方案的一个或多个中，电负性可以由超过一种带负电荷的基团提供。
在每个上述实施方案的一个或多个中，电负性可以由复杂配体提供，所述复杂配体包括与赋予第二反应性的其它官能团组合的羧基、磺基或磷酰基。在一个这样的实施方案中，电负性可以由复杂配体提供，所述复杂配体包括与至少一个氨基组合的一个或多个羧基，使得带负电荷的配体具有参与金属配位的强能力。这样的配体的例子可以是亚氨基二乙酸或次氮基三乙酸(nitriloacetic acid)。在另一个这样的实施方案中，所述复杂配体可以包含与一个或多个负电荷直接地或间接地共价连接的芳族或脂族疏水基团。
在每个上述实施方案的一个或多个中，除了负电性的多孔颗粒以外，所述填充的色谱柱还包含其它颗粒。
在每个上述实施方案的一个或多个中，所述负电性的多孔颗粒或所述其它颗粒中的至少一种包含一个或多个选自以下的第二化学官能团：阴离子交换、疏水相互作用、氢键合、π-π相互作用和金属螯合作用。
在每个上述实施方案的一个或多个中，所述方法可以进一步包括：在使所述样品与所述填充的色谱柱接触的步骤之前，使所述样品与一种或多种解离剂接触的额外步骤，其中所述解离剂的目的是，将多核苷酸物质从它可能非特异性地结合的污染物解离。
在每个上述实施方案的一个或多个中，所述解离剂可以是有机溶剂。
在每个上述实施方案的一个或多个中，所述解离剂可以是乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、二甲亚砜、甘油、乙醇或异丙醇。
在上述实施方案的一个或多个中，所述解离剂可以以从非零量至0.1％或更高、1％或更高、10％或更高、或20％或更高范围内的浓度存在。
在一个或多个上述实施方案中，所述解离剂可以是从非零浓度至8M或更高(例如0.5M或更高、1M或更高、2M或更高、4M或更高、6M或更高)的离液剂，诸如尿素。
在一个或多个上述实施方案中，所述解离剂可以是表面活性剂。
在一个或多个上述实施方案中，所述表面活性剂可以是：非离子表面活性剂，诸如Triton或吐温或Brij；或两性离子表面活性剂诸如CHAPS、CHAPSO或辛基葡萄糖苷。
在一个或多个上述实施方案中，所述表面活性剂可以以小于0.1％的浓度存在于样品中。
在一个或多个上述实施方案中，所述解离剂可以是氢键干扰剂，诸如尿素或山梨醇。
在一个或多个上述实施方案中，所述解离剂可以是氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸或组氨酸。
在一个或多个上述实施方案中，所述氨基酸可以是在从非零量至500mM的范围内的浓度。
在一个或多个上述实施方案中，所述解离剂可以是螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)、三(2-氨基乙基)胺(TREN)或去铁胺。
在一个或多个上述实施方案中，所述螯合剂可以是在从非零量至50mM的范围内的浓度。
在每个上述实施方案的一个或多个中，所述方法可以进一步包括：在使所述样品与所述填充的色谱柱接触的步骤之前，使所述样品与一种或多种盐接触的额外步骤，其中所述盐的目的是，将多核苷酸物质从它可能非特异性地结合的污染物解离。
在每个上述实施方案的一个或多个中，加入所述样品中的盐可以由氯化钠、氯化钾或其它所谓的中性盐组成。
在每个上述实施方案的一个或多个中，加入所述样品中的盐可以由离液盐(诸如胍)组成。
在每个上述实施方案的一个或多个中，所述盐可以是在从非零量至2M或更高(例如50mM或更高、100mM或更高、200mM或更高、500mM或更高、1M或更高)的范围内的浓度。
在每个上述实施方案的一个或多个中，所述污染物可以是金属离子、蛋白、脂质、内毒素、病毒、细胞培养基组分、不希望的核苷酸物质或它们的组合。
在每个上述实施方案的一个或多个中，所述样品可以含有一种或多种污染物，其中由于执行本文中公开的方法，所述多核苷酸的更纯状态与所述样品相比具有降低的这类污染物的含量。
可以提供用于方便地实施任意上述实施方案的方法的试剂盒。
在某些实施方案中，所述颗粒间空间大于样品体积的大约2倍。在某些实施方案中，含有多孔负电性颗粒的柱部分的颗粒间空间大于样品体积。在某些具有仅用带负电荷的多孔颗粒填充的柱的实施方案中，所述样品体积是填充柱体积的约40％或小于填充柱体积；在某些具有用带负电荷的多孔颗粒和其它颗粒填充的柱的实施方案中，所述样品体积是柱中重力沉降的带负电荷的多孔颗粒的体积的约40％或小于该体积。
在某些实施方案中，在柱中填充的带负电荷的多孔颗粒的颗粒间空间具有与样品大约相同的体积，或比样品体积大10％，或比样品体积大20、30、40、50、60、70、80、90或100％，或比样品体积大1.5或2或2.5或3或4或5倍或更多倍。
在某些实施方案中，在使所述样品与所述柱接触之前，用平衡缓冲液平衡所述柱。在某些这样的实施方案中，将所述柱平衡至大约3至大约9的pH。在某些这样的实施方案中，用具有约4至约6.0的pH的缓冲液平衡所述柱。在某些这样的实施方案中，用具有约4.5至约5.5的pH的缓冲液平衡所述柱。在某些实施方案中，将所述柱平衡至大约1mS/cm至大约30mS/cm的电导率值。在某些实施方案中，选择所述柱的pH、盐浓度和电导率条件，使得负电性的多孔颗粒和来自样品的组分(除了多核苷酸以外)之间的静电相互作用基本上暂停(suspend)。在本发明的某些实施方案中，可以为平衡缓冲液和/或洗脱缓冲液选择pH、盐浓度和电导率条件，使得负电性的多孔颗粒和来自样品的组分(除了期望的蛋白以外)之间的静电相互作用基本上暂停。在某些实施方案中，经平衡的柱的电导率为约0.1至约15mS/cm。在某些实施方案中，为了在洗脱液上进行后续纯化步骤，可以将所述柱平衡至处于或接近样品施加条件的条件。
在某些实施方案中，所述样品条件可以在从大约3的pH至大约10的pH的范围内。在某些这样的实施方案中，所述样品的电导率值可以在从大约0.1mS/cm至大约250mS/cm的范围内。在某些实施方案中，所述样品条件可以在从大约2的pH至大约10的pH的范围内，且在某些实施方案中，所述样品的电导率值条件可以在从大约0.1mS/cm至大约250mS/cm的范围内。
在某些实施方案中，所述洗脱条件可以在从大约2的pH至大约10的pH的范围内。在某些这样的实施方案中，在样品以后立即施加的缓冲液的电导率可以在从大约0.1mS/cm至大约250mS/cm的范围内。在某些实施方案中，在样品以后立即施加的缓冲液具有比样品或平衡缓冲液更低的电导率。在某些实施方案中，在样品以后立即施加的缓冲液具有比样品或平衡缓冲液更高的电导率。
