CN111148846B - 在水凝胶中捕获离散生物单元并使其条码化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在水凝胶中捕获离散生物单元并使其条码化的方法。还涉及用于分析离散生物单元中的基因表达、基因型、单体型或表观基因组的方法。本发明还涉及用于实施本公开的方法的试剂盒。

Description

在水凝胶中捕获离散生物单元并使其条码化的方法
技术领域
本发明涉及在水凝胶中捕获离散生物单元并使其条码化的方法。特别地，本发明涉及用于离散生物单元的表达分析的方法，以及用于实施本发明的方法的试剂盒。本发明的方法还可以用于单细胞转录组谱分析、基因分型、定相和/或单体型分型。
背景技术
为了进行下一代测序(NGS)分析，必须执行三个任务：1)样品制备(样品准备)，2)测序和3)生物信息学分析。已利用微流体技术改善了三个要求中的第一个，即样品制备，特别是实现了反应的高通量(HT)并行化和规模效率。急需HT微流体样品制备的一种应用是通过RNA测序(单细胞RNA测序)进行单细胞基因表达分析。其原因在于要分析的细胞数量可能在数百到数千之间，并且每个工作流程都是从首先在单个反应室中分离单个细胞开始的。因此，任何微流控平台的HT并行化反应能力都需要与这些细胞数量要求相匹配。
第一个用于单细胞RNA测序分析的商业化微流控平台基于PDMS(聚二甲基硅氧烷)芯片技术。该平台的可用版本能够处理数十个到数百个细胞。在纳升(nL)体积的PDMS室中分离悬浮液中的细胞，然后通过打开阀门并进入适当的裂解试剂入口，通过施加裂解试剂来裂解细胞。在每个后续步骤中完成阀门的打开和特定试剂入口的选择，以连续实现mRNA的逆转录，向cDNA中添加衔接子序列以及PCR。然后从芯片中收获单细胞产物的扩增子，并进行批量处理，以完成测序的样品制备。使用PDMS架构的平台受到限制，因为它们需要昂贵的多层PDMS芯片以及复杂的压力和热控制仪器来操作这些芯片。而且，反应的次数由可以制造的最小PDMS的特性决定。对于合理大小的芯片，这意味着在给定的时间内最多只能处理1000个细胞，而这对于大部分生物样品来说是不够的。即使处理量足够高，从芯片和仪器的角度来看，PDMS基础设施的价格也非常昂贵。
油包水微滴乳液是微流体的另一种形式。与基于PDMS的技术相比，微滴的优势在于可以显著增加反应次数。处理量仅受乳液体积的限制，并且次数随着微滴尺寸的减小而成比例地增加。包被有对每个珠特定的克隆寡聚物的包封珠的发现使微滴反应的并行分子编码成为可能。例如，在基因表达应用空间中，在微滴中裂解细胞后，珠寡聚物与mRNA结合，并在此过程中编码具有共同珠分子标签的单细胞转录组，珠分子标签也称为珠条形码。测序后，可以将具有相同条形码的序列组合在一起，从而有效地在各个反应室或微滴中重建珠和细胞的先前偶联，并实现单细胞分析。分子生物学步骤根据微滴编码技术平台的各种形式而变化。在Drop-SEQ中，mRNA与微滴中的珠寡聚物结合后，逆转录和随后的样品制备步骤在破损的乳液中以大批量进行。在其他可商购获得的平台中，逆转录以微滴形式发生，最终样品制备步骤以大批量进行。尽管消除了处理量瓶颈，但微滴还有其他重大缺陷。首先，微滴及其单分散构造与用于裂解难裂解细胞(如植物细胞、一些细菌，尤其是革兰氏+细菌、霉菌、孢子、酵母、分枝杆菌等)、获得细胞核并执行许多关键分子生物学步骤的表面活性剂水平不兼容。第二，在微滴中进行多步分子生物学反应非常困难。尽管例如通过微滴合并或微注射(pico-injection)可以实现，但是多步微滴工作流程显著增加了微流控设置的复杂性和成本。第三，微滴平台需要高级油、难以在工业规模上制造的复杂芯片以及用于容纳和管理通过这些芯片的精确流控的仪器。液滴平台所需的所有三个要素，即油、芯片和仪器，给制造和技术支持带来负担，重要的是，显著增加了终端用户的成本，从而限制了微滴技术的广泛采用。
设计本发明以消除现有技术的缺点。实际上，发明人出乎意料地开发了用于单细胞基因表达分析的新方法，该方法不需要PDMS芯片或微滴，同时保留了微滴平台能够处理多于数千个细胞的关键益处。基于水凝胶平台的使用，这项新技术还解决了与微滴技术相关的三个关键问题。首先，水凝胶平台支持任何表面活性剂水平，从而可能裂解任何细胞或细胞核，并支持关键的生物化学和分子生物学反应。第二，可以容易地进行多步反应，因为可溶性试剂可以容易地通过水凝胶进入反应器空间。通过简单地交换与水凝胶接触的大部分溶液从而进行后续反应。第三，不需要昂贵的油、芯片和/或微滴生成仪器。对于自动化，可以使用仪器来管理水凝胶反应器平台，但这不是必需的。
PDMS和微滴技术的局限性以及水凝胶反应器平台的改进并不局限于单细胞基因表达空间。它们适用于底物具有多个引物结合位点的任何应用，例如在定相和基因组结构应用中用作底物的单细胞基因组和长裸DNA分子。分子生物学反应根据底物的种类和样品制备方法的输出要求而有所不同。然而，在水凝胶中捕获生物单元并使其条码化的基本方法保持不变。
发明内容
本发明涉及一种在水凝胶中捕获离散生物单元的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使多个生物单元与多个条形码单元接触以形成生物单元/条形码单元复合体，
b)使所述生物单元/条形码单元复合体与水凝胶溶液接触，和
c)聚合水凝胶溶液以使所述生物单元/条形码单元复合体嵌入水凝胶基质中，
d)使水凝胶基质中每个生物单元/条形码单元复合体内的生物单元的核酸条码化。
在一个实施方案中，每个条形码单元包含特有的条形码。
本发明还涉及一种用于分析离散生物单元中的基因表达的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使多个生物单元与多个条形码单元接触以形成生物单元/条形码单元复合体，其中每个条形码单元包含特有的条形码，并且其中所述条形码单元包含至少一种涉及结合所述生物单元的元件，
b)使所述生物单元/条形码单元复合体与水凝胶溶液接触，
c)聚合水凝胶溶液以使所述生物单元/条形码单元复合体嵌入水凝胶基质中，
d)从水凝胶基质中的每个生物单元中释放核酸，
e)使来自水凝胶基质中的每个生物单元的核酸条码化，
f)由来自每个生物单元的核酸合成cDNA文库，
g)扩增来自每个生物单元的cDNA文库，其中来自每个生物单元的cDNA文库的扩增使特有的条形码的克隆拷贝掺入来自每个生物单元的扩增产物中，和
h)任选地，对扩增产物进行测序。
本发明还涉及一种用于分析离散生物单元的基因型的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使多个生物单元与多个条形码单元接触以形成生物单元/条形码单元复合体，其中每个条形码单元包含特有的条形码，并且其中所述条形码单元包含至少一种涉及结合所述生物单元的元件，
b)使所述生物单元/条形码单元复合体与水凝胶溶液接触，
c)聚合水凝胶溶液以使所述生物单元/条形码单元复合体嵌入水凝胶基质中，
d)从水凝胶基质中的每个生物单元中释放基因组DNA，
e)使来自水凝胶基质中的每个生物单元的基因组DNA条码化，
f)任选地，由来自每个生物单元的核酸合成DNA文库，
g)扩增来自每个生物单元的基因组DNA或DNA文库，其中来自每个生物单元的基因组DNA或DNA文库的扩增使特有的条形码的克隆拷贝掺入每个生物单元的扩增产物中，和
h)任选地，对扩增产物进行测序。
本发明还涉及一种用于分析离散生物单元的单体型的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使多个生物单元与多个条形码单元接触以形成生物单元/条形码单元复合体，其中每个条形码单元包含特有的条形码，并且其中所述条形码单元包含至少一种涉及结合所述生物单元的元件，
b)使所述生物单元/条形码单元复合体与水凝胶溶液接触，
c)聚合水凝胶溶液以使所述生物单元/条形码单元复合体嵌入水凝胶基质中，
d)任选地，从水凝胶基质中的每个生物单元中释放核酸，
e)使来自水凝胶基质中的每个生物单元的核酸条码化，
f)任选地，由来自每个生物单元的核酸合成DNA文库
g)扩增来自每个生物单元的核酸或DNA文库，其中来自每个生物单元的核酸或DNA文库的扩增使特有的条形码的克隆拷贝掺入来自每个生物单元的扩增产物中，和
h)任选地，对扩增产物进行测序。
本发明还涉及一种用于分析离散生物单元的表观基因组的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使多个细胞生物单元与多个条形码单元接触以形成生物单元/条形码单元复合体，其中每个条形码单元包含特有的条形码，并且其中所述条形码单元包含至少一种涉及结合所述生物单元的元件，
b)使所述生物单元/条形码单元复合体与水凝胶溶液接触，
c)聚合水凝胶溶液以使所述生物单元/条形码单元复合体嵌入水凝胶基质中，
d)从水凝胶基质中的每个生物单元中释放非核小体结合的DNA，
e)使来自水凝胶基质中的每个生物单元的非核小体结合的DNA条码化，
f)任选地，由来自每个生物单元的非核小体结合的DNA合成DNA文库，
g)扩增来自每个生物单元的非核小体结合DNA或DNA文库，其中来自每个生物单元的非核小体结合的DNA或DNA文库的扩增使特有的条形码的克隆拷贝掺入来自每个生物单元的扩增产物中，和
h)任选地，对扩增产物进行测序。
在一个实施方案中，生物单元固定在载体上。在一个实施方案中，条形码单元固定在载体上。
在一个实施方案中，生物单元固定在水凝胶层中的载体上。在一个实施方案中，条形码单元固定在水凝胶层中的载体上。
在一个实施方案中，特有的条形码以多个克隆拷贝存在于每个条形码单元上。
在一个实施方案中，特有的条形码包括核酸序列条形码。
在一个实施方案中，特有的条形码包括核酸序列引物。在一个实施方案中，核酸序列引物包括随机核酸序列引物。在一个实施方案中，核酸序列引物包括特异性核酸序列引物。
在一个实施方案中，条形码单元包含至少一种涉及结合生物单元的元件。在一个实施方案中，至少一种涉及结合生物单元的元件包括蛋白、肽和/或其片段；抗体和/或其片段；核酸；碳水化合物；维生素和/或其衍生物；辅酶和/或其衍生物；受体配体和/或其衍生物；和/或疏水基团。
在一个实施方案中，每个条形码单元由珠组成。
在一个实施方案中，通过引物模板退火在水凝胶基质中进行条码化的步骤。在一个实施方案中，通过引物定向延伸在水凝胶基质中进行条码化的步骤。在一个实施方案中，通过连接在水凝胶基质中进行条码化的步骤。
在一个实施方案中，离散生物单元包括细胞、细胞群、病毒、细胞核、线粒体、叶绿体、生物大分子、外排体、染色体、邻近性保留的转座DNA片段和/或核酸片段。
在一个实施方案中，细胞或细胞群包括体外培养的细胞、干细胞、肿瘤细胞、组织活检细胞、血细胞和组织切片细胞。
本发明还涉及一种试剂盒，其包括：
-多个条形码单元，其中所述条形码单元包含至少一种涉及结合生物单元的元件，并且其中每个条形码单元包含特有的条形码；
-水凝胶溶液和/或用于制备水凝胶溶液的水凝胶单体；
-任选地，用于结合生物单元和/或条形码单元的载体；
-用于生物化学和分子生物学测定的试剂和溶液；
-使用说明。
本发明还涉及一种试剂盒，其包括：
-包含多个预先结合的条形码单元的载体，其中所述条形码单元包含至少一种涉及结合生物单元的元件，并且其中每个条形码单元包含特有的条形码；
-水凝胶溶液和/或用于制备水凝胶溶液的水凝胶单体；
-用于生物化学和分子生物学测定的试剂和溶液；
-使用说明。
定义
在本发明中，以下术语具有以下含义：
-术语“约”或“大约”可以表示在由本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围内，其将部分取决于如何测量或确定该值，即测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在1内或大于1的标准偏差。或者，在数字之前的“约”是指所述数字的值的加或减10％。或者，特别是关于生物系统或过程，该术语可以表示在值的一个数量级内，在5倍以内，更优选在2倍以内。在本申请和权利要求书中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则应假设术语“约”表示特定值在可接受的误差范围内。
-术语“扩增”是指产生所需模板序列的多个拷贝，即至少2个拷贝的过程。扩增核酸的技术是技术人员众所周知的，并且包括特异性扩增方法以及随机扩增方法。
-术语“A加尾”是指用于将非模板化的A核苷酸添加至双链DNA分子的3′平末端的酶促方法。
-术语“条形码”是指可以用作特有的标识符以特定地识别离散生物单元的分子模式。术语“条形码”还指用于识别样品内分析物的源或来源，例如，从离散生物单元提取或衍生的核酸序列的分子模式。
-术语“条形码单元”是指生物单元可以结合或固定在其上的可识别的基底或基质。条形码单元可以是刚性的、固体的或半固体的。
-术语“条码化”是指通过引物模板退火、依赖引物的DNA合成和/或连接，将离散条形码单元的条形码，优选核酸条形码连接到生物单元模板核酸序列。
-术语“珠”是指可以是球形(例如，微球)或具有不规则形状的离散颗粒。珠的直径可以小到约0.1μm，也可以大到约几毫米。
-术语“生物单元”是指离散的生物结构以及生物结构的部分、组分或组合。生物单元的实例包括但不限于细胞或细胞的组，病毒，细胞器如细胞核、线粒体或叶绿体，大分子复合体如外排体，生物大分子如染色体、核酸片段、邻近性保留的转座DNA(CPT-DNA)片段、蛋白或肽。
-术语“碳水化合物”是指具有通式Cx(H2O)y的任何一类有机化合物。碳水化合物包括糖、淀粉、纤维素和胶。碳水化合物可以是单糖、二糖或多糖。碳水化合物可以是天然存在的或合成的。
单糖是具有单链或单环结构的单体或简单糖。单糖还可以通过其结构和在环或链中的碳原子数来分类，例如醛糖、酮糖、吡喃糖、呋喃糖、三糖、四糖、戊糖、己糖和庚糖等。单糖的实例包括但不限于N-乙酰基葡糖胺、阿洛糖、阿卓糖、阿拉伯糖、脱氧核糖、二羟基丙酮、赤藓糖、果糖、岩藻糖、α-L-吡喃岩藻糖、半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖(右旋糖)、葡萄糖醛酸、甘油醛、古洛糖、艾杜糖、来苏糖、甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、甘露糖醛酸、神经氨酸、阿洛酮糖、鼠李糖、核糖、核酮糖、山梨糖、塔格糖、苏糖、木糖和木酮糖。
二糖由两个单糖通过糖苷键连接形成。二糖的实例包括但不限于纤维二糖、龙胆二糖、异麦芽糖、乳糖、乳酮糖、昆布二糖、麦芽糖、甘露二糖、蜜二糖、黑曲霉唐、芸香糖、蔗糖、海藻糖和木二塘。
