CN103501871A - 质粒dna亚型和拓扑异构体的液相分离 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含氨基甲酰基修饰的阴离子交换配体的材料在分离质粒DNA(pDNA)的亚型、拓扑异构体、低聚形式和高聚形式中的用途，其中阳离子基团(C)和氢供体基团(N-H)由3至5个原子长度的间隔基连接，固定在或嵌入到非均质基质。

Description

质粒DNA亚型和拓扑异构体的液相分离
发明领域
本发明涉及分离质粒DNA的亚型、拓扑异构体、低聚形式和高聚形式的色谱材料和方法，该质粒DNA通过使用氨基甲酰基修饰的阴离子交换配体固定在或嵌入到到非均质基质。
发明背景
质粒DNA(pDNA)是染色体外的遗传单位，其为宿主细胞提供附加的功能。自从发现其在基因治疗或遗传接种的重大潜力，这些新型药物的生物技术产物引起了非常大的重视(Schleef,M.,Plasmids for Therapy and Vaccination,Wiley-VCH,Weinheim2001)。在许多可能的亚型中，所谓的共价闭合环型(ccc)被认为对治疗是最有效的。药用级ccc质粒DNA是在大肠杆菌中发酵然后经过pDNA的获取、碱性裂解和多步纯化制得的(Urthaler,J.等,Journal ofBiotechnology,2007,128,pgs:132-149)。对于人类基因治疗，所有这些步骤必须满足监管指南的要求。因此，应避免使用动物来源的化合物(例如酶，例如鸡卵清溶菌酶)和/或有毒试剂。此外，生产过程必须保证低水平的宿主相关杂质(例如细菌宿主的内毒素)，参阅Urthaler,J.,Chemical Engineering &Technology,2005,28,pgs:1408-1420。此外，有关其他pDNA亚型的ccc型在生物活性药物的最终制剂中建议具有高含量(FDA,U.,in:Administration,F.a.D.(Ed.),Considerations for Plasmid DNA Vaccines for Infectious DiseaseIndications,Rockville,MD2007)。
除了在质量控制中，在上游和下游加工过程中也需要对质粒亚型分布进行可靠分析。除了ccc型，治疗和接种效果较差的其他类型需要被监控：(a)由ccc型通过DNA主链的单个断口形成的开环型(oc)，和(b)当两个断口紧挨着时形成的直线型(lin)。除了这些单体型，在发酵过程中也可产生二聚形式和低聚形式(Lahijani,R.等,Human Gene Therapy,1996,7,pgs:1971-1980)，例如串联型(即，长的连续DNA分子，其包含串联连接的多重复制的相同DNA序列)和连环型(即，彼此交织成链的环状DNA)。连环DNA是环对环连接，而连锁DNA是端对端连接。
有多种有效分离总质粒DNA的方法(Stadler J.等,J Gene Med,2004;6,pgs:S54–S66)，例如嗜硫芳香色谱(Sandberg,L.M.等,Journal of Biotechnology,2004,109,pgs:193-199)，疏水相互作用色谱(Ferreira,G.N.M.等,Pharm.Pharmacol.Commun.,1999,5,pgs:57-59；Diogo,M.M.等,Journal ofChromatography A,2005,1069,pgs:3-22；Tiainen P.等,Journal ofChromatography A,2007,1138,pgs:84-94；Urthaler J.等,Chemical Engineeringand Technology,2005,28,pgs:1408-1420)或肽亲和色谱(Han Y.和Gareth M.F.,J.Chromatogr.B,2008,874,pgs:21-26)。在EP 1 187 840 B1中公开了使用疏水相互作用色谱(HIC)制备分离两种pDNA亚型(ccc和oc)。但是，这个分离方案是基于非特异性(即疏水性)相互作用，且与根据本发明的方法相比，分离效果相对较低(如图7所示)。此外，由于HIC分离需要极高负载的亲液盐(cosmotropic salt)(如图1所示)，该负载后得到的产物溶液需要相应的脱盐，即通过使用例如体积排阻色谱、透析或膜分离将大量的盐除去。此外，经济地处理积累的盐是非常必要的。此外，描述了使用聚(L-赖氨酸)硅藻土色谱分离多种类型的核酸(例如在Finkelstein D.B.等,J.Biochemistry,1972,11,25,pgs:4853-8；或在Monaghan-Cannon M.和Dunican L.K.,The BiochemicalJournal,1969,115,3,7P)。此外，公开了氨基酸(精氨酸、组氨酸、赖氨酸)亲和色谱分离(a)为了分析用，在Sousa A.等,J.Sep.Sci.2010,33,pgs:2610–2618，和(b)为了制备目的，在Sousa F.等,Trends in Biotechnology,Vol.26No.9,2008,pgs:518-525。最近，在Y.Han等,J.Chromatogr.B,2008,874,pgs:21-26中报道显示一个连接到聚甲基丙烯酸酯整体色谱柱(monolith)的16-肽，其序列为NH2-Cys-Met-Lys-Tyr-Val-Ser-His-Gly-Thr-Val-Ser-Arg-Val-Val-Asn-Gln-COOH，其可以与pDNA结合并对一些亚型具有选择性。
ccc质粒的天然样品包含一系列不同程度超螺旋的独特的拓扑异构体(topological isomer,topoisomer)。这些ccc拓扑异构体有不同的连接数，因此有不同的超螺旋转数(Depew,R.E.,Wang,J.C.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1975,72,pgs:4275-4279)。超螺旋包含两种分量，扭转(Tw)和缠绕(Wr)，两者是可互变的，但在某一个拓扑异构体中，两者的总量是不变的。细菌质粒在生物工程学、分子生物学和新型生物药物和治疗的研发中是一个重要元素，其在体内呈负超螺旋。超螺旋的数量大约是6%左右，这意味着在标准条件下，最普遍类型的DNA(称为B-DNA)的每100个螺旋翻转平均引入6个负超螺旋，相应的平均每1050个碱基对(如果用于计算的标准值是每翻转有10.5个碱基对)有6个负超螺旋。根据昼夜节律，在体内发现拓扑异构型在细菌细胞增殖中被改变(Woelfle,M.A.,PNAS,2007,104,47,pgs:18819-18824)。
有关质粒拓扑异构体的分离方法，有多种可用的基于凝胶的电泳法，其中包含高分辨率的毛细管凝胶电泳(Schmidt,T.等,Analytical Biochemistry,1999,274,pgs:235-240)，但是全部都要承受低耐用，低样品耐盐性和高时间消耗。在DNA嵌入试剂的前提下，这一操作中可导致不必要的毒性。因此，在分析和制备应用中，基于液相色谱的方法是优选的。大量不同的色谱应用和不同色谱载体对制备具有各种质量偏好的质粒纯化是有用的(例如，Diogo,M.M.等,Journal of Chromatography,A2005,1069,pgs:3-22；Wu,L.,Pang,G.-c.,Chromatographia2007,66,pgs:151-157;Tiainen,P.等,Journal ofChromatography,A2007,1149,pgs:158-168；Sousa,F.等,AnalyticalBiochemistry2005,343,pgs:183-185；或Urthaler,J.等,Journal ofChromatography,A2005,1065,pgs:93-106)。但是，分析量的选择局限于阴离子交换柱，例如Tosoh Bioscience的DNA-NPR(Tosoh Corporation,Tokyo,Japan)或Waters的GenPak Fax(Waters Corporation,Milford,Massachusetts,USA)，它们利用相同的基本材料，即由亲水有机聚合物与基于二乙基氨基乙基(DEAE)的配体组成的2.5μm无孔颗粒。拓扑异构体分布目前仅可通过电泳技术来分析。除此之外，本领域既没有材料也没有方法(包含色谱法)可用于分离这个类型的ccc质粒DNA。
通常，任一色谱方法的效果主要依赖于三个要素：(1)分离室的长度，例如装载了色谱材料的色谱柱，(2)描述了被分析物在色谱柱上的移动速率的保留因子(容量因子)，和(3)表示两种被分离物间的保留因子的比的选择性。最具影响的为最后一个要素，其中载体材料(也称为固相/基质/载体)的性质和连接在或嵌入到载体的配体的性质都影响其选择性。