在某些实施方案中，所述柱平衡缓冲液可以具有约5.0的pH和小于1mS/cm的电导率，诸如在没有加入盐的情况下由20mM或更低浓度的乙酸介导。在某些实施方案中，所述乙酸盐的浓度可以是在约20mM至约50mM的范围内。
在某些实施方案中，在样品以后立即施加的缓冲液可以具有与平衡缓冲液相同的组成。在某些实施方案中，在样品以后施加的缓冲液可以具有与平衡缓冲液不同的组成。在某些实施方案中，在样品以后立即施加的缓冲液可以具有比平衡缓冲液高得多的电导率，其目的是，除去可能与带负电荷颗粒结合的带正电荷材料。
在某些实施方案中，可以在样品中包括过量的盐或其它添加剂，以在为后续使用循环的准备中清洁柱。应该理解，这样的添加剂也可以介导解离多核苷酸和污染物物质之间的非特异性相互作用的有益效果，结果是，通过该技术达到纯度程度的增加和/或聚集体减少。
在某些实施方案中，所述带负电荷的多孔颗粒是阳离子交换颗粒。在某些这样的实施方案中，所述阳离子交换颗粒具有电负性，所述电负性部分地由诸如羧基、磺基、磷酰基、亚氨基二乙酸基或次氮基三乙酸基等基团提供。在某些实施方案中，所述柱含有除了负电性的多孔颗粒以外的颗粒。在某些实施方案中，所述负电性的多孔颗粒和所述额外颗粒中的至少一种具有一个或多个选自以下的第二化学官能团：阳离子交换、疏水相互作用、氢键合、π-π相互作用和金属螯合作用。
在某些实施方案中，所述技术利用所谓的嫁接配体，所述嫁接配体在颗粒孔内建立带电荷基团的致密网络，使得所述网络在物理上阻碍或阻止缺少强正电荷的溶质的进入。
在某些实施方案中，所述技术利用带负电荷的多孔颗粒色谱介质，其具有阻止多核苷酸的有效进入的孔径。可用于阻止多核苷酸颗粒进入的示例性孔径包括约10nm至约100nm的范围，包括在二者之间的任意值和其分数，取决于多核苷酸的尺寸。本领域技术人员会明白，也可以采用小于10nm的孔径，包括、但不限于，1、2、3、4、5、6、7、8或9nm。同样地，本领域技术人员还会明白，可以采用大于100nm的孔径，包括、但不限于，120、150、200、300和500nm，包括在其之间的任意值和其分数。本领域技术人员会认识到，基于要纯化的多核苷酸适当地选择孔径。这样的多孔颗粒可以构成整个样品体积或其任意更小部分。
在某些实施方案中，本发明提供了在使所述样品与所述柱接触的步骤之前，使所述样品与解离剂接触的额外步骤。在某些这样的实施方案中，解离剂可以是盐、有机溶剂或有机聚合物、氢键干扰剂、离液剂、表面活性剂或螯合剂。
在某些实施方案中，本发明提供了在使所述样品与所述柱接触的步骤之前，使所述样品与超过一种解离剂接触的额外步骤。在某些这样的实施方案中，所述解离剂可以包括任意下述解离剂类别中的超过一种，或来自不同类别的试剂的组合，其中所述类别包括例如：盐、有机溶剂或有机聚合物、氢键干扰剂、离液剂、表面活性剂或螯合剂。
在某些这样的实施方案中，所述解离剂是选自以下的非离子有机聚合物：聚乙二醇、聚丙二醇和聚丁二醇。在某些这样的实施方案中，所述解离剂具有大约500D或更小的平均分子量。在某些这样的实施方案中，所述解离剂是选自以下的有机溶剂：乙二醇、丙二醇、丁二醇、二甲基亚砜、乙醇和甘油。在某些这样的实施方案中，所述解离剂以大约1％(w/v)或更大的浓度提供。
在某些实施方案中，所述解离剂是选自以下的表面活性剂：吐温、Triton、CHAPS、CHAPSO和辛基葡萄糖苷。在某些这样的实施方案中，以大约1％(w/v)或更低的非零浓度，或以大约0.1％(w/v)或更低的非零浓度，提供所述表面活性剂。
在某些实施方案中，本发明提供了方法，其包括：在使所述样品与所述柱接触的步骤之前，除去不溶性固体的额外步骤。
在某些实施方案中，本发明提供了方法，其中所述样品含有一种或多种污染物，其中由所述方法的执行产生的多核苷酸的更纯状态具有与样品相比降低的这类污染物的含量。例如，在某些实施方案中，在所述污染物是蛋白的情况下，蛋白浓度可以下降超过10倍、或超过20倍、或超过50倍、或超过90倍、或超过95倍。
在某些实施方案中，通过在使多核苷酸基本上不被带负电荷颗粒结合的条件下暴露于那些颗粒，调节澄清的、但是在其它方面未纯化的样品，其目的是，在实施本发明之前清除高酸性的污染物。在一个这样的实施方案中，将带负电荷颗粒直接加入样品中，例如以整个样品体积的约2-5％(v:v)的量。在某些这样的实施方案中，所述带负电荷颗粒包括第二官能团，诸如其具有参与疏水相互作用或金属配位的能力。在这样的实施方案中，该实施应当理解为如下改善本发明的执行：除去可能干扰多核苷酸与用于实施本发明的填充柱的带负电荷颗粒之间的相互作用的样品组分。在某些这样的实施方案中，该处理发生在通过超滤浓缩多核苷酸之前。在其它这样的实施方案中，该处理可以在没有有关的超滤步骤下发生。在其它这样的实施方案中，该处理发生在通过超滤浓缩多核苷酸之后。在第一种情况中，应当理解可能改善超滤步骤的执行。在最后一种情况中，应当理解会减小处理过程的体积和清除高酸性的污染物所需的带负电荷颗粒的体积。在任何情况下，在本发明的处理之前，可以在除去颗粒之前添加中间步骤。
在某些实施方案中，本发明提供了用于方便地实施本发明的方法的试剂盒，所述试剂盒包括执行本发明所需的一些或全部材料，优选地以方便地执行本发明的方法的量和浓度。这样的试剂盒还可以包括在所述试剂盒中提供的材料的使用说明书。
定义下述术语以便可以更容易地理解本发明。在详细描述中阐述了其它定义。
“柱平衡”表示达到期望的缓冲液在用色谱介质填充的柱中的稳定和均匀分布。在平衡时，在柱出口处测量的洗脱液的pH、电导率和UV吸收基本上等于在柱入口处引入的洗脱液。
“柱体积”表示在被称作柱的通常为圆柱形的装置内的填充颗粒的总体积。术语柱体积通常理解为对应于所谓的总柱体积，其包含3个部分：被称作空隙体积的颗粒间空间的体积，被称作孔体积的孔内的体积，和经常被称作基质体积的被颗粒的固体基质占据的体积。
“电导率值”表示电解质溶液的导电能力。可以测量电解质的溶液的电导率，例如，通过确定被固定距离隔开的2个电极之间的溶液的电阻。电导率值最常见地被表示为毫西门子/cm(mS/cm)。
“污染物”表示降低多核苷酸纯度的任何不希望的无机或有机实体。污染物包括这样的实体：其可以与多核苷酸形成在多种条件下保持稳定的结合体。本发明的方法可以提供这样的聚集体的有效解离，以将多核苷酸从它所结合的污染物回收。示例性的污染物具体地包括蛋白，但是也包括多核苷酸、细胞内容物、细胞培养基组分等。
