CN102115789B - 用于第二代高通量测序的核酸标签及其设计方法 - Google Patents

Abstract

用于第二代高通量测序的核酸标签及其设计方法，涉及一种核酸标签。提供一种可实现快速、高效和特异地同时标记近百个独立样本，适用于多样本混合测序，主要为96孔板条件下的用于第二代高通量测序的核酸标签及其设计方法。所述核酸标签为A组，长度为5nt的8个标签；B组，长度为5nt的8个标签；C组，长度为6nt的12个标签。设计第1条标签序列：Tag1：CTAGA；设计另3条标签：Tag2：TGCAG；Tag3：ACGTC；Tag4：GATCT；设计另4条标签：Tag5：CGTAC；Tag6：TAGCA；Tag7：ATCGT；Tag8：GCATG；计算标签两两之间具有相同碱基的位置数。

Description

用于第二代高通量测序的核酸标签及其设计方法

技术领域

本发明涉及一种核酸标签，尤其是涉及一种用于第二代高通量测序的核酸标签及其设计方法。

背景技术

核酸标签是指已知序列的一小段核酸，通常包含几个到几十个核苷酸(nt)，通过分子生物学方法与待标记的核酸连接来标记该核酸。将核酸标签应用于多样品混合测序，可以区分每条序列来自的样品。

随着第二代DNA测序技术的发展和成熟，测序的通量越来越高，为同时测定多个样本提供了可能。比如Roche/454的GS FLX Titanium测序系统一次可以得到100万条序列，如果同时测定96个样本，每个样本可以得到约1万条序列。目前Roche(罗氏)公司提供了两种同时测定多样本的方法，一是物理分区，把测序反应区平均分隔为2或4或8或16个物理区块，每个物理区块测定1个样本；第二种方法是给每个样本的一端加上一段10个核苷酸的特异标签序列，不同的样本这段标签序列不同，样本混合测序后可以根据这段特异标签序列来追踪样本来源。罗氏公司目前提供成熟的标签有15个。国外的其他研究小组也发表了不同于罗氏公司的标签方法，比如通过PCR方法在序列一端加4nt的特异标签([1]Hoffmann，C.，Minkah，N.，Leipzig，J.，Wang，G.，Arens，M.Q.，Tebas，P.，and Bushman，F.D.(2007).DNA bar coding and pyrosequencing to identify rare HIV drug resistance mutations.Nucleic AcidsRes 35，e91[；2]Kasschau，K.D.，Fahlgren，N.，Chapman，E.J.，Sullivan，C.M.，Cumbie，J.S.，Givan，S.A.，and Carrington，J.C.(2007).Genome-wide profiling and analysis ofArabidopsis siRNAs.PLoS Biol 5，e57)或两端各加上2nt([3]Binladen，J.，Gilbert，M.T.，Bollback，J.P.，Panitz，F.，Bendixen，C.，Nielsen，R.，and Willerslev，E.(2007).The use of codedPCR primers enables high-throughput sequencing of multiple homolog amplification products by454 parallel sequencing.PLoS ONE 2，e197)或10nt的特异标签([4]Parameswaran，P.，Jalili，R.，Tao，L.，Shokralla，S.，Gharizadeh，B.，Ronaghi，M.，and Fire，A.Z.(2007).A pyrosequencing-tailored nucleotide barcode design unveils opportunities for large-scale sample multiplexing.Nucleic Acids Res 35，e130)。在目前的分子生物学实验操作，通常会利用96孔板进行多样本的平行处理，因此在混合测序领域，同时对96个不同DNA样本进行标签也就有了非常实用的价值。而以上公开的方法要么可以区分的样本数太少，无法满足96个样本标签的需要，比如物理分区或2nt的标签；要么标签序列过长，使得引物和接头设计变得复杂和昂贵，比如10nt的标签。针对配合第二代测序系统的96孔板操作的特异标签方法还未见报道。