用于小分子的伴有中等大小孔(细孔)的多孔载体不让生物分子进入其中(Rozing,G.P.,Journal of Chromatography A,1989,476,pgs:3-19)。大宗运输大的多孔材料缓慢且样品回收率低。在分析领域中，最有希望的选项为以无孔颗粒表面的薄保留层为特征的微膜固定相(Huber,C.G.,Journal ofChromatography,A,1998,806,pgs:3-30)。另一选择为整体色谱柱(尤其适用于制备用途)，因为其结合容量极好和分析极快，且在快速柱流动中分辨率高和没有质量转移限制(Hahn,R.等,Separation Science and Technology,2002,37,pgs:1545-1565)。
在本领域中，用于质粒分离的离子交换色谱中应用的配体不受关注，其中使用了简单的叔胺(例如DEAE，二乙基氨基乙基)或季胺(通常缩写为Q)作为标准。这些不确定组分根据被分析物的负电荷数分离核苷酸(Wieder,W.等,Journal of Separation Science,2006,29,pgs:2478-2484)，导致了分离的相对不充分。因为分离(其与分析和制备方法高度相关)取决于电荷密度和水动力因子(Onishi,Y.等,Analytical Biochemistry,1993,210,pgs:63-68)，可以观察到与障碍色谱(slalom chromatography)(即其中DNA分子穿过闭合色谱柱的过程沿着流动方向，而且类似蛇前进，被称为”蛇行”)相似的效果。在该方法中，pDNA异构体分离取决于流速和梯度斜率(Smith,C.R.等,Journal of Chromatography,B:Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences,2007,854,pgs:121-127)，导致该系统更不稳健和更难预测。此外，Molloy等,Nucleic AcidResearch,2004,32,e129/121-e129/110中指出通过使用基于DEAE配体的离子交换色谱分离质粒的一些缺点，其中与应用琼脂糖凝胶电泳相比，在cccpDNA样品中oc亚型(杂质)的计量含量显著更低。
包括辛可尼丁氨基甲酸酯(cinchonan carbamate)和辛可尼丁脲(cinchonanurea)的各种辛可尼丁生物碱配体在不对称有机合成(WO92/20677和US6197994B1)中被公开为手性催化剂，和在分析化学(Laemmerhofer M.等,Journal of Chromatography,A1996,741,pgs:33-48；WO97/46557；US6616825B1；Lee Y.-K.等,Polymer43,2002,pgs:7539–7547)中被公开为手性判别剂(即手性选择剂)。此外，氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)配体结构目前已经被描述在Sousa F.,Queiroz J.A.,J of Chromatography A,doi:10.1016/j.chroma.2010.11.002(发表中)和Sousa A等,J.Sep.Sci.2010,33,pgs:2610–2618中，用于以分析规模分离oc和ccc pDNA亚型。
本领域中尚无通过使用色谱法(包含亲和色谱法)有效分离所有三种pDNA亚型(ccc、oc和lin)的完整、充分稳健、可预测、可靠和精确的方法和/或材料，无论在制备规模还是分析规模。
发明概述
该发明涉及包含根据式1中的配体的材料在分离质粒DNA亚型或拓扑异构体中的用途：
其中，该配体包含阳离子基团(C)和氢供体基团(N-H)，它们由3至5个原子长度的间隔基连接，
m、o和r彼此独立地为0或1，和
k、l、n和p彼此独立地为0、1或2，和
Y是选自-CH2-、-O-、-NH-或-S-基团的任一基团，
Z是选自-C-、-S-或-P-基团的任一基团，和
R1、R2和R3是任一选自下列的取代基团：氢、C1-18支链或非支链烷基、C2-18支链或非支链烯基、C2-18支链或非支链炔基、C3-11-碳环、C3-8-杂环、C5-18-芳基和C5-13-杂芳基，
其中，R1、R2和R3彼此独立地任选地包含一个或多个选自-S-、-O-、-NH-的基团，和
R1、R2和R3中的每一个可任选地和独立地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自氢、C1-6支链或非支链烷基、C2-6支链或非支链烯基、C2-6支链或非支链炔基、C3-8-碳环、C3-8-杂环、C5-10-芳基、C5-10-杂芳基，和
其中，阳离子基团C是C3-11杂环，其包含至少一个氮原子和任选地另一个选自硫、氧、氮和磷的杂原子，或
C5-18杂芳基包含至少一个氮原子和任选地另一个选自硫、氧、氮和磷的杂原子，或
支链或非支链C1-10烷基、支链或非支链C2-10烯基、支链或非支链C2-10炔基包含至少一个氮原子和任选地另一个选自硫、氧、氮和磷的杂原子，其中，C和R3或C和R2通过成环彼此任选地连接，和
其中，该配体通过R1或R3基团任选地固定在或嵌入到基质。
此外，本发明涉及分离质粒DNA亚型(包括共价闭合环型(ccc)、开环型(oc)和直线型(lin)、低聚形式和高聚形式，例如单体、二聚体、三聚体、四聚体、低聚体、多聚体，和/或ccc拓扑异构体)的方法，该方法通过使用根据本发明的材料。
发明详述
出乎意料地发现，根据本发明的材料(包含一个氨基甲酰基修饰的离子交换配体，其固定在或嵌入到非均质基质)可用于分离质粒DNA(pDNA)亚型、拓扑异构体、低聚形式和高聚形式。
在其最广泛的方面，本发明提供一种材料，其包含根据式1的配体
Figure BDA0000403233220000061
其中，配体包含阳离子基团(C)和氢供体基团(N-H)，它们由3至5个原子长度的间隔基连接，
m、o和r彼此独立地为0或1，和
k、l、n和p彼此独立地为0、1或2，和
Y是选自-CH2-、-O-、-NH-或-S-基团的任一基团，
Z是选自-C-、-S-或-P-基团的任一基团，和
R1、R2和R3是任一选自下列的取代基团：氢、C1-18支链或非支链烷基、C2-18支链或非支链烯基、C2-18支链或非支链炔基、C3-11-碳环、C3-8-杂环、C5-18-芳基和C5-13-杂芳基，
其中，R1、R2和R3彼此独立地任选地包含一个或多个选自-S-、-O-、-NH-的基团，和
R1、R2和R3中的每一个可任选地和独立地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自氢、C1-6支链或非支链烷基、C2-6支链或非支链烯基、C2-6支链或非支链炔基、C3-8-碳环、C3-8-杂环、C5-10-芳基和C5-10-杂芳基，和
其中，阳离子基团(C)是C3-11杂环，其包含至少一个氮原子和任选地另一个选自硫、氧、氮和磷的杂原子，或
C5-18杂芳基包含至少一个氮原子和任选地另一个选自硫、氧、氮和磷的杂原子，或
支链或非支链C1-10烷基、支链或非支链C2-10烯基、支链或非支链C2-10炔基包含至少一个氮原子和任选地另一个选自硫、氧、氮和磷的杂原子，其中，C和R3或C和R2通过成环彼此任选地连接，和
其中，该配体通过R1或R3基团任选地固定在或嵌入到基质，
其用于分离质粒DNA亚型或拓扑异构体。
其中一个更优选的实施方案表示根据式2的材料
Figure BDA0000403233220000071
其中NA表示阳离子基团的氮原子，
NB-H是氢供体(与羰基C=O相邻)，
Y是氧(–O–)因此形成氨基甲酸酯基团或
Y是(-NH-)因此形成脲基团，和
R1、R2、R3是任一选自下列的取代基团：氢、C1-18支链或非支链烷基、C2-18支链或非支链烯基、C2-18支链或非支链炔基、C3-11-碳环、C3-8-杂环、C5-18-芳基和C5-13-杂芳基，
其中R1、R2和R3彼此独立地任选地包含一个或多个选自-S-、-O-、-NH-的基团，和
其中R1、R2和R3可任选地和独立地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自氢、C1-6支链或非支链烷基、C2-6支链或非支链烯基、C2-6支链或非支链炔基、C3-8-碳环、C3-8-杂环、C5-10-芳基和C5-10-杂芳基，和
其中该取代任选地包含通过R1或R3的锚定至基质，
其用于分离质粒DNA或拓扑异构体。
在根据式2的一个最优选的实施方案中，Y=-O-，R1是烷基，其固定在二氧化硅或巯基丙基修饰(thiolpropyl-modified)的二氧化硅上，R2是甲氧基喹啉和R3是乙基或乙烯基。