“负电性的多孔颗粒”或“带负电荷的多孔颗粒”表示这样的不溶性固体：其可以是或不是大致球形的，且可以具有任意尺寸的孔。任选地，颗粒可以具有在小于10微米至超过100微米的范围内的尺寸，且平均孔径可以在从小于10nm(多微孔的)至超过100nm(大孔的)的范围内。颗粒的电负性可以由化学基团提供，所述化学基团包括、但不限于弱阴离子交换基团、羧基或磷酰基，强阴离子交换基团诸如磺基，或具有净负电荷的多模式基团，或前述基团的组合。在带负电荷的表面上建立多模式特性的第二官能团可以由带负电荷的或带正电荷的基团、疏水基团、π-π键合基团、氢键合基团或金属-螯合基团组成。所述第二官能团可以作为用于合成颗粒的制备材料或方法的非故意副产物存在于负电性颗粒上，或它们可以通过故意设计而存在。第二官能团的浓度可以在从小于1毫当量/mL颗粒至超过100毫当量/mL的范围内。术语负电性的多孔颗粒包括市售的被称作阳离子交换剂的多孔颗粒色谱材料，且可以包括为负电性的所谓的混合模式色谱材料。
“颗粒间体积”或“空隙体积”表示柱内未被颗粒本身占据的体积；颗粒之间的空间。这经常被称作柱的空隙体积。对于类似大小的大致球形的颗粒而言，当所述颗粒通过重力进行沉降且不通过机械方式物理压缩时，空隙体积通常占用那些颗粒填充的柱的约40％。
“孔体积”表示在多孔颗粒的孔内的体积。所述孔可以是物理上未阻塞的，具有主要分布在孔壁上的带正电荷的基团，或部分地阻塞的，具有分布在位于孔内的聚合物网络表面上或内部的带正电荷的基团。在所述孔被部分地阻塞的情况下，表观阻塞程度可以随抗体或其它样品组分的电荷特征而变化，和/或作为缓冲液条件(诸如pH和电导率)的函数。
“非离子有机聚合物”表示天然存在的或合成的烃，所述烃由缺少带电荷基团的连接的重复有机亚基组成。它可以是直链的，具有一些支链的主要直链的，或主要支链的。适合于实施本发明的例子包括、但不限于：聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。PEG具有结构式HO-(CH2-CH2-O)n-H。例子包括、但不限于：具有在小于100道尔顿至超过1000道尔顿的范围内的平均聚合物分子量的组合物。
“解离剂”表示这样的有机或无机化合物：其通过促进污染物从要纯化的多核苷酸的解离，可以减少污染，或与其它试剂组合辅助减少污染。有机解离剂可以包括、但不限于，酰脲、氨基酸、非离子有机聚合物、有机溶剂、螯合剂和表面活性剂等。无机解离剂具体地包括盐。
“有机溶剂”表示以液体状态存在的天然存在的或合成的有机化合物。适合于实施本发明的例子包括、但不限于：乙二醇、丙二醇、甘油、二甲亚砜、乙醇和苯氧乙醇。
“多核苷酸”表示由在链中共价地键合的多个核苷酸单体组成的生物聚合物。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是多核苷酸的例子。多核苷酸的例子包括、但不限于，基因组DNA、cDNA、双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、信使RNA(mRNA)、短干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)等。多核苷酸可以具有形成氢键的高倾向。这样的多核苷酸可以以多种尺寸和构型存在，其中的任一种可以通过本发明进行加工。多核苷酸可以是单链、双链或三链。
多核苷酸还可以包括非天然的多核苷酸，包括具有非天然主链(诸如硫代磷酸酯主链)的那些，或掺入非天然碱基的那些。多核苷酸还可以包括肽核酸(PNA)。
“蛋白”表示一组复杂有机大分子中的任一种，所述复杂有机大分子含有碳、氢、氧、氮，且经常含有硫，并且主要由通过肽键连接的一条或多条氨基酸链组成。蛋白可以具有天然来源或重组来源。可以用非氨基酸部分修饰蛋白，诸如通过糖基化、聚乙二醇化或缀合其它化学部分。蛋白的例子包括、但不限于抗体、凝固因子、酶和肽激素。
“多核苷酸制品”表示含有目标多核苷酸的任意水性的或主要水性的溶液，诸如含有细胞的细胞培养物收获物、(基本上)无细胞的细胞培养物上清液、或来自纯化阶段的含有目标多核苷酸的溶液。
“样品施加条件”表示如何供给含有期望蛋白的样品，且包括，例如，样品浓度、洗脱液电导率、pH等。通常可以将样品施加条件选择成在该条件下使所述柱被平衡以确保纯化的条件，或可以不同于这样的条件。
“固体材料”表示不溶性的有机固体，所述固体在性质上可以是微粒状的、结晶性的、聚合的、纤维性的、多孔的-中空纤维的、整体的或膜状的。它可以由无孔的或多孔的颗粒、多孔的膜、多孔的滤器或多孔的整体料组成。如果是微粒，所述颗粒可以是或不是大致球形的，且可以具有从小于100nm至超过100微米范围内的尺寸。多孔颗粒的平均孔径可以在从小于约10nm(多微孔的)至超过约100nm(大孔的)的范围内。膜中的平均孔径可以在从小于100nm至超过1微米的范围内。膜或整体料中的平均通道尺寸可以在从小于1微米至超过10微米的范围内。所述固体材料可以进一步由这样的化合物构造组成：例如其中将颗粒嵌入在网状基质中，夹在膜之间，或二者。
“表面活性剂”包括“表面活性剂(surface active agents)”诸如这样的有机分子类别：其通常具有疏水部分和亲水部分，从而造成它们被称作两亲的。在水溶液中的足够浓度，表面活性剂可以自结合成簇，其中疏水部分聚集在中心以使与水的接触最小化，且亲水部分向外辐射以使与水的接触最大化。在有生物制品(特别是含有具有疏水特性或具有疏水特性区域的材料的那些)存在下，表面活性剂的疏水部分倾向于自发地与疏水材料的一些部分结合，并通过表面活性剂的亲水部分的影响而增加它们的溶解度。它们也可以用于调节溶解在水性溶剂中的不同疏水材料之间发生的疏水相互作用。适合用于实施本发明的某些实施方案的表面活性剂的例子包括、但不限于：非离子型表面活性剂诸如聚山梨酯表面活性剂(例如，吐温20、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯和吐温80、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)和Triton(例如，聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚)，和两性离子表面活性剂诸如CHAPS(3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵基]-1-丙烷磺酸盐)、CHAPSO(3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵基]-2-羟基-1-丙烷磺酸盐)和辛基葡萄糖苷(例如，(2R,3S,4S,5R,6R)-2-(羟甲基)-6-八氧基噁烷(octoxyoxane)-3,4,5-三醇)。