多糖是由两个或多于两个单糖通过糖苷键连接形成的聚合物。由3个至10个单糖形成的多糖通常称为寡糖。多糖的实例包括但不限于琼脂糖、藻酸盐、支链淀粉、直链淀粉、卡拉胶、纤维素、几丁质、几丁己糖、壳聚糖、硫酸软骨素、凝乳聚糖、硫酸皮肤素、葡聚糖、糊精、乳化胶、叉红藻胶、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、吉兰糖胶、葡糖胺、糖原、糖胺聚糖、瓜耳胶、阿拉伯胶、硫酸乙酰肝素、肝素、透明质酸、脱酰透明质酸、菊糖、异麦芽酮糖、刺梧桐胶、硫酸角质素、昆布多糖、槐豆胶、胞壁酸、果胶酸、果胶、短梗霉多糖、石耳葡聚糖、鼠李糖胶、裂褶菌多糖、小核菌聚糖、水苏糖、淀粉、黄芪胶、维兰(welan)胶、黄原胶和黄胞胶。
如本文所用，术语“碳水化合物”还指“糖缀合物”，其是与其他化学物质例如蛋白和脂质共价键合的碳水化合物。糖缀合物的实例包括但不限于糖脂、糖肽、糖蛋白、脂多糖和肽聚糖。
-术语“cDNA文库”是指由从mRNA逆转录的互补DNA组成的文库。
-术语“细胞”和“细胞群”包括但不限于体外培养中的细胞；干细胞，例如胚胎干细胞、成年干细胞、癌症干细胞、诱导多能干细胞或诱导干细胞；肿瘤细胞，例如赘生性细胞；组织活检细胞；血细胞，例如红细胞、白细胞、肥大细胞、巨噬细胞、血小板或其祖细胞；和组织切片细胞。
-术语“克隆拷贝”是指单个条形码的相同拷贝的群体。
-术语“包被”和“涂覆”是指基底例如载体和/或条形码单元的覆盖、修饰或官能化。
-术语“辅酶”是指与脱辅基酶结合的非蛋白元件，其是通过在酶反应过程中改变化学结构并将诸如原子或电子之类的功能性要素递送至反应底物来辅助酶反应的因子。“辅酶”也可以称为“辅因子”或“辅助酶”。
辅酶的实例包括但不限于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、NADH、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、NADPH、腺苷三磷酸(ATP)、磷酸腺苷硫酸(PAPS)、尿苷二磷酸(UDP)、胞苷二磷酸(CDP)、鸟苷三磷酸(GTP)、肌苷三磷酸(ITP)、硫胺素焦磷酸(TPP)、黄素单核苷酸(FMM)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、辅酶A(CoA)、生物胞素、四氢叶酸、辅酶B12、脂酰赖氨酸、1，1-顺式-视黄醛和1，2，5-二羟基胆钙化醇。
-术语“互补”或“互补的”是指能够通过氢键与另一个多核苷酸序列形成碱基配对的多核苷酸序列。例如，鸟嘌呤(G)是胞嘧啶(C)的互补碱基，腺嘌呤(A)是胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)的互补碱基。
-术语“邻近性”是指基于共享信息的两个或多于两个DNA片段之间的空间关系。信息的共享方面可以是关于相邻、间隔和距离的空间关系。有关这些关系的信息反过来又有助于来自DNA片段的序列读取的分层组装或映射。该邻近性信息提高了此类组装或映射的效率和准确性，因为与常规鸟枪法测序结合使用的常规组装或映射方法没有考虑单独的序列读取的相关基因组的起源或坐标，而它们与衍生出单独的序列读取的两个或多于两个DNA片段之间的空间关系有关。
-术语“所需模板序列的拷贝”并非必须指与模板序列具有完美的序列互补性或同一性。拷贝可以包括例如核苷酸类似物，例如脱氧肌苷，有意的序列改变和/或在扩增过程中发生的序列错误。在一个实施方案中，所需序列的拷贝与模板序列具有至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，至少约100％的同一性。
-术语“洗涤剂”是指具有亲脂性和亲水性(即两亲性)特征的分子。洗涤剂根据表面活性剂的电荷，可分为四大类：
(1)阴离子洗涤剂是指具有负离子电荷的洗涤剂。阴离子洗涤剂的实例包括但不限于十二烷基硫酸钠(SDS)、N-月桂基肌氨酸(十二烷基肌氨酸)、胆酸钠、脱氧胆酸钠、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸锂(LDS)。
(2)阳离子洗涤剂是指具有正离子电荷的洗涤剂。阳离子洗涤剂的实例包括但不限于季铵盐、具有酰胺键的胺、聚氧乙烯烷基和脂环族胺、N，N，N′，N′四取代的乙二胺、2-烷基1-羟乙基2咪唑啉乙氧基化胺和烷基铵盐。
(3)非离子型洗涤剂是指不具有任何离子基团的洗涤剂。非离子型洗涤剂的实例包括但不限于聚山梨醇酯、辛基酚乙氧基化物、葡萄糖胺、芦布若尔(Lubrol)、苄泽(Brij)、Nonidet、泊洛沙姆、Genapol和胰加漂(Igepal)。
聚山梨醇酯的实例包括但不限于聚山梨醇酯20(吐温20)、聚山梨醇酯40(吐温40)、聚山梨醇酯60(吐温60)、聚山梨醇酯65(吐温65)、聚山梨醇酯80(吐温80)和聚山醇酯85(吐温85)。
辛基酚乙氧基化物的实例包括但不限于Triton X-15、Triton X-35、Triton X-45、Triton X-100、Triton X-102、Triton X-114、Triton X-165(70％)、Triton X-305(70％)、Triton X-405(70％)和Triton X-705(70％)。
葡萄糖胺的实例包括但不限于N-辛酰基-N-甲基葡萄糖胺(MEGA-8)、N-壬酰基-N-甲基葡萄糖胺(MEGA-9)和N-癸酰基-N-甲基葡萄糖胺(MEGA-10)。
芦布若尔的实例包括但不限于Lubrol WX、Lubrol PX、Lubrol 12A9、Lubrol17A10、Lubrol 17A17、Lubrol N13和LubrolG。
苄泽的实例包括但不限于Brij 35、Brij 58、Brij 93、Brij 97、Brij C2、BrijS2、Brij L4、Brij C10、Brij O10、Brij S10、Brij O20、Brij S20、Brij L23和Brij S100。
Nonidet的实例包括但不限于Nonidet P40。
泊洛沙姆的实例包括但不限于泊洛沙姆124、泊洛沙姆181、泊洛沙姆182、泊洛沙姆184、泊洛沙姆188(普朗尼克F68)、泊洛沙姆331、泊洛沙姆407(普朗尼克F127)。
Genapol的实例包括但不限于Genapol X-080、Genapol X-100和Genapol C-100。
胰加漂的实例包括但不限于Igepal CA-210、Igepal CA-520、Igepal CA-630、Igepal CA-720、Igepal CO-520、Igepal CO-630、Igepal CO-720、Igepal CO-890和IgepalDM-970。
(4)两性离子洗涤剂是指具有离子基团但无净电荷的洗涤剂。两性离子洗涤剂的实例包括但不限于酰胺基磺基甜菜碱、烷基甜菜碱和丙烷磺酸铵，如酰胺基磺基甜菜碱-14、酰胺基磺基甜菜碱-16、3-[((3-胆酰胺基丙基)二甲基铵]-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)、3-[((3-胆酰胺基丙基)二甲基铵-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO)、3-(4-庚基)苯基-3-羟基丙基)二甲基铵丙烷磺酸盐(C7BzO)、3-(N，N-二甲基辛基铵)丙烷磺酸盐内盐、3-(癸基二甲基铵)丙烷磺酸盐内盐、3-(十二烷基二甲基铵)丙烷磺酸盐内盐、3-(N，N-二甲基肉豆蔻基铵)丙烷磺酸盐内盐、3-(N，N-二甲基棕榈基铵)丙烷磺酸盐内盐、3-(N，N-二甲基十八烷基铵)丙烷磺酸盐内盐。
-术语“表观基因组”是指细胞的DNA和/或组蛋白的所有化学变化，并负责转座因子的基因表达调节、发育、分化和抑制。
-术语“基因组结构”是指沿染色体定位的遗传单位(例如基因座、基因等)的顺序、数量和存在。
-术语“单体型”是指一起从单个亲本遗传而来的来自单个染色体上不同基因座的基因的组。单体型信息有助于理解DNA的相同(顺式)或等位(反式)链的基因变体的潜在功能作用。
-术语“水凝胶”是指具有物理或化学交联的亲水性高含水量的聚合物网络。根据交联程度，水凝胶通常以两种状态存在：溶胶状态和凝胶状态。在溶胶状态下，水凝胶表现为液体，而在凝胶状态下，水凝胶表现为没有流动。如对本领域技术人员显而易见的的是，当水凝胶可能已经是处于溶胶状态的聚合物时，术语“聚合水凝胶”在本文中用于表示实现溶胶至凝胶转变所需的聚合和/或交联。
-术语“水凝胶基质”是指处于凝胶状态的水凝胶的物理结构，即如本文进一步公开的，达到本发明目的所需的孔隙率的聚合物的交联网络。
-当用于两个或多于两个核酸序列的序列之间的关系中时，术语“同一性”是指核酸之间的序列相关性的程度，其由两个或多于两个核苷酸残基的区段之间的匹配数确定。“同一性”使用由特定数学模型或计算机程序(即“算法”)所确定的空位比对(如果有)来测量两个或多于两个序列之间较小者的相同匹配的百分比。相关核酸序列的同一性可以通过已知方法容易地计算。这样的方法包括但不限于在Lesk，Arthur M.(1988)，“Computational molecular biology”，New York，NY：Oxford University Press；Smith，Douglas W.(1993)，“Biocomputing：informatics and genome projects”，New York，NY：Academic Press；Griffin，Annette M.和Hugh G.Griffin(1994)，“Computer analysis ofsequence data，part 1”，Totowa，NJ：Humana；von Heinje，Gunnar(1987)，“Sequenceanalysis in molecular biology：treasure trove or trivial pursuit”，AcademicPress；Gribskov，Michael和John Devereux(1991)，“Sequence analysis primer”，NewYork，NY：M.Stockton Press；Carillo等人，1988.SIAMJ.Applied Math.48：1073中所述的那些。用于确定同一性的优选方法被设计为在测试的序列之间给出最大的匹配。公开的计算机程序中描述了确定同一性的方法。用于确定两个序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux等人，1984.Nucl Acid Res.2：387；GeneticsComputer Group，University of Wisconsin，Madison，Wis.)、BLASTN、和FASTA(Altschul等人，1990.J Mol Biol.215：403-410)。BLASTX程序可从美国国家生物技术信息中心(NCBI)和其他来源(BLAST manual；Altschul等人NCB/NLM/NIH Bethesda，Md.20894；Altschul等人，1990.J Mol Biol.215：403-410)公开获得。众所周知的史密斯沃特曼算法也可以用于确定同一性。
-术语“试剂盒”和“试剂套装”是指任何产品(例如，包装或至少一个容器)，其包含实施本发明方法所必需的不同试剂，并包装以允许它们运输和储存。术语“试剂盒”和“试剂套装”应包含物理上分开的组成部分的实体，这些组成部分应单独使用，但在功能上相互关联。试剂盒可以作为用于执行本发明方法的单元被销售、分发或出售。此外，可以在保护试剂免受外部环境影响的容器内，例如密封的无菌容器中，提供任何或所有试剂盒试剂。试剂盒还可以包含描述该试剂盒及其使用方法的包装说明书。
-术语“连接”是指用共价键将DNA分子连接在一起的过程。例如，DNA连接涉及在一个核苷酸的3′羟基与另一个核苷酸的5′磷酸之间产生磷酸二酯键。优选在连接酶存在下于约4℃至约37℃的温度下进行连接。合适的连接酶的实例包括嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)连接酶、水生栖热菌(Thermus acquaticus)连接酶、大肠杆菌(E.coli)连接酶、T4连接酶和热球菌(Pyrococcus)连接酶。
-术语“裂解物”是指遵循生物单元的裂解程序的材料的液体或固体收集物。
-术语“裂解”或“分解”是指为了获得原本无法获得的材料而破坏生物单元的过程。当生物单元是细胞时，裂解是指破坏细胞的细胞膜，使试剂通过细胞膜孔转移到细胞中和/或引起细胞内容物溢出。裂解方法是技术人员众所周知的，并且包括但不限于蛋白水解裂解、化学裂解、热裂解、机械裂解和渗透裂解。
-术语“核酸序列引物”或“引物”是指能够与核酸杂交或退火并在适当条件下用作核苷酸聚合的起始位点的寡核苷酸，所述适当条件例如存在核苷三磷酸和用于聚合的酶，例如DNA或RNA聚合酶或逆转录酶，在合适的缓冲液中和在合适的温度下。
-术语“寡核苷酸”是指核苷酸的聚合物，通常是指核苷酸的单链聚合物。在一些实施方案中，寡核苷酸包含2个至500个核苷酸，优选10个至150个核苷酸，优选20个至100个核苷酸。寡核苷酸可以是合成的或可以是酶促制备的。在一些实施方案中，寡核苷酸可包含核糖核苷酸单体、脱氧核糖核苷酸单体或两者的混合物。
-术语“PCR柄序列”和“通用标签序列”是可互换的，并且是指用于使得能够扩增，优选PCR扩增从生物单元提取或衍生的核酸序列，并对其进行进一步测序的核酸序列。在一个实施方案中，PCR柄与模板序列缺乏同源性。在一个实施方案中，PCR柄序列对于整个样品制备工作流程是通用的。
-术语“定相”是指鉴定同源染色体的单个互补体。
-术语“削平”或“平端化”是指除去不相容的3′或5′DNA突出端，以促进平末端连接。可将技术人员众所周知的几种技术用于DNA末端削平。例如，可以通过使用水解末端磷酸二酯键的具有核酸外切酶活性的酶来水解DNA末端的未配对核苷酸，从而一次去除一个突出的碱基。在存在dNTP的情况下，可以通过采用DNA聚合酶在凹陷的3′末端填充来使具有5′突出端的DNA片段平端化。末端去除或填充可使用多种酶完成，包括DNA聚合酶I大(Klenow)片段、T4DNA聚合酶或绿豆核酸酶。