根据本发明的术语“材料”涉及和包含氨基甲酰基修饰的阴离子交换型配体，其任选地固定在或嵌入到非均质(固相或液体)基质，例如色谱载体、底物、薄膜或液相。
在本发明含义内，术语“氨基甲酰基”涉及选自-O-C(=O)-NH-、-C(=O)-NH-、-C(=O)-NH2的部分，或其也可是脲-NH-C(=O)-NH-或卡巴肼-NH-NH-C(=O)-NH-的部分。
在本发明含义内，氨基甲酰基不排除其他电子等排官能团，其包含氢-供体受体系统，例如磺酰胺、磷酰胺和相似的官能团，如式2所定义。
根据本发明的术语“配体”涉及和包含以下化学结构，其经过连接基连接或嵌入到基质，其能够与质粒DNA相互作用。配体优选的实施方案是喹核(quincorine)-或喹核醇(quincoridine)-氨基甲酸酯或喹核-或喹核醇-脲。在上下文中分离质粒DNA亚型、拓扑异构体、低聚形式和高聚形式的用途中，一个更优选的实施方案是辛可尼丁氨基甲酸酯和辛可尼丁脲，最优选奎宁-或奎尼丁-氨基甲酸酯，尤其丙基氨基甲酰基-奎宁或奎尼丁，叔丁基氨基甲酰基-奎宁或奎尼丁，和烯丙基氨基甲酰基-10,11-二氢奎宁或奎尼丁。
术语“任选地被取代”是指亚甲基基团的氢原子或芳香环或杂芳环的氢原子被不同的有机或无机取代基取代。
本文中术语“C1-18-烷基”是指由1到18个碳原子组成的饱和的支链或非支链碳氢化合物链。
本文中术语“C1-6-烷基”是指由1到6个碳原子组成的饱和的支链或非支链碳氢化合物链。
本文中术语“C2-18-烯基”是指由2到18个碳原子组成的不饱和的支链或非支链碳氢化合物链，其中包含至少一个双键。
本文中术语“C2-6-烯基”是指由2到6个碳原子组成的不饱和的支链或非支链碳氢化合物链，其中包含至少一个双键。
术语“C2-18-炔基”是指由2到18个碳原子组成的不饱和的支链或非支链碳氢化合物链，其中包含至少一个叁键。
本文中术语“C2-6-炔基”是指由2到6个碳原子组成的不饱和的支链或非支链碳氢化合物链，其中包含至少一个叁键。
术语“支链”是指碳氢化合物链(其任选地包含一个选自硫、氧或氮的链原子)中至少有一个原子共价地连接到另一个链原子上。
术语“非支链”是指碳氢化合物链(其任选地包含一个选自硫、氧或氮的链原子)中任一原子均未共价地连接到另一个链原子上。
在本发明的含义内，术语“链原子”是指存在两个分开的键的原子，例如碳、硫、氧或氮。
术语“C3-11-碳环”是指脂肪族碳氢化合物，其有3至11个碳环原子。
术语“C3-8-碳环”是指脂肪族碳氢化合物，其有3至8个碳环原子。
术语“C3-8-杂环”是碳环，其包含3至8个环原子，其中至少有一个环原子不是碳而是选自N、O或S的原子。
术语“C5-18-芳基”是芳香的碳氢化合物环，该环有5至18个环原子。
术语“C5-10-芳基”是芳香的碳氢化合物环，该环有5至10个环原子。
术语“C5-13-杂芳基”是芳香环，该环有5至13个环原子，其中至少有一个环原子不是碳而是选自N、O或S的原子。
术语“C5-10-杂芳基”是芳香环，该环有5至10个环原子，其中至少有一个环原子不是碳而是选自N、O或S的原子。
在一个优选的实施方案中，R1是选自氢、C1-8支链或非支链烷基、C2-8支链或非支链烯基和C2-8支链或非支链炔基的取代基中的任一个，其任选地包含一个或多个硫原子。
在另一个优选的实施方案中，R1是选自C3-8-碳环、C5-8-杂环、C5-10-芳基和C5-9-杂芳基的取代基中的任一个。
在更优选的实施方案中，R3是选自氢、C1-8支链或非支链烷基、C2-8支链或非支链烯基和C2-8支链或非支链炔基的取代基中的任一个，其任选地包含一个或多个硫原子。
在另一优选的实施方案中，R2是选自氢、C5-10-芳基和C5-9-杂芳基的取代基中的任一个。
在根据式1的一个最优选的实施方案中，o=0和m=1或o=1和m=0。
在根据式1的更优选的实施方案中，o=0和m=1，和k=1和l=1，Z是-C-和n=1。或者，在另一个最优选的实施方案中，o=1和m=0，和k=1和l=1，Z是-C-和p=1。
在根据式1的更优选的实施方案中，o=0和m=1，和k=1和l=1，Z是-S-和n=2。
在根据式1的更优选的实施方案中，o=1和m=0，k=1和l=1，Z是-S-和p=2。
术语“锚定至基质”是指任一取代基，其在配体和基质间或在配体和连接在基质上的残基间形成一个稳定的连接。
根据本发明的术语“分子量”是指根据本发明的配体的组成原子的相对原子质量的总和。在优选的实施方案中，配体的分子量在200至2000Da之间，更优选在250至1200Da之间，最优选在400至700Da之间。
“阳离子基团C”是C3-11杂环，其包含至少一个氮原子和任选的另一个选自硫、氧、氮和磷的杂原子，或
C5-18杂芳基，其包含至少一个氮原子和任选的另一个选自硫、氧、氮和磷的杂原子，或
支链或非支链C1-10烷基、支链或非支链C2-10烯基、支链或非支链C2-10炔基，其包含至少一个氮原子和任选的另一个选自硫、氧、氮和磷的杂原子，
其中C和R3或C和R2通过形成一个环彼此任选地连接。
在本发明的含义内，术语“环”是指单环、双环、多环或螺环。
在更优选的实施方案中，阳离子基团被掺入环系统或双环系统中。
在优选的实施方案中，双环系统为托品烷、(氢)喹诺里西啶、(氢)吡咯双烷、1-氮杂-金刚烷、氮杂双环[3.2.1]辛烷、氮杂双环[3.2.1]壬烷、氮杂双环[3.3.1]壬烷、(氢)吲哚里西啶、(氢)苯并咪唑、(氢)喹啉、(氢)异喹啉，更优选氮杂双环[4.4.0]癸烷，最优选喹核碱。
在本发明的含义内，术语“阳离子基团”还指包含一个氮原子的部分，所述氮原子带有部分或固定的正电荷，其选自叔胺、季铵、仲胺、伯胺或胍，脒和(杂)芳香胺基。阳离子基团的优选实施方案表示脂肪族的胺，更优选季胺，最优选叔胺。在一个最优选的实施方案中，叔胺是喹核碱的一部分。
术语“氢供体部分”是指结合到电负性原子(例如氮、氧或氟)的氢原子的组合。
术语“氢受体基团”是指具有至少一个自由电子对的负性原子(例如氧、氮、氟或硫)。
在本发明的含义内，术语“间隔基”是指一组特定数量的邻近原子，其两端被连接到功能重要的实体，即一端连接阳离子基团(C)且另一端连接氢供体部分(N-H)。邻近原子的数量按照穿过原子链的最短距离计酸。间隔基的长度在3到5个原子之间。在最优选的实施方案中，间隔基的长度等于4个原子。
在另一更优选的实施方案中，根据本发明的配体离基质的距离不大于6个原子。
在本发明的含义内，术语“固定”是指共价结合到固体或液体基质(载体)上。
在本发明的含义内，术语“嵌入”是指非共价包埋入固体或液体基质(载体)中。
术语“锚定至基质”是指任一取代基，其在配体和基质间或在配体和连接在基质上的残基间形成一个稳定的连接。
在本发明的含义内，术语“非均质基质”是指不能与溶剂混成一体的基质(载体)，其包含不溶的或不混溶的溶解的质粒DNA。
术语“质粒DNA”是指染色体外遗传单位，其包含双链脱氧核糖核酸。
在本发明的含义内，术语“亚型”是指相同分子量的质粒DNA的不同形式，其选自共价闭合环(ccc)、开环(oc)和直线(lin)质粒。该亚型的相关分析应被称为亚型分析。
在本发明的含义内，术语“低聚和多聚”是指不同分子量的质粒DNA的不同形式，其源自单体亚型组合成较大分子，其分子量是单体的整倍数。因此，术语低聚表示2、3或4个单体的组合，而术语多聚表示5和多个单体的组合。低聚和多聚组合可以以连环型或串联型的形式。
根据本发明的术语“连环型”是指环状DNA，其交织连接成一个链。
根据本发明的术语“串联型”是指长的连续的DNA分子，其包含串联连接的多重复制的相同DNA序列。
术语“连环型”和“串联型”的特征在于连环的DNA是环对环连接，而串联的DNA是端对端连接。
在本发明的含义内，术语“拓扑异构体”是指不同超螺旋程度的共价闭合环(ccc)质粒DNA分子，其通过拓扑异构连接数或连接数差来描述。一个单个质粒的拓扑异构体具有相同的分子量和连接。该拓扑异构体的相关分析应被称为拓扑学分析或拓扑异构体分析。
在本发明的含义内，术语“分离”是指不同形式的质粒DNA的分离，所述形式例如亚型、拓扑异构体、低聚形式和高聚形式，其基于这些配体形式的不同亲和力(称为化学亲和性原理)。
术语“色谱法”涉及一组分离技术，其采用两个非均质相，其中一个相被称为流动相，其沿着被称为固定相的另一相移动。
优选的实施方案为根据本发明的材料，其中氢供体N-H与氢受体基团相邻。
在本发明的含义内，术语“相邻”是指两个原子或原子团通过单个共价键直接连接。
在优选的实施方案中，氢受体选自羰基(C=O)、磺酰基(SO2)和磷酰基(P=O)。
在更优选的实施方案中，氢受体和氢供体基团形成酰胺、氨基甲酸酯、脲、磷酰胺或磺酰胺基团的一部分。