“酰脲”表示具有天然或合成来源的环状或无环有机分子，其包含一个或多个脲部分或其衍生物。在某些实施方案中，本发明提供了酰脲诸如尿素、尿酸、乙内酰脲、尿囊素(CAS号97-59-6；铝克洛沙、尿囊素铝、尿囊素、脲基乙内酰脲、5-脲基乙内酰脲、乙醛酰基酰脲、乙醛酸二酰脲、2,5-二氧代-4-咪唑烷基脲)、嘌呤、及其衍生物。在某些实施方案中，本发明提供了式R-CO-NH-CO-NH2或R-CO-NH-CO-NH-CO-R'或R'R″NH-CO-NR″'R″″的有机分子，其中有关的“R-基团”可以是H或任意有机部分。
“空隙排阻”表示这样的化学相互作用：通过该作用，使用带静电荷的颗粒填充的柱的环境内的样品的至少一种组分由于静电排斥的结果而被约束以基本上停留在柱床的颗粒间空间内，和/或不能克服进入孔的物理阻力，所述物理阻力可以由位于颗粒中的孔的固有尺寸施加，或其次由其中在孔内存在静电荷的物理形式施加。
“空隙排阻模式”或“空隙排阻色谱法”表示在填充的带静电荷的颗粒的柱中实施的分级分离方法，其中施加于柱的样品体积不大于填充的床内的颗粒间体积，且期望的样品组分(诸如蛋白)不能进入颗粒的孔中，且由此受约束在颗粒间空间(这也通常被称作空隙体积)中移动。空隙排阻色谱法的一个基本的且独特的特征是，不需要将样品平衡至柱操作条件，作为其结果，样品条件可以包括被认为不适合用于在带静电荷的颗粒上进行色谱法的非常高的盐浓度和pH值。其它基本的且独特的特征包括，它的达到缓冲液更换结合分级分离的独特能力。在空隙排阻色谱法中，期望的蛋白洗脱在柱所平衡的缓冲液中，不依赖于用于将它施加于柱的样品组成。
在某些实施方案中，在样品施加之前，可以将多核苷酸洗脱在平衡柱的相同缓冲液中。在这样的实施方案中，本发明可以提供以下优点：它可以用于更换样品所在的缓冲液的目的，从它的最初制剂至更适合用于通过其它方法进行后续加工的制剂。当样品最初所在的缓冲液的组成没有限制(除了避免破坏多核苷酸的要求以外)时，柱平衡缓冲液的组成必须在一定范围内，所述范围不会在多核苷酸上产生正电荷至足以造成大部分多核苷酸结合带负电荷颗粒的水平。适当的平衡条件随带负电荷的多孔颗粒的选择和具体多核苷酸的特定特征而变化。一般而言，柱平衡条件可以在以下范围内，但不限于此：小于0.1mS/cm至超过30mS/cm的电导率值，和从小于4.0至大于9.0的pH值。
在某些其中技术的目的是降低污染物水平的实施方案中，将有利的是，采用不会造成多核苷酸基本上结合带负电荷颗粒的最低pH和/或最低电导率。应该理解，根据抗体的溶解度和稳定性要求，可以调节最低pH和/或最低电导率的指南。
在某些其中负电性颗粒带有额外化学官能团的实施方案中，可能必要的或有益的是，采用高pH值或包括添加剂，所述添加剂调节多核苷酸与颗粒表面的相互作用，以便实施所述方法。最简单的这样的转化可以是添加NaCl或其它盐。通过评价NaCl浓度的不同增量，诸如25mM、50mM、100mM、200mM等，可以实验性地确定最有效的水平。一旦确定了有效范围，可以用以更细的增量进行的后续实验或借助于统计方法诸如所谓的实验设计(DoE)将其细化。也可以考虑替代性的盐，以及其它添加剂包括糖、离液剂、有机溶剂和表面活性剂等。也可以评价添加剂的组合，包括与不同的pH值的组合。
在某些实施方案中，位于柱内的带负电荷颗粒可以属于单一类型或多种类型，包括多孔和无孔颗粒的组合，或具有不同孔径的多孔颗粒的组合。在本发明采用具有不同孔径的颗粒的组合的情况下，一个颗粒子集可以具有在物理上排阻抗体的尺寸的孔，而另一个子集可以具有不排阻多核苷酸的孔径。在这样的情况下，具有足够大以致于不排阻多核苷酸的孔的子集可以以在物理上阻碍缺少强正电荷的多核苷酸进入孔的方式呈现配体。
在某些实施方案中，本发明可以用于从粗制样品或在任何纯化阶段初步分级分离多核苷酸；在任何情况下解释了，本发明可以与其它纯化方法组合，以达到特定多核苷酸应用所需的总纯化程度。
在某些实施方案中，通过超滤可以浓缩要引入的样品。
在某些实施方案中，可能有利的是，在将样品引入柱之前，将样品暴露于一个或多个带负电荷的表面。这样的暴露应当被理解为除去高正电性的样品组分，所述组分可能倾向于污染用于实施本发明的柱，但是也应当理解，可能需要开发特殊条件来除去污染剂而不损失多核苷酸。例如，可能必须加入盐，所述盐足以阻止多核苷酸的结合，但是不足以阻止来自在其中生产多核苷酸的宿主细胞的多核苷酸压紧蛋白的结合。在实施本发明之前所述样品可向其暴露的带负电荷的表面可以包括颗粒、膜、纤维、整体料或化合物构造。
在某些实施方案中，在空隙排阻色谱模式中采用的负电性的色谱介质包含选自阳离子交换剂、金属亲和介质和多模式色谱介质的一种，其具体例子包括Unosphere S和UNOsphere Rapid S；UNOsphere Profinity；Capto MMC，和适合于实施所述方法的基于其它负电性颗粒的介质。在某些实施方案中，可以使用具有负电性基团的任意阳离子交换介质，但是，本领域技术人员会明白，并非所有负电性的介质都是合适的。尽管没有完整地阐明限定成功介质的确切参数，本领域技术人员对于其在空隙排阻阴离子交换色谱法中的执行能力可以容易地筛选任何特定负电性介质。在最基础水平，这容易在简单实验中完成，其中将候选阳离子交换颗粒填充在柱中，例如以20mL的体积。理想地允许颗粒通过重力进行沉降，然后设定液流接头，使得它接触、但是不显著压迫床。所述技术可以在这样的柱上执行：其中床已经被压缩，但是压缩会减少颗粒间空间，其直接结果是，减小柱的容积样品容量。例如，20mL重力沉降床可以具有高达约8mL的样品容积容量，但是床的25％压缩(达到15mL的容积)将会使容量减小至低于15mL相同介质在重力沉降床中的容量的水平。这提示且实验证据倾向于支持以下观点：与颗粒体积不同，压缩会不匀称地减小颗粒间体积。理想地以特定方式构造所述柱所在的色谱法系统，从而以不会造成样品在到达柱的路上显著稀释的方式递送样品，因为所述技术依赖于进入柱的样品的体积不大于柱的颗粒间体积。众所周知层流会在边界稀释样品。在具有几米长度的5mL样品环的实例中，样品在进入柱时的样品体积可以远大于最初引入环中的5mL，例如可能增加至7.5mL或甚至10mL或更多。具有所谓的超环的系统非常适用于实施本发明，因为借助于它们对圆筒-柱塞设计的依赖性，它们允许施用大样品体积，而不造成通过层流的过度稀释。