-术语“聚合酶链反应”或“PCR”涵盖的方法包括但不限于等位基因特异性PCR、不对称PCR、热启动PCR、序列间特异性PCR、甲基化特异性PCR、微型引物PCR、多重连接依赖性探针扩增、多重PCR、巢式PCR1、定量PCR、逆转录PCR和/或降落式PCR。适用于扩增核酸的DNA聚合酶包括但不限于Taq聚合酶Stoffel片段、Taq聚合酶、Advantage DNA聚合酶、AmpliTaq、AmpliTaq Gold、Titanium Taq聚合酶、KlenTaq DNA聚合酶、Platinum Taq聚合酶、Accuprime Taq聚合酶、Pfu聚合酶、Pfu聚合酶turbo、Vent聚合酶、Vent外切聚合酶、Pwo聚合酶、9Nm DNA聚合酶、Therminator、Pfx DNA聚合酶、Expand DNA聚合酶、rTth DNA聚合酶、DyNAzyme-EXT聚合酶、Klenow片段、DNA聚合酶I、T7聚合酶、测序酶TM、Tfi聚合酶、T4DNA聚合酶、Bst聚合酶、Bca聚合酶、BSU聚合酶、phi-29DNA聚合酶和DNA聚合酶β或其修饰版本。在一个实施方案中，DNA聚合酶具有3′-5′校正活性，即核酸外切酶活性。在一个实施方案中，DNA聚合酶具有5′-3′校正活性，即核酸外切酶活性。在一个实施方案中，DNA聚合酶具有链置换活性，即DNA聚合酶使配对的核酸从其互补链沿从5′向3′的方向解离，同时接近模板依赖性核酸合成。DNA聚合酶例如大肠杆菌DNA聚合酶I、DNA聚合酶I的Klenow片段、T7或T5噬菌体DNA聚合酶和HIV病毒逆转录酶是同时具有聚合酶活性和链置换活性的酶。可以将诸如解旋酶的试剂与不具有链置换活性的诱导剂结合使用，以产生链置换作用，即核酸的置换与相同序列的核酸合成相偶联。同样，来自大肠杆菌或其他生物体的蛋白例如Rec A或单链结合蛋白可以与其他诱导剂结合用于产生或促进链置换(Kornberg A.和Baker T.A.(1992).第4至6章.在DNA replication中(第二版，第113至225页)。纽约：W.H.Freeman)。
-术语“引物定向延伸”是指其中引物用于在核酸分子的线性或对数扩增中引发核酸序列的复制的本领域已知的任何方法。引物定向延伸可以通过本领域已知的几种方案中的任何一种来完成，包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)和链置换扩增(SDA)。如上文所述，“引物定向延伸”可以通过DNA聚合酶进行。
-术语“随机扩增技术”包括但不限于多重置换扩增(MDA)、随机PCR、多态DNA随机扩增(RAPD)或多次退火环状循环扩增(MALBAC)。
-术语“受体配体”是指来自较大复合体的与另一实体例如受体结合的任何物质。
-术语“逆转录”是指使用RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶，RT)复制RNA以产生DNA的互补链(cDNA)。RNA的逆转录可以通过本领域技术人员众所周知的技术，使用逆转录酶和4种脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)，即脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)和(脱氧)胸苷三磷酸(dTTP)的混合物来进行。在一些实施方案中，RNA的逆转录包括第一链cDNA合成的第一步。第一链cDNA合成的方法是技术人员众所周知的。第一链cDNA合成反应可以使用序列特异性引物、寡聚(dT)引物或随机引物的组合。逆转录酶的实例包括但不限于M-MLV逆转录酶、SuperScript II(Invitrogen)、SuperScript III(Invitrogen)、SuperScript IV(Invitrogen)、Maxima(ThermoFisher Scientific)、ProtoScript II(New England Biolabs)、PrimeScript(ClonTech)。
-术语“单细胞表观基因组谱分析”或“单细胞表观基因组学”是指对单细胞表观基因组的分析。
-术语“单细胞基因分型”或“单细胞基因组学”是指对单细胞基因组的分析。
-术语“单细胞单体型分析”是指基于整个基因组的单体型的解析。
-术语“单细胞转录组谱分析”或“单细胞转录组学”是指对单细胞转录组的分析。
-术语“间隔区”是指用于延长寡核苷酸的长度的化学基团或锚定部分。间隔物的实例包括但不限于乙二醇聚合物、烷基、寡核苷酸、肽和肽模拟物。
-术语“特异性扩增技术”包括但不限于需要温度循环的方法(例如聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应、基于转录的扩增)和/或等温扩增系统(例如自我维持序列复制、复制酶系统、解旋酶系统、链置换扩增、基于滚环的扩增和NASBA)。
-术语“载体”是指可以将生物单元和/或条形码单元固定在其上的基质。载体可以是刚性的、固体的或半固体的。
-术语“模板”或“模板序列”是指需要扩增的核酸序列。模板可以包括DNA或RNA。在一个实施方案中，模板序列是已知的。在一个实施方案中，模板序列是未知的。
-术语“模板转换”是指逆转录酶从初始核酸序列模板转换至新核酸序列模板(称为“模板转换寡核苷酸”)3′端的能力，该3′端与从初始模板合成的cDNA的3′端几乎没有或没有互补性。
-术语“模板转换衔接子序列”和“模板转换寡核苷酸”是指在核酸聚合反应期间，聚合酶从初始模板(例如，模板DNA或RNA)转换至的寡核苷酸模板。在这方面，模板DNA或RNA可以称为“供体模板”，并且模板转换寡核苷酸可以被称为“受体模板”。
当使用莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(M-MLV逆转录酶)发生逆转录时，该酶的末端核苷酸转移酶(TdT)活性会导致在新生cDNA链的3′端非模板导向地添加核苷酸。外源添加的“模板转换寡核苷酸”通过聚(G)引物位点与C区段退火。然后，逆转录酶将模板从mRNA转换至模板转换寡核苷酸，从而在第一链cDNA上添加“衔接子序列”或“衔接子”(即“衔接”)。优选地，衔接子序列与PCR柄具有同源性。
-术语“转录组”是指单个细胞的总RNA组分。在一些实施方案中，术语“转录组”可以具体指RNA聚合酶II的聚腺苷酸化产物。
-术语“特有的分子标识序列”是指可用于区分生物单元核酸序列的PCR扩增和进一步测序后的扩增产物复制物的核酸序列。
-术语“维生素”是指对对象的正常代谢而言少量必需的有机物质的组。维生素的实例包括但不限于α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、视黄醇和维A酸(维生素A)；硫胺素(维生素B1)和类似物，例如酰呋硫胺、蒜硫胺素、苯磷硫胺、呋喃硫胺、辛硫胺、丙舒硫胺和舒布硫胺；核黄素(维生素B2)；烟酸和尼克酸(维生素B3)；腺嘌呤、肉碱和胆碱(维生素B4)；泛酸、右泛醇和泛硫乙胺(维生素B5)；吡哆醇、磷酸吡哆醛、吡哆胺和吡啶醇(维生素B6)；生物素(维生素B7)；单磷酸腺苷(AMP)和肌醇(维生素B8)；叶酸、二氢叶酸、亚叶酸和左旋甲基四氢叶酸(维生素B9)；4-氨基苯甲酸(pABA)(维生素B10)；蝶酰庚谷氨酸(PHGA)(维生素B11)；腺苷钴胺素、氰钴胺素、羟钴胺素和甲基钴胺素(维生素B12)；乳清酸(维生素B13)；潘氨酸(维生素B15)；二甲基甘氨酸(DMG)(维生素B16)；苦杏仁苷(维生素B17)；左旋肉碱(维生素B20)；抗坏血酸和脱氢抗坏血酸(维生素C)；麦角固醇和麦角钙化醇(维生素D2)；7-脱氢胆固醇、维生素原D3、胆钙化醇、25-羟基胆钙化醇、骨化三醇和骨化三酸(calcitroic acid)(维生素D3)；二氢麦角钙化醇(维生素D4)；阿法骨化醇、二氢速甾醇、钙泊三醇、他卡西醇和帕立骨化醇(维生素D5)；α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、γ-生育三烯酚、δ-生育三烯酚和托可索仑(维生素E)；叶绿醌(维生素K1)；甲基萘醌类(维生素K2)；甲萘醌(维生素K3)；甲萘氢醌(维生素K4)；及其衍生物。
-本文所使用的术语仅出于描述特定情况的目的，并不旨在进行限制。如本文所使用的，指代物前不含有数量词也旨在包括复数形式，除非上下文另外明确指出。此外，对于在详细描述和/或权利要求中使用术语“包括”、“有”、“具有”、“含有”，这些术语旨在以类似于术语“包含”的方式表示包含性的。
发明详述
本发明涉及在水凝胶中捕获离散生物单元并使其条码化的方法。
在一个实施方案中，多个生物单元结合在载体上。在一个实施方案中，多个条形码单元结合在载体上。
在一个实施方案中，该方法包括使多个生物单元与多个条形码单元接触以形成生物单元/条形码单元复合体。在一个实施方案中，该方法还包括使生物单元/条形码单元复合体与水凝胶溶液接触。在一个实施方案中，该方法还包括使水凝胶溶液聚合以使生物单元/条形码单元复合体嵌入水凝胶基质中。在一个实施方案中，该方法还包括使水凝胶基质中每个生物单元/条形码单元复合体内的生物单元的核酸条码化。
在一个实施方案中，水凝胶聚合后，生物单元和条形码单元解除结合，即生物单元/条形码单元复合体的结合化学被降解。分解复合体的技术是技术人员众所周知的。
在一个实施方案中，可以对根据本发明的在水凝胶中捕获的生物单元进行生物化学和分子生物学测定。在一个实施方案中，可以对根据本发明在水凝胶中捕获的离散生物单元进行生物化学和分子生物学测定。在一个实施方案中，可以对根据本发明的在水凝胶中捕获的条形码单元进行生物化学和分子生物学测定。在一个实施方案中，可以根据本发明对在水凝胶中捕获的离散条形码单元进行生物化学和分子生物学测定。在一个实施方案中，可将水凝胶解聚以允许在溶液和/或本体中进行一些生物化学和分子生物学测定。
生物化学和分子生物学测定的实例包括但不限于细胞裂解、PCR、逆转录、核酸水解、脱帽(即5′帽结构的水解)、转录组谱分析(或转录组学)、基因分型(或基因组学)、表观基因组谱分析(或表观基因组学)、定相和单体型分析。
这里参考用于说明的实例应用描述了根据本发明的方法的几个方面。应当理解的是，阐述了许多具体细节、关系和方法以提供对本文所述特征的全面理解。然而，相关领域的普通技术人员将容易认识到，本文描述的特征可以在没有一个或多于一个特定细节的情况下实践或通过其他方法来实践。本文描述的特征不受动作或事件的所示顺序的限制，因为一些动作可以以不同的顺序和/或与其他动作或事件同时发生。此外，根据本文描述的特征，实施方法并不需要所有示出的动作或事件。
基于交联机理，水凝胶可分为物理水凝胶和化学水凝胶。
在一个实施方案中，水凝胶由至少一种天然聚合物制备。在一个实施方案中，水凝胶由至少一种合成聚合物制备。在一个实施方案中，水凝胶由至少一种天然/合成杂合聚合物制备。在一个实施方案中，水凝胶由至少一种天然聚合物和至少一种合成聚合物制备。
在一个实施方案中，用于本发明的水凝胶是物理水凝胶。
物理水凝胶交联包括但不限于缠结链、氢键、疏水相互作用和微晶形成。物理水凝胶可通过离子相互作用、结晶、立体复合体形成、疏水化多糖、蛋白相互作用和氢键合成。
在一个实施方案中，物理水凝胶是永久的。在一个实施方案中，物理水凝胶是可逆的。
在一个实施方案中，用于本发明的水凝胶是化学水凝胶。
化学水凝胶交联包括但不限于共价键。化学水凝胶可以通过链增长聚合、加成和缩聚以及γ和电子束聚合来合成。
在一个实施方案中，化学水凝胶通过末端官能化大分子单体的聚合来形成。
在一个实施方案中，化学水凝胶是永久的。在一个实施方案中，化学水凝胶是可逆的。
在一个实施方案中，水凝胶是多糖水凝胶。
多糖包括但不限于藻酸盐、琼脂糖、κ糖卡拉胶、ι拉卡拉胶、壳聚糖、葡聚糖、肝素、吉兰糖胶、天然吉兰胶、鼠李糖胶、脱乙酰化鼠李糖胶、S-657、维兰胶。
在一个实施方案中，聚合的多糖水凝胶通过共价交联、离子交联、化学缀合、酯化和/或聚合形成。
在一个实施方案中，多糖水凝胶是藻酸盐，并且聚合的藻酸盐在二价阳离子例如钙的存在下通过离子交联形成。
在一个实施方案中，水凝胶是基于蛋白的水凝胶。
蛋白包括但不限于胶原蛋白、纤维蛋白、明胶、层黏连蛋白。
在一个实施方案中，聚合的基于蛋白的水胶凝通过热凝胶作用形成。在一个实施方案中，使用交联剂使基于蛋白的水凝胶交联。
基于蛋白的水凝胶的交联剂包括但不限于碳二亚胺、氰胺、二醛淀粉、二酰亚胺、二异氰酸酯、己二酰亚胺二甲酯、环氧化合物、乙醛、甲醛、戊二醛、甘油醛、六亚甲基二胺、对苯二甲醛及其混合物。
在一个实施方案中，水凝胶是与如上所述蛋白结合的多糖水凝胶。
在一个实施方案中，水凝胶是不可生物降解的合成水凝胶。
不可生物降解的聚合物包括但不限于乙烯基化的单体和乙烯基化的大分子单体，特别是甲基丙烯酸2-羟乙酯、甲基丙烯酸2-羟丙酯、丙烯酰胺、丙烯酸、N-异丙基丙烯酰胺、聚N-异丙基丙烯酰胺、甲氧基聚乙二醇单丙烯酸酯。
在一个实施方案中，不可生物降解的分子聚合需要至少一种交联剂。在一个实施方案中，不可生物降解的合成水凝胶通过不可生物降解的分子和交联剂的共聚形成。
不可生物降解的合成水凝胶的交联剂包括但不限于N，N′-亚甲基双丙烯酰胺、乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯。
在一个实施方案中，不可生物降解的分子聚合还需要至少一种引发剂，例如过硫酸根离子(过硫酸铵、过硫酸钾等)、硝酸铈(IV)铵、四甲基乙二胺(TEMED)。
在一个实施方案中，水凝胶可以解聚。“解聚”是指水凝胶返回到溶液中的反应。如对本领域技术人员显而易见的那样，这不一定要求大量的解聚和/或大量的交联断裂。实现凝胶到溶胶转变所需的解聚和/或交联断裂的程度将取决于水凝胶的性质，并且可以通过常规方法容易地确定。在一个实施方案中，水凝胶的解聚是化学的。在一个实施方案中，水凝胶的解聚是热的。在一个实施方案中，水凝胶的解聚是酶促的。
在一个实施方案中，水凝胶的解聚可通过去除二价阳离子来实现。可以通过去除二价阳离子而解聚的水凝胶的实例包括但不限于藻酸盐。
在一个实施方案中，水凝胶的解聚可以通过添加还原剂来实现。还原剂的实例包括但不限于膦类化合物，例如，三(2-羧乙基)膦(TCEP)和二硫苏糖醇(DTT)。可通过添加还原剂而解聚的水凝胶的实例包括但不限于采用交联剂共聚的水凝胶，例如不可生物降解的合成水凝胶。
在一个实施方案中，水凝胶的解聚可以通过热熔融，即在温度升高时熔融来实现。
在一个实施方案中，用于本发明的水凝胶是热敏的。
“热敏”是指在形成后，水凝胶在升高到至少一种聚合物的熔点以上时解聚并且在冷却至室温或低于其熔点时重新形成的水凝胶。
在一个实施方案中，用于本发明的水凝胶是热可逆的。