标签的使用必须考虑测序错误。如果测序错误正好落在标签区，那么标签序列的改变可能使得其所在的序列无法分辨来源。最坏的情况是如果测序错误正好把某个特异标签变为另1个特异标签，那么就会把其所在的序列分配给错误的样本。比如，2nt的标签，一共可能的标签有4×4＝16个。如果16个标签都用上的话，那么只要标签上有测序错误，就无法避免地从1个标签变为另1个标签。因此采用标签的饱和度越高，发生这种错误的概率就越高。由于第二代DNA测序技术的错误率比传统Sanger测序法要高，比如Roche/454的GS FLXTitanium测序系统在前面400bp内的错误率一股会达到0.5％～1％，再考虑到实际操作的其他误差和更大的读长，错误率可能会更高些。标签的容错性能必须与这些数值匹配。对于4nt的标签来说，其总共有4^4＝256个可能的标签，如果随机选取其中96个做为实际标签，按照测序错误率为0.8％计算，那么总共有3.2％标签将发生测序错误，而每个测序错误的标签有37.5％(96/256＝37.5％)的可能性误读为其他标签，即总序列的1.2％将被错误地分配到其他样本，这么高的错误分配率将严重影响实验结果。因此标签的设计必须符合科学原则，降低错误分配率。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以实现快速、高效和特异地同时标记近百个独立样本，适用于Roche/454GS FLX、Applied Biosystems/SOLiD和Illumina/Solexa的多样本混合测序，主要为96孔板条件下的用于第二代高通量测序的核酸标签及其设计方法。

本发明所述用于第二代高通量测序的核酸标签为：

A组，长度为5nt的8个标签：

A-Tag1：CTAGA；

A-Tag2：TGCAG；

A-Tag3：ACGTC；

A-Tag4：GATCT；

A-Tag5：CGTAC；

A-Tag6：TAGCA；

A-Tag7：ATCGT；

A-Tag8：GCATG：

B组，长度为5nt的8个标签：

B-Tag1：CTCTA；

B-Tag2：GCTAG；

B-Tag3：AGACC；

B-Tag4：TAGGA；

B-Tag5：CATAC；

B-Tag6：GTAGA；

B-Tag7：ACGTA；

B-Tag8：TAACG；

C组，长度为6nt的12个标签：

C-Tag1：CTGTCA；

C-Tag2：CAACGA；

C-Tag3：CCTGAT；

C-Tag4：GACAGT；

C-Tag5：GTCTTC；

C-Tag6：GGAACA；

C-Tag7：TCAGTG；

C-Tag8：TCGAAC；

C-Tag9：TGCCTT；

C-Tag10：AGTCAC；

C-Tag11：ACGTGT；

C-Tag12：ATTGCG。

本发明所述用于第二代高通量测序的核酸标签的设计方法包括以下步骤：

1)设计第1条标签序列，没有连续两个相同的碱基：

Tag1：CTAGA；

2)设计另3条标签，这4条标签标签对齐后，两两之间差异最大，即两两之间具有相同碱基的位置数为0：

Tag2：TGCAG；

Tag3：ACGTC；

Tag4：GATCT；

3)设计另4条标签，每条新设计的标签与前面4条标签对齐后，两两之间拥有相同碱基的位置数不超过2，每条路线都经过Tag1-Tag4标签；每条标签被同一路线踩到的位置不超过2个；Tag1-Tag4标签的每个位置均被踩到，且只被踩过1次，把每条路线经过的碱基按顺序连接起来，就是1条新的标签，由此获得4条新标签如下：