本领域普通技术人员会理解，作为流体穿过不同阀门和混合器的结果，任何给定的色谱法系统也造成样品引入装置(注射器)和柱之间的特定量的样品稀释，并且作为一般规则，柱体积与特定系统的内部前置柱稀释体积的比率越大，在柱(at-the-column)样品体积作为功能系统稀释的相对增加越低。实际上，这意味着，在设计和构造成用于大规模应用的色谱仪上运行小柱将会对可以在注射器施加的样品体积造成严重次要限制，而在这样的系统上运行大柱将允许用户在样品进入柱的点处施加更大体积的样品，所述体积保持在给定柱的容积限度内。对于在系统诸如AKTAExplorer 100上的20mL重力填充的未压缩的柱，使用深绿色PEEK管道，且配备预先已经加载含有多核苷酸的样品的超环，且用50mM乙酸盐(pH 4.0)平衡柱，将1mL样品加载上柱。在抗体开始离开柱的点处，做出图标。在电导率变化(其指示与样品结合的小分子的通过)的点处，做出另一个图标。在所述标记之间的体积会提供柱的颗粒间体积的有用估计。计算颗粒间体积与总柱体积的比率。适合于执行空隙排阻阳离子交换色谱法技术的阳离子交换色谱介质将表现出约1/2.5的比率，但是表现出低比率(诸如1/2.4、1/2.3、1/2.2、1/2.1、1/2.0或更低)的介质可以提供有用的结果，只要进入柱的样品的体积没有超过根据以上结果调节的体积即可。应当理解，这里提示的确定给定的阴离子交换介质用于进行多核苷酸的空隙排阻阳离子交换色谱法的适合性的条件不一定是实现最有效的污染物除去的条件，也不一定是最适合于所有形式的多核苷酸的条件。还应当理解，包括额外化学官能团的负电性介质(所述额外化学官能团造成所述负电性介质被销售用于所谓的多模式色谱法)将需要包括评价不同缓冲液条件的工艺开发的额外方面，以确定给定的介质是否适合于执行空隙排阻模式的吸附色谱法。一个实例包括所谓的混合模式或多模式负电性色谱介质，其在Capto MMC的商品名下销售，据称其并入了造成它参与氢键和疏水相互作用的官能团。
本发明的其它目的和优点将部分地阐述在下面的描述中，且部分地从所述描述显而易见，或可以通过实施本发明来获知。借助于在权利要求书中指定的要素和组合，会实现和达到本发明的目的和优点。
应当理解，前述一般描述和下述详细描述仅仅是示例性的和解释性的，且不限制要求保护的发明。
在关于使用本发明的某些实施方案的准备中，必须确定就柱而言可用的样品体积。在其最简单的模式中，在柱中的所有颗粒都是带负电荷的多孔颗粒的情况下，通过将未压缩的重力沉降填充的色谱床的总体积乘以0.4，可以估计该值。通过简单实验可以精确地确定可允许的最大样品体积，在所述简单实验中，将柱平衡至中等pH的低盐缓冲液，并施加在高盐缓冲液中的多核苷酸样品，然后施加额外的平衡缓冲液。标记多核苷酸开始洗脱的点，如通过在280nm的UV吸光度的增加所指示的。标记高盐开始洗脱的点，如通过电导率的增加所指示的。所述标记之间的体积代表该柱的每个循环的最大样品体积。
对于包括除了多孔负电性颗粒以外的额外颗粒(诸如带有第二化学表面的那些)的柱而言，适合执行本发明的某些实施方案的样品体积可以通过仅乘以带负电荷的多孔颗粒的体积进行估计。可以应用以上实验以具体地限定最大样品。显而易见，对于给定的混合的负电颗粒和其它颗粒柱而言，最大样品体积相对于仅带负电荷的多孔颗粒柱减小，与被非负电颗粒占据的相对柱体积成比例。
在某些实施方案中，用于纯化特定多核苷酸制品的方法的开发通常开始于最简单选择的评价，所述最简单选择将是仅用带负电荷的多孔颗粒填充的柱。适当的颗粒可以由销售的用于实施所谓的阴离子交换色谱法技术的市售色谱介质组成。数十种这样的产品的例子包括：Capto S,Capto CM,Capto MMC,S Sephadex,CM Sephadex(GE Healthcare)；GigaCap S和S-Toyopearl(Tosoh Bioseparations)；Macroprep High-S,UNOsphere S,UNOsphere Rapid S,Nuvia S,Profinity(Bio-Rad Laboratories)；Eshmuno S,SFractogel,(Merck)；和S-HyperD(Pall)。这样的产品目前没有关于它们的表面上的第二官能团的特性或浓度进行标记，也没有关于孔径进行标记，也没有关于排阻极限进行标记，也没有关于虚拟孔径(其源自它们各自的配体嫁接方法的采用以增强它们的功能性)进行标记，也没有关于通常可从供应商得到的这类信息进行标记。应当预见到，所有这样的产品包括多个物理和化学官能团，且应当谨慎地评价超过一种产品以确定哪种在性质上最适合用于纯化特定多核苷酸制品。在一个实施方案中，评价可以开始于UNOsphere S和UNOsphereRapid S、Capto MMC或更小的候选物子集。
对于任何给定的多核苷酸，评价柱最初平衡至的pH和电导率值范围是可取的。作为一般规则，污染物减少在多核苷酸保持可溶性和稳定性的最低pH和最低电导率时是最佳的，所以适当酸性的缓冲液诸如20-50mM乙酸盐(pH 4.5)的最初条件可以是方便的开始地方。可以随后评价更低和更高的pH值，其中pH值低至2.0或高于9.0，且电导率值范围为从小于0.1mS/cm至超过30mS/cm。
在某些实施方案中可能有用的是，评价使得洗脱的样品适合应用于后续纯化步骤而无需进一步样品制备的条件。例如，如果洗脱的样品要在以后应用于阴离子交换柱(pH6.0)，可能合乎需要的是，将所述柱平衡至pH 6.0。如果洗脱的样品要在以后应用于羟磷灰石柱，可能合适的是采用中性pH和将缓冲液的磷酸盐浓度设定在羟磷灰石柱需要的水平，并且省略螯合剂诸如EDTA或柠檬酸盐。在为与后续分级分离方法的连续性选择平衡缓冲液的任何情况下，将仍然通常评价低pH低电导率条件，以确保在本步骤中没有牺牲纯化潜力。
不受限于任何特定理论，据信，所述方法事实上不依赖于样品组成。结果，在某些实施方案中，所述样品可以含有多种试剂(单独地或组合地)，以增强多核苷酸-污染物复合物的解离。