“热可逆”是指形成后，水凝胶在升高到至少一种聚合物的熔点以上时解聚并且即使在冷却至室温或低于其熔点时也不会重新形成的水凝胶。
在一个实施方案中，水凝胶的至少一种聚合物的熔点为约20℃至约200℃，优选为约25℃至约100℃。
在一个实施方案中，水凝胶具有足够小的孔径以捕获生物单元、条形码单元和/或从生物单元提取或衍生的分析物。在一个实施方案中，水凝胶具有足够大的孔径以允许生物化学和分子生物学试剂的扩散。
在一个实施方案中，水凝胶的孔径为约1nm至1μn，优选约10nm至500nm，更优选25nm至250nm。
在一个实施方案中，水凝胶基质是生物化学和分子生物学试剂可到达的。在一个实施方案中，水凝胶基质具有至少一个生物化学和分子生物学试剂可到达的表面。在一个实施方案中，至少一个生物化学和分子生物学试剂可到达的表面是天然存在的。在一个实施方案中，至少一个生物化学和分子生物学试剂可到达的表面在水凝胶聚合之前、期间和/或之后成形。
在一个实施方案中，条形码单元的组成、形状、形式和修饰可以根据应用从一系列选项中进行选择。
可以在本发明中用作条形码单元的示例性材料包括但不限于丙烯酸类、碳(例如，石墨、碳纤维)、纤维素(例如，乙酸纤维素)、陶瓷、可控孔玻璃、交联多糖(例如琼脂糖、SEPHAROSETM或藻酸盐)、凝胶、玻璃(例如经修饰或官能化的玻璃)、金(例如，原子级光滑的Au(111))、石墨、无机玻璃、无机聚合物、乳胶、金属氧化物(例如SiO2、TiO2、不锈钢)、半金属、金属(例如原子级光滑的Au(111))、云母、硫化钼、纳米材料(例如高取向的热解石墨(HOPG)纳米片)、硝化纤维素、NYLONTM、光纤束、有机聚合物、纸、塑料、聚丙烯酰吗啉、聚(4-甲基丁烯)、聚对苯二甲酸乙二酯、聚丁酸乙烯酯、聚丁烯、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚乙烯、聚甲醛、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯、多糖、聚苯乙烯、聚氨酯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、石英、人造丝、树脂、橡胶、半导体材料、二氧化硅、硅(例如，表面氧化的硅)、硫化物和TEFLONTM。
在一个实施方案中，条形码单元由单一材料构成。在另一个实施方案中，条形码单元由几种不同材料的混合物构成。
在一个实施方案中，用于本发明的条形码单元可以是简单的正方形网格、棋盘网格、六边形阵列等。合适的条形码单元还包括但不限于珠、载玻片、芯片、颗粒、线、凝胶、片、管、球体、容器、毛细管、垫、切片、膜、培养皿、微量滴定板例如768孔、384孔、96孔、48孔、24孔、12孔、8孔、6孔、4孔、1孔等。在各种实施方案中，条形码单元可以是生物的、非生物的、有机的、无机的或其任何组合。
因此，多个条形码单元中的单个条形码单元可以是所述多个条形码单元中最小的、不可分割的部分。多个条形码单元中的单个条形码单元可以是例如网格上的单个正方形、珠群体中的单个珠、微量滴定板中的单个孔等。或者，多个条形码单元中的单个条形码单元可以是所述多个条形码单元中的最小部分，其中生物单元和条形码单元之间的单个结合事件在分子水平上发生。或者，多个条形码单元中的单个条形码单元可以是所述多个条形码单元中的部分，其范围为约1为约2至约1mm2，优选约1优选2至约1000m2，更优选约1更m2至约50μm2。在一个实施方案中，针对可制造性选择该尺寸范围。在一个实施方案中，选择该尺寸范围以确保形成1∶1比例的生物单元/条形码单元复合体。
条形码单元的表面可以根据技术人员已知的方法进行修饰，以促进生物单元在其上的捕获或固定。
在一个实施方案中，条形码单元在其表面上包含反应性基团，例如羧基、氨基、羟基、环氧基等。
在一个实施方案中，条形码单元可具有功能性修饰，例如附着于其表面的官能团。
在一个实施方案中，使用于本发明的条形码单元条码化。
在一个实施方案中，多个条形码单元中的每个单个条形码单元包含特有的条形码。在一个实施方案中，多个条形码单元中的每个单个条形码单元包含特有的条形码的克隆拷贝。
在一个实施方案中，条形码单元包括涉及结合至少一种生物单元的至少一种元件。
在一个优选实施方案中，条形码单元是珠。
根据本发明的方法的实施可以依赖于每个离散生物单元和/或结合到每个条形码单元的反应分析物的下游鉴定。因此，可能希望将至少一个标识符或条形码添加到条形码单元，以传递关于生物单元和/或样品中的分析物的源或来源的信息，例如从离散生物单元提取或衍生的核酸序列。
在一个实施方案中，条形码单元是条码化的。在一个实施方案中，多个条形码单元中的每个单个条形码单元包含特有的条形码。在一个实施方案中，多个条形码单元中的每个单个条形码单元包含特有的条形码的克隆拷贝。
条形码可以具有各种不同的形式，包括标记、标签，探针等。
在一个实施方案中，条形码单元是光学条码化的。在一个实施方案中，条形码单元是非光学条码化的。在一个实施方案中，条形码单元是光学条码化的和非光学条码化的。
光学条形码包括但不限于发色团、荧光团、量子点、苯乙烯单体及其组合，其可以例如通过它们的光谱如拉曼光谱或电磁光谱；和/或通过它们的颜色强度来鉴定。
非光学条形码包括但不限于生物分子序列，例如DNA、RNA和/或蛋白序列，其可以例如通过测序来鉴定。
在一个实施方案中，本发明中使用的特有的条形码的数量为约2个至约1012个。
在一个实施方案中，在多个条形码单元中的每个单个条形码单元中包含的每个特有的条形码的克隆拷贝的数量为约2个约1012个。
在一个实施方案中，根据本发明的条形码单元包括非光学条形码。在一个实施方案中，根据本发明的条形码单元包括核酸条形码。在一个实施方案中，核酸条形码是单链的。在一个实施方案中，核酸条形码是双链的。在一个实施方案中，核酸条形码是单链和/或双链的。在一个实施方案中，根据本发明的条形码单元包括DNA条形码。在一个实施方案中，根据本发明的条形码单元包括RNA条形码。在一个实施方案中，根据本发明的条形码单元包括DNA和RNA条形码的混合物。
在一个实施方案中，根据本发明的核酸条形码包含5个至20个核苷酸，优选8个至16个核苷酸。
在一个实施方案中，条形码单元包含多个特有的核酸序列，即特有的条形码的克隆拷贝。
在一个实施方案中，所述特有的核酸序列是简并序列。在一个实施方案中，所述特有的核酸序列是基于组合化学的。
将条形码共价连接到载体上，优选连接到条形码单元上的技术是本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于以组合方式复制结合的引物，以组合方式连接衔接子以及以组合方式化学添加核苷酸。
在一个实施方案中，在条形码单元上扩增所述特有的核酸序列，使得多个条形码单元中的每个单个条形码单元被起始核酸序列的克隆拷贝包被。
在一个实施方案中，在条形码合成期间直接进行核酸条形码与条形码单元的共价连接。在一个实施方案中，在条形码合成之后进行核酸条形码与条形码单元的共价连接。
将核酸条形码共价连接到条形码单元上的技术是技术人员众所周知的。
在一个实施方案中，通过将条形码与生物单元的核酸进行引物模板退火来实现生物单元的核酸的条码化。在一个实施方案中，通过将条形码与生物单元的核酸进行引物定向延伸来实现生物单元的核酸的条码化。在一个实施方案中，通过将条形码与生物单元的核酸进行连接来实现生物单元的核酸的条码化。
根据本发明的方法的实施可以依赖于生物单元或来自生物单元的核酸序列的固定、复制、延伸和/或扩增。因此，可能希望将至少一种核酸序列引物添加至条形码单元，优选将至少一种核酸序列引物添加至多个条形码单元中的每个单个条形码单元，以固定、复制、延伸和/或扩增生物单元或来自生物单元的遗传信息。
在一个实施方案中，核酸序列引物是单链的。在一个实施方案中，核酸序列引物是双链的。在一个实施方案中，核酸序列引物是单链和/或双链的。
在一个实施方案中，核酸序列引物是简并的(即随机的)核酸序列引物。在一个实施方案中，核酸序列引物对目的核酸序列具有特异性。
在一个实施方案中，核酸序列引物可在生物单元或来自生物单元的核酸序列的多个位置处引发。在一个实施方案中，生物单元或来自生物单元的核酸序列包含多个引发位点。
在一个实施方案中，核酸序列引物包含聚-dT序列。在一个实施方案中，核酸序列引物包含聚-dU序列。因此，核酸序列引物对聚-A序列具有特异性。聚-A序列可以存在于例如mRNA的3′端的聚-A尾内。
在一个实施方案中，核酸序列引物包含序列(dT)nVN，其中n为5至50，V代表除了T/U之外的任何核苷酸(即A、C或G)，并且N代表任何核苷酸(即，A、T/U、C或G)。在一个实施方案中，核酸序列引物包含序列(dU)nVN，其中n为5至50，V代表除了T/U之外的任何核苷酸(即，A、C或G)，并且N代表任何核苷酸(即，A、T/U、C或G)。因此，核酸序列引物对(A)nBN序列具有特异性，其中n为5至50，B代表除了A之外的任何核苷酸(即T/U、C或G)，N代表任何核苷酸(即，A、T/U、C或G)。(A)nBN序列可以存在于例如mRNA的3′端，在聚-A尾与3′UTR或CDS之间重叠。
在一个实施方案中，核酸序列引物包含聚-I序列。因此，核酸序列引物是非特异性的，并且可以引发生物单元或来自生物单元的任何核酸序列。
在一个实施方案中，核酸序列引物包含5个至50个核苷酸，优选5个至30个核苷酸。
在一个实施方案中，在核酸序列引物的合成期间直接进行核酸序列引物与条形码单元的共价连接。在一个实施方案中，在核酸序列引物合成后进行核酸序列引物与条形码单元的共价连接。
在一个实施方案中，条形码单元包含至少一种寡核苷酸。
在一个实施方案中，至少一种寡核苷酸是DNA寡核苷酸。在一个实施方案中，至少一种寡核苷酸是RNA寡核苷酸。在一个实施方案中，至少一种寡核苷酸是DNA/RNA杂合寡核苷酸。
在一个实施方案中，至少一种寡核苷酸是单链的。在一个实施方案中，至少一种寡核苷酸是双链的。在一个实施方案中，至少一种寡核苷酸是单链和/或双链的。
在一个实施方案中，至少一种寡核苷酸包含至少一种核酸条形码和至少一种核酸序列引物。在一个实施方案中，至少一种寡核苷酸从5′至3′包含至少一种核酸条形码和至少一种核酸序列引物。在一个实施方案中，至少一种寡核苷酸从5′至3′包含至少一种核酸序列引物和至少一种核酸条形码。在一个实施方案中，核酸条形码在给定条形码单元的表面上的所有寡核苷酸上是相同的。在一个实施方案中，一个条形码单元表面上的寡核苷酸相对于另一条形码单元而言，核酸条形码是不同的。在一个实施方案中，核酸序列引物在给定条形码单元表面上的所有寡核苷酸上是相同的。在一个实施方案中，核酸序列引物在给定条形码单元的表面上的所有寡核苷酸上是不同的。在一个实施方案中，核酸序列引物在所有寡核苷酸和条形码单元上是相同的。在一个实施方案中，核酸条形码包含5个至20个核苷酸，优选8个至16个核苷酸。在一个实施方案中，核酸序列引物包含5个至50个核苷酸，优选5个至30个核苷酸。
在一个实施方案中，至少一种寡核苷酸还包含PCR柄序列。在一个实施方案中，PCR柄序列在所有寡核苷酸和条形码单元上是相同的。在一个实施方案中，PCR柄序列包含10个至30个核苷酸，优选15个至25个核苷酸。
在一个实施方案中，至少一种寡核苷酸还包含特有的分子标识序列。在一个实施方案中，特有的分子标识序列在给定条形码单元的表面上的所有寡核苷酸上是不同的。在一个实施方案中，特有的分子标识序列包含10个至30个核苷酸，优选15个至25个核苷酸。
在一个实施方案中，至少一种寡核苷酸还包含间隔区。
在一个实施方案中，至少一种寡核苷酸从5′至3′(即，相对于条形码单元的表面从近端到远端)包含：
-任选地，间隔区；
-任选地，PCR柄序列；
-核酸条形码；
-任选地，特有的分子标识序列；和
-核酸序列引物。
在一个实施方案中，至少一种寡核苷酸从3′至5′(即，相对于条形码单元的表面从远端到近端)包含：
-任选地，间隔区；
-任选地，PCR柄序列；
-核酸条形码；
-任选地，特有的分子标识序列；和
-核酸序列引物。
在一个实施方案中，在核酸寡核苷酸的合成期间直接进行核酸寡核苷酸与条形码单元的共价连接。在一个实施方案中，在核酸寡核苷酸的合成之后进行核酸寡核苷酸与条形码单元的共价连接。
将核酸寡核苷酸共价连接和/或合成至条形码单元上的技术是本领域技术人员众所周知的，条形码单元例如为玻璃或塑料管或珠、硝化纤维素或尼龙过滤器、微量滴定孔、琼脂糖珠凝胶和磁性颗粒。这些技术包括但不限于UV辐射、生物素-抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白共价化学连接(Macosko等人，2015.Cell.161：1202-1214；Fan等人，2015.Science.347(6222)：1258367；Beaucage，S.L.(1993)，In Protocols foroligonucleotides and analogs-Synthesis and properties.Totowa，NJ：Humana Press，20：33-61；Conner等人，1983.Proc Natl Acad Sci.USA.80：278-282；Lockley等人，1997.Nucleic Acids Res.25：1313-1314；Joos等人，1997.Anal Biochem.247：96-101；Cohen等人，1997.Nucl Acid Res.25：911-912；Yang等人，1998.Chem Lett.3：257-258；Maskos等人，1992.Nucl Acid Res.20：1679-1684；Chrisey等人，1996.Nucl Acid Res.24：3131-3039；Chrisey等人，1996.Nucl Acid Res.24：3040-3047；Marble等人，1995.Biotechnol Prog.11：393-396；Liu等人，1997.Promega Notes Mag.64：21-25；Weiler等人，1996.Anal Biochem.243：218-227；Beattie等人，1995.Mol Biotechnol.4：213-225；Rasmussen等人，1991.Anal Biochem.198：138-142；Timofeev等人，1996.NuclAcid Res.24：3142-3148；Yershov等人，1997.Anal Biochem.250：203-211；DeAngelis等人，1995.Nucl Acid Res.23：4742-4743；Haukanes等人，1993.Biotechnology.11：60-63).