在更优选的实施方案中，质粒DNA包含任一以下组分的混合物：ccc和它的拓扑异构体、oc、lin、二聚体、三聚体、四聚体、低聚体、多聚体(连环型或串联型的形式)，与质粒大小和它的核苷序列无关。
在本发明的含义内，术语“基质”包括能够连接配体的固体载体或能够溶解配体的液体。
在本发明的含义内，术语“固体基质”是指适用于所需色谱分离或液-固提取的固体载体，其选自无机聚合物或有机聚合物，优选微薄膜基于二氧化硅的颗粒。
术语“微薄膜”是指无孔的基质颗粒，其特征在于用薄的、固定相的保持层覆盖具有不通过液体的载体材料的核心(熔融二氧化硅颗粒或有机聚合物微球)。该薄的、固定相的保持层可通过使表面粗糙来获得，且连接各自的色谱配体以获得可以保留目标溶质的吸附表面。
术语“液体基质”是指选自非极性溶剂的液体，例如烃、环烷烃，或聚合物液体(例如聚硅氧烷、聚氧化乙烯)，或聚合物液体(例如在另一溶剂中稀释的聚硅氧烷或聚氧化乙烯)。
在优选的实施方案中，根据本发明的基质选自有机或无机聚合物。
术语“有机聚合物”是指固体有机聚合物，例如聚(甲基)丙烯酸酯及其共聚物、聚苯乙烯及其共聚物、聚(甲基)丙烯酰胺及其共聚物、开环异位聚合物、多糖及其共聚物，例如琼脂糖，且在聚合物表面带有能够与间隔基和/或配体共价连接的化学基团。
术语“无机聚合物”是指固体无机聚合物，例如氧化硅(二氧化硅)、氧化钛、氧化锗、氧化锆、氧化铝和玻璃。聚合物表面能够与间隔基和/或配体共价连接。
在更优选的实施方案中，固体基质为颗粒、整体色谱柱树脂、薄膜或磁珠。
术语“颗粒”是指不同大小和形态学特征的固体基质结构，其包括但不限于不规则的、规则的、球状的、有孔的、无孔的、微薄膜的。通常，在分离室内有大量的(>1000)个体颗粒。
术语“整体色谱柱树脂”是指固体基质结构，其包含允许对流的流经通道，也被称为大孔，任选地包含较小的孔，例如细孔和微孔。通常，在分离室内仅为单片或仅为少量(<10)个体整体色谱柱树脂。
术语“薄膜”是指薄层状的固体基质，其使溶剂渗透和使包括样品组分的溶质半渗透。薄膜选自多糖，例如纤维素、纤维素酯、聚(甲基)丙烯酸酯、聚(苯乙烯)、聚四氟乙烯、聚砜、聚丙烯腈、聚苯醚、聚乙烯、聚丙烯、特氟隆、聚对苯二甲酸乙二酯、聚偏氯乙烯、PVC、聚酰亚胺、PVA、聚碳酸酯。
术语“磁珠”是指由磁性或铁磁性内部核心和外部固体基质壳组成的颗粒，当施加磁场时，其可被吸引。
根据本发明的优选实施方案的材料选自：
(结构a)
Figure BDA0000403233220000131
将3-(烯丙基氨基甲酰基氧基)-N-苄基哌啶固定到3-巯基丙基二氧化硅基质上
Figure BDA0000403233220000132
在左侧的子结构表示载体基质，和在虚线右侧的子结构表示配体。
(结构b)
Figure BDA0000403233220000141
将三乙氧基甲硅烷基活化的丙基氨基甲酰基奎宁配体固定到裸露的二氧化硅基质上
Figure BDA0000403233220000142
在左侧的子结构表示载体基质，和在虚线右侧的子结构表示配体。
(结构c)
Figure BDA0000403233220000143
将烯丙基氨基甲酰基-10,11-二氢奎宁配体固定到3-巯基丙基修饰的二氧化硅基质上。
Figure BDA0000403233220000151
在左侧的子结构表示载体基质，和在虚线右侧的子结构表示配体。
(结构d)
Figure BDA0000403233220000152
将O-叔丁基氨基甲酰基-喹核固定到3-巯基丙基修饰的二氧化硅基质上
Figure BDA0000403233220000153
在右侧的子结构表示载体基质，和在虚线左侧的子结构表示配体。
(结构e)
将叔丁基喹核基(quincorinyl)-脲配体固定到3-巯基丙基修饰的二氧化硅基质上
Figure BDA0000403233220000162
在右侧的子结构表示载体基质，和在虚线左侧的子结构表示配体。
(结构f)
Figure BDA0000403233220000171
将叔丁基氨基甲酰基奎宁固定到巯基丙基修饰的二氧化硅基质上
在右侧的子结构表示载体基质，和在虚线左侧的子结构表示配体。
(结构g)
将叔丁基氨基甲酰基奎宁配体固定到硫醇修饰的聚甲基丙烯酸酯小珠(Suprema-Gel30u)上
Figure BDA0000403233220000182
在右侧的子结构表示载体基质，和在虚线左侧的子结构表示配体。
全部三种pDNA亚型或拓扑异构体的分离是受包含氨基甲酰基修饰的阴离子交换配体材料制约的，该材料尚未针对这类液相分离得以应用。根据本发明的这些配体包含NH-供体、H-受体和阴离子交换点的充分确定的排列。因此质粒亚型/拓扑异构体与包含所述配体的材料的相互作用以确定的方式进行，确保不变的洗脱顺序。因此，本发明请求保护一个新的基于化学亲和性原理分离极大生物分子的可靠的和可预测的概念。此外，ccc拓扑异构体具有在生物技术生产包括终产物鉴定中表示额外质量控制参数的潜能。
显然地，本领域技术人员可对本发明的材料、方法和过程进行各种改进。因此，本发明旨在涵盖这些改进和修改，只要在所附权利要求及其等同物范围内。所有出版物以其整体引入本文作为参考。
设计了适用于质粒DNA分离的色谱配体，以便使得更容易与基质连接称为可能(实施例1)，其中配体包含末端烯烃基团，在自由基加成反应中与硫醇基团反应。因此，第一步是连接基连接到包含末端硫醇基团的基质上。第二步是在自由基引发剂存在下该基质与包含配体的烯烃混合，以得到配体和连接到基质的连接基间的稳定硫醚键(参见结构a)。通过这个过程，稳定的色谱材料容易地获得在基质表面上的高配体覆盖。
为切实评估根据本发明的材料的作用，将两个奎宁-氨基甲酸酯配体，即丙基氨基甲酰基奎宁和烯丙基氨基甲酰基-10,11-二氢奎宁，用于色谱分析分离质粒pMCP1(Boehringer Ingelheim，大小4.9kb)。第一个配体通过一个短的丙基-连接基锚定在配体与二氧化硅基质之间(在基质的第一个硅原子和NH氢供体之间有4个键，参见结构b)，另一个配体通过一个长的连接基连接到巯基丙基修饰的二氧化硅基质上(在基质的第一个硅原子和NH氢供体之间有8个键，参见结构c)。对比长连接基和短连接基的色谱性质表明，通过使用短连的接配体，oc型的回收率显著提高(即完全回收率等于在一次色谱运行中记录到1μg的4.9kb质粒，如实施例2所示)。主要区别是连接基的长度(3个原子对比7个原子)，即在配体和基质表面之间的距离不相等。发现使用具有短连接基的材料完全回收所有亚型(包括oc型)由于带负电荷的剩余硅烷醇的靠近，其对pDNA有拒绝效果。此外，这些数据显示，与目前用于pDNA亚型分析的市售柱，在oc和ccc型之间的分离度和在材料的oc回收方面，所述材料性质全部提高(优势)。
为了检测基质的形态学的影响，将上个段落中描述的长连接的配体通过长连接基连接到下列基于二氧化硅的基质上：1.5μm无孔颗粒、10μm多孔颗粒和整体色谱柱(实施例3)。在与上个段落类似的实验方案中检测了包含这些材料的柱。在此，包含全部三种pDNA亚型(pMCP1质粒的oc、ccc和lin亚型)的样品被装载到柱上并在相同条件下从柱上洗脱。在这些固体载体间观察到实质不同。所有被检测的基质都适用于分离ccc亚型与oc亚型和分离ccc亚型与lin亚型。另外，当使用1.5μm基质时，可完成oc和直线亚型之间的有效分离(参见图1a)。因此，对于分析目的，优选选择1.5μm载体。但是，10μm多孔基质(参见图1b)和整体色谱柱载体(参见图1c)都适用于仅集中分离ccc型的制备应用。尽管oc和lin亚型被一起洗脱出来，在这种情况下仍可完成对ccc型的有效分离。
关于拓扑异构体的分离，发现在所有被检验的载体中，以最大量的拓扑异构体之间的保留时间差异计算的色谱选择性都是相等的(0.12±0.02)。这显示了化学亲和性分离原理在的重要性，得到分离的高稳健性。但是，1.5μm基质由于小峰宽而提供了最高的分离效果，因此其是用于分析目的的优选选择。
一般而言，发现小的无孔球状颗粒为pDNA亚型和拓扑异构体提供了最好的分离效果，因此其最适用于分析规模分离。大的多孔颗粒和整体色谱柱也为pDNA形式提供了好的分离，尤其当分离ccc亚型与oc和直线亚型时。由于其低的压差和较高的结合容量，尤其整体色谱柱所固有，它们更适用于制备应用。
此外，实施例4对比了两种分离pDNA的不同方法，即方法1通过使用增加的氯化钠(NaCl)梯度和方法2通过增加的pH梯度。在这两种情况下，包含基于1.5μm无孔颗粒(结构b)的材料的色谱柱用于pDNA的分离。发现这两种用于pDNA鉴定的分析方法检验显著区别。
在使用方法1和用NaCl和异丙醇的组合梯度洗脱结合的pDNA的分析过程中，二者的流动相浓缩物、NaCl和异丙醇同时增加。在该情况下，在单一色谱运行中全部分离oc、直线型和个别的ccc拓扑异构体(参见图1a)。