在某些实施方案中，其中已经预先用如上所述的解离剂处理样品中的多核苷酸，或如果要在未纯化的细胞培养物上清液样品上实施所述方法，通过使用具有大量第二官能团的带负电荷的多孔颗粒，可以增强方法的执行。实例可以包括基于多孔颗粒的市售的色谱法产品，其具有有意地与第二官能团组合的正电荷。这样的介质通常被称作混合模式。Capto MMC(GE Healthcare)和Nuvia cPrime(Bio-Rad Laboratories)是市售的混合模式色谱法产品的例子，所述产品将正电荷与赋予参与疏水相互作用、π-π键合和氢键合的能力的官能团组合。在文献中已知了类似的组合，且可以预见到额外的市售实体。本领域技术人员显而易见，可能需要修改平衡缓冲液的配方以防止被第二官能团截留或减慢。在CaptoMMC Nuvia cPrime的情况下，例如，可能必须在比销售的用于阳离子交换的色谱介质所要求的条件更高的pH和更高的电导率下操作。另一类所谓的多模式带负电荷介质可以包括所谓的固定化的金属亲和色谱配体(IMAC)诸如亚氨基二乙酸或次氮基三乙酸。但是，第二官能团的包含不会损害本发明的适应样品的能力，无论样品组成如何。这是与标准的流穿和结合-洗脱方法(其在有具有高电导率的样品存在下完全不能达到分级分离)的一个基本的且重要的区别。
在某些其中样品包括诸如上述的组合物的实施方案中，可替换地可能有用的是，将多孔负电性颗粒与具有第二化学官能团的不同颗粒组合，并将两种或几种颗粒类型一起填充在同一柱中。带有第二官能团的颗粒可以是多孔的或无孔的。如上所述，所述方法保持不依赖于样品组成。同样地，平衡条件可受限于暂停抗体和第二官能团之间的相互作用的需要。例如，如果存在带有正电荷官能团的颗粒且特定多核苷酸具有结合这样的电荷的强烈趋势，可能必须降低pH和/或增加电导率。在如上所述的这种情况下，有利的权衡是，一个或多个第二官能团的包含可能实现更高的纯化程度。
在某些其中将多孔负电性颗粒与具有第二官能团的不同颗粒组合的实施方案中，所述不同颗粒可以在负电性颗粒床的上面铺层或填充在单独的柱中，所述单独的柱可以在负电性颗粒柱之前紧挨着或之后紧挨着悬垂。在某些实施方案中，将所述多孔负电性颗粒与带有第二官能团的单独颗粒混合。
在某些替代实施方案中，可以实施所述方法，使得第二颗粒可以预先直接加入样品中，以清除可能引起麻烦的污染物，并然后将所述颗粒与样品分离，使得部分地纯化的样品然后与柱接触。
当开发颗粒混合物以优化特定多核苷酸的纯化时，可以可替换地或额外地根据它们的增强pH控制和/或减小将柱滴定至其期望操作pH所需的缓冲液体积的能力，选择第二官能团。例如，已知阴离子交换剂当暴露于升高的电导率时会产生失控的暂时pH增加。当电导率下降时，它们产生失控的暂时pH下降。这些效应的幅度和持续时间随步骤之间的电导率差异、交换剂的电荷特征和缓冲容量而变化。阳离子交换剂遭受相同的问题，但是失控的pH偏离的方向与阴离子交换剂发生的方向相反。因此，将第二正电性官能团与主要负电性官能团组合会减小pH偏离的幅度和持续时间。通过实验可以容易地确定官能团的理想混合物。
在某些采用不同于负电性颗粒的具有官能团的额外颗粒，且其中将那些不同颗粒与负电性颗粒混合或在负电性颗粒之前填充在柱中的实施方案中，可能必须从施加于仅有负电性颗粒的柱的量向下调节最初样品体积以补偿样品体积的增加，所述增加作为多核苷酸在穿过柱的过程中发生扩散而分散的结果而发生。通过简单实验可以容易地确定最初样品体积的减小(如果有的话)的必要程度，其中判据是平衡缓冲液内的多核苷酸的洗脱。
在某些实施方案中，由于所述方法的有效性不依赖于在样品施加以后立即施加的缓冲液的组成，所述方法不同于带负电荷的多孔颗粒的其它应用。在许多情况下，有利的是，在样品施加之后立即施加缓冲液组合物，其意图完全地洗脱与多孔颗粒结合的材料。例如，可以将柱平衡至25mM乙酸盐(pH 4.5)。将含有多核苷酸的细胞培养物上清液(含有1.0M氯化钠,pH 7.0)以占柱体积的35％的体积施加，然后施加2M氯化钠,pH 8.0。基本上纯化的多核苷酸洗脱在乙酸盐缓冲液中。该现象的原因是，如上所述，多核苷酸仅仅穿过颗粒间空间移动，而追踪-缓冲液还必须穿过颗粒内孔空间移动。该方案的令人注目的特征是，它支持同时洗脱污染物和清洁柱的独特能力，具有缩短过程循环、减少过程时间和材料使用的实际益处。这使得在小柱上执行多个循环(而不是在大柱上的单个循环)成为有吸引力的，这会进一步减少材料使用。
在某些实施方案中，可能有利的是，在样品之后施加平衡缓冲液或较低电导率的缓冲液，例如20mM乙酸盐(pH 4.0)，为了增强具有大于负电性多孔颗粒的平均孔径的流体动力学尺寸的酸性污染物(诸如多核苷酸)的保留的明确目的，因为它们否则可以在多核苷酸的拖尾边界处洗脱，并可能污染它至过度的和非必要的程度。就所述柱可以包括增加的正电性颗粒而言，这也可以增强负电性污染物的除去。从约50％的填充柱体积开始，可以通过实验确定低电导率追踪-缓冲液的理想体积。
在某些实施方案中，所述方法支持比在多孔颗粒上的色谱法常用的流速更快的流速。这是因为，在质量运输是对流的情况下，多核苷酸仅仅穿过颗粒间空间移动，且因此不受多核苷酸的缓慢扩散常数影响，也不受流速或样品粘度影响。因此，所述方法可以在高达1000cm/小时或更大的线性流速高效地实施，与此相比，普通的多孔颗粒色谱法操作在50-100cm/小时或更低进行。但是，超过300cm/小时的流速可能需要减小的样品体积。这是因为，能够进入孔中的污染物的质量运输是扩散性的，在增加流速或样品粘度的情况下变得低效。过度的流速会使污染物具有更少的机会达到与多孔颗粒的孔的扩散平衡。实验将揭示任何给定的多核苷酸和缓冲液组合物集合的理想流速。
在某些其中将负电性的多孔颗粒组合在带有其它表面化学成分的多孔颗粒的柱中的实施方案中，通常有用的是，将最大样品体积仅仅基于负电性颗粒的体积。即使那样，可能需要谨慎地通过实验确定最大样品体积，因为缺少负电性表面的颗粒的存在可能具有稀释柱内的样品的效应。
在某些实施方案中，可以将带有表面化学成分(而不是负电性)的颗粒填充在单独的柱中，所述单独的柱与负电性颗粒柱串联悬垂。在这样的构型中，可以适用与以下情形讨论的相同的注意事项：将其它化学颗粒与负电性颗粒混合在同一柱中。
在某些实施方案中，本文中公开的方法可以用于样品制备以后的初步纯化步骤中。在其它实施方案中，它可以用于中间纯化，或它可以用于最终纯化。本领域技术人员显而易见，在其中没有将所述方法用作过程的最后一个步骤的任何情况下，它具有如下促进总过程连续性的能力：通过它在减少污染物的同时用缓冲液交换样品的能力。
在某些实施方案中，本发明可以与其它纯化方法结合实施。具体地，它可以与尺寸排阻、阴离子交换、阳离子交换、疏水相互作用、差别排阻、羟磷灰石或其它形式或混合模式色谱法或生物亲和色谱法以任意组合使用；也与沉淀、结晶、超速离心和水性两相分配方法结合使用。
得到经加工的多核苷酸以后，可以抛弃柱的内容物。可替换地，可以用高浓度的盐清洁柱，然后通过重新平衡来恢复至原始条件，使得它可以用于额外的循环。也可以用适当的试剂(诸如氢氧化钠)将所述柱消毒。