根据本发明的方法的实施可以依赖于生物单元在条形码单元上的结合和/或固定。因此，可能希望添加至少一种用于将生物单元结合到条形码单元的元件，以便捕获离散生物单元。
在一个实施方案中，生物单元在条形码单元上的结合和/或固定是非特异性的。在一个实施方案中，生物单元在条形码单元上的结合和/或固定是特异性的。
在一个实施方案中，将生物单元结合和/或固定在条形码单元上需要存在至少一种用于将条形码单元结合在生物单元上的元件。
用于结合生物单元的元件和/或结合条形码单元的元件包括但不限于蛋白或其片段、肽、抗体或其片段、核酸(例如单链或双链DNA或RNA)、碳水化合物、维生素或其衍生物、辅酶或其衍生物、受体配体或其衍生物、疏水基团。
在一个实施方案中，用于结合生物单元的元件和/或用于结合条形码单元的元件至少包含蛋白和/或肽。蛋白或肽的实例包括但不限于抗体(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)及其片段，包括但不限于Fab片段、F(ab′)2片段、scFv片段、双抗体、三抗体、scFv-Fc片段、小抗体；蛋白A、蛋白G、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、其受体及片段、以及其配体和片段。
在一个实施方案中，用于结合生物单元的元件和/或用于结合条形码单元的元件至少包含核酸。核酸的实例包括但不限于DNA、RNA和人工核酸，例如包含肌苷、黄嘌呤核苷、怀丁苷和/或其类似物的核酸。
在一个实施方案中，用于结合生物单元的元件和/或用于结合条形码单元的元件至少包含碳水化合物。碳水化合物的实例包括但不限于单糖、二糖和多糖。
在一个实施方案中，用于结合生物单元的元件和/或用于结合条形码单元的元件至少包含维生素。
在一个实施方案中，用于结合生物单元的元件和/或用于结合条形码单元的元件至少包含辅酶。
在一个实施方案中，用于结合生物单元的元件和/或用于结合条形码单元的元件至少包含受体配体。
在一个实施方案中，用于结合生物单元的元件和/或用于结合条形码单元的元件至少包含疏水基团。疏水基团的实例包括但不限于具有约2个至约8个碳原子的烷基，例如乙基、丙基、丁基、戊基、庚基或辛基及其异构形式；或芳基，例如苯基、苄基或萘基。
使用用于结合生物单元的元件涂覆条形码单元的技术是技术人员熟知的。
在一个实施方案中，涂覆可以是全部涂覆，即完全覆盖条形码单元，或者可以是部分涂覆，即仅覆盖条形码单元的部分。
在一个实施方案中，使用用于结合生物单元的元件涂覆条形码单元需要使条形码单元官能化。官能化的条形码单元的实例包括但不限于氨基官能化条形码单元、羧基官能化条形码单元、羟基官能化条形码单元和环氧官能化条形码单元。使条形码单元官能化的技术在本领域中是众所周知的，包括但不限于有机硅烷交联，例如甲氧基硅烷、乙氧基硅烷和乙酰氧基硅烷衍生物交联。
使用用于结合生物单元的元件涂覆条形码单元的技术的实例包括但不限于吸附和共价连接。可以使用偶联剂在官能化的条形码单元上进行共价连接，所述偶联剂例如为碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、磺基-NHS、二甲基氨基丙基(DEAP)、戊二醛、醛、氰基硼氢化钠(NaCNBH3)、琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、二硫苏糖醇(DTT)和/或溴化氰(BrNC)。
在一个实施方案中，用于结合条形码单元的至少一种元件天然存在于生物单元上和/或生物单元中。在一个实施方案中，用于结合条形码单元的至少一种元件不是天然存在于生物单元上和/或生物单元中。
在一个实施方案中，在结合和/或固定在条形码单元上之前，将生物单元与至少一种抗体一起孵育。在一个实施方案中，至少一种抗体对生物单元具有特异性。在一个实施方案中，至少一种抗体被官能化。官能化的实例包括但不限于蛋白或其片段、肽、抗体或其片段、核酸(例如单链或双链DNA或RNA)、碳水化合物、维生素或其衍生物、辅酶或其衍生物、受体配体或其衍生物、和疏水基团。在一个实施方案中，抗体被生物素化，即被生物素部分官能化。
根据本发明的方法的实施可以依赖于单个生物单元在单个条形码单元上的结合和/或固定。因此，可能希望防止超过一个生物单元与每个条形码单元结合；或者，防止超过一个条形码单元与每个生物单元结合。
取决于诸如生物单元和条形码单元的浓度和/或大小的参数，超过一个生物单元可以结合至单个条形码单元，反之亦然。因此，根据本发明的方法提供了用于确保、选择和/或纯化具有1∶1比例的生物单元/条形码单元复合体的方法。根据本发明的方法还提供了用于形成具有1∶1比例的生物单元/条形码单元复合体的方法。
在一个实施方案中，本发明的方法包括选择和/或纯化具有1∶1比例的生物单元/条形码单元复合体的步骤。根据一个实施方案，多个生物单元可以与多个条形码单元接触以形成可以被进一步选择和/或纯化的生物单元/条形码单元复合体。
选择和/或纯化复合体的技术是技术人员众所周知的，包括但不限于尺寸排阻色谱技术、密度梯度技术和/或过滤技术。
在一个实施方案中，本发明的方法包括用于形成具有1∶1比例的生物单元/条形码单元复合体的方法。
在一个实施方案中，将生物单元结合至载体。在一个实施方案中，将条形码单元结合至载体。
在使多个生物单元与多个条形码单元接触之前将多个生物单元结合到载体产生了位阻，并使载体成为障碍物，从而防止条形码单元与单个生物单元的多次结合。因此，可能期望使用相对于生物单元更大的条形码单元。另外，条形码单元相对于生物单元的有限浓度可用于确保每个生物单元最多结合一个条形码单元。
替代地，在使多个条形码单元与多个生物单元接触之前将多个条形码单元结合到载体产生了位阻，并使载体成为障碍物，从而防止生物单元与单个条形码单元的多次结合。因此，可能期望使用相对于生物单元更小的条形码单元。另外，生物单元相对于条形码单元的有限浓度可用于确保每个条形码单元最多结合一个生物单元。
在一个实施方案中，载体的组成、形状、形式和修饰可以根据应用从一系列选项中进行选择。
可以在本发明中用作载体的示例性材料包括但不限于丙烯酸类、碳(例如，石墨、碳纤维)、纤维素(例如，乙酸纤维素)、陶瓷、可控孔玻璃、交联多糖(例如琼脂糖、SEPHAROSETM或藻酸盐)、凝胶、玻璃(例如经修饰或官能化玻璃)、金(例如，原子级光滑的Au(111))、石墨、无机玻璃、无机聚合物、乳胶、金属氧化物(例如SiO2、TiO2、不锈钢)、半金属、金属(例如原子级光滑的Au(111))、云母、硫化钼、纳米材料(例如高取向的热解石墨(HOPG)纳米片)、硝化纤维素、NYLONTM、光纤束、有机聚合物、纸、塑料、聚丙烯酰吗啉、聚(4-甲基丁烯)、聚对苯二甲酸乙二酯、聚丁酸乙烯酯、聚丁烯、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚乙烯、聚甲醛、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯、多糖、聚苯乙烯、聚氨酯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、石英、人造丝、树脂、橡胶、半导体材料、二氧化硅、硅(例如，表面氧化的硅)、硫化物和TEFLONTM。
在一个实施方案中，载体由单一材料构成。在另一个实施方案中，载体由几种不同材料的混合物构成。
在一个实施方案中，用于本发明的载体可以是管、珠、载玻片、芯片、颗粒、线、凝胶、片、管、球体、容器、毛细管、垫、切片、膜、培养皿、微量滴定板例如768孔、384孔、96孔、48孔、24孔、12孔、8孔、6孔、4孔、1孔、正方形网格、棋盘网格、六边形阵列等。在各种实施方案中，载体可以是生物的、非生物的、有机的、无机的或其任何组合。
载体的表面可以根据技术人员已知的方法进行修饰，以促进生物单元和/或条形码单元在其上的捕获或固定。
在一个实施方案中，生物单元和/或条形码单元在载体上的捕获或固定是非特异性的。
在一个实施方案中，将生物单元和/或条形码单元捕获或固定在涂覆载体的水凝胶层中。
在一个实施方案中，生物单元和/或条形码单元在载体上的捕获或固定是特异性的。
在一个实施方案中，载体在其表面上包含反应性基团，例如羧基、氨基、羟基、环氧基等。在一个实施方案中，载体可具有功能性修饰，例如附着于其表面的官能团。在一个实施方案中，载体包含涉及结合至少一种生物单元和/或至少一种条形码单元的至少一种元件。
如上所述，用于结合生物单元和/或条形码单元的元件包括但不限于蛋白或其片段、肽、抗体或其片段、核酸(例如单链或双链DNA或RNA)、碳水化合物、维生素或其衍生物、辅酶或其衍生物、受体配体或其衍生物、和疏水基团。
使用用于结合生物单元和/或条形码单元的元件涂覆载体的技术是技术人员众所周知的。
在一个实施方案中，涂覆可以是全部涂覆，即完全覆盖载体，或者可以是部分涂覆，即仅覆盖载体的部分。
在一个实施方案中，使用用于结合生物单元和/或条形码单元的元件涂覆载体需要载体的官能化。官能化的载体的实例包括但不限于氨基官能化载体、羧基官能化载体、羟基官能化载体和环氧官能化载体。使载体官能化的技术在本领域中是众所周知的，包括但不限于有机硅烷交联，例如甲氧基硅烷、乙氧基硅烷和乙酰氧基硅烷衍生物交联。
使用用于结合生物单元和/或条形码单元的元件涂覆载体的技术的实例包括但不限于吸附和共价连接。可以使用偶联剂在官能化的载体上进行共价连接，偶联剂例如为碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、磺基-NHS、二甲基氨基丙基(DEAP)、戊二醛、醛、氰基硼氢化钠(NaCNBH3)、琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、二硫苏糖醇(DTT)和/或溴化氰(BrNC)。
在一个实施方案中，根据本发明的在水凝胶中捕获离散生物单元的方法包括以下步骤：
a)使多个生物单元与多个条形码单元接触以形成生物单元/条形码单元复合体，
b)使所述生物单元/条形码单元复合体与水凝胶溶液接触，
c)聚合水凝胶溶液以使所述生物单元/条形码单元复合体嵌入水凝胶基质中，和
d)使水凝胶基质中每个生物单元/条形码单元复合体内的生物单元的核酸条码化。
在一个实施方案中，每个条形码单元至少包含涉及结合如上文所定义的生物单元的元件。在一个实施方案中，每个生物单元至少包含涉及结合如上文所定义的条形码单元的元件。
在一个实施方案中，每个条形码单元包含如上文所定义的特有的条形码。在一个实施方案中，每个条形码单元包含特有的条形码的克隆拷贝。
在一个实施方案中，每个条形码单元包含至少一种如上文所定义的核酸序列引物。
在一个实施方案中，每个条形码单元包含如上文所定义的核酸寡核苷酸。
在一个实施方案中，多个生物单元结合在如上文所定义的载体上。在一个实施方案中，多个条形码单元结合在如上文所定义的载体上。
在一个实施方案中，根据本发明的方法可以包括选择和/或分选生物单元的步骤。生物单元的选择和/或分选可以基于给定的表面分子如蛋白或碳水化合物的表达，或基于每个生物单元的特定光散射和荧光特性。生物单元的选择和/或分选也可以基于生物单元的大小。选择和/或分选生物单元的方法是技术人员众所周知的，并且包括但不限于荧光激活细胞分选(FACS)、荧光原位杂交流式细胞术(FISH-FC)、IsoRaft阵列、DEPArray芯片实验室技术、磁性细胞分选、免疫沉淀、过滤等。
在一个实施方案中，根据本发明的方法可包括裂解生物单元的步骤。
在一个实施方案中，根据本发明的方法可以包括对生物单元的RNA成分，优选生物单元的mRNA成分进行逆转录的步骤。
在一个实施方案中，可以在使水凝胶基质中每个生物单元/条形码单元复合体内的生物单元的核酸条码化的步骤之前、期间或之后进行生物化学和分子生物学测定。
在一个实施方案中，根据本发明的方法可以包括预先扩增生物单元的核酸如DNA、RNA或cDNA的步骤。在一个实施方案中，根据本发明的方法可以包括在使水凝胶基质中每个生物单元/条形码单元复合体内的生物单元的核酸条码化的步骤之前预先扩增生物单元的核酸如DNA、RNA或cDNA的步骤。
在一个实施方案中，根据本发明的方法可以包括纯化模板用于生物化学和分子生物学测定的步骤。在捕获生物单元/条形码单元复合体后，可以从水凝胶中去除与核酸模板或包封核酸模板的膜结合的内源或外源蛋白和复合体。核酸纯化的技术是技术人员众所周知的，并且包括但不限于使用蛋白酶K和/或洗涤剂如SDS、肌氨酰、NP-40等。
在一个实施方案中，根据本发明的方法可包括清洁经扩增的核酸的步骤。在制备用于测序的核酸文库之前，可能需要除去单链引物和反应产物，例如酶。核酸清洁的技术是技术人员众所周知的，包括但不限于使用单链特异性核酸酶和/或使用磷酸酶以使核酸的磷酸化末端去磷酸化。单链特异性核酸酶的实例包括但不限于核酸外切酶I、绿豆核酸酶、核酸酶Bh1、核酸酶P1、核酸酶S1、BAL 31核酸酶。磷酸酶的实例包括但不限于碱性磷酸酶，例如虾碱性磷酸酶。
在一个实施方案中，根据本发明的方法可包括确定经扩增核酸的大小的步骤。根据制造商的建议，当使用含有相似大小片段的DNA文库时，例如Illumina或Ion Torrent的短读取测序仪效果最佳。如果没有正确选择文库的大小，这些测序仪的效率可能会降低。用于DNA大小选择的技术是技术人员众所周知的，包括但不限于核酸凝胶电泳、基于珠的方案、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、自动大小选择。
在一个实施方案中，根据本发明的方法可以包括核酸和/或cDNA文库片段化的步骤。
在一个实施方案中，根据本发明的方法可以包括核酸和/或cDNA文库酶促片段化的步骤。
在一个实施方案中，根据本发明的方法可以包括核酸和/或cDNA文库机械片段化的步骤。
在一个实施方案中，根据本发明的方法可以包括核酸和/或cDNA文库平端化的步骤。
在一个实施方案中，根据本发明的方法可以包括对核酸和/或cDNA文库A-加尾的步骤。
在一个实施方案中，根据本发明的方法可以包括核酸和/或cDNA文库连接的步骤。
在一个实施方案中，根据本发明的方法可包括标记的步骤。标记核酸和/或cDNA文库的技术是技术人员众所周知的。
在一个实施方案中，根据本发明的方法可包括核酸测序的步骤。在一个实施方案中，核酸的测序可以通过下一代测序(NGS)进行。用于核酸文库的NGS的方法是技术人员已知的，并且包括但不限于配对末端测序、合成测序和单读取测序。
在一个实施方案中，根据本发明的方法包括使水凝胶基质与可用于实施该方法的生物化学和分子生物学试剂接触。在一个实施方案中，水凝胶基质是足够多孔的以允许生物化学和分子生物学试剂的扩散，而不允许条形码单元、生物单元和/或分析物例如从离散生物单元提取或衍生的核酸的扩散。在一个实施方案中，可以通过交换和/或洗涤与水凝胶基质接触的生物化学和分子生物学试剂来进行后续步骤。
生物化学和分子生物学试剂是本领域技术人员众所周知的，并且包括已知进行生物化学和分子生物学测定的所有试剂，例如溶液(缓冲溶液、洗涤溶液等)、洗涤剂、酶、核酸引物等。
在一个实施方案中，生物化学和分子生物学试剂的扩散是被动扩散。被动扩散包括但不限于渗透和扩散电泳。
在一个实施方案中，生物化学和分子生物学试剂的扩散是主动扩散。在水凝胶中主动扩散的技术是技术人员众所周知的，包括但不限于使用泵、电渗和电泳。
在一个实施方案中，通过交换与水凝胶接触的大部分试剂来进行后续步骤。
在一个实施方案中，根据本发明的方法不需要使用昂贵的油、芯片和/或微滴生成仪器。
在一个实施方案中，根据本发明的方法可以是自动化的。
在一个实施方案中，根据本发明的方法可包括溶解水凝胶基质的步骤。在一个实施方案中，可以在整个方法中的任何时间发生水凝胶基质的溶解。溶解水凝胶基质的技术是技术人员众所周知的，并且包括但不限于使用酶例如琼脂酶进行酶促解聚和利用热进行热解聚。
在一个实施方案中，一旦至少一种拷贝，优选来自至少一个条形码单元的特有条形码的克隆拷贝掺入生物单元和/或分析物例如从离散生物单元提取或衍生的核酸，则可以发生水凝胶基质的溶解。