在使用方法2和用pH和异丙醇的组合梯度洗脱结合的pDNA的分析过程中，流动相浓缩物的pH值以及异丙醇含量同时增加。在该情况下，全部三种亚型(oc、ccc和直线)被分离(参见图2a)，但是不能分离个别的拓扑异构体。由于ccc亚型以单一峰被洗脱，与NaCl介导的洗脱相比，另外两种形式的分离被进一步提高。此外，当装载1μg的每种亚型到50x4.6mm的柱上时，在被检测的质粒大小的整个范围内(即4.9kb，尤其9.9kb和14.5kb)发现完全回收全部亚型(oc、lin和ccc)(即与已知技术例如离子交换色谱相比时，分离大尺寸的pDNA更优)。因此，优选方法2用于分析测定质粒的同质性，即相对于其他形式(oc和lin)的ccc型的含量，而不依赖于质粒大小，以及用于ccc型pDNA的分离的制备应用(而不分离拓扑异构体)，因为与NaCl介导的洗脱相比其峰型窄和所收集的级分的盐负荷较低。
为了证明待用于pDNA亚型和拓扑异构体分离的配体的可变性，将三种不同的配体连接到5μm球状二氧化硅颗粒上，即叔丁基氨基甲酰基-喹核(结构d)和叔丁基喹核基-脲(结构e)，两者通过长连接基连接，和丙基氨基甲酰基奎宁直接地(结构b)连接到载体上(实施例5)。将包含约5%的oc亚型的ccc型pDNA样品装载到每个柱上，在相同条件下采用氯化钠和异丙醇的线性梯度洗脱。图3a显示采用了叔丁基喹核基-脲配体的该pDNA样品的色谱分离，图3b显示采用了叔丁基氨基甲酰基-喹核配体的该分离，而在图4a(实线)显示采用了丙基氨基甲酰基奎宁配体的该分离。在所有这些柱中，获得的可比的洗脱图样(等于洗脱顺序)证明了化学亲和性原理的稳健性。首先，oc亚型从柱上被洗脱，之后获得被称为ccc拓扑异构体的Boltzmann-分布图样(即根据其自由能，每个个体物质的相对浓度；根据其能量，对于系统状态的分布的可能性测量)。该新型、稳健的分离，尤其质粒拓扑异构体的分离，代表了用于质粒DNA的主要发明，并且描述了在分析和制备规模应用二者的显著性优势。
为了证明材料的装载能力，将总量为284μg的pDNA装载到50x4.6mm柱上，所述柱包含1.5μm无孔二氧化硅载体和丙基氨基甲酰基奎宁配体。对于该实验，采用了HPLC系统的最大进样量。用组合的盐和异丙醇梯度洗脱后，获得示于图3c的色谱图。没有观察到超负荷效应和个别拓扑异构体峰之间色谱分离度的降低。因此，通过使用该类小尺寸的单一分析柱，毫克量的个体拓扑异构体在大约30到50次运行后能轻易地被分离。此外，色谱法通常特征在于线性可扩缩性，因此较大规模的制备应用可根色谱放大的通常规则来建立。
拓扑异构体的洗脱图样通过使用补充方法(毛细管凝胶电泳)分析洗脱级分来评价(实施例6)。在个别拓扑异构体洗脱时，发现负超螺旋低的那些首先被洗脱。相应地，负超螺旋高的拓扑异构体后被洗脱，如图4a(虚线)中的色谱图的分离的色谱级分“A”和“B”的分离和包含氯喹的毛细管凝胶电泳(图4b)所述。较低超螺旋的拓扑异构体，该实例中的拓扑异构体“A”，也有较低的翻转，因此该分子比较高超螺旋的拓扑异构体“B”有更大尺寸。由于凝胶电泳分离是依赖大小的，拓扑异构体“B”比拓扑异构体“A”移动更快，且松弛的oc亚型是样品中移动最慢的物质。通过分析市售质粒例如pUC19(2.7kbp，SigmaAldrich)、pBR322(4.4kb，Sigma Aldrich)、pET-40b(+)(6.2kbp，Invitrogen)或pBACsurf-1(9.5kbp，Invitrogen)，遵循Boltzmann分布的pMCP1质粒(4.9kbp)的拓扑异构体图样也采用了包含丙基氨基甲酰基奎宁配体的柱记录。
为了证明拓扑异构体分析中的相关性，随质粒发酵的时程研究了质粒拓扑异构体图样(实施例7)。将包含细菌细胞的细胞群样品利用NaOH/SDS破裂。将悬浮液离心来获得包含pDNA的细胞质内容物。使用二维的高效液相色谱法(HPLC)方法，其中在第一步中，通过使用分子排阻色谱(SEC)从混合物中分离总pDNA，在第二维中，使用含有烯丙基氨基甲酰基-10,11-二氢奎宁配体的二氧化硅(示于结构c)柱分离ccc拓扑异构体。在两小时的时间间隔取出的发酵样品通过2D HPLC分析。结果显示在第二维后获得的色谱图重叠(图5a)。从开始发酵后11、13、15和17小时后取出的样品记录所示的色谱图。通过最大量的ccc拓扑异构体表示的最大拓扑异构体分布(图5a中用箭头标记)在发酵期间变化。在该情况下，总超螺旋移向较低负超螺旋。分布最大化的整个过程显示在图5b中。在发酵过程中，ccc pDNA的超螺旋在发酵的第一个小时显著变化，但是直至最后仍保持相似。这些数据支持了拓扑异构体分析的重要性，其可用于过程阶段的指示，以及作为通过使用液相色谱的简单方法中测定的质量控制参数，并用于整个生产过程中的稳定性研究。
附图说明
图1a至1c：在相同的洗脱条件下，分析包含pMCP1质粒(4.9kbp)的ccc、oc和lin亚型的混合物的pDNA样品的色谱图，其通过258nm的UV吸收记录。
使用了三个柱，各包含连接到不同的二氧化硅基质的叔丁基氨基甲酰基-奎宁配体(参见结构f)，即1.5μm无孔颗粒(图1a)、10μm多孔颗粒(图1b)和整体色谱柱(Chromolith Si Performance,Merck)(图3c)。洗脱条件：方法1(参见实施例4)。“Y”轴反映了以毫吸收单位[mAU]计的在258nm的UV吸收的pDNA亚型的浓度与“X”轴对应的保留时间[min]的关系。
图2：在pH-和异丙醇介导的梯度洗脱条件下，来自包含pMCP1质粒(4.9kbp)的ccc、oc和lin亚型的pDNA样品的色谱图，其通过258nm的UV吸收记录。
三个主峰对应于三个分别的pDNA亚型oc、lin、ccc(如图2中标示)。洗脱条件：方法2“Y”轴反映了以毫吸收单位[mAU]计的在258nm的UV吸收的pDNA亚型的浓度与“X”轴对应的保留时间[min]的关系。
图3a和3b：在NaCl介导的洗脱期间，分析具有高ccc含量的pMCP1质粒(4.9kbp)的pDNA样品的色谱图，其通过258nm的UV吸收记录。
在这些色谱图中，ccc型在oc亚型之后被洗脱，其被分为一组个别的拓扑异构体。与使用固定到3-巯基丙基修饰的二氧化硅的叔丁基喹核基-脲配体(如图3b的结构e)相比，当使用固定到3-巯基丙基修饰的二氧化硅的叔丁基氨基甲酰基-喹核配体(如图3a的结构d)时，拓扑异构体之间的分离度更高。“Y”轴反映了以毫吸收单位[mAU]计的在258nm的UV吸收的pDNA亚型的浓度与“X”轴对应的保留时间[min]的关系。
图3c：装载284μg具有高ccc含量的pMCP1质粒(4.9kbp)的pDNA样品后，通过258nm的UV吸收记录的色谱图。通过NaCl梯度应用结合到1.5μm无孔二氧化硅的三乙氧基甲硅烷基活化的丙基氨基甲酰基奎宁-配体完成洗脱。
第一个峰表示开环(oc)亚型，而ccc亚型的21个拓扑异构体之后被洗脱出来。“Y”轴反映了以毫吸收单位[mAU]计的在258nm的UV吸收的pDNA亚型的浓度与“X”轴对应的保留时间[min]的关系。
图4a：在NaCl介导的洗脱期间应用结合到1.5μm无孔二氧化硅的三乙氧基甲硅烷基活化的丙基氨基甲酰基奎宁-配体，分析具有高ccc含量的pMCP1质粒(4.9kbp)的pDNA样品的色谱图的叠加，其通过258nm的UV吸收记录。
在这些色谱图中，ccc型在oc亚型之后被洗脱，其被分为一组个别的拓扑异构体。A和B表示分离出的拓扑异构体级分。虚线表示将在相同柱上被洗脱出的拓扑异构体的之前级分再进样后的级分A和B。“Y”轴反映了以毫吸收单位[mAU]计的在258nm的UV吸收的pDNA亚型的浓度与“X”轴对应的保留时间[min]的关系。
图4b：毛细管电泳法分离包含级分A和B的混合物，其中级分与显示在图4a的A和B相同。
直线型是移动最快的形式。级分B移动地比级分A快，因此表明其具有更小的尺寸和更高的超螺旋。“Y”轴反映了以毫吸收单位[mAU]计的在258nm的UV吸收的pDNA亚型的浓度与“X”轴对应的保留时间[min]的关系。
图5a：在NaCl介导的梯度洗脱期间在第二色谱维度(即粗样品的纯化步骤后)通过应用结构b公开的材料获得的，来自在pDNA发酵期间11、13、15和17小时后取出的pDNA样品的色谱图的叠加，其通过258nm的UV吸收记录。
箭头表示拓扑异构体分布图中的最丰富的拓扑异构体，因此其可用作总超螺旋的指示，其在发酵期间明显地变化。在除了图4b的所有色谱图中，“Y”轴反映了以毫吸收单位[mAU]计的在258nm的UV吸收的pDNA亚型的浓度与“X”轴对应的保留时间[min]的关系。
图5b：表示为最丰富的拓扑异构体的相对连接数的最大拓扑异构体分布图(以最大峰面积计算)，其为总超螺旋的测量值(在发酵开始时该值为0)(y轴)对整个发酵持续时间(x轴)的曲线。