在某些实施方案中，可以将本发明机械化和自动化以增加处理量。在某些这样的实施方案中，例如，所述方法可以包括：自动化的多柱系统，诸如用于执行模拟的移动床色谱法。
实施例
提供下述实施例来指导本发明的实施。尽管提供的实施例具体地显示了DNA的不同纯化，但是本领域技术人员会明白，类似的条件和原理可以应用于RNA和其它天然的或非天然的多核苷酸的纯化。此外，本领域技术人员会明白，在操作一些核苷酸(诸如RNA)时，由于它们极大的不稳定性，适当的警惕可能是必要的。这样的必要警惕完全是在本领域技术人员的权限内。
实施例1.用多孔颗粒阳离子交换介质(Nuvia S,Bio-Rad)填充柱。用50mM Hepes(pH 7.0)平衡柱。将哺乳动物(中国仓鼠卵巢(CHO))细胞在4M胍中匀浆化。通过离心使物理碎片沉淀。将在4M胍中的上清液(占柱体积的20％)施加于柱，并用平衡缓冲液追踪样品。超过90％的DNA洗脱在平衡缓冲液中。稍后与来自原始样品的胍的通过一起，除去蛋白和其它污染物。
实施例2.如实施例1所述，将得自鲑鱼精的纯化的DNA施加于柱。平衡缓冲液是50mM Tris(pH 8.0)，其导致DNA洗脱在该缓冲液中。将洗脱的DNA直接施加于平衡至相同条件的阴离子交换整体料(QA)。随后用盐梯度从阴离子交换整体料洗脱DNA，以约60mS/cm的电导率洗脱。本实施例解释了可以如何使用本发明在单个单元操作中纯化DNA和制备用于后续方法步骤的样品。
实施例3.如实施例2所述，将得自鲑鱼精的纯化的DNA施加于Nuvia S柱。平衡缓冲液为50mM Hepes、50mM磷酸盐(pH 7.0)，其导致DNA洗脱在该缓冲液中。将洗脱的DNA直接施加于羟磷灰石(CHT I型,40微米)的柱，然后洗脱在磷酸盐梯度中，在约225-275mM磷酸盐mS/cm的磷酸盐浓度范围内洗脱。本实施例提供了可以如何使用本发明在单个单元操作中纯化DNA和制备用于后续方法步骤的样品的另一种解释。普通技术人员会明白，本发明可以类似地用于连接2个纯化步骤，例如用羟磷灰石执行初步纯化步骤，使用本发明实现额外的纯化，同时平衡样品用于施用于阴离子交换柱，然后执行阴离子交换步骤。普通技术人员会明白，这样的3-步法可以适合用于将基因治疗载体纯化至适合于体内人治疗的水平。
实施例4.从新鲜哺乳动物细胞纯化DNA。通过离心从细胞培养物浓缩中国仓鼠卵巢细胞。抛弃上清液，并将干燥的胍直接加入样品中，以建立3M的终浓度。将细胞在胍中手工地匀浆化，然后通过离心除去大部分微粒，随后通过穿过0.45微米膜过滤完全除去它们。将5mL澄清上清液样品施加于20mL的UNOsphere Rapid S柱，该柱平衡至0.05M乙酸盐(pH4.1)。样品之后施加足够的缓冲液，以推进样品穿过柱。同时在254和280nm监测柱流出物。洗脱峰的254/280比率为约1.7，指示高度地、但是不完全纯化的DNA。污染物和胍洗脱在第二个峰中，并抛弃。将在0.04M乙酸盐(pH 4.1)中的含有DNA的样品滴定至pH 7.0，并施加于平衡至相同条件的QA 334微升整体盘进行进一步纯化。将整体料用5分钟线性梯度洗脱至1M NaCl(4mL/min)。DNA在0.6M NaCl时洗脱在具有2:1的254/280比率的尖锐峰中，指示非常高的纯度。
实施例5.从干燥的哺乳动物细胞纯化DNA。遵循实施例4的形式，但是将在培养皿上以薄层涂片的CHO细胞在通风橱中干燥过夜，然后在5M胍(pH 5)中匀浆化。结果与在实施例4中得到的相同。
实施例6.在带负电荷的疏水多模式色谱介质上的DNA纯化。将得自鲑鱼精的纯化的基因组DNA再悬浮于50Hepes、100mM NaCl(pH7.0)中。将样品穿过0.22微米膜过滤以除去微粒，然后将5mL施加于用Capto MMC(由负电荷、疏水残基和氢键合残基组成的多模式色谱介质)填充的20mL柱，该柱平衡至50mM乙酸盐、100mM NaCl(pH 4.0)。90％的DNA完全分配至空隙体积中并洗脱在乙酸盐缓冲液中，剩余的DNA在盐穿过柱以后洗脱。
实施例7.在带负电荷的金属亲和多模式色谱介质上的DNA纯化。将得自鲑鱼精的纯化的基因组DNA再悬浮于50Hepes、100mM NaCl(pH 7.0)中。将样品穿过0.22微米膜过滤以除去微粒，然后将5mL施加于用Capto MMC(由构造成提供金属亲和力的负电荷组成的多模式色谱介质(UNOsphere Profinity))填充的20mL柱，平衡至50mM乙酸盐、100mM NaCl(pH4.0)。DNA完全分配至空隙体积并洗脱在乙酸盐缓冲液中。
鉴于样品体积相对于柱体积的重要性，本领域技术人员会认识到以不导致样品在样品边界处失控分散的方式施加样品的重要性，这将具有在样品可以进入柱中之前非故意地增加样品体积的作用。借助于被称作超环的装置(其特别地避免在样品边界处的分散)，将样品施加于所有以上实施例。
本领域普通技术人员会明白，可以施加样品来纯化其它多核苷酸并具有同样的成功预期。实例具体地包括RNA。
本发明可以与其它纯化方法组合以达到较高的纯化水平。这样的其它纯化方法的例子包括、但不限于：常用于纯化多核苷酸的其它方法诸如超速离心、超滤、密度梯度过滤、亲和色谱法、阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、固定化的金属亲和色谱法和其它混合模式色谱方法；以及沉淀、结晶和液-液萃取的方法。开发适合于不同方法的条件并将它们与本文中的发明结合以达到特定多核苷酸的必要纯化，是在本领域普通技术人员的权限内。
本文中引用的所有参考文献都以它们的整体通过引用并入且用于所有目的，达到如同明确地且单独地指出每篇单独的出版物或专利或专利申请通过引用整体并入用于所有目的的相同程度。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与在本说明书中含有的公开内容矛盾的情况下，本说明书意图替代和/或优先于任何这样的矛盾材料。
在本说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、色谱法条件、诸如此类的所有数字，在所有情况下应理解为由术语“约”修饰。因此，除非相反说明，否则在说明书和所附的权利要求书中阐述的数字参数是近似值，所述近似值可以随本发明寻求得到的期望性能而变化。
本领域技术人员会明白，可以做出本发明的许多修改和变化，而不背离本发明的精神和范围。本文描述的具体实施方案仅仅作为示例而提供，且无意以任何方式进行限制。说明书和实施例意图仅仅视作示例性的，本发明的真实范围和精神由下述权利要求指定。