在一个实施方案中，一旦从离散生物单元提取或衍生的至少一种核酸相对于至少一种寡核苷酸进行引发，优选相对于至少一种包含来自离散条形码单元的核酸序列引物的寡核苷酸进行引发，则可以发生水凝胶基质的解聚。
本文描述的方法可以在多种应用中实施，包括但不限于单细胞转录组谱分析、单细胞基因分型、定相和单细胞表观基因组谱分析。
将变得清楚的是，在所公开的申请中列举的实施方案不是本发明的所有强制性特征，而仅仅是实现本发明的说明。单细胞转录组谱分析、单细胞基因分型、定相和/或单细胞表观基因组谱分析领域的技术人员将知道如何使用本领域的常识来调整该方法。此外，这些步骤可以与本公开的任何其他合适的步骤、方面和/或特征组合，和/或通过本公开的任何其他合适的步骤、方面和/或特征进行修改，所述合适的步骤、方面和/或特征包括在本公开中列出的科学文献和专利文献中描述的那些或本领域技术人员已知的那些。
本发明涉及用于分析离散生物单元中的基因表达的方法。
单细胞转录组谱分析依赖于单细胞mRNA成分的扩增及其测序。单细胞转录组的产生通常需要第一步的逆转录，以将具有聚(A)尾的mRNA转换为第一链cDNA，然后可以对其进行进一步的扩增和测序。
在一个实施方案中，用于分析离散生物单元中的基因表达的方法可以包括以下步骤：
a)使多个生物单元与多个条形码单元接触以形成生物单元/条形码单元复合体，其中每个条形码单元包含特有的条形码，并且其中所述条形码单元包含至少一种涉及结合所述生物单元的元件，
b)使所述生物单元/条形码单元复合体与水凝胶溶液接触，
c)聚合水凝胶溶液以使所述生物单元/条形码单元复合体嵌入水凝胶基质中，
d)从水凝胶基质中的每个生物单元中释放核酸，
e)使来自水凝胶基质中的每个生物单元的核酸条码化，
f)由来自每个生物单元的核酸合成cDNA文库，
g)扩增来自每个生物单元的cDNA文库，其中来自每个生物单元的cDNA文库的扩增使特有的条形码的克隆拷贝掺入来自每个生物单元的扩增产物中，和
h)对扩增产物进行测序。
在一个实施方案中，根据本发明的用于分析离散生物单元中的基因表达的方法包括本领域技术人员熟知的其他步骤。这些步骤描述于Macosko等人，2015.Cell.161：1202-1214；Fan等人，2015.Science.347(6222)：1258367；Klein等人，2015.Cell.161(5)：1187-201；Gierahn等人，2017.Nat Methods.14(4)：395-398；和美国专利申请US2016-0289669、US2016-0265069、US2016-0060621和US2015-0376609中，其全部内容通过引用并入本文。
在一个实施方案中，每个条形码单元包含至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸包含聚-dT核酸序列引物、特有的条形码和/或PCR柄。
在一个实施方案中，每个条形码单元包含至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸包含聚-dU核酸序列引物、特有的条形码和/或PCR柄。
在一个实施方案中，每个条形码单元包含至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸包含(dT)nVN核酸序列引物、特有的条形码和/或PCR柄，其中n为5至50，V代表除了T/U以外的任何核苷酸(即A、C或G)，N代表任何核苷酸(即A、T/U、C或G)。
在一个实施方案中，每个条形码单元包含至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸包含(dU)nVN核酸序列引物、特有的条形码和/或PCR柄，其中n为5至50，V代表除了T/U以外的任何核苷酸(即A、C或G)，N代表任何核苷酸(即A、T/U、C或G)。
在一个实施方案中，通过细胞裂解，优选通过使用非离子型洗涤剂和/或蛋白酶K的细胞裂解从每个生物单元释放核酸。
在一个实施方案中，该方法还包括洗去非离子型洗涤剂和/或蛋白酶K的步骤。
在一个实施方案中，该方法还包括使蛋白酶K失活的步骤。在一个实施方案中，通过热和/或化学抑制来使蛋白酶K失活。
在一个实施方案中，使用来自条形码单元的至少一种寡核苷酸的至少一种核酸序列引物来合成来自每个生物单元的核酸的cDNA文库。
在一个实施方案中，通过逆转录，即使用逆转录酶来合成来自每个生物单元的核酸的cDNA文库。
在一个实施方案中，逆转录酶是M-MLV逆转录酶。
在一个实施方案中，优选使用第二链反应组分合成cDNA文库的cDNA的互补链。在一个实施方案中，使用RNA酶H、DNA聚合酶I和/或DNA连接酶合成cDNA文库的cDNA的互补链。
在一个实施方案中，使cDNA文库片段化，以获得cDNA片段。用于使DNA片段化的方法是本领域众所周知的，包括但不限于Covaris超声处理和DNA酶促切割。
在一个实施方案中，使cDNA片段平端化。在一个实施方案中，对cDNA片段进行A-加尾。
在一个实施方案中，将衔接子添加至cDNA文库。可以使用多种方法将衔接子添加至cDNA文库，该方法包括但不限于Tn5转座和连接。
在一个实施方案中，用条形码单元的至少一种寡核苷酸的至少一种核酸序列引物进行cDNA文库的扩增。
在一个实施方案中，可使用游离的核酸序列引物，即未结合至条形码单元的核酸序列引物，来增强扩增步骤。
本发明还涉及用于分析离散生物单元的基因型的方法。
单细胞基因分型依赖于单细胞DNA的全基因组扩增(WGA)来产生足够的DNA用于测序。WGA的几种方法是可用的，并且是技术人员众所周知的。但是，一些方法会导致扩增偏差，进而导致基因组覆盖率不足。采用简并引物进行的基于PCR的指数WGA引入了序列依赖性偏差。使用置换链的Φ29DNA聚合酶进行的多重置换扩增(MDA)代表了改进，但由于非线性扩增，也可能引入偏差。多次退火环状循环扩增(MALBAC)是引入准线性预扩增以减少与非线性扩增相关的偏差的另一种方法。其在准线性预扩增阶段依赖于BstI DNA聚合酶，在随后的指数扩增中依赖于高保真PCR酶(Zong等人，2012.Science.338(6114)：1622-6；Lu等人，2012.Science.338(6114)：1627-30)。
在一个实施方案中，用于分析离散生物单元的基因型的方法可以包括以下步骤：
a)使多个生物单元与多个条形码单元接触以形成生物单元/条形码单元复合体，其中每个条形码单元包含特有的条形码，并且其中所述条形码单元包含至少一种涉及结合所述生物单元的元件，
b)使所述生物单元/条形码单元复合体与水凝胶溶液接触，
c)聚合水凝胶溶液以使所述生物单元/条形码单元复合体嵌入水凝胶基质中，
d)从水凝胶基质中的每个生物单元中释放基因组DNA，
e)使来自水凝胶基质中的每个生物单元的基因组DNA条码化，
f)任选地，由来自每个生物单元的核酸合成DNA文库，
g)扩增来自每个生物单元的基因组DNA或DNA文库，其中来自每个生物单元的基因组DNA或DNA文库的扩增使特有的条形码的克隆拷贝掺入每个生物单元的扩增产物中，和
h)对扩增产物进行测序。
在一个实施方案中，根据本发明的用于分析离散生物单元的基因型的方法包括本领域技术人员熟知的其他步骤。这些步骤描述于Hutchison等人，2005.Proc Natl AcadSci USA.102(48)：17332-6；Leung等人，2016.Proc Natl Acad Sci USA.113(30)：8484-9；Wang等人，2012.Cell.150(2)：402-12；Marcy等人，2007.PLoS Genet.3(9)：1702-8；Gole等人，2013.Nat Biotechnol.31(12)：1126-32；Zhang等人，2006.Nat Biotechnol.24(6)：680-6；和国际申请WO2016/061517和WO2005/003304中，其全部内容通过引用并入本文。
在一个实施方案中，每个条形码单元包含至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸包含核酸序列引物、特有的条形码和/或PCR柄。在一个实施方案中，每个条形码单元包含至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸包含寡dN引物(例如六核苷酸d(N6)或八核苷酸d(N8)引物，其中N代表任何核苷酸(即，A、T/U、C或G))、特有的条形码和/或PCR柄。
在一个实施方案中，通过细胞裂解和/或细胞核裂解，优选通过使用离子型洗涤剂和/或蛋白酶K的细胞裂解和/或细胞核裂解从每个生物单元中释放基因组DNA。
在一个实施方案中，该方法还包括洗去离子表面型洗涤剂和/或蛋白酶K的步骤。
在一个实施方案中，该方法还包括使蛋白酶K失活的步骤。在一个实施方案中，通过热和/或化学抑制来使蛋白酶K失活。
在一个实施方案中，该方法还包括使基因组DNA变性的步骤。使基因组DNA变性的方法是技术人员众所周知的，包括但不限于碱处理和/或加热。
在一个实施方案中，使用来自条形码单元的至少一种寡核苷酸的至少一种核酸序列引物来合成来自每个生物单元的核酸的cDNA文库。
在一个实施方案中，通过引物定向延伸来合成来自每个生物单元的核酸的cDNA文库。
在一个实施方案中，通过全基因组扩增(WGA)进行基因组DNA的扩增。在一个实施方案中，用条形码单元的至少一种寡核苷酸的至少一种核酸序列引物进行基因组DNA的扩增。
在一个实施方案中，使扩增的基因组DNA片段化以获得DNA片段。用于使DNA片段化的方法是本领域众所周知的，包括但不限于Covaris超声处理和DNA酶促切割。
在一个实施方案中，使cDNA片段平端化。在一个实施方案中，对cDNA片段进行A-加尾。
在一个实施方案中，将衔接子添加至DNA片段。可以使用多种方法将衔接子添加至DNA片段，包括但不限于Tn5转座和/或连接。
在一个实施方案中，用于分析离散生物单元的基因型的方法可以实施直接文库制备(DLP)。在一个实施方案中，对扩增的基因组DNA进行标记。在一个实施方案中，对未扩增的基因组DNA进行标记。直接文库制备和标记是技术人员众所周知的。可以参考，例如Vitak等人，2017.Nat Methods.14(3)：302-308；Adey等人，2010.Genome Biol.11(12)：R119；Gertz等人，2012.Genome Res.22(1)：134-41；和Zahn等人，2017.Nat Methods.14(2)：167-173，其全部内容通过引用并入本文。因此，在一个实施方案中，每个条形码单元包含至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸包含核酸序列引物、特有的条形码和/或PCR柄。在一个实施方案中，核酸序列引物具有与至少一种Tn5衔接子互补的序列。在一个实施方案中，核酸序列引物包含序列5’-TCGTCGGCAGCGTC-3’(SEQ ID NO：1)或5’-GTCTCGTGGGCTCG-3’(SEQ ID NO：2)或由其组成。
在一个实施方案中，该方法包括将标记的来自每个生物单元的基因组DNA连接至每个条形码单元的至少一个寡核苷酸的步骤。
在一个实施方案中，该方法包括扩增DNA片段的步骤。扩增DNA片段的技术是技术人员众所周知的。
在一个实施方案中，用条形码单元的至少一种寡核苷酸的至少一种核酸序列引物进行DNA片段的扩增。在一个实施方案中，用至少一种核酸序列引物进行DNA片段的扩增，所述核酸序列引物不是条形码单元的至少一种寡核苷酸的至少一种核酸序列引物。
在一个实施方案中，可使用游离的核酸序列引物，即未结合至条形码单元的核酸序列引物，来增强扩增步骤。
本发明还涉及一种用于分析离散生物单元的单体型，即定相的方法。
定相依赖于高分子量即大于25千碱基或50千碱基的DNA的全基因组扩增(WGA)，以产生足够的DNA用于测序。WGA的几种方法是可用的，并且是技术人员众所周知的。但是，一些方法会导致扩增偏差，进而导致基因组覆盖率不足。采用简并引物进行的基于PCR的指数WGA引入了序列依赖性偏差。使用置换链的Φ29DNA聚合酶进行的多置换扩增(MDA)代表了改进，但由于非线性扩增，也可能引入偏差。多次退火环状循环扩增(MALBAC)是引入准线性预扩增以减少与非线性扩增相关的偏差的另一种方法。其在准线性预扩增阶段依赖于BstIDNA聚合酶，在随后的指数扩增中依赖于高保真PCR酶(Zong等人，2012.Science.338(6114)：1622-6；Lu等人，2012.Science.338(6114)：1627-30)。替代地，Tn5转座酶和随后的扩增可以在称为“邻近性保留转座”(CPT-测序)的方法中用于文库制备(Amini等人，2014.Nat Genet.46(12)：1343-9)。在该方法中，基因组DNA任选地被纯化后的第一步是通过Tn5转座标记DNA。这将使DNA片段化，并将通用衔接子直接添加到模板中。填补空隙后，然后使用与插入的Tn5衔接子互补的引物进行PCR，然后进行测序。
在一个实施方案中，用于分析离散生物单元的单体型的方法可以包括以下步骤：
a)使多个生物单元与多个条形码单元接触以形成生物单元/条形码单元复合体，其中每个条形码单元包含特有的条形码，并且其中所述条形码单元包括至少一种设计结合所述生物单元的元件，
b)使所述生物单元/条形码单元复合体与水凝胶溶液接触，
c)聚合水凝胶溶液以使所述生物单元/条形码单元复合体嵌入水凝胶基质中，
d)任选地，从水凝胶基质中的每个生物单元中释放核酸，
e)使来自水凝胶基质中的每个生物单元的核酸条码化，
f)任选地，由来自每个生物单元的核酸合成DNA文库，
g)扩增来自每个生物单元的核酸或DNA文库，其中来自每个生物单元的核酸或DNA文库的扩增使特有的条形码的克隆拷贝掺入来自每个生物单元的扩增产物中，和
h)对扩增产物进行测序。
在一个实施方案中，根据本发明的用于分析离散生物单元的单体型的方法包括本领域技术人员熟知的其他步骤。这些步骤描述于国际申请WO2015/126766、WO2016/130704、WO2016/61517、WO2015/95226、WO2016/003814、WO2005/003304、WO2015/200869、WO2014/124338、WO2014/093676中；美国专利申请US2015-066385中；Kuleshov等人，2014.NatBiotechnol.32(3)：261-6；Amini等人，2014.Nat Genet.46(12)：1343-9；Kaper等人，2013.Proc Natl Acad Sci USA.110(14)：5552-7；Peters等人，2012.Nature.487(7406)：190-5和Zheng等人，2016.Nat Biotechnol.34(3)：303-11中，其全部内容通过引用并入本文。
在一个实施方案中，用于结合生物单元的至少一种元件是抗Tn5抗体。在一个实施方案中，用于结合生物单元的至少一种元件是链霉抗生物素蛋白，并且该生物单元与生物素化的抗Tn5抗体接触。
在一个实施方案中，每个条形码单元包含至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸包含核酸序列引物、特有的条形码和/或PCR柄。在一个实施方案中，核酸序列引物具有与至少一种Tn5衔接子互补的序列。在一个实施方案中，核酸序列引物包含序列5’-TCGTCGGCAGCGTC-3’(SEQ ID NO：1)或5’-GTCTCGTGGGCTCG-3’(SEQ ID NO：2)或由其组成。在另一个实施方案中，每个条形码单元包含至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸包含寡dN引物(例如六核苷酸d(N6)或八核苷酸d(N8)引物，其中N代表任何核苷酸(即，A、T/U、C或G))、特有的条形码和/或PCR柄。
在一个实施方案中，通过细胞裂解和/或细胞核裂解，优选通过使用离子型洗涤剂和/或蛋白酶K的细胞裂解和/或细胞核裂解从每个生物单元中释放核酸。