Tag5：CGTAC；

Tag6：TAGCA；

Tag7：ATCGT；

Tag8：GCATG；

4)计算标签两两之间具有相同碱基的位置数。

本发明所述应用上述标签标记96个样品的方法包括以下步骤：

1)以8个1组的长度为5nt的标签为行标签，96孔板共有8行，每行对应1个标签，同一行的DNA样品标记同1个行标签；

2)以12个1组的长度为6nt的标签为列标签，96孔板共有12列，每列对应1个标签，同一列的DNA样品标记同1个列标签；

3)每个DNA样品同时标记两个标签，即DNA的两端都标记有标签，一端为行标签，另一端为列标签；

4)混合测序结束后，检索DNA两端的标签序列，根据实验设计的行标签与列标签的两两组合把序列归类。

本发明具有如下特点：

1.每组标签均具有很高的特异性

按照上述列明的标签和设计方法，同1组标签两两之间至少有3个位置是不同的，这保证了标签的容错能力。如果标签序列发生1次测序错误，最凑巧的情况下，与其他同组标签之间仍然有2nt的差异，所以误判为其他标签的可能性为零；根据相似性，错误标签与正确标签只有1nt差别，而与其他标签都至少有2nt差别，所以追踪出原标签的可能性为100％。如果标签序列发生2次或以上测序错误，由于高通量测序系统的质量控制，只有极低比例的这类序列进入下一环节，又由于同1组标签之间至少有3个位置的不同，因此只有在非常巧合的情况下会被误读为其他标签。可见这套标签误判为其他标签的可能性极低，而通过精细的追踪程序，1nt测序错误的序列都可以追踪到正确的原始标签。

2.本套标签与96孔板操作完全相容

根据这套标签设计了接头和引物，在一系列实验中(具体见实施例)，相同PCR条件下，通常有85个以上样品能得到阳性条带，剩余样品在优化条件之后也能得到条带。由此可见这套标签所标定的引物具有相似的扩增效率，完全适用于96孔板操作。

3.本套标签与目前商业化的3种第二代测序系统都能相容

Roche/454测序系统的测序长度在350bp以上，被标记序列长度不超过350bp情况下，大部分序列可以同时测到两个标签，从而通过行标签与列标签的两两组合的情况追踪回原始样品。Applied Biosystems/SOLiD和Illumina/Solexa都具有两端测序的功能，因此大部分DNA两端的特异标签可以同时采集到，不会丢失标签两两组合的可靠性。

4.依据本套标签，使得标记96个样品的成本非常低廉

对于96个样品的标记，如果采取一端标记的方法，就需要设计96个特异的接头和96条特异的引物。而依据本套标签两两组合的原理，只需要设计20个特异接头和20条特异引物。

附图说明

图1为路线辅助设计标签的示意图。内部表格是A组的Tag1～Tag4的序列，箭头代表路线，1条路线代表1个新设计的标签。

图2为本发明实施例的96孔板、行标签、列标签示意图。水平方向为1～12，12个列标签，垂直方向为A～H8个行标签。

图3为本发明实施例96个样品中第1～48个样品的PCR跑胶图。数字1～48表示样品编号，M是分子量标记。

图4为本发明实施例96个样品中第49～96个样品的PCR跑胶图。数字49～96表示样品编号，M是分子量标记。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

本发明所述用于第二代高通量测序的核酸标签为：

A组，长度为5nt的8个标签：

A-Tag1：CTAGA；A-Tag2：TGCAG；A-Tag3：ACGTC；A-Tag4：GATCT；A-Tag5：GTAC；A-Tag6：TAGCA；A-Tag7：ATCGT；A-Tag8：GCATG。

B组，长度为5nt的8个标签：

B-Tag1：CTCTA；B-Tag2：GCTAG；B-Tag3：AGACC；B-Tag4：TAGGA；B-Tag5：CATAC；B-Tag6：GTAGA；B-Tag7：ACGTA；B-Tag8：TAACG。

C组，长度为6nt的12个标签：

C-Tag1：CTGTCA；C-Tag2：CAACGA；C-Tag3：CCTGAT；C-Tag4：GACAGT；C-Tag5：GTCTTC；C-Tag6：GGAACA；C-Tag7：TCAGTG；C-Tag8：TCGAAC；C-Tag9：TGCCTT；C-Tag10：AGTCAC；C-Tag11：ACGTGT；C-Tag12：ATTGCG。

本发明所述用于第二代高通量测序的核酸标签的设计方法包括以下步骤：

1)设计第1条标签序列，没有连续两个相同的碱基：Tag1：CTAGA。

2)设计另3条标签，这4条标签标签对齐后，两两之间差异最大，即两两之间具有相同碱基的位置数为0：Tag2：TGCAG；Tag3：ACGTC；Tag4：GATCT。

3)设计另4条标签，每条新设计的标签与前面4条标签对齐后，两两之间拥有相同碱基的位置数不超过2。这里需要借助路线辅助设计，如图1所示。每条路线都经过Tag1-Tag4标签；每条标签被同一路线踩到的位置不超过2个；Tag1-Tag4标签的每个位置均被踩到，且只被踩过一次。把每条路线经过的碱基按顺序连接起来，就是1条新的标签。由此获得4条新标签：Tag5：CGTAC；Tag6：TAGCA；Tag7：ATCGT；Tag8：GCATG。