Claims (32)

1.纯化包含多核苷酸的样品的方法，所述方法包括下述步骤：(i)提供填充的色谱柱，其包含带负电荷的多孔颗粒，(ii)将所述填充的色谱柱平衡至允许所述多核苷酸洗脱的条件，(iii)使所述样品与所述填充的色谱柱接触，使得施加的样品体积小于或等于所述填充的色谱柱内的带负电荷的多孔颗粒的颗粒间空间，(iv)从所述填充的色谱柱洗脱多核苷酸，其中所述多核苷酸处于更纯的状态。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸是基因组DNA、细胞器DNA、质粒DNA、单链DNA、或双链DNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸是线粒体DNA或叶绿体DNA。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是未纯化的，处于中间纯度水平，或高度纯化的。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸在施加于所述柱之前已经经过浓缩。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸在施加于所述填充的色谱柱之前已经通过超滤进行浓缩。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品在施加于所述填充的色谱柱之前已经预先在使多核苷酸基本上不结合一个或多个带负电荷的表面的条件下暴露于所述表面。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述一个或多个带负电荷的表面进一步包含第二反应性，所述第二反应性包括参与疏水相互作用、金属亲和相互作用或它们的组合的能力。
9.根据权利要求7或8中的任一项所述的方法，其中所述一个或多个带负电荷的表面包括膜、整体柱、一个纤维或多个纤维、一个颗粒或多个颗粒或其组合。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述填充的色谱柱仅用带负电荷的多孔颗粒填充，且样品体积小于所述填充的色谱柱的体积的40％。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述填充的色谱柱被平衡至在2至9范围内的pH。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述填充的色谱柱被平衡至在0.1mS/cm至30mS/cm范围内的电导率值。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述填充的色谱柱用具有在选自以下范围内的pH的缓冲液平衡：(1)2至8，(2)4至7，和(3)4.5至6.0。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述填充的色谱柱被平衡至在0.1mS/cm至15mS/cm范围内的电导率值。
15.根据权利要求1所述的方法，其中为了在包含多核苷酸的洗脱液上进行后续纯化步骤中使用，所述填充的色谱柱被平衡至处于或接近样品施加条件的条件。
16.根据权利要求1所述的方法，其中用于使所述样品与所述填充的色谱柱接触的样品施加条件包括在2至10范围内的pH。
17.根据权利要求1所述的方法，其中平衡所述填充的色谱柱的步骤包括：向所述填充的色谱柱施加具有在4至9的范围内的pH的平衡缓冲液。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述平衡缓冲液的电导率值包括0.1mS/cm至30mS/cm的范围。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述带负电荷的多孔颗粒包括阳离子交换颗粒。
20.根据权利要求1所述的方法，其中由选自羧基、磺基或磷酰基的基团部分地将电负性赋予所述带负电荷的多孔颗粒。
21.根据权利要求1所述的方法，其中除了所述带负电荷的多孔颗粒以外，所述填充的色谱柱还包含其它颗粒。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述带负电荷的多孔颗粒具有选自以下的一个或多个第二官能团：带负电荷的或带正电荷的基团、疏水基团、氢键合基团、π-π键合基团和金属螯合基团。
23.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括：在使所述样品与所述填充的色谱柱接触的步骤之前，使所述样品与一种或多种污染物解离剂接触的额外步骤。
24.根据权利要求23所述的方法，其中在使所述样品与所述柱接触的步骤之前，所述污染物解离剂选自：盐、非离子有机聚合物、有机溶剂、表面活性剂和离液剂。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述污染物解离剂是选自聚乙二醇、聚丙二醇和聚丁二醇的非离子有机聚合物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述非离子有机聚合物具有在130D至1000D的范围内的平均分子量。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述污染物解离剂是选自乙二醇、丙二醇、丁二醇、二甲基亚砜、乙醇和苯氧乙醇的有机溶剂。
28.根据权利要求23-27中的任一项所述的方法，其中以在0.01％至25％重量/体积范围内的浓度提供所述污染物解离剂。
29.根据权利要求24所述的方法，其中所述污染物解离剂是选自吐温、Triton、CHAPS、CHAPSO和辛基葡萄糖苷的表面活性剂。
30.根据权利要求29所述的方法，其中以在0.001％至1％重量/体积的范围内的浓度提供所述表面活性剂。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中以在0.001％至0.1％重量/体积的范围内的浓度提供所述表面活性剂。
32.根据权利要求21所述的方法，其中所述带负电荷的多孔颗粒、所述其它颗粒中的至少一种或二者具有选自以下的一个或多个第二官能团：带负电荷的或带正电荷的基团、疏水基团、氢键合基团、π-π键合基团和金属螯合基团。
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