在一个实施方案中，使用来自条形码单元的至少一种寡核苷酸的至少一种核酸序列引物来合成来自每个生物单元的核酸的DNA文库。
在一个实施方案中，该方法还包括洗去离子型洗涤剂和/或蛋白酶K的步骤。
在一个实施方案中，该方法还包括使蛋白酶K失活的步骤。在一个实施方案中，通过热和/或化学抑制来使蛋白酶K失活。
在一个实施方案中，该方法还包括使来自每个生物单元的核酸变性的步骤。使核酸变性的方法是技术人员众所周知的，包括但不限于碱处理和/或加热。
在一个实施方案中，通过全基因组扩增(WGA)进行来自每个生物单元的核酸的扩增。在一个实施方案中，用条形码单元的至少一种寡核苷酸的至少一种核酸序列引物对来自每个生物单元的核酸进行扩增。
在一个实施方案中，使扩增的来自每个生物单元的核酸片段化，以获得核酸片段。用于使DNA片段化的方法是本领域众所周知的，包括但不限于Covaris超声处理和DNA酶促切割。
在一个实施方案中，使核酸片段平端化。在一个实施方案中，对核酸片段进行A-加尾。
在一个实施方案中，将衔接子，优选Tn5衔接子添加至核酸片段。可以使用多种方法将衔接子添加至核酸片段，该方法包括但不限于Tn5转座和/或连接。
在一个实施方案中，用于分析离散生物单元的单体型的方法可以实施邻近性保留转座(CTP-测序)。该方法描述于国际申请WO2016/061517中，其通过引用并入本文。
在一个实施方案中，该方法包括优选地用Tn5转座酶标记来自每个生物单元的核酸的步骤。在一个实施方案中，来自每个生物单元的核酸是高分子量DNA(HMW-DNA)。在一个实施方案中，标记来自每个生物单元的HMW-DNA保留了来自每个生物的HMW-DNA的邻近性。
在一个实施方案中，该方法包括破坏来自每个生物单元的核酸，优选来自每个生物单元的HMW-DNA的邻近性的步骤。破坏邻近性的技术是技术人员众所周知的，包括但不限于优选通过使用离子型洗涤剂和/或蛋白酶K从每个生物单元的核酸中释放Tn5复合体。
在一个实施方案中，该方法包括衔接子，优选Tn5衔接子的空隙填补的步骤。
在一个实施方案中，该方法包括扩增标记的来自每个生物单元的核酸的步骤。在一个实施方案中，用条形码单元的至少一种寡核苷酸的至少一种核酸序列引物对标记的来自每个生物单元的核酸进行扩增。
在一个实施方案中，该方法包括将标记的来自每个生物单元的核酸连接至每个条形码单元的至少一个寡核苷酸的步骤。
在一个实施方案中，该方法包括扩增加标记的核酸的步骤。扩增核酸的技术是技术人员众所周知的。在一个实施方案中，用条形码单元的至少一种寡核苷酸的至少一种核酸序列引物对标记的核酸进行扩增。
在一个实施方案中，可使用游离的核酸序列引物，即未结合至条形码单元的核酸序列引物，来增强扩增步骤。
本发明还涉及用于分析离散生物单元的表观基因组的方法。
已经开发了基于Tn5转座的单细胞核小体定位，称为“基于高通量测序的染色质转座酶可接近性实验”(ATAC-测序)(Buenrostro等人，2015.Nature.523(7561)：486-90)。在这种方法中，第一步是通过针对完整细胞或分离的细胞核使用低百分比的非离子型洗涤剂，使分子能够接近无核小体的DNA。然后通过Tn5转座对可接近的DNA进行标记。这将使DNA片段化，并将通用衔接子直接添加到模板中。然后使用与那些衔接子互补的引物进行PCR，然后进行测序。
因此，在一个实施方案中，用于分析离散生物单元的表观基因组的方法可以包括以下步骤：
a)使多个细胞生物单元与多个条形码单元接触以形成生物单元/条形码单元复合体，其中每个条形码单元包含特有的条形码，并且其中所述条形码单元包含至少一种涉及结合所述生物单元的元件，
b)使所述生物单元/条形码单元复合体与水凝胶溶液接触，
c)聚合水凝胶溶液以使所述生物单元/条形码单元复合体嵌入水凝胶基质中，
d)从水凝胶基质中的每个生物单元中释放非核小体结合的DNA，
e)使来自水凝胶基质中的每个生物单元的非核小体结合的DNA条码化，
f)任选地，由来自每个生物单元的非核小体结合的DNA合成DNA文库，
g)扩增来自每个生物单元的非核小体结合的DNA或DNA文库，其中来自每个生物单元的非核小体结合的DNA或DNA文库的扩增使特有的条形码的克隆拷贝掺入来自每个生物单元的扩增产物中，
h)对扩增产物进行测序。
在一个实施方案中，从非核小体起始位点开始由每个生物单元扩增非核小体结合的DNA或DNA文库。非核小体起始位点是发生转座的位点，即可接近DNA的位点。任选地，非核小体起始位点是DNA被酶促片段化且DNA被连接的位点。
在一个实施方案中，根据本发明的用于分析离散生物单元的表观基因组的方法包括本领域技术人员熟知的其他步骤。这些步骤描述于国际申请WO2014/189957；Buenrostro等人，2015.Nature.523(7561)：486-90；Buenrostro等人，2013.Nat Methods.10(12)：1213-8；和Christiansen等人，2017.Methods Mol Biol.1551：207-221中，其全部内容通过引用并入本文。
在一个实施方案中，每个条形码单元包含至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸包含核酸序列引物、特有的条形码和/或PCR柄。在一个实施方案中，核酸序列引物具有与至少一种衔接子序列，优选至少一种Illumina衔接子序列互补的序列。在一个实施方案中，核酸序列引物具有与至少一种Tn5衔接子互补的序列。在一个实施方案中，核酸序列引物包含序列5’-TCGTCGGCAGCGTC-3’(SEQ ID NO：1)或5’-GTCTCGTGGGCTCG-3’(SEQ ID NO：2)或由其组成。
在一个实施方案中，通过细胞裂解，优选通过使用非离子型洗涤剂和/或蛋白酶K的细胞裂解从每个生物单元释放非核小体结合的DNA。
在一个实施方案中，使用来自条形码单元的至少一种寡核苷酸的至少一种核酸序列引物来合成来自每个生物单元的非核小体结合的DNA的DNA文库。
在一个实施方案中，该方法还包括洗去非离子型洗涤剂和/或蛋白酶K的步骤。
在一个实施方案中，该方法还包括使蛋白酶K失活的步骤。在一个实施方案中，通过热和/或化学抑制来使蛋白酶K失活。
在一个实施方案中，对非核小体结合的DNA进行标记。用于标记的技术是技术人员众所周知的。在一个实施方案中，通过Tn5转座，优选使用Illumina衔接子序列，对非核小体结合的DNA进行标记。
在一个实施方案中，该方法包括将标记的来自每个生物单元的非核小体结合的DNA连接至每个条形码单元的至少一个寡核苷酸的步骤。
在一个实施方案中，该方法包括扩增标记的来自每个生物单元的非核小体结合的DNA的步骤。扩增DNA的技术是技术人员众所周知的。
在一个实施方案中，用条形码单元的至少一种寡核苷酸的至少一种核酸序列引物扩增标记的非核小体结合的DNA。在一个实施方案中，用至少一种核酸序列引物扩增标记的非核小体结合的DNA，所述核酸序列引物不是条形码单元的至少一种寡核苷酸的至少一种核酸序列引物。
在一个实施方案中，标记的非核小体结合的DNA的扩增将来自Tn5转座酶的衔接子序列掺入来自每个生物单元的扩增产物中。
在一个实施方案中，可使用游离的核酸序列引物，即未结合至条形码单元的核酸序列引物，来增强扩增步骤。
本发明还涉及试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包括：
-多个条形码单元，
-水凝胶溶液和/或用于制备水凝胶溶液的水凝胶单体，
-用于生物化学和分子生物学测定的试剂和溶液，和
-使用说明。
在一个实施方案中，每个条形码单元包含至少一种涉及结合如上文所定义的生物单元的元件。在一个实施方案中，每个条形码单元包含至少一种如上文所定义的核酸序列引物。在一个实施方案中，每个条形码单元包含至少一种如上文所定义的核酸寡核苷酸。
在一个实施方案中，试剂盒还包括用于结合生物单元和/或条形码单元的至少一个载体。
在一个实施方案中，试剂盒包括：
-包含多个预先结合的条形码单元的载体，
-水凝胶溶液和/或用于制备水凝胶溶液的水凝胶单体，
-用于生物化学和分子生物学测定的试剂和溶液，和
-使用说明。
在一个实施方案中，每个条形码单元包含至少一种涉及结合如上文所定义的生物单元的元件。在一个实施方案中，每个条形码单元包含至少一种如上文所定义的核酸序列引物。在一个实施方案中，每个条形码单元包含至少一种如上文所定义的核酸寡核苷酸。
附图说明
图1是说明水凝胶中生物单元的捕获和条码化的图。使用以下符号：(A)条形码单元；(B)生物单元；(B*)条码化的生物单元；(C)用于结合生物单元的元件；(HS)水凝胶(溶胶态)；(HG)水凝胶基质(处于凝胶状态的水凝胶)；(HG/HS)固态或凝胶态的水凝胶；(1)生物单元与条形码单元的结合；(2)与水凝胶溶液接触；(3)水凝胶聚合；(4)生物单元条码化；(5)引物定向延伸、连接、扩增、片段化、加衔接子；(6)下一代测序。
图2是示出结合至单个条形码单元的多个生物单元的图。使用以下符号：(A1，A2)条形码单元；(B1，B2)生物单元；(C)用于结合生物单元的元件；(Y)偏差数据；(1)生物单元与条形码单元的结合；(2-6)图1的步骤2至6。
图3是示出了结合至单个生物单元的多个条形码单元的图。使用以下符号：(A1，A2)条形码单元；(B1，B2)生物单元；(C)用于结合生物单元的元件；(1)生物单元与条形码单元的结合；(2-6)图1的步骤2至6。
图4是说明在结合至条形码单元、捕获和条码化之前生物单元与固体载体的结合的图。条形码单元显著大于生物单元，因此阻止了多个条形码单元与单个生物单元的结合。使用以下符号：(A1，A2)条形码单元；(B1，B2)生物单元；(C)用于结合生物单元的元件；(S)固体载体；(11)生物单元与固体载体的结合；(12)在溶液中添加条形码单元；(1)生物单元与条形码单元的结合；(2-6)图1的步骤2至6。
图5是说明在结合至生物单元、捕获和条码化之前条形码单元与固体载体的结合的图。生物单元显著大于条形码单元，因此阻止了多个生物单元与单个条形码单元的结合。使用以下符号：(A1，A2)条形码单元；(B1，B2)生物单元；(C)用于结合生物单元的元件；(D)用于结合条形码单元的元件；(S)固体载体；(21)条形码单元与固体载体的结合；(22)在溶液中添加生物单元；(1)生物单元与条形码单元的结合；(2-6)图1的步骤2至6。
图6是说明在结合至条形码单元、捕获和条码化之前生物单元与固体载体的结合的图。条形码单元和生物单元的大小大致相同。条形码单元处于有限稀释，以防止多个条形码单元与单个生物单元结合。使用以下符号：(A)条形码单元；(B1，B2)生物单元；(C)用于结合生物单元的元件；(S)固体载体；(11)生物单元与固体载体的结合；(12*)在溶液中以有限浓度添加条形码单元；(1)生物单元与条形码单元的结合；(2-6)图1的步骤2至6。
图7是说明在结合至生物单元、捕获和条码化之前条形码单元与固体载体的结合的图。生物单元和条形码单元的大小大致相同。生物单元处于有限稀释，以防止多个生物单元与单个条形码单元结合。使用以下符号：(A1，A2)条形码单元；(B)生物单元；(C)用于结合生物单元的元件；(D)用于结合条形码单元的元件；(S)固体载体；(21)条形码单元与固体载体的结合；(22*)在溶液中以有限浓度添加生物单元；(1)生物单元与条形码单元的结合；(2-6)图1的步骤2至6。
图8是说明可能的单细胞RNA测序转录组工作流程的图，其使用包含寡核苷酸的条形码单元，其本身包含聚-dT核酸序列引物、特有的条形码和PCR柄。第一步中存在多个条形码寡核苷酸，但为简单起见，此处仅在步骤84之后显示一个为(a)。步骤1-3(1-3)可以如图1所示执行，或可能涉及固体载体，并因此包括图4至7的其他步骤。使用以下符号：(A)条形码单元；(B)生物单元；(HG)水凝胶基质(处于凝胶状态的水凝胶)；(HG/HS)固态或凝胶态的水凝胶；(R)聚(A)mRNA；(a)条形码；(PCR)PCR柄；(Tn)聚(T)引物；(DNA1)第一链cDNA；(DNA2)第二链cDNA；(83*)通过使用非离子型洗涤剂进行细胞裂解；(84)条码化，即用条形码寡核苷酸的寡d(T)引物引发聚(A)mRNA；(85)第2链cDNA合成(任选地通过模板转换和扩增)；(86)片段化、加衔接子、扩增、下一代测序。
图9是示出使用包含寡核苷酸的条形码单元的可能的定相工作流程的图，其本身包含互补的Tn5衔接子核酸序列引物、特有的条形码和PCR柄。第一步中存在多个条形码寡核苷酸，但为简单起见，此处仅在步骤94之后显示一个。可以与图5和图7中的条形码单元的固体载体结合或图4至6中的转座酶的固体载体结合。使用以下符号：(A)条形码单元；(CPT)邻近性保留的转座DNA；(Tn5)Tn5转座酶；(Tn5S)Tn5衔接子序列；(a)条形码；(PCR)PCR柄；(Tn5P)Tn5衔接子引物；(HS)水凝胶(溶胶态)；(HG)水凝胶基质(处于凝胶状态的水凝胶)；(HG/HS)固态或凝胶态的水凝胶；(91)转座酶与条形码单元结合；(2)与水凝胶溶液接触；(3)水凝胶聚合；(94)释放转座酶；(95)连接、空隙填补；(96)扩增、下一代测序。
实施例
通过以下实施例说明本发明。然而，应当理解的是，本发明不限于这些实施例的具体细节。
实施例1：在水凝胶中捕获离散生物单元并使其条码化
本发明涉及捕获离散生物单元(即细胞或细胞群、病毒、细胞器、大分子复合体或生物大分子)。
本发明及其应用基于图1中描述的连续步骤的实施。
第一步，形成生物单元/条形码单元复合体，每个复合体包含单个条形码单元和单个生物单元(图1的步骤1)。可以在生物单元结合和/或固定在条形码单元上时形成生物单元/条形码单元复合体。因此，条形码单元必须在其表面上带有用于特异性或非特异性结合生物单元的元件。这些元件包括蛋白或其片段、肽、抗体或其片段、核酸、碳水化合物、维生素或其衍生物、辅酶或其衍生物、受体配体或其衍生物、和/或疏水基团。同时，生物单元必须天然地或非天然地带有与条形码单元的元件结合的互补元件。例如，用于结合生物单元的元件可以是针对在生物单元表面上表达或存在的分子(天然或人工的)的抗体。另一选择可以是使用针对在生物单元表面上表达或存在的分子的生物素化抗体，并且随后使携带生物素化抗体的生物单元与涂有链霉抗生物素蛋白的条形码单元结合。
一旦形成生物单元/条形码单元复合体，该复合体就可与水凝胶溶液接触，该水凝胶溶液在聚合后会捕获生物单元/条形码单元复合体(图1的步骤2-3)。
然后，通过使水凝胶与任何所需的试剂和/或溶液接触，可以直接在水凝胶基质中进行生物化学和分子生物学测定。
例如，合适的水凝胶溶液可以是藻酸盐。它的细粒度允许与钙聚合时形成非常小的孔，从而捕获生物单元/条形码单元复合体而没有任何扩散的风险，同时仍允许较小的组分例如试剂和/或溶液的扩散。
通常，当生物单元是细胞、细胞群、细胞核或细胞器时，第一步将包括裂解生物单元以释放其核酸成分。水凝胶平台可支持任何洗涤剂水平，甚至可以裂解难以裂解的生物单元。
然后可以通过相对于涂覆在条形码单元表面上的寡核苷酸进行引发，使释放的核酸条码化(图1的步骤4)。通常，每个条形码单元包含寡核苷酸的克隆拷贝，该寡核苷酸由至少一个引物位点(核酸序列引物)和条形码序列组成。在给定条形码单元的每个寡核苷酸中，条形码序列应始终相同，以便能够识别从一个离散生物单元提取或衍生的核酸的源或来源。
一旦实现条码化(即，用条形码单元的核酸序列引物引发生物单元的核酸)，就可以对条码化的核酸(被捕获在水凝胶基质中，或在水凝胶基质溶解后的溶液中)进行经典的生物化学和分子生物学测定。这些测定包括但不限于且不必按如下顺序：引物定向延伸、连接、扩增、片段化、衔接子序列的添加、下一代测序等(图1的步骤5-6)。例如，当使用藻酸盐作为水凝胶时，可以从水凝胶中洗去钙以允许解聚。在进行任何生物化学和分子生物学测定之前，尤其是在引物定向延伸之前，可以使用其他阳离子例如钠，来使被引发的，即条码化的核酸稳定。
当实施本发明的方法时，关键的步骤是使单个生物单元与单个条形码单元结合，以形成1∶1的复合体。如图2所示，多个生物单元与单个条形码单元的结合会使获得的后续数据，尤其是单细胞下一代测序数据产生偏差。在进行序列分析时，带有“条形码1”的序列将会产生偏差或被损坏，因为它们是从两个不同的生物单元中收集的。