4)计算标签两两之间具有相同碱基的位置数，标签两两比较表参见表1。

表1

在表1中，数字表示两两间具有相同碱基的位置数。由表1表明，每个标签与其他标签的相似度，“小计”栏表明，1个标签与其他标签相似程度的总和，这个数值越低越好，但各标签的这个数值必须均衡。如果个别标签这一栏的数值显著地高，那么就要调整标签序列，直到数值均衡。

本发明所述应用上述标签标记96个样品的方法包括以下步骤：

1)以8个1组的长度为5nt的标签为行标签，96孔板共有8行，每行对应1个标签，同一行的DNA样品标记同1个行标签；

2)以12个1组的长度为6nt的标签为列标签，96孔板共有12列，每列对应1个标签，同一列的DNA样品标记同1个列标签；

3)每个DNA样品同时标记两个标签，即DNA的两端都标记有标签，一端为行标签，另一端为列标签；

4)混合测序结束后，检索DNA两端的标签序列，根据实验设计的行标签与列标签的两两组合把序列归类。

以下给出具体实施例：96个贝类基因组DNA样品的标记

1)基本原理

根据分子生物学实验标准的96孔板12×8的格局(参见图2)，可以把特异标签也设计为12×8的组合。由于DNA的两端均可以连接上标签，那么通过两端标签的12×8两两特异组合可以用来标记96个DNA样品。把标记不同行的标签命名为行标签(column-barcode)，简称c-bar，共8个，96孔板同一行的样品标记相同的行标签；把标记不同列的标签命名为列标签(row-barcode)，简称r-bar，共12个，96孔板同一列的样品标记相同的列标签(参见图2)。

用T_c和T_r分别表示c-bar和r-bar标签的长度；用p_D表示把序列错误分配给其他样本的概率，具体到行和列，即有p_Dc、p_Dr分别表示错误分配的行标签和列标签。错误分配的概率p_D等于选取标签数与可能标签总数的比例，即：

$p_{\mathrm{Dc}}=\frac{8}{4^{\mathrm{Tc}}}$

$p_{\mathrm{Dr}}=\begin{array}{c}12\\ 4^{\mathrm{Tr}}\end{array}$

如果设p_D＜0.01，则有T_c≥5，T_r≥6。因此为了使带有测序错误的标签分配给错误的样本的概率小于1％，那么行标签的长度不小于5nt，列标签的长度不小于6nt。

标签的容错性除了要避免错误分配外，还要具有把错误修正并追踪到正确样本的能力。因此行标签两两之间或列标签两两之间必须有3nt以上的差别，这样即使其中1个nt测序错误，与之最相似的序列依然是原先的标签。

由于Roche/454GS FLX采用焦磷酸测序法，3个以上连续相同的碱基将让碱基读取出现更多的错误，这个情况需要避免。因此标签不允许有连续3个相同的碱基，尽量避免连续2个相同的碱基。

由于通常采用PCR方法加入标签，而96孔板操作时每个孔的实验条件是相同的，为了保证每个样本PCR效率一致，标签之间的GC含量要尽量保持一致。

本实施例按照以下设计方法：

设计B组8个长度为5nt的标签和C组12个长度为6nt的标签，分别当作行标签和列标签，这套标签完全符合以上原则。表2表示了本实施例采用的融合了标签的引物。其中下划线部分为标签序列，其他部分为Roche/454测序用引物。c-bar1～c-bar8引物带有测序引物454A的3’端序列和行标签；r-bar1～r-bar12引物带有测序引物454B的3’端序列和列标签。利用Primer Designer version 3.0软件计算，所有引物的Tm值在66～73℃之间。