总的来说，在发酵期间拓扑异构体图样发生变化。“Y”轴表示相对连接数ΔLk与“X”轴反映的持续时间[小时]的关系。
实施例
实施例1：合成配体和结合到固体基质的方案。
方案1：将980mg(5mmol)的(R)-(-)-1-苄基-3-羟基哌啶(Sigma Aldrich)转移至一个三口圆底烧瓶中，用15ml二氯甲烷将其溶解。仪器充满氮气，502μl(5.7mmol，1.15eq.)的烯丙基异氰酸酯(Fluka)与作为催化剂的3μl(5μmol)二丁基二月桂酸锡(Aldrich)一起加至混合物中。该淡黄色溶液回流3小时，该反应进程用TLC(二氯甲烷:甲醇=20:1)监测。在使用以二氯甲烷:甲醇=25:1作为洗脱剂的快速二氧化硅柱色谱后，产物3-(烯丙基氨基甲酰基氧基)-N-苄基哌啶，以58%的产率被分离。3-巯基丙基修饰的二氧化硅基质(或载体)由裸露的5μm球状二氧化硅(30g，Daiso，Japan)和3-巯基丙基-甲基二甲氧基硅烷(8.6ml)在含有4-二甲氨基吡啶(57mg，Fluka)的无水甲苯中回流7个小时得到。通过在甲苯中回流产生的3-巯基丙基修饰的二氧化硅和1,1,1,3,3,3-六甲基二甲硅基胺(Fluka)共3个小时形成三甲基硅烷基(TMS)-封端的硅烷醇来进行封端。将330mg(1.2mmol)的3-(烯丙基氨基甲酰基氧基)-N-苄基哌啶和2.05g封端的巯基丙基修饰的5μm二氧化硅转移至配有机械搅拌器的三口圆底烧瓶中，并悬浮液30ml甲醇中。使该仪器剧烈搅动，同时加入5mg偶氮-双-(异丁腈)(AIBN，Merck)在5ml甲醇中的溶液。该混合物在氮气环境下回流20小时，然后通过烧结玻璃滤器(孔隙度3)将其过滤。用甲醇洗涤二氧化硅材料后，在60℃干燥48小时。该合成材料表示将3-(烯丙基氨基甲酰基氧基)-N-苄基哌啶固定至3-巯基丙基二氧化硅基质(结构a)上。
方案2：硫醇修饰的有机聚合物基质如下获得：通过将178mg磷酸氢二钠(Merck)溶解在20ml蒸馏水和5ml异丙醇(Roth)的混合液中制备反应缓冲液。用稀释的正磷酸将pH调节至8.0。将132.6mg的Suprema-Gel30u(PolymerStandards Service-USA,Inc.)悬浮于1.8ml反应缓冲液中。然后，加入192μl的NaSH水合物(Sigma Aldrich)在反应缓冲液(100mg/ml)中的溶液，该混合物在加热套(Eppendorf)中在63℃搅拌2小时。通过小玻璃漏斗(孔隙度3)，将修饰的材料用反应缓冲液洗涤两次，用水洗涤两次，用0.1mol/l HCl洗涤一次，再用水洗涤，和用甲醇洗涤两次。
将二硫化物还原至末端巯醇：将672mg磷酸二氢钠溶解在11.8ml水和2.8ml甲醇的混合物中制备TCEP缓冲液(pH的测量值为4.6)。然后，将19mg(75μmol)三(2-羧乙基)-膦的盐酸盐(TCEP)(Fluka)溶解在1ml的TCEP缓冲液中。将34.5mg硫醇修饰的Supremagel加至该溶液中，将该混合物在室温搅拌过夜。悬浮液用小漏斗过滤，材料用TCEP缓冲液、甲醇和最终用己烷洗涤。元素分析(54.52%碳，7.67%氢，1.40%硫)显示硫浓度为0.44mmol/g而没有氮存在。该活性硫醇的浓度为0.14mmol/g，其由分光光度法(Nogueira等,Analytica Chimica Acta,2005,vol.533(2),pp.179-183)测得。
配体-修改：将14.4mg还原的硫醇修饰的Suprema-Gel30u转移至安全锁紧的塑料反应管(eppendorf)内。加入130μl的3.2mg/ml叔丁基氨基甲酰基奎宁(在公司内部制备)的甲醇溶液、10μl的2mg/ml AIBN(Merck)的甲醇溶液和0.36ml甲醇，该混合物填充氮气。该反应管在65℃搅拌18小时。悬浮液用小漏斗过滤，材料用甲醇洗涤3次和最终用石油醚洗涤。元素分析(50.27%碳，7.70%氢，0.11%氮，0.97%硫)显示其成功地将叔丁基氨基甲酰基奎宁配体固定至硫醇修饰的有机聚合物基质(结构g)上。
实施例2：连接基的长度对质粒亚型回收率的影响。
合成了两种带有奎宁-氨基甲酸酯配体的色谱用固体载体，其中一个的配套通过短连接基连接至基质(在裸露的二氧化硅上的三乙氧基甲硅烷基活化的丙基氨基甲酰基奎宁，结构b)，另一个基质通过长连接基(在3-巯基丙基修饰的二氧化硅上的9-烯丙基氨基甲酰基-10,11-二氢奎宁，参见结构c)。根据实施例1的方案1合成具有长连接基的载体，从10,11-二氢奎宁(Buchler,germany)和烯丙基异氰酸酯(Sigma Aldrich)开始，以95%产率连接至封端的3-巯基丙基修饰的二氧化硅上。根据元素分析(14.01%C，2.18%H，1.38%N和1.90%S)，该配体密度是318μmol/g。
为了制备带有短连接的配体的基质，将3-异氰酸酯基丙基-三乙氧基甲硅烷(1mol eq.)和奎宁(1.05mol eq.)在甲醇中回流，得到含氨基甲酸酯的产物。伴随机械搅拌将裸露的5μm球状二氧化硅直接加入至该混合物中(每毫摩奎宁有0.5g裸露的二氧化硅)，该悬浮液进一步回流，获得三乙氧基甲硅烷基丙基氨基甲酰基奎宁修饰的二氧化硅。用甲醇洗涤后，将该硅烷醇基团根据实施例1的方案1封端。根据元素分析(7.90%C，1.21%H，0.911%N)，配体密度为217μmol/g。
在公司内部，在600bar压力下用修饰的5μm二氧化硅固定相装填包含生成的载体的HPLC柱。HPLC分析在配备二元泵、恒温自动采样器(冷却至4℃)和用D2灯作为UV源的DAD UV检测器的Agilent1200SL系统(Waldbronn,germany)上进行。样品组分通过使用方法1洗脱，即同时增加的NaCl梯度和增加的异丙醇梯度(“混合的NaCl和异丙醇梯度”)。
HPLC洗脱剂和色谱条件：首先，制备0.5mol/L的NaH2PO4(Merck)的储备液。洗脱剂A包含1:10稀释的储备液(50mmol/L的NaH2PO4)，用5M NaOH滴定至7.0。洗脱剂B包含含有0.6mol/L的NaCl(Fluka)和10%(v/v)异丙醇(Roth)的1:10稀释的储备液(50mmol/L的NaH2PO4)，用5M NaOH滴定至7.0。在分析过程中，在15分钟内运行从0到100%B的梯度。流速设定为0.7ml/min，检测波长为258nm(狭缝：4nm，参考360nm和100nm带宽)和温度为50℃(在3μl热交换器中预热该溶剂)。
为了记录色谱操作，将3μl的2.84mg/ml包含5%oc型的ccc pDNA样品的溶液(基于凝胶电泳的结果)装载到色谱柱上，并用增加量的洗脱剂B洗脱。冲洗后，在色谱柱上进样4次50μl的3M NaCl，并用100%洗脱剂B冲洗色谱柱以确保不存在遗留和在0%B使色谱柱重新均衡5min，将20μl的0.05mg/ml的oc亚型的溶液装载到色谱柱上，并用增加量的洗脱剂B洗脱。进一步冲洗后，在色谱柱上进样4次50μl的3M NaCl并用100%洗脱剂B洗涤色谱柱，将20μl的0.05mg/ml的lin亚型的溶液装载到柱子上，并用增加量的洗脱剂B洗脱。
当比较使用具有长连接的配体的基质获得的oc和直线亚型的峰面积时，回收率(按照每μg的oc亚型的pDNA的峰面积和每μg的直线亚型的pDNA的峰面积之间的比率计算)约为60%。但是，当使用短连接的配体时，该数据在彼此的分析误差(5%)内。当比较ccc和直线亚型样品获得的峰面积时，两钟测试的载体均显示了95到100%的回收率。
实施例3：基质形态学在分离pDNA亚型和拓扑异构体中的影响。
将根据实施例2中描述的操作由叔丁基异氰酸酯和奎宁合成的叔丁基氨基甲酰基奎宁配体，通过3-巯基丙基甲硅烷活性载体连接到1.5μm无孔二氧化硅颗粒(获自Micra Scientific Inc.,USA)上，连接到10μm多孔二氧化硅颗粒(获自Daiso Co,Ltd.,Japan)上和包含2μm大孔的二氧化硅整体色谱柱ChromolithTM(获自Merck,germany)上。分别地，这些载体对于1.5μm颗粒有3m2/g的比表面积和对于10μm颗粒和整体色谱柱有300m2/g的比表面积。将1.5μm无孔二氧化硅颗粒装填到50x4.6mm的柱中，所述柱获自BischoffChromatography(Germany)，而在公司内部，在600bar压力下将10μm颗粒装填到150x4.0mm柱中。该色谱仪器和采用的色谱条件在实施例2中公开。