同样，多个条形码单元与单个生物单元的结合也会使单细胞下一代测序数据产生偏差(图3)。从“生物单元1”(B1)收集的序列数据将会用“条形码1”和“条形码2”(A1和A2)表示两次。
有几种方法可以帮助避免形成非化学计量的生物单元/条形码单元复合体。
图4显示了目标生物单元在载体上的固定，该载体涂覆有用于结合所述生物单元的元件(步骤11)。一旦固定在载体上，生物单元就可以与条形码单元接触(步骤12)，优选与相对于生物单元具有更大尺寸的条形码单元接触，从而产生阻碍并防止多个条形码单元与单个生物单元结合(步骤1)。因此，由于每个生物单元仅结合一个条形码单元，因此可以将后续的下一代测序数据解析为单个生物单元。
使用载体，例如涂覆有用于结合生物单元的元件例如生物素的微量离心管，可以容易地实现这种构造。使生物单元例如细胞与链霉抗生物素蛋白偶联的抗体接触，然后沉积在管中以进行结合。去除多余的细胞。然后将涂覆有生物素的条形码单元例如珠沉积在管中，以使其与细胞结合。去除多余的珠。然后将水凝胶溶液例如藻酸钠与钙离子一起倒入试管中，以使藻酸盐聚合。然后可以例如通过在管的顶部添加洗涤剂来处理捕获的细胞。通过毛细作用，洗涤剂到达被捕获的细胞并裂解它们的膜，从而释放它们的核酸成分。藻酸盐的孔径小到足以避免核酸扩散，同时允许较小的反应物和底物扩散。当来自离散细胞的核酸被释放并附着到其相邻条形码珠的核酸序列条形码上时，就会发生条码化。核酸被正确条码化后，即可洗净样品以去除钙离子。藻酸盐水凝胶溶解，并可直接在管中在溶液中进行其他步骤。替代地，条形码单元可以结合在载体上，该载体涂覆有用于结合所述条形码单元的元件。结合到载体后，条形码单元就可以与生物单元接触，优选与相对于条形码单元具有更大尺寸的生物单元接触，从而产生阻碍并防止多个生物单元与单个条形码单元结合(图5)。
还可使用载体例如涂覆有水凝胶薄层的微量离心管来实现这种构造，该水凝胶在聚合后将条形码单元固定在整个载体上。然后将生物单元例如细胞沉积在管中，以使其与条形码单元结合(条件是固定条形码单元的水凝胶层比条形码单元的最小尺寸薄，即至少部分条形码单元仍可用于接触生物单元)。去除多余的细胞。然后将水凝胶溶液倒入管中并聚合。然后可以如上所述处理被捕获的细胞。核酸被正确条码化后，即可溶解两种水凝胶(即涂覆管的薄层和捕获生物单元的水凝胶基质)，并可直接在管中在溶液中进行其他步骤。
避免形成非化学计量的生物单元/条形码单元复合体的另一种策略是使用载体，其中如上所述分别用有限浓度的条形码单元或生物单元使目标生物单元(图6)或条形码单元(图7)结合和/或固定。优选地，游离单元(分别为条形码单元或生物单元)的浓度低于与载体结合的单元(分别为生物单元或条形码单元)的浓度。这样可确保每个生物单元最多结合一个条形码单元，反之亦然，从而可以将后续的下一代测序数据解析为单个生物单元。一些生物单元(图6的步骤1)或条形码单元(图7的步骤1)未分别与条形码单元或生物单元偶联，因此不会产生任何数据。
实施例2：单细胞转录组谱分析
单细胞转录组谱分析是可以使用本发明方法进行的众多生物化学和分子生物学测定之一(图8)。
如实施例1所述在水凝胶溶液中形成生物单元/条形码单元复合体(图1的步骤1-3)后；可选地，在图4至图7的附加步骤(11和12或12*，或21和22或22*)之后，使水凝胶聚合，从而捕获生物单元/条形码单元复合体(图8中的“1-3”)。
最常见地，生物单元是细胞，例如哺乳动物细胞，或适合于单细胞转录组谱分析的任何其他细胞。单细胞转录组谱分析依赖于单细胞mRNA含量的扩增及其测序。因此，第一步是通过直接在水凝胶中裂解细胞来释放细胞的mRNA成分。为此，可以将非离子型洗涤剂或任何其他适合用于细胞裂解的试剂直接应用于水凝胶基质。通过扩散，试剂可以到达生物单元，并裂解它们(图8的步骤83*)。
释放的mRNA在其局部环境中与条形码单元携带的寡核苷酸结合。这些寡核苷酸存在于每个条形码单元上的多个克隆拷贝中，并且就条形码单元至条形码单元的序列而言是特有的。这些寡核苷酸包含PCR柄、特有的条形码序列和核酸序列引物。
哺乳动物mRNA具有天然的3′聚(A)序列，因此可以相对于包含聚(T)序列的核酸序列引物进行引发(图8的步骤84)。引发(即条码化)后，可以在水凝胶基质内或溶液中进行以下分子生物学步骤。通常，使用逆转录酶在条形码单元寡核苷酸的3′端进行第一链cDNA的合成。
然后可以任选地通过模板转换和扩增进行第二链cDNA的合成(图8的步骤85)。下一步包括例如cDNA文库的片段化、加衔接子和扩增。
最终可以通过下一代测序对条码化、扩增的和加衔接子的产物进行测序(图8的步骤86)。
实施例3：定相
定相是可以使用本发明的方法进行的另一种分子生物学测定(图9)。
第一步，通过将Tn5转座酶与高分子量DNA(即生物单元)混合，在溶液中组装转座体。该步骤有时被称为标记(tagmentation)，产生邻近性保留的转座DNA(CPT-DNA)片段，然后是第二步，其中使转座体与条形码单元接触，该条形码单元包含用于结合生物单元的元件(图9的步骤91)。有利地，该元件结合Tn5转座酶。
然后使CPT-DNA/条形码单元复合体与水凝胶溶液接触，使其聚合(图9的步骤2-3)。一旦在水凝胶基质中被捕获后，使用离子型洗涤剂和/或蛋白酶K释放Tn5转座酶，从而破坏邻近性并产生包含Tn5衔接子序列的DNA片段(图9的步骤94)。
包含Tn5衔接子序列的所释放的DNA片段可以在其局部环境中相对于条形码单元所携带的核酸序列引物进行引发，从而包含互补的Tn5衔接子序列(例如，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2)。这些寡核苷酸存在于每个条形码单元上的多个克隆拷贝中，并且就条形码单元至条形码单元的序列而言是特有的。这些寡核苷酸包含PCR柄、特有的条形码序列和与Tn5衔接子序列互补的核酸序列引物(Tn5衔接子引物，Tn5P)。引发(即条码化)后，可以在水凝胶基质内或在水凝胶溶解后的溶液中进行以下分子生物学步骤。
在水凝胶基质或溶液中均可发生连接、空隙填补和扩增(图9的步骤95)。
最终可以通过下一代测序对条码化的、扩增的和加衔接子的产物进行测序(图9的步骤96)。
分子生物学的其他变型可以在国际专利申请WO2016/061517(例如，图15-21)中找到，其通过引用并入本文。

Claims (26)

1.一种在水凝胶中捕获多个离散生物单元的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使所述多个离散生物单元与多个条形码单元接触以形成多个离散生物单元/条形码单元复合体，
b)使所述多个离散生物单元/条形码单元复合体与水凝胶溶液接触，
c)聚合水凝胶溶液以使所述多个离散生物单元/条形码单元复合体的离散生物单元/条形码单元复合体嵌入由水凝胶溶液形成的水凝胶基质中，和
d)使释放自水凝胶基质中的每个所述离散生物单元/条形码单元复合体内的生物单元的核酸条码化，
其中每个条形码单元包含特有的条形码，并且
其中所述方法不需要使用芯片和/或微滴生成仪器。
2.一种用于分析多个离散生物单元中的基因表达的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使所述多个离散生物单元与多个条形码单元接触以形成多个离散生物单元/条形码单元复合体，其中每个条形码单元包含特有的条形码，并且其中所述条形码单元包含至少一种涉及结合所述生物单元的元件，
b)使所述多个离散生物单元/条形码单元复合体与水凝胶溶液接触，
c)聚合水凝胶溶液以使所述多个离散生物单元/条形码单元复合体的离散生物单元/条形码单元复合体嵌入水凝胶基质中，
d)从存在于水凝胶基质中的多个离散生物单元/条形码单元复合体的每个离散生物单元/特有的条形码珠复合体的生物单元中释放核酸，
e)使水凝胶基质中的释放自每个离散生物单元/特有的条形码珠复合体的生物单元的所述核酸条码化，
f)由释放自每个离散生物单元/特有的条形码珠复合体的生物单元的核酸合成cDNA文库，
g)扩增来自每个生物单元的所述cDNA文库，其中来自每个生物单元的所述cDNA文库的扩增使所述特有的条形码的克隆拷贝掺入来自每个生物单元的扩增产物中，和
h)对扩增产物进行测序，
其中所述方法不需要使用芯片和/或微滴生成仪器。
3.一种用于分析多个离散生物单元的基因型的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使所述多个离散生物单元与多个条形码单元接触以形成多个离散生物单元/条形码单元复合体，其中每个条形码单元包含特有的条形码，并且其中所述条形码单元包含至少一种涉及结合所述生物单元的元件，
b)使所述多个离散生物单元/条形码单元复合体与水凝胶溶液接触，
c)聚合水凝胶溶液以使所述多个离散生物单元/条形码单元复合体的离散生物单元/条形码单元复合体嵌入水凝胶基质中，
d)从存在于水凝胶基质中的每个离散生物单元/特有的条形码珠复合体的生物单元释放基因组DNA，
e)使释放自水凝胶基质中的每个生物单元/特有的条形码珠复合体的生物单元的所述基因组DNA条码化，
f)由释放自每个离散生物单元/特有的条形码珠复合体的生物单元的核酸合成DNA文库，
g)扩增来自每个生物单元的所述基因组DNA或DNA文库，其中来自每个生物单元的所述基因组DNA或DNA文库的扩增使所述特有的条形码的克隆拷贝掺入每个生物单元的扩增产物中，和
h)对扩增产物进行测序，
其中所述方法不需要使用芯片和/或微滴生成仪器。
4.一种用于分析多个离散生物单元的单体型的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使所述多个离散生物单元与多个条形码单元接触以形成多个离散生物单元/条形码单元复合体，其中每个条形码单元包含特有的条形码，并且其中所述多个条形码单元的条形码单元包含至少一种涉及结合所述生物单元的元件，
b)使所述多个离散生物单元/条形码单元复合体与水凝胶溶液接触，
c)聚合水凝胶溶液以使所述多个生物单元/条形码单元复合体的离散生物单元/条形码单元复合体嵌入水凝胶基质中，
d)从存在于水凝胶基质中的每个生物单元/特有的条形码珠复合体的生物单元释放核酸，
e)使释放自水凝胶基质中的每个离散生物单元/特有的条形码珠复合体的生物单元的所述核酸条码化，
f)由来自每个生物单元的核酸合成DNA文库，
g)扩增来自每个生物单元的所述核酸或DNA文库，其中来自每个生物单元的所述核酸或DNA文库的扩增使所述特有的条形码的克隆拷贝掺入来自每个生物单元的扩增产物中，和
h)对扩增产物进行测序，
其中所述方法不需要使用芯片和/或微滴生成仪器。
5.一种用于分析多个离散生物单元的表观基因组的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使多个离散细胞生物单元与多个条形码单元接触以形成多个离散生物单元/条形码单元复合体，其中每个条形码单元包含特有的条形码，并且其中所述条形码单元包含至少一种涉及结合所述生物单元的元件，
b)使所述多个离散生物单元/条形码单元复合体与水凝胶溶液接触，
c)聚合水凝胶溶液以使所述多个离散生物单元/条形码单元复合体的离散生物单元/条形码单元复合体嵌入水凝胶基质中，
d)从存在于水凝胶基质中的每个离散生物单元/特有的条形码珠复合体的生物单元释放非核小体结合的DNA，
e)使来自水凝胶基质中的每个生物单元的所述非核小体结合的DNA条码化，
f)由来自每个生物单元的非核小体结合的DNA合成DNA文库，
g)扩增来自每个生物单元的所述非核小体结合的DNA或DNA文库，其中来自每个生物单元的所述非核小体结合的DNA或DNA文库的扩增使所述特有的条形码的克隆拷贝掺入来自每个生物单元的扩增产物中，和
h)对扩增产物进行测序，
其中所述方法不需要使用芯片和/或微滴生成仪器。
6.根据权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的方法，其中在每个生物单元/特有的条形码珠复合体中，条形码单元的数量等于或多于生物单元的数量。
7.根据权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的方法，其中水凝胶基质具有限制所述经释放的核酸在水凝胶基质中的扩散的孔径。
8.根据权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的方法，其中所述生物单元固定在载体上。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述生物单元固定在水凝胶层中的载体上。
10.根据权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的方法，其中所述条形码单元固定在载体上。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述条形码单元固定在水凝胶层中的载体上。
12.根据权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的方法，其中所述特有的条形码以多个克隆拷贝的形式存在于每个条形码单元上。
13.根据权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的方法，其中所述特有的条形码包括核酸序列条形码。
14.根据权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的方法，其中所述特有的条形码还包括核酸序列引物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述核酸序列引物包括随机核酸序列引物和/或特异性核酸序列引物。
16.根据权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的方法，其中所述条形码单元还包含至少一种涉及结合生物单元的元件。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述至少一种涉及结合生物单元的元件包括蛋白、肽和/或其片段；核酸；碳水化合物；维生素；辅酶；受体配体；和/或疏水基团。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述至少一种涉及结合生物单元的元件包括抗体和/或其片段。
19.根据权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的方法，其中所述每个条形码单元由珠组成。
20.根据权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的方法，其中条码化的步骤通过引物模板退火、引物定向延伸和/或连接在水凝胶基质中进行。
21.根据权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的方法，其中所述离散生物单元包括细胞、病毒、细胞核、线粒体、叶绿体、生物大分子、外排体和/或染色体。
22.根据权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的方法，其中所述离散生物单元包括邻近性保留的转座DNA片段。
23.根据权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的方法，其中所述离散生物单元包括核酸片段。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述细胞包括体外培养的细胞和组织活检细胞。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述细胞包括干细胞、肿瘤细胞和血细胞。
26.根据权利要求21所述的方法，其中所述细胞包括组织切片细胞。
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