表2

引物名	引物序列	Tm(℃)
			c-bar1	GTGTCTCCGACTCAGCTCTA	66
c-bar2	GTGTCTCCGACTCAGGCTAG	68
			c-bar3	GTGTCTCCGACTCAGAGACC	68
c-bar4	GTGTCTCCGACTCAGTAGGA	66
			c-bar5	GTGTCTCCGACTCAGCATAC	66
c-bar6	GTGTCTCCGACTCAGGTAGA	66
			c-bar7	GTGTCTCCGACTCAGACGTA	67
c-bar8	GTGTCTCCGACTCAGTAACG	66
			r-bar1	CTTGGCAGTCTCAGCTGTCA	71
r-bar2	CTTGGCAGTCTCAGCAACGA	73
			r-bar3	CTTGGCAGTCTCAGCCTGAT	71
r-bar4	CTTGGCAGTCTCAGGACAGT	69
			r-bar5	CTTGGCAGTCTCAGGTCTTC	68
r-bar6	CTTGGCAGTCTCAGGGAACA	72
			r-bar7	CTTGGCAGTCTCAGTCAGTG	68
r-bar8	CTTGGCAGTCTCAGTCGAAC	69
			r-bar9	CTTGGCAGTCTCAGTGCCTT	71
r-bar10	CTTGGCAGTCTCAGAGTCAC	67
			r-bar11	CTTGGCAGTCTCAGACGTGT	70
r-bar12	CTTGGCAGTCTCAGATTGCG	73

2)实验步骤

(1)提取96个贝类个体的基因组DNA样品，用合适手段剪切；

(2)在96孔板上，按照图2所示的行列两两组合方式，加上与表1相匹配的接头；

(3)在96孔板上，按照图2所示的行列两两组合方式，加入表1所示的对应引物，进行PCR反应，反应条件为：50μl反应体系，模板含量2ng，引物各20pmol，dNTP 5μmol，exTaq(TaKaRa)0.2μl。94℃预变性2min，25个循环(94℃30s，60℃50s，72℃30s)，72℃5min；

(4)取10μl PCR产物，进行1.2％琼脂糖凝胶电泳；

(5)PCR产物等量混合，切取200-300bp片段，纯化后提交Roche/454的GS FLXTitanium系统进行测序；

(6)序列分析，统计被标签标记的序列数，统计每个个体被标签分辨的比例。

3)实验结果

(1)96个样品的PCR跑胶结果见图3和图4。理想的扩增结果是在200bp～3000bp范围出现弥散亮带。由图可见，一次PCR获得了88个样品的目的条带。其他8个样品经过第二次实验也获得了阳性结果。可见表2所示的含有本发明标定标签的引物可以高效地用于PCR反应；

(2)本次测序共获得234,952条有效序列(即完全测通，而且测序准确度99.0％以上)，其中被计算机程序识别带有两端标签，并成功分配给96个样品的序列共233,556条(允许1个碱基的错误)，占总有效序列的99.4％。每个样品获得的序列数见表3。可见每个标签获得的序列数目比较均衡，表明本发明标定的标签完全合适于多样品的标记。

4)结论

B组和C组标签经过实验验证，99.4％的序列可以追溯为原标定样本，表明本套标签标定效率极高；而且标签组合能严格地对应到96个样品，表明其特异性极好；原本繁复的实验工作，应用与96孔板操作相容的标签后，工作量大大简化，极大增加了工作效率；在较多步骤的实验流程后，每个个体被标定的比例比较均衡，表明本套标签具有很好的鲁棒性。

表3

Claims (1)

1.用于第二代高通量测序的核酸标签，其特征在于为：

B组，长度为5nt的8个标签：

B-Tag1：CTCTA；

B-Tag2：GCTAG；

B-Tag3：AGACC；

B-Tag4：TAGGA；

B-Tag5：CATAC；

B-Tag6：GTAGA；

B-Tag7：ACGTA；

B-Tag8：TAACG；和

C组，长度为6nt的12个标签：

C-Tag1：CTGTCA；

C-Tag2：CAACGA；

C-Tag3：CCTGAT；

C-Tag4：GACAGT；

C-Tag5：GTCTTC；

C-Tag6：GGAACA；

C-Tag7：TCAGTG；

C-Tag8：TCGAAC；

C-Tag9：TGCCTT；

C-Tag10：AGTCAC；

C-Tag11：ACGTGT；

C-Tag12：ATTGCG。

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