包含全部三种亚型的样品通过混合60μl的10mM乙二胺四乙酸二钠盐(“EDTA·Na2”,Fluka)水溶液、10μl的2.84μg/μl包含约10%oc亚型的ccc pDNA样品，和50μl的0.05μg/μl直线亚型来制备。直线亚型根据生产商的说明书通过用EcoR V(Sigma Aldrich)消化来产生，且加入EDTA用于灭活核酸内切酶。在色谱运行中，将10μl包含所有三种pDNA亚型(pMCP1质粒的oc、ccc和lin亚型)的这些pDNA样品溶液装载到柱子上，并在相同条件下洗脱。为了分析目的，优选1.5μm载体。但是，10μm多孔载体(参见图1b)和整体色谱柱载体(参见图1c)两者都适用于仅关注分离ccc型的制备应用。
实施例4：使用混合的pH和异丙醇梯度洗脱的色谱方法(方法2)与使用混合的NaCl/异丙醇梯度洗脱的色谱方法(方法1)的比较。
将100μl包含0.15μg oc亚型、0.3μg直线亚型和14.2μg ccc亚型的pDNA样品装载到包含连接至1.5μm无孔二氧化硅的三乙氧基甲硅烷基丙基氨基甲酰基奎宁配体(参见结构b)材料上。样品组分利用方法2进行洗脱，即同时用增加的pH梯度和增加的异丙醇梯度(“混合的pH和异丙醇梯度”)，在Agilent1200SL系统上记录在258nm的UV吸收。
HPLC洗脱剂和色谱条件：首先，制备0.5mol/L的NaH2PO4(Merck,Darmstadt,germany)的储备液。洗脱剂A包含1:10稀释的储备液(50mmol/L的NaH2PO4)，用5M NaOH滴定至7.2。洗脱剂B包含1:10稀释的储备液(50mmol/L的NaH2PO4)和20%(v/v)异丙醇，用5M NaOH滴定至7.9。在分析过程中，在15分钟内运行从0到100%B(对应于从pH7.2到pH7.9的梯度)的梯度。在分析操作之间，将色谱柱用氯化钠洗涤(进样50μl的3M NaCl(水溶液))，同时流动相组成在80%B维持1分种，接着重新平衡到0%B维持5分种。流速设定为0.7ml/min，检测波长为258nm(狭缝：4nm，参考360nm和100nm带宽)和温度为60℃(在3μl热交换器中预热该溶剂)。当将这些色谱图与实施例2所述的方法1获得的那些(参见图1a)相比时，后者优选用于分离pDNA拓扑异构体。方法2优选用于分析确定质粒同质性，即ccc型相对其他类型(oc和直线型)的含量，和用于分离ccc pDNA(不分离拓扑异构体)的制备应用。
实施例5：配体变型和高载样量的证明
合成了用于色谱的三种固体载体。根据实施例1的方案1合成叔丁基氨基甲酰基-喹核配体(结构d)，其由喹核(Buchler,germany)和叔丁基异氰酸酯开始，并在乙酸乙酯(在公司内部重蒸)/三乙胺(Fluka)(10:1)中进行快速二氧化硅柱色谱，以96%产率得到，其被连接到封端的巯基丙基修饰的5μm二氧化硅颗粒上。根据元素分析(10.51%C，1.98%H，0.979%N，1.85%S)，该配体密度为307μmol/g。
根据实施例1的方案1合成叔丁基喹核基脲的配体(结构e)，其由喹核-胺(Buchler,germany)和叔丁基异氰酸酯开始，并在乙酸乙酯(在公司内部重蒸)/甲醇/三乙胺(Fluka)(10:1:1)中进行快速二氧化硅柱色谱，以96%产率得到，并连接到封端的3-巯基丙基修饰的5μm二氧化硅颗粒上。根据元素分析(8.965%C，1.87%H，0.979%N，1.94%S)，配体密度为210μmol/g。
根据实施例2，使用1.5μm无孔二氧化硅颗粒(Micra Scientific Inc.,USA)制备三乙氧基甲硅烷基丙基氨基甲酰基奎宁修饰的二氧化硅基质。根据元素分析，配体密度为9μmol/g，因为其比表面积为1/100。将该三乙氧基甲硅烷基丙基氨基甲酰基奎宁修饰的二氧化硅材料装填到4.6x50mm的柱子中，而将另外两种材料装填到150x4.0mm的柱子中。
HPLC洗脱剂和色谱条件：首先，制备0.5mol/L的NaH2PO4(Merck)的储备液。洗脱剂A包含1:10稀释的储备液(50mmol/L的NaH2PO4)，用5M NaOH滴定至7.0。洗脱剂B包含含有0.6mol/L的NaCl(Fluka)和30%(v/v)异丙醇(Roth)的1:10稀释的储备液(50mmol/L的NaH2PO4)，用5M NaOH滴定至7.0。在分析过程中，在24分钟内运行从60到100%B的梯度(叔丁基氨基甲酰基-喹核和叔丁基喹核基脲配体)和在15分钟内运行从0到25%B的梯度(三乙氧基甲硅烷基丙基氨基甲酰基奎宁配体)。流速设定为0.7ml/min，检测波长为258nm(狭缝：4nm，参考360nm和100nm带宽)和温度为60℃(在3μl热交换器中预热该溶剂)。
为了记录色谱操作(图5c、5d和6a)，将3μl的2.84mg/ml包含5%oc型的ccc pDNA样品的溶液装载到色谱柱上，并用增加量的洗脱剂B洗脱。为了证明其高载样量，将100μl包含284μg总pDNA的样品溶液装载到4.6x50mm的柱上，并用增加量的洗脱剂B洗脱。粗略估计，该柱包含约0.5g的色谱材料，发现其可充分分离284μg总pDNA。通过相同洗脱方式确定根据本发明所有配体均能够分离pDNA亚型和拓扑异构体，因此其证明了化学亲和性原理的稳健性。
实施例6：拓扑异构体鉴别及其洗脱顺序的证明。
根据实施例1的方案1合成包含烯丙基氨基甲酰基-10,11-二氢奎宁配体(参见图2b)的基质，并在公司内部装填到150x4.0mm的柱中。该色谱系统和色谱条件公开在实施例5中，不同的是在30分钟内运行从10到60%B的梯度。
为了记录色谱操作，将100μl的2.84mg/ml包含4%oc型的ccc pDNA样品的溶液装载到色谱柱上，并用增加量的洗脱剂B洗脱。在运行过程中，根据UV检测器收集两份各包含单一拓扑异构体的级分。该级分用Millipore(MA,USA)提供的VSWP纤维素酯膜(25mm直径，25nm孔)以纯净水透析。将圆盘放在水表面有光泽的一面朝上，并小心地将300μl的体积装载到圆盘表面。在4℃漂浮15到30分种后，用移液管回收样品并将20μl各级分的溶液再进样到色谱系统。
毛细管凝胶电泳在来自Agilent Technologies的DCE仪器上进行。内径为100μm的DB-17涂覆的毛细管购自J&W Scientific(Folsom,CA)，用保险刀片剪至32cm长并通过除去聚酰亚胺涂层制得检测窗口(有效长度为24.5cm)。对于拓扑异构体分析，将毛细管用购于Acros organics(Geel,Belgium)的包含0.1%羟基丙基甲基纤维素(HPMC，86kDa)的三-硼酸盐-EDTA(TBE，89mM硼酸，89mm Tris，2mm EDTA，用NaOH滴定至pH9.0)的缓冲液填满。为了完成缓冲液的均质化，在添加生物聚合物后将该溶液搅拌24h，之后在无干扰的室温条件下静置24h。为了得到高超螺旋ccc质粒的更高分离度，将插入剂添加至该电泳缓冲液[de Carmejane等,Proceedings of SPIE-The InternationalSociety for Optical Engineering,1999,vol.3602,p.346-354]，在该情况下，分别将12μl的5mg/ml二磷酸氯喹(Fluka)水溶液加至4ml电泳缓冲液中，得到15μg/ml氯喹的最终浓度。通过电动进样在-5kV引入样品4秒钟。然后在25℃、3.3kV的负电模式电泳25min，在258nm处进行UV检测。在进样之前，将毛细管用水冲洗3分种，然后用运行缓冲液预先准备5分种。总的来说，在个体拓扑异构体洗脱时，发现低负超螺旋的那些最先被洗脱。
实施例7：在质粒DNA生物技术制备中拓扑异构体分布的过程控制。
在大肠杆菌中批次发酵编码为AS24(4.4kb，Boehringer Ingelheim)的pDNA的过程中，以2小时的时间间隔取出样品，然后立即冷冻。分析前，解冻该样品，并根据生产商的说明书使用MiniPrep Kit(Qiagen)分离和浓缩pDNA。天然质粒样品被直接进样到二维HPLC系统并进行分析。
色谱条件：2D HPLC系统(biocompatible Ultimate3000by Dionex)，其包含两个额外的10-1柱切换阀。
第一维：Sepax Technologies Inc.(USA)提供的SRT SEC1000(体积排阻柱)，洗脱剂：含0.1mol/l NaCl和1mmol/l EDTA的0.1mol/l Tris(Fluka)，pH7.5(等梯度洗脱)，流速：2.0ml/min
第二维:用包含如图2b中公开的配体的5μm二氧化硅的100x4.0mm柱，洗脱剂A：50mm磷酸缓冲液pH=7.2，洗脱剂B：含0.6mol/l NaCl和10%(v/v)异丙醇的洗脱剂A pH=7.2，柱温60℃，流速1.0ml/min，检测UV258nm；15min的0到100%B的线性梯度，进样量20μl。在发酵过程中，ccc pDNA的超螺旋变化显著，其可可靠地通过使用根据本发明的分离pDNA拓扑异构体的方法确定。
实施例8：在CIM整体色谱柱上的辛可宁(cinchorine)型配体.
用新制的2M硫氢化钠(Sigma-Aldrich)在甲醇和0.1M磷酸二氢钠水溶液(Merck)的混合物(20:80，v/v)中的溶液(pH=8.15)以HPLC泵的流经模式冲洗将
Figure BDA0000403233220000311
Epoxy Disk整体色谱柱(BIA Separations)共2h。之后，将柱子用甲醇/水(20:80，v/v)洗涤，然后再用甲醇洗涤。
通过将叔丁基氨基甲酰基喹核(结构d)溶于甲醇中制备0.25M叔丁基氨基甲酰基喹核的溶液，并添加α,α′-偶氮异丁腈(AIBN)(6mg/ml，0.037M)作为自由基引发剂。将混合物超声5min，用尼龙膜过滤，用氮气扫气10min。然后，将该叔丁基氨基甲酰基喹核-溶液泵入到硫醇官能化的CIM圆柱中。将该柱的两端密封，转移至水浴中，其中色谱配体的自由基加成在60℃发生。24小时后，将柱子从水浴中取出，用甲醇冲洗然后利用HPLC泵以流动相平衡。质粒亚型的分离通过使用具有有机基质的洗脱方法1(NaCl-梯度)来进行，尤其适用于制备目的。
实施例9：包含无孔有机聚合物颗粒的环氧基团的修饰。
在三口圆底烧瓶中将环氧修饰的无孔聚甲基丙烯酸酯小珠(环氧-NPR，2.5μm，获自Tosoh)悬浮于甲醇中。加入硫氢化钠与甲醇和0.1M磷酸二氢钠水溶液的混合物(20:80，v/v)的2M溶液(pH=8.15)(相对于环氧基团10-倍摩尔过量)，并在氮气流下搅拌2h。之后，将颗粒过滤，并用甲醇/水(20:80，v/v)洗涤，然后再用甲醇洗涤。通过将叔丁基氨基甲酰基喹核(结构d)溶于甲醇中制备0.25M叔丁基氨基甲酰基喹核的溶液，并添加α,α′-偶氮异丁腈(AIBN)(6mg/ml，0.037M)作为自由基引发剂。将混合物超声5min，用尼龙膜过滤，并用氮气扫气10min。然后，在三口圆底烧瓶中将该叔丁基氨基甲酰基喹核溶液加入到上述合成的硫醇修饰的NPR颗粒的悬浮液中。用于结合选择剂至硫醇官能化的小珠的自由基加成反应，通过在60℃氮气气流下搅拌24小时来进行。然后，将颗粒过滤，用甲醇洗涤若干次。该颗粒浆液装填到尺寸为33x4.6mm ID的不锈钢柱中。用于分离质粒亚型的柱的测试使用具有有机基质的洗脱方法1(同时的NaCl-和异丙醇梯度)来进行，尤其适用于分析目的。

Claims (21)

1.包含式1的配体的材料在分离与质粒DNA亚型或拓扑异构体中的用途：
Figure FDA0000403233210000011
其中，该配体包含阳离子基团(C)和氢供体基团(N-H)，它们由3至5个原子长度的间隔基连接，
m、o和r彼此独立地为0或1，和
k、l、n和p彼此独立地为0、1或2，和
Y是选自-CH2-、-O-、-NH-或-S-基团的任一基团，
Z是选自-C-、-S-或-P-基团的任一基团，和
R1、R2和R3是任一选自下列的取代基团：氢、C1-18支链或非支链烷基、C2-18支链或非支链烯基、C2-18支链或非支链炔基、C3-11-碳环、C3-8-杂环、C5-18-芳基和C5-13-杂芳基，
其中，R1、R2和R3彼此独立地任选包含一个或多个选自-S-、-O-、-NH-的基团，和
R1、R2和R3中的每一个可任选地且独立地被一个或多个取代基所取代，所述取代基选自氢、C1-6支链或非支链烷基、C2-6支链或非支链烯基、C2-6支链或非支链炔基、C3-8-碳环、C3-8-杂环、C5-10-芳基和C5-10-杂芳基，和
其中，该阳离子基团C是C3-11杂环，其包含至少一个氮原子和任选地另一个选自硫、氧、氮和磷的杂原子，或
C5-18杂芳基包含至少一个氮原子和任选地另一个选自硫、氧、氮和磷的杂原子，或
支链或非支链C1-10烷基、支链或非支链C2-10烯基、支链或非支链C2-10炔基包含至少一个氮原子和任选地另一个选自硫、氧、氮和磷的杂原子，
其中，C和R3或C和R2任选地通过成环彼此连接，和
其中，所述配体通过R1或R3基团任选地固定在或嵌入到基质。
2.根据权利要求1的使用，其中，间隔基的长度等于4个原子。
3.根据权利要求1或2的用途，其中R1是任一选自下列的取代基团：氢、C1-8支链或非支链烷基、C2-8支链或非支链烯基、C2-8支链或非支链炔基，其任选地包含一个或多个硫原子。
4.根据权利要求1或2的用途，其中R1是任一选自下列的取代基团：C3-8-碳环、C5-8-杂环、C5-10-芳基和C5-9-杂芳基。
5.根据权利要求1至4的用途，其中R3是任一选自下列的取代基团：氢、C1-8支链或非支链烷基、C2-8支链或非支链烯基和C2-8支链或非支链炔基，其任选地包含一个或多个硫原子。
6.根据权利要求1至4中一项的用途，其中R3是C5-10芳基或C5-10杂芳基。
7.根据权利要求1至6中一项的用途，其中所述氢供体基团(N-H)与至少一个氢受体相邻，所述氢受体选自羰基(C=O)、磺酰基(-SO2-)和磷酰基(-P(=O)-)。
8.根据权利要求7中的用途，其中所述氢受体是羰基基团(C=O)。
9.根据权利要求1至8中一项的用途，其中o=0和m=1。
10.根据权利要求1至8中一项的用途，其中o=1和m=0。
11.根据权利要求1至8中一项的用途，其中o=0和m=1，以及其中k=1和I=1，Z是-C-和n=1。
12.根据权利要求1至8中一项的用途，其中o=0和m=1，以及其中k=1和I=1，Z是-C-和p=1。
13.根据权利要求1至12中一项的用途，其中所述基质是固体或液体，选自有机或无机聚合物，其中所述无机聚合物是硅基或氧化锆，和其中所述有机聚合物是聚甲基丙烯酸酯或琼脂基。
14.根据权利要求13的用途，其中所述基质是颗粒、整体色谱柱树脂、薄膜或磁珠。
15.根据权利要求1至14中一项的用途，其中所述质粒DNA亚型是共价闭合环型(ccc)、开环型(oc)或直线型(lin)。
16.根据权利要求15的用途，其中所述质粒DNA亚型包括单体、二聚体、三聚体、四聚体、低聚体或多聚体的混合物，其中，所述低聚和多聚质粒DNA是连环或串联的形式。
17.根据权利要求1至16中一项的用途，其中所述材料选自：
结构(b)
Figure FDA0000403233210000031
结构(c)
Figure FDA0000403233210000032
结构(f)
Figure FDA0000403233210000033
和结构(g)
Figure FDA0000403233210000041
18.材料，其选自：
结构(a)
Figure FDA0000403233210000042
结构(d)
Figure FDA0000403233210000043
和结构(e)
Figure FDA0000403233210000051
19.权利要求18材料在分离质粒DNA亚型或拓扑异构体中的用途。
20.一种色谱分离质粒DNA亚型或拓扑异构体的方法，其使用根据权利要求1到19中一项的材料。
21.根据权利要求20的方法，其包括步骤：
a．稀释/溶解包含pDNA亚型或拓扑异构体的样品，
b．装载样品至材料中，
c．洗涤结合的样品，
d．从材料中洗脱样品，
e．检测和/或收集被洗脱的部